DE69222091T2

DE69222091T2 - Peptid-Synthese an fester Phase

Info

Publication number: DE69222091T2
Application number: DE69222091T
Authority: DE
Inventors: Ronald Cotton; Michael Brian Giles
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: AstraZeneca UK Ltd
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-11
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2012-06-12
Also published as: NO922319L; JP3249178B2; DE69222091D1; EP0518655B1; AU1704092A; NO922319D0; NO303390B1; AU667035B2; ES2106831T3; JPH05170791A; GB9112825D0; CA2069724A1; EP0518655A2; EP0518655A3; CA2069724C; US5602231A; ATE157986T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, und zwar insbesondere ein Verfahren zur Peptid- Synthese an fester Phase, beispielsweise zur Herstellung des Decapeptids Goserelin.
Die Synthese von Peptiden an fester Phase ist seit fast 30 Jahren bekannt, nämlich seit den Pionierarbeiten von Merrifield, die zuerst 1962 veröffentlicht wurden. Das allgemeine Prinzip dieses Synthese-Typs ist:
{a) Eine N-geschützte Aminosäure (die Schutzgruppe ist üblicherweise t-Butoxycarbonyl, das mit Boc abgekürzt wird) wird an einen festen, unlöslichen Träger (gewöhnlich ein Polystyrolharz) gebunden, und zwar an ihrem Carboxy-Ende über eine Verknüpfungsgruppe (üblicherweise ein Benzylester).
(b) Die N-Schutzgruppe wird mit Mitteln entfernt, durch die die Aminosäure nicht von dem festen Träger gelöst wird, und eine zweite N-geschützte Aminosäure wird an die bereits gebundene gekuppelt (üblicherweise durch Verwendung eines Carbodiimid-Kupplungsmittels).
(c) Die Sequenz wird unter Verwendung so vieler N- geschützter Aminosäuren wiederholt, wie zur Bildung des gewünschten Peptids erforderlich sind, das immer noch mit seinem Carboxy-Ende an den festen Träger gebunden ist.
(d) Die letzte N-Schutzgruppe wird entfernt, und das Peptid wird von dem festen Träger durch die Abspaltung der Verknüpfungsgruppe (üblicherweise unter Verwendung einer starken Säure) von dem festen Träger abgetrennt.
Die gesamte Synthese kann maschinell erfolgen, und in einigen Fällen kann das Peptid ohne Eingreifen von Hand gebildet werden. Die Boc-Schutzgruppen werden durch Trifluoressigsäure entfernt, und die Peptid-Kette wird von dem festen Träger mit einer stärkeren Säure, beispielsweise Fluorwasserstoffsäure, entfernt.
Seit der Einführung dieser Technik sind zwar viele Modifikationen vorgenommen worden, aber das heute allgemeine angewendete Verfahren ist im wesentlichen immer noch das zuerst beschriebene. Zwei Hauptinnovationen sind die Verwendung eines Polyamids als fester Träger und die Verwendung einer N-Fluoren-9-yl-methoxy-carbonyl (Fmoc) Schutzgruppe für die Nα-Gruppe der Aminosäure. Die Fmoc-Gruppe unterscheidet sich insofern, als sie basenlabil ist (üblicherweise Piperidin). Hinsichtlich weiterer Details wird sich beispielsweise auf Atherton und Sheppard, "Solid phase peptide synthesis - a practical approach", IRL Press at Oxford University Press, 1989; Barany et al., "Solid-phase peptide synthesis: a silver anniversary report", Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30, 705 - 739 und Fields et al., ibid, 1990, 35, 161 - 214 bezogen.
In dieser Beschreibung werden durchweg die Standardabkürzungen für Aminosäuren, Schutzgruppen, Kupplungsmittel und dgl. verwendet. Um alle Zweifel zu vermeiden, handelt es sich neben den oben definierten Abkürzungen Boc und Fmoc bei den folgenden Abkürzungen um die relevanten Standardabkürzungen:
Arg Arginin
Azala Aza-alanin (H&sub2;N-NMe-COOH)
Azgly Azaglycin (H&sub2;N-NH-COOH)
Azphe Azaphenylalanin (H&sub2;H-NBzl-COOH)
D-Ser D-Serin
Glp Pyroglutaminsäure
His Histidin
Leu Leucin
Pro Prolin
Ser Serin
Trp Tryptophan
Tyr Tyrosin
DIPC Diisopropylcarbodiimid
HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
DIEA N,N-Diisopropylethylamin
DMF N,N-Dimethylformamid
But tert.-Butyl
Bzl Benzyl
Su Succinimido
Goserelin ist ein synthetisches Analogon des natürlich vorkommenden Hormons LHRH und wird zur Behandlung des Prostatakrebses, des Brustkrebses und bestimmter gynäkologischer Beschwerden verwendet. Bei der zuerst erwähnten Behandlung wirkt es durch Auslösung einer chemischen Kastration. Goserelin ist
[D-Ser(But)&sup6;, Azgly¹&sup0;]-LHRH.
Es zeigt sich, daß zwei Merkmale dieser Struktur nicht mit den traditionellen Synthesewegen zur Peptid-Synthese an fester Phase verträglich sind. Das erste ist die Carboxyterminale Aminosäure Azgly, weil Verfahren zur Bindung einer derartigen Gruppe an einen festen Träger allgemein nicht bekannt sind, obwohl Knolle et al., Peptides 1990, 414 - 415 die Bindung des Dipeptids Pro-Azgly an ein Aminomethylharz durch eine substituierte Phenylpropionsäure-Verknüpfungsgruppe beschreiben. Dieses Verfahren ist natürlich nur zur Festphasensynthese von Peptiden mit einem C-terminalen Azgly anwendbar. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist im Gegensatz dazu jedoch zur Synthese von Peptiden geeignet, die eine Aza- Aminosäure an einer beliebigen Position in der Peptid-Kette enthalten. Das freie Azaglycin hat natürlich eine terminale -NH-COOH-Gruppe, bei der es sich somit um eine instabile Carbaminsäure handelt.
Das zweite Merkmal von Goserelin, das mit der traditionellen Festphasensynthese nicht verträglich ist, ist die tert.-Butyl-Gruppe, die an den D-Serin-Rest gebunden ist. Wenn diese Gruppe erhalten bleiben soll, sind traditionelle Maßnahmen zur Entfernung des vervollständigten Peptids von dem festen Träger unter Verwendung einer starken Säure nicht anwendbar.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Goserelin und anderen Peptiden, die Aza- Aminosäuren in beliebiger Position in der Peptid-Kette enthalten, durch Festphasensynthese bereit.
In Synthesis, Juni 1989, Stuttgart, Deutschland, Seiten 405 - 413 sind Verfahren zur Synthese von Aza-Aminosäuren enthaltenden Peptiden offenbart, die jedoch alle in Lösung durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Festphasen-Synthese eines Peptids, das mindestens eine Aza-Aminosäure enthält, bereitgestellt, bei dem:
(i) ein aktiver Ester oder ein Imidazolid einer N- geschützten Aza-Aminosäure im Falle der Synthese eines eine C-terminale Aza-Aminosäure enthaltenden Peptids entweder mit einem geeigneten reaktiven festen Träger umgesetzt wird, oder im Falle der Synthese eines eine nicht-C-terminale Aza-Aminosäure enthaltenden Peptids mit einem Peptid, das an einen festen Träger gebunden ist,
(ii) weitere herkömmliche Schritte zur Festphasen-Peptid- Synthese zur aufeinanderfolgenden Anfügung weiterer Aminosäuren durchgeführt werden, so daß ein an den festen Träger gebundenes Peptid mit der erforderlichen Aminosäure-Sequenz gebildet wird, und
(iii) das Peptid von dem festen Träger abgespalten wird.
Geeignete aktive Ester zur Umsetzung mit dem festen Träger sind beispielsweise Succinimido-, Benzotriazol-1-yl-, Pentafluorphenyl-, 2,4,5-Trichlorphenyl- oder 3,4-Dihydro- 4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl-ester.
Der reaktive fester Träger kann einer herkömmlicher sein, der auf einem vernetzten Polystyrolharz beruht, in das Chlormethyl-Gruppen eingeführt wurden, welche wiederum mit einer Phenoxy-Gruppe umgesetzt wurden, beispielsweise ein Rink-Harz (H. Rink, Tet. Lett. (1987), 28, 3787 - 3790) SASRIN-Harz (super acid sensitive resin, N. Mergler, R. Tanner, J. Gostelli und P. Grogg, Tet. Lett. (1988), 29, 4005 - 4008) oder Wang-Harz (W. S. Wang, J. Am. Chem. Soc. (1973), 95, 1328 - 1333). Ein besonders bevorzugter Träger zur Verwendung bei der Herstellung von Peptiden mit einem C-terminalen Amid ist das als Fmoc-NH-Rink-Harz bekannte Harz, welches 4-(α-Fmoc-amino-2',4'-dimethoxybenzyl)- phenoxy-Gruppen aufweist, die an Methylen-Gruppen am Polystyrolharz gebunden sind. Peptide, welche durch diese Gruppe gebunden sind, können von dem Harzträger durch eine kurze Behandlung mit einer Säure geringer Konzentration, z.B. Trifluoressigsäure, abgespalten wirden.
Geeignete Aza-Aminosäuren, die in dem obigen Verfahren verwendet werden können, sind beispielsweise Azaglycin, Azaalanin und Azaphenylalanin.
Die als Ausgangsmaterialen verwendeten aktiven N-geschützten Azaaminoacylester sind neue Verbindungen und bilden ein weiteres Merkmal der Erfindung. Insbesondere stellen Fmoc- Azgly-OSu, Fmoc-Azala-OSu, Fmoc-Azphe-OSu, Fmoc-Azala-OBt und Fmoc-Azphe-OBt konkrete weitere Merkmale der Erfindung dar.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Festphasensynthese eines Peptids, das eine Aminosäure enthält, die eine tert.-Butyloxy-Gruppe in ihrer Seitenkette aufweist, bereitgestellt, bei dem eine Verknüpfungsgruppe verwendet wird, welche die C-terminale Aminosäure an den festen Träger bindet, welche Verknüpfungsgruppe unter den Bedingungen labil ist, welche die O-tert.-Butyl-Gruppe nicht abspalten.
Eine geeignete Verknüpfungsgruppe ist die von dem oben angegebenen Fmoc-NH-Rink-Harz bereitgestellte. Durch die Entfernung des synthetisierten Peptids von dem Harz durch kurze Behandlung mit einer Säure geringer Konzentration, z.B. Trifluoressigsäure, wird der tert.-Butylether in der Seitenkette des synthetisierten Peptits nicht abgespalten.
Die Aminosäuren, die in einem derartigen Peptid enthalten sein können, umfassen die tert.-Butylether von beispielsweise Serin, D-Serin, Threonin, Tyrosin und Hydroxyprolin.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Festphasensynthese eine Peptids, das mindestens eine Aza-Aminosäure enthält, bereitgestellt, bei dem:
(i) ein aktiver Ester einer N-geschützten Aza-Aminosäure im Falle der Synthese eines eine C-terminale Aza- Aminosäure enthaltenden Peptids entweder mit einem geeigneten reaktiven festen Träger umgesetzt wird, oder im Falle der Synthese eines eine nicht-C- terminale Aza-Aminosäure enthaltenden Peptids mit einem Peptid, das an einen festen Träger gebunden ist,
(ii) eine herkömmliche Festphasen-Peptid-Synthese ohne die Verwendung von Schutzgruppen an den Seitenketten der Aminosäuren Serin, Arginin, Tyrosin, Threonin und Hydroxyprolin durchgeführt wird,
(iii) das Peptid von dem festen Träger abgespalten wird, und
(iv) das so gebildete Produkt mit Hydrazin umgesetzt wird, um sämtliche Acyl-Gruppe zu entfernen, die sich an Serin, Arginin, Tyrosin, Threonin oder Hydroxyprolin während der Synthese gebildet haben.
Geeignete aktivierte Gruppen und feste Träger sind die oben definierten.
Während der letzten Stufe dieses Verfahrens werden sämtliche acylierten Seitenketten-Gruppen, die gebildet wurden, durch das Hydrazin deacyliert.
Die Erfindung wird ohne Beschränkung durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:

Beisdiel 1

(a) Synthese von N¹-Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-N²- succinimido-oxy-carbonylhydrazin (Fmoc-Azgly-OSu)

Eine Lösung von 95%igem wäßrigen Hydrazin (1,28 ml) in Acetonitril (100 ml) wurde tropfenweise während 2 h bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von Fluoren-9- ylmethylsuccinimidocarbonat (Fmoc-OSu, 13,48 g) in Acetonitril (200 ml) gegeben, worauf das Gemisch weitere 16 h gerührt und dann filtriert wurde. Der feste Rückstand wurde mit einem 1:1 V/V Gemisch aus Acetonitril und Diethylether und dann mit Diethylether gewaschen und anschließend getrocknet. So ergab sich Fluoren-9-ylmethoxycarbonylhydrazin (Fmoc-Hydrazin, 7,81 g). Weitere 0,96 g dieses Material ergaben sich durch Konzentration des Filtrats und der Waschfraktionen und durch Filtration und Kristallisation der festen Rückstände aus Ethanol.
Das obige Fmoc-Hydrazin (8,77 g) und Disuccinimidocarbonat (9,72 g) wurden bei Raumtemperatur zu Acetonitril (150 ml) gegeben, worauf das Gemisch 10 min gerührt wurde, bis alles gelöst war und dann weitere 20 h, worauf zur Trockne eingedampft wurde. Eine Lösung des Rückstandes in Ethylacetat wurde nacheinander mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Wasser und gesättigter wäßriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Petrolether (Kp.: 60 - 80ºC) gerührt, worauf das Gemisch filtriert und der feste Rückstand getrocknet wurde. So ergab sich Fmoc-Azgly-OSu (11,81 g, 87 % Ausbeute), dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie, ¹H-NMR bei 250 MHz und Elementaranalyse bestätigt wurde.

(b) Bindung von Fmoc-Azgly-OSu an das Harz

Alle Festphasenreaktionen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers Biosearch 9500 durchgeführt. Bei allen Kupplungsreaktionen wurden 4 Moläquivalente der Acylierungs-Komponente verwendet.
4-(α-Fmoc-amino-2',4'-dimethoxybenzyl)phenoxy-polystyrolharz, das mit 1 % Divinylbenzol vernetzt war (Fmoc-NH-Rink- Harz, 1 g, 0,64 mäq/g) wurde mit einer 20%igen V/V Lösung von Piperidin in DMF zur Entfernung der Fmoc-Gruppe behandelt, mit DMF gewaschen und dann eine Stunde mit 4 Moläquivalenten Fmoc-Azgly-OSu in Form einer 0,2 molaren Lösung in DMF umgesetzt.

(c) Bildung des Decapeptids Goserelin

Die restlichen 9 Aminosäuren wurden nacheinander an das obige Harz angefügt, und zwar unter Betrieb des Synthesizers im automatischen Modus. In allen Fällen handelte es sich bei dem verwendeten Kupplungsmittel um Diisopropylcarbodiimid (DIPC), wobei die Aminosäuren (abgesehen von Glp, das in der letzten Stufe verwendet wird und nicht geschützt werden muß) am Amino-Ende durch Fmoc geschützt waren. Histidin (in Stufe 8 verwendet) wurde zweimal mit Fmoc geschützt. Bei sämtlichen anderen Aminosäuren mit einer funktionellen Gruppe in ihrer Seitenkette wurde keine Schutzgruppe verwendet. Die Reaktionsbedingungen wurden in jeder Stufe wie folgt leicht variiert:

(i) Anfügung von Pro

Die folgenden Arbeitsschritte wurden durchgeführt:
Waschen mit DMF
20 % Piperidin in DMF (2 min)
20 % Piperidin in DMF (8 min)
Waschen mit DMF
Fmoc-Pro-OH/DIPC/DMF
Waschen mit DMF

(ii) Anfügung von Arg

Obwohl im automatischen Modus gearbeitet wurde, wurde das Fortschreiten der Acylierung nach dem Verfahren von Kaiser (E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger & P. I. Cook, Anal. Biochem. (1970), 34, 595 - 598) verfolgt und diese verlängert, sofern erforderlich. Die folgenden Arbeitsschritte wurden durchgeführt:
Waschen mit DMF
20 % Piperidin in DMF (2 min)
20 % Piperidin in DMF (8 min)
Waschen mit DMF
Fmoc-Arg(HCl)-OH/DIPC/DMF (2,5 h)
Waschen mit DMF
Waschen mit 10 % DIEA/DMF (5 min)
Waschen mit DMF
Waschen mit 0,5 Molar HOBt/DMF (5 min)
Fmoc-Arg-(HCl)-OH/DIPC/DMF (1,5 h)
Waschen mit DMF

(iii) bis einschließlich (vii) - Anfügung von Leu, D- Ser(But), Tyr, Ser, Trp

Die folgenden Arbeitsschritte wurden durchgeführt:
Waschen mit DMF
20 % Piperidin in DMF (2 min)
20 % Piperidin in DMF (8 min)
Waschen mit DMF
Waschen mit 0,5 M HOBt/DMF (5 min)
Fmoc-(Aminosäure)-OH (die Aminosäuren in der Sequenz)/DIPC/DMF (1 h)

(viii) Anfügung von His

Die oben für (iii) bis (vii) angegebene Reaktionsreihenfolge wurde mit dem Unterschied wiederholt, daß das verhältnismäßig unlösliche Fmoc-His(Fmoc)-OH manuell statt automatisch hinzugefügt wurde.

(ix) Anfügung von Glp

Die oben für (iii) bis (vii) angegebene Reaktionsreihenfolge wurde wiederholt. Dann wurde das Harz mit DMF und schließlich mit Dichlormethan und dann getrocknet.

(d) Abspaltung des Pedtids vom Harz

Das wie oben beschrieben hergestellte Peptidharz (0,3 g) wurde zweimal jeweils 3 min lang bei Raumtemperatur mit einer Lösung von Trifluoressigsäure (200 µl) in Dichlormethan (10 ml) behandelt, worauf das Gemisch in ein Triethylamin (800 µl) enthaltendes Gefäß filtriert wurde. Das Harz wurde mit Dichlormethan und dann mit Methanol gewaschen, worauf die Kombination aus Filtrat und Waschfraktionen zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst, worauf die Lösung zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde in Wasser (20 ml) gelöst und mit 95%igem wäßrigen Hydrazin (100 µl) versetzt, worauf das Gemisch 2 h bei Labortemperatur gehalten wurde. Dann wurde das Gemisch filtriert, Acetonitril (ausreichend viel um 5 Vol.-% des Gemisches auszumachen) zu dem Filtrat gegeben und die Lösung direkt auf eine Umkehrphasenchromatographiesäule (Dynamax, C&sub1;&sub8;, 300 Å, 12 µm, 25 x 2,25 cm) gegeben. Die Säule wurde mit einem Gradienten (5 %, ansteigend auf 18 %, bezogen auf das Volumen) Acetonitril in Wasser, der 0,1 % Trifluoressigsäure enthielt, eluiert. Geeignete Fraktionen wurden gepoolt und lyophylisiert, und zwar unter Erhalt von Goserelin (73 mg), dessen Struktur durch Aminosäure-Analyse und Massenspektroskopie bestätigt wurde.

Beispiel 2

Synthese von N¹-Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-N²-methyl-N²- (succinimidooxycarbonyl)hydrazin (Fmoc-Azala-OSu)

Fmoc-OSu (16,86 g) wurde bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von N¹-Boc-N¹-methylhydrazin (7,31 g) in Acetonitril (75 ml) gegeben, worauf das Reaktionsgemisch 4,5 h auf Rückfluß erhitzt und dann weitere 72 h bei Raumtemperatur gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde zwischen Wasser und Dichlormethan ausgeschüttelt. Die Dichlormethan- Schicht wurde abgetrennt, mit gesättigter wäßriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Gummirückstand wurde in Chloroform (70 ml) gelöst, worauf die Lösung auf eine Silicagel-Säule (Merck Kieselgel 60/9385, 5 x 30 cm) geladen und mit Chloroform und im Anschluß daran mit Chloroform/Methanol (99,5/0,5 V/V) eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden gepoolt und zur Trockne eingedampft, und zwar unter Erhalt von N¹-tert.-Butoxycarbonyl-N¹-methyl-N²- (fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)hydrazid in Form eines gelben Gummis (8,75 g), dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie (MH&spplus; = 369) bestätigt wurde.
Eine 5,2 molare Lösung von Chlorwasserstoff in Ethylacetat (10 ml) wurde zu der gerührten Lösung des obigen Produkts (4,6 g) in Ethylacetat (15 ml) gegeben, und zwar bei Raumtemperatur. Nach 25 min hatte sich ein weißer Niederschlag gebildet. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet. So ergab sich N¹-Fluoren-9-yl-methoxycarbonyl-N²-methylhydrazin- (N¹-Fmoc- N²-methylhydrazin)-Hydrochlorid ((2,5 g), dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie (MH&spplus; = 269 bestätigt wurde).
Triethylamin (1,5 ml) und Bis-succinimidocarbonat (BSC, 2,56 g) wurden nacheinander zu einer gerührten Suspension des obigen Hydrazidhydrochlorids (3,05 g) in Acetonitril (30 ml) gegeben, und zwar bei Raumtemperatur. Dann wurden weitere Portionen zu 0,5 g BSC zu dem gerührten Reaktionsgemisch gegeben, nämlich nach 15 bzw. 30 min. Nach 2 h wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Ethylacetat (50 ml) und gesättigtem wäßrigen Natriumhydrogencarbonat erhitzt. Die Ethylacetat-Schicht wurde abgetrennt, mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und dann mit gesättigter wäßriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst, worauf die Lösung auf eine Silicagel-Säule (Merck Kieselgel 60/9385, 40 x 2 cm) geladen und nacheinander mit Chloroform, Chloroform/Methanol (99,5:0,5 V/V) und Chloroform/Methanol (99:1 V/V) eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurde gepoolt und unter Erhalt von Fmoc-Azala-OSu zur Trockene eingedampft, das sich in Form eines weißen Schaums (2,8 g) ergab, dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie (MH&spplus; = 410) bestätigt wurde.

Beispiel 3

Synthese von N¹-Fluoren-9 -ylmethoxycarbonyl-N²-methyl-N²- benzyl-N2-succinimido-oxycarbonylhydrazin (Fmoc-Azphe-OSu)

Eine Lösung von N¹-tert.-Butoxycarbonyl-N¹-benzylhydrazin (8,84 g) in Acetonitril (20 ml) wurde zu einer Lösung von Fmoc-OSu (13,43 g) in Acetonitril (150 ml) gegeben, worauf das Reaktionsgemisch 10 h unter Rückfluß erhitzt und dann zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde zwischen Chloroform und Wasser ausgeschüttelt, und die Chloroform- Schicht wurd abgetrennt, zweimal mit Wasser und dann mit gesättigter wäßriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Chloroform und Ethylacetat (98:2, V/V) gelöst, worauf die Lösung auf eine Silicagel-Säule (Merck Kieselgel 60/9385, 35 x 4 cm) geladen und mit Chloroform/Ethylacetat (98:2, V/V) eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden kombiniert und zur Trockne eingedampft, so daß sich N¹-Fmoc-N²-benzyl-N²-Bochydrazin in Form eines weißen kristallinen Feststoffs (16,5 g) ergab, dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie (MH&spplus; = 445) bestätigt wurde.
Eine 5,2 molare Lösung von Chlorwasserstoff in Ethylacetat (50 ml) wurde zu einer Lösung des obigen Hydrazids (16,4 g) in Ethylacetat (50 ml) gegeben, worauf das Gemisch 1 h bei Raumtemperatur gehalten und dann zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (60 ml) gelöst, wodurch langsam ein gelatineartiger Feststoff ausfiel. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Ethylacetat und dann mit Diethylether gewaschen und schließlich getrocknet, und zwar unter Erhalt von N¹-Fmoc-N²-benzylhydrazin-Hydrochlorid (9,57 g), dessen Struktur durch FAB- Massenspektroskopie (MH&spplus; = 345) bestätigt wurde.
Triethylamin (1,4 ml) und Bis-succinimidocarbonat (BSC, 2,56 g) wurden zu einer gerührten Suspension des obigen Hydrazidhydrochlorids (3,81 g) in Acetonitril (100 ml) gegeben, worauf bei Raumtemperatur weiter gerührt wurde. Dann wurden weitere Mengen BSC (1,2 g und 1,0 g) in Intervallen zu einer Stunde dazugegeben. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in einem geringen Volumen eines Gemisch aus Ethylacetat und Petrolether (Kp.: 60 - 80ºC) (45:55 V/V) gelöst. Die Lösung wurde auf eine Silicagelsäule (Merck Kieselgel 60/9385, 30 x 3 cm) geladen und mit dem gleichen Ethylacetat/Petrolether- Gemisch eluiert. Geeignete Fraktionen wurden gepoolt und zur Trockne eingedampft, und zwar unter Erhalt von Fmoc- Azphe-OSu in Form eines verfestigten Gummis (3,8 g), dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie (MH&spplus; = 486) bestätigt wurde.

Beispiel 4

Synthese von N¹-Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-N²-methyl-N²- benzotriazol-1-yloxycarbonylhydrazin (Fmoc-Azala-OBt)

Bis-benzotriazol-1-yl-carbonat (4,23 g) wurde zu einer gerührten Suspension von N¹-Fmoc-N¹-methylhydrazin- Hydrochlorid (3,05 g) und Triethylamin (1,4 ml) in Acetonitril (50 ml) gegeben, wodurch die Suspension rasch klar wurde. Das Gemisch wurde 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Der feste Rückstand wurde mit Acetonitril und dann mit Diethylether gewaschen, und schließlich getrocknet. So ergab sich Fmoc-Azala-OBt in Form eines amorphen Feststoffs (1,56 g), dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie (MH&spplus; = 430) bestätigt wurde.

Beispiel 5

Synthese von N¹-Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-N²-benzyl-N²- benzotriazol-1-yloxycarbonylhydrazin (Fmoc-Azphe-OBt)

Bis-benzotriazol-1-yl-carbonat (4,23 g) wurde zu einer gerührten Suspension von Triethylamin (1,40 ml) und N¹- Fmoc-N²-benzylhydrazin-Hydrochlorid (3,81 g) in Acetonitril (50 ml) gegeben, worauf das Gemisch bei Raumtemperatur 3 h gerührt und dann zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde in einem 1:2 V/V Gemisch aus Ethylacetat und Petrolether (Kp.: 60 - 80ºC) gelöst und dann auf eine Silicagelsäule (Merck Kieselgel 60/9385, 35 x 3 cm) geladen und mit dem gleichen Ethylacetat/Petrolether-Gemisch eluiert. Geeignete Fraktionen wurden gepoolt und zur Trockne eingedampft, und zwar unter Erhalt von Fmoc-Azphe- OBt in Form eines weißen Schaums (2,6 g), dessen Struktur durch FAB-Massenspektroskopie (MH&spplus; = 506) bestätigt wurde.

Claims

1. Verfahren zur Festphasen-Synthese eines Peptids, das mindestens eine Aza-Aminosäure enthält, bei dem:

(i) ein aktiver Ester oder ein Imidazolid einer N- geschützten Aza-Aminosäure im Falle der Synthese eines eine C-terminale Aza-Aminosäure enthaltenden Peptids entweder mit einem geeigneten reaktiven festen Träger umgesetzt wird, oder im Falle der Synthese eines eine nicht-C-terminale Aza-Aminosäure enthaltenden Peptids mit einem Peptids, das an einen festen Träger gebunden ist,

(ii) weitere herkömmliche Schritte zur Festphasen- Peptid-Synthese zur aufeinanderfolgenden Anfügung weiterer Aminosäuren durchgeführt werden, so daß ein an den festen Träger gebundenes Peptid mit der erforderlichen Aminosäure-Sequenz gebildet wird, und

(iii) das Peptid von dem festen Träger abgespalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Festphasensynthese eines Peptids, das mindestens ein C-terminales Azaglycin-, Azaalanin- oder Azaphenylalaninamid enthält, bei dem:

(i) ein aktiver Ester oder ein Imidazolid von N- geschütztem Azaglycin, Azaalanin oder Azaphenylalanin mit einem geeigneten reaktiven festen Träger umgesetzt wird,

(ii) weitere herkömmliche Schritte zur Festphasen- Peptid-Synthese durchgeführt werden, um nacheinander weitere Aminosäuren anzufügen, so daß ein an den festen Träger gebundenes Peptid mit der erforderlichen Aminosäure-Sequenz gebildet wird,

(iii) das Peptid von dem festen Träger abgespalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Festphasensynthese von Goserelin, bei dem:

(i) ein aktiver Ester oder ein Imidazolid von N- geschütztem Azaglycin mit einem geeigneten reaktiven festen Träger umgesetzt wird,

(ii) weitere herkömmliche Schritte zur Festphasen- Peptid-Synthese durchgeführt werden, um nacheinander Prolin, Arginin, Leucin, O-tert.-Butyl- D-serin, Tyrosin, Serin, Trypthophan, Histidin und Pyroglutaminsäure anzufügen, so daß an den festen Träger gebundenes Goserelin gebildet wird, und

(iii) das Goserelin von dem festen Träger durch Säurebehandlung abgespalten wird.

4. Verfahren zur Festphasensynthese eines Peptids, das mindestens eine Aza-Aminosäure enthält, bei dem:

(i) ein aktiver Ester oder ein Imidazolid einer N- geschützten Aza-Aminosäure im Falle der Synthese eines eine C-terminale Aza-Aminosäure enthaltenden Peptids entweder mit einem geeigneten reaktiven festen Träger umgesetzt wird, oder im Falle der Synthese eines eine nicht-C-terminale Aza-Aminosäure enthaltenden Peptids mit einem Peptid, das an einen festen Träger gebunden ist,

(ii) eine herkömmliche Festphasen-Peptid-Synthese ohne die Verwendung von Schutzgruppen an den Seitenketten der Aminosäuren Serin, Arginin, Tyrosin, Threonin und Hydroxyprolin durchgeführt wird,

(iii) das Peptid von dem festen Träger abgespalten wird, und

(iv) das so gebildete Produkt mit Hydrazin zur Entfernung sämtlicher Acyl-Gruppen umgesetzt wird, die sich an Serin, Arginin, Tyrosin, Threonin oder Hydroxyprolin während der Synthese gebildet haben.

5. Verfahren nach Anspruch 4 zur Festphasensynthese eines Peptids, das ein C-terminales Azaglycin-, Azaalanin- oder Azaphenylalaninamid enthält, bei dem:

(ii) eine herkömmliche Festphasen-Peptid-Synthese ohne Verwendung von Schutzgruppen an den Seitenketten der Aminosäuren Serin, Arginin, Tyrosin, Threonin und Hydroxyprolin durchgeführt wird,

(iii) das Peptid von dem festen Träger abgespalten wird, und

(iv) das so gebildete Produkt mit Hydrazin zur Entfernung sämtlicher Acyl-Gruppen umgesetzt wird, die sich während der Synthese an Serin, Arginin, Tyrosin, Threonin oder Hydroxyprolin gebildet haben.

6. Verfahren nach Anspruch 4 zur Festphasensynthese von Goserelin, bei dem:

(iii) das Peptid von dem festen Träger durch Säurebehandlung abgespalten wird,

7. Aktive N-geschützte Azaaminoacylester, die sich zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche eignen, ausgewählt unter Fmoc- Azgly-OSu, Fmoc-Azala-OSu, Fmoc-Azphe-OSu, Fmoc-Azala- OBt und Fmoc-Azphe-OBt.