KR20170014624A - Tdm-621의 제조방법 - Google Patents

Tdm-621의 제조방법 Download PDF

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윤희균
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Abstract

본 발명은 TDM-621의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 종래의 고체상 합성방법에 따른 문제점을 해결하여, 비교적 간단한 방법으로 고순도 및 고수율로 TDM-621을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규 TDM-621의 제조방법은 상업적 대량생산에 적합한 이점이 있다.

Description

TDM-621의 제조방법{Method of preparing TDM-621}
본 발명은 TDM-621의 제조방법에 관한 것이다.
TDM-621은 16개의 아미노산 서열(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)을 지닌 달팽이에서 추출한 천연 유래물질이며, 외과 수술시 사용하는 국부 지혈제로 유럽 식약처(EMEA)에 등록된 의료기기이다.
펩타이드 합성방법에는 통상 고체상(Solid-Phase) 합성방법과 액체상(Solution-Phase) 합성방법이 있다. 고체상 합성방법은 아미노산을 순차적으로 고체 지지체에 부착시켜 아미노산 서열의 합성을 완료하고, 지지체로부터 분리하여 원하는 펩타이드를 얻는다. 고체상 합성방법은 반응속도가 빠르고 부산물이 적으며, 자동화가 용이하다는 장점이 있다. 그러나, 고체상 합성방법은 펩타이드 합성 시 과량의 원료가 필요하고, 서열이 증가하면 합성의 난이도가 높아지며, 유연물질이 증가하고, 합성 시간 및 원료 사용량이 기하급수적으로 증가한다는 단점이 있다.
한편, 액체상 합성방법은 통상의 유기 합성방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반응 단계수가 많고 복잡하다는 단점이 있다. 또한, 각 단계에 따라 중간체를 유리해야 하고, 합성 과정 중에 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 문제가 있다.
현재 통상의 긴 서열의 펩타이드 합성 시에는 주로 고체상 합성방법을 통하여 제조하고 있으며, TDM-621 역시 고체상 합성방법에 의하여 제조되고 있다. 그러나, TDM-621과 같이 서열의 길이가 증가하는 경우에는 합성의 난이도가 증가하며, TDM-621과 구조가 비슷하여 분리가 어려운 유연물질이 과량 생기게 되어 정제가 매우 어려운 문제가 있다.
따라서, 합성 과정이 비교적 간단하면서도, 고순도 및 고수율의 TDM-621을 생산할 수 있는, 새로운 제조방법이 필요하다.
미국 특허 등록 제5670483호
본 발명은 상기의 기술적 과제를 해결하기 위한 것으로, 고순도 및 고수율의 TDM-621의 제조방법에 관한 것에 관한 것이다.
본 발명은, 하기 화학식 II로 표시되는 펩타이드 및 하기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드를 액체상(solution-phase) 합성 방법으로 커플링 반응시켜 하기 화학식 VII로 표시되는 펩타이드를 수득하고 탈보호화 하는 것을 포함하는 TDM-621의 제조방법을 제공한다.
[화학식 II]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
[화학식 VI]
H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
[화학식 VII]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
본 발명에 따르면, 종래의 고체상 합성방법에 따른 문제점을 해결하여, 비교적 간단한 방법으로 고순도 및 고수율로 TDM-621을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규 TDM-621의 제조방법은 상업적 대량생산에 적합한 이점이 있다.
도 1은 하기 실시예에서 제조된 중간체인 화학식 II의 펩타이드의 NMR 데이터를 보여준다.
도 2는 하기 실시예에서 제조된 중간체인 화학식 II의 펩타이드의 mass 데이터를 보여준다.
도 3은 하기 실시예에서 제조된 중간체인 화학식 VI의 펩타이드의 NMR 데이터를 보여준다.
도 4는 하기 실시예에서 제조된 중간체인 화학식 VI의 펩타이드의 mass 데이터를 보여준다.
도 5는 하기 실시예에서 제조된 TDM-621의 NMR 데이터를 보여준다.
도 6은 하기 실시예에서 제조된 TDM-621의 mass 데이터를 보여준다.
본 발명자들은 TDM-621의 제조에 있어서, 종래의 고체상 합성방법의 문제점을 개선하기 위한 방법을 연구한 결과, 고체상 합성방법 및 액체상 합성방법을 이용하는 경우 고순도의 TDM-621을 고수율로 제조할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다. 구체적으로, 고체상 합성방법 및 액체상 합성방법을 이용하여 새로운 중간체들(하기 화학식 II 및 하기 화학식 VI 참조)을 제조하고, 이들 중간체들을 액체상 합성방법을 이용하여 반응시켜 최종 산물이 TDM-621을 제조한다.
이하에서는, 이해의 편의를 위하여 중간체의 제조방법에서부터 순차적으로 기술하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명에서 사용되는 중간체들은 공지의 임의의 방법을 이용하여 제조하여도 무방하다.
용어의 정리
본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회(Commission of biochemical nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다.
본 명세서에서 사용한 약어는 다음과 같다:
Ala: 알리닌(Alanine)
Arg: 아르기닌(Arginine)
Asp: 아스파테이트(Aspartate)
Ac: 아세틸(acetyl)
Boc: t-부틸옥시카보닐(t-butyloxycarbonyl)
tBu: t-부틸(t-butyl)
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시옥시카보닐 (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐(2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)
본 명세서에서 사용된 작용기 및 보호기 R의 종류는 다음과 같다:
R1: 수소, 또는 아민기 보호기
R2: 수소, 또는 구아니딘 보호기
R3: 수소, 또는 하이드록시기 보호기
R4: 수소, 또는 하이드록시기 보호기
R5: 수소, 또는 아민기 보호기
(1) 화학식 I로 표시되는 펩타이드의 제조
하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상 합성방법을 사용하여 제조할 수 있다(Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. , 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem., 34:595-598(1970)). 요약하면, 레진에 아미노기가 보호화된 아미노산을 결합시킨 후 아미노기의 보호기를 제거한 후에 다시 아미노기가 보호화된 아미노산을 합성시켜 원하는 서열의 펩타이드를 합성할 수 있다.
레진은 제조되는 서열의 펩타이드의 측쇄 보호기를 보존 시킬 수 있을 만큼 온화한 산성조건에서 쉽게 분해될 수 있는 일반적인 레진을 사용할 수 있다.
아미노산 보호기 또는 측쇄 작용기의 보호기를 선택하는 경우에는 반응상에서 보호기가 노출되는 조건과 분자 내 작용기를 고려하여야 한다. 각각의 보호기와 분자 내 작용기는 서로 다른 보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, 커플링 반응에서 탈보호화 반응이 일어나지 않아야 하며, 원하는 서열을 합성 후 레진에서 분리하는 조건 및 시약에 대해 안정해야 한다.
[화학식 I]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-레진
(2) 화학식 II(중간체 I)로 표시되는 펩타이드의 제조
화학식 II로 표시되는 펩타이드는 상기 단계 (1)에서 얻은 펩타이드로부터 온화한 산성 조건하에서 레진을 제거하여 얻을 수 있다. 이때 산성조건은 아미노산 서열의 측쇄보호기를 보존 시킬 수 있을 만큼 온화한 조건이어야 한다.
예를 들어, 온화한 산성 조건으로, 유기 용매 및 산을 포함하는 혼합물의 존재 하에서 레진을 제거할 수 있다. 산 및 유기 용매는 당업계에서 통상적으로 사용되는 산 및 유기 용매를 사용할 수 있으며, 산은 예를 들어 아세트산, 디클로로아세트산, 아미노옥시아세트산, 트리플루오로아세트산 등의 각종 아세트산, 염산, 질산 및 황산 등일 수 있고, 유기 용매는 디클로로메탄, 디클로로에탄, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메탄올 및 에탄올 등일 수 있다.
[화학식 II]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
(3) 화학식 III으로 표시되는 펩타이드의 제조
상기 단계 (1)과 동일한 방법으로 고체상 합성방법을 이용하여 하기 화학식 III으로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 합성할 수 있다.
[화학식 III]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-레진
(4) 화학식 IV로 표시되는 펩타이드의 제조
상기 단계 (2)와 동일한 방법으로 화학식 III의 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 IV로 표시되는 펩타이드를 합성할 수 있다.
[화학식 IV]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-R4
(5) 화학식 V로 표시되는 펩타이드 제조
화학식 V로 표시되는 펩타이드는 액체상 합성방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 단계 (4)에서 얻은 화학식 IV로 표시되는 펩타이드 및 H-Ala-NHR5를 커플링 시약으로 반응시켜 화학식 V로 표시되는 펩타이드를 합성할 수 있다.
[화학식 V]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
커플링 반응은 -5 내지 45℃의 온도 조건 하에서, 커플링 시약 및 유기 용매의 존재 하에서 수행될 수 있으며, 추가로 염기의 존재 하에서 수행될 수도 있다.
통상의 레진에서 C-말단의 작용기를 NHR5로 얻기 위해서는 측쇄 보호기를 보존하지 못하는 가혹한 산성조건 하에서 레진을 제거해야 하므로 고체상 합성방법의 적용이 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 고체상 합성방법으로 7개의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(화학식 IV로 표시되는 펩타이드)를 제조하고, 액체상 합성방법으로 여기에 C-말단이 NHR5인 Ala 을 도입하여 8개의 아미노산 서열을 포함하는 화학식 V의 펩타이드를 합성한다.
(6) 화학식 VI(중간체 II)로 표시되는 펩타이드의 제조
상기 단계 (5)에서 수득한 화학식 V의 펩타이드를 탈보호화, 즉, N-말단 보호기를 제거하여 화학식 VI로 표시되는 펩타이드를 합성할 수 있다.
[화학식 VI]
H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
탈보호화는 통상의 염기, 구체적으로 유기계 염기의 존재 하에서 수행될 수 있다. 염기는, 이에 제한되는 것은 아니나, 피페리딘(piperidine), N,N'-디이소프로필에틸아민(N,N'-diisopropylethylamine: DIPEA) 및 1,8-디아자바이사이클로운덱-7-엔(1,8-diazabicycloundec-7-ene: DBU)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 피페리딘 및 DIPEA일 수 있으며, 피페리딘이 바람직하다.
(7) 화학식 VII로 표시되는 펩타이드의 제조
화학식 VII로 표시되는 펩타이드는 상기 단계 (5)과 동일하게 액체상 합성방법을 이용하여 합성할 수 있다. 상기 단계 (2)에서 얻은 중간체 I 및 상기 단계 (6)에서 얻은 중간체 II를 커플링 반응을 통하여 결합하여 화학식 VII로 표시되는 펩타이드를 합성할 수 있다.
[화학식 VII]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
커플링 반응은 -5 내지 45℃의 온도 조건 하에서, 커플링 시약 및 유기 용매의 존재 하에서 수행될 수 있으며, 추가로 염기의 존재 하에서 수행될 수도 있다.
(8) TDM-621의 제조
TDM-621은 상기 단계 (7)에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 탈보호화하여 합성할 수 있다.
탈보호화는 산 및 안정화제를 포함하는 혼합물의 존재 하에서 수행될 수 있다. 산은, 통상의 유기산, 무기산을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 아세트산, 디클로로아세트산, 아미노옥시아세트산, 트리플루오로아세트산 등의 각종 아세트산, 염산, 질산, 황산 등을 포함한다. 안정화제는, 통상의 안정화제를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 물, 티오아니솔, 트리이소프로필렌, 페놀, 에탄디티올, 또는 2 종 이상의 이들의 혼합물 등을 포함한다.
한 구체예에서, 탈보호화는 트리플루오로아세트산, 물, 페놀, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합물; 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물; 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌, 물 및 에탄디티올의 혼합물; 하에서 가능하며, 예를 들어, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 하에서 수행될 수 있다.
상기 내용을 바탕으로 TDM-621을 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다(반응식 1).
[반응식 1]
Figure pat00001
따라서, 본 발명은 하기 화학식 II로 표시되는 펩타이드 및 하기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드를 액체상(solution-phase) 합성 방법으로 커플링 반응시켜 하기 화학식 VII로 표시되는 펩타이드를 수득하고 탈보호화 하는 것을 포함하는 TDM-621의 제조방법을 제공한다.
[화학식 II]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
[화학식 VI]
H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
[화학식 VII]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
한 구체예에서, 화학식 II로 표시되는 펩타이드는 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 하기 화학식 I로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하고 상기 레진을 제거하여 수득될 수 있다.
[화학식 I]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-레진
상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, 및 R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기이다.
상기 단계에서, 탈보호화는 예를 들어, 산 및 안정화제를 포함하는 혼합물의 존재 하에서 수행될 수 있다. 산은, 통상의 유기산, 무기산 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 아세트산, 디클로로아세트산, 아미노옥시아세트산, 트리플루오로아세트산 등의 각종 아세트산, 염산, 질산, 황산 등을 포함한다. 안정화제는, 통상의 안정화제를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 물, 티오아니솔, 트리이소프로필렌, 페놀, 에탄디티올, 또는 2 종 이상의 이들의 혼합물 등을 포함한다.
한 구체예에서, 탈보호화는 트리플루오로아세트산, 물, 페놀, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합물; 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물; 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌, 물 및 에탄디티올의 혼합물; 하에서 가능하며, 예를 들어, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 하에서 수행될 수 있다.
한 구체예에서, 화학식 VI로 표시되는 펩타이드는
고체상 합성 방법으로 하기 화학식 III으로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하는 제1단계;
상기 제1단계에서 제조된 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 IV로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제2단계:
상기 제2단계에서 제조된 펩타이드 및 H-Ala-NHR5를 액체상 합성 방법으로 커플링 반응시켜 하기 화학식 V로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제3단계; 및
상기 제3단계에서 제조된 펩타이드를 탈보호화하는 제4단계를 포함하여 수득될 수 있다.
[화학식 III]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-레진
[화학식 IV]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-R4
[화학식 V]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
상기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드의 제조의 한 구체예에 있어서, 탈보호화는 염기의 존재 하에서 수행될 수 있다. 염기는 통상의 염기, 구체적으로 유기계 염기를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 피페리딘(piperidine), N,N'-디이소프로필에틸아민(N,N'-diisopropylethylamine: DIPEA) 및 1,8-디아자바이사이클로운덱-7-엔(1,8-diazabicycloundec-7-ene: DBU)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 피페리딘 및 DIPEA일 수 있으며, 피페리딘이 바람직하다.
한 구체예에서, R1은 이에 제한되는 것은 아니나, 수소, 카복시벤질기, 벤질옥시카바메이트기, t-부틸카바메이트기, 아세틸기, 벤질기, 파라메톡시 페닐기, 벤질아민기, 트리플루오로아세트아미드기, 포름 아미드기 및 메틸 카바메이트기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
R2는 이에 제한되는 것은 아니나, t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기, 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기 및 토루엔설포닐기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, R2는 t-부틸옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기일 수 있으며, 또는 t-부틸옥시카보닐기일 수 있다.
R3 내지 R5는 각각 독립적으로 t-부틸기, 메틸기, 에틸기 등을 포한하는 탄소수 1 내지 8의 알킬기, 트리메틸실릴에테르기, 트리에틸에테르기, 트리이소프로필실릴에테르기, t-부틸디페닐실릴에테르기, 아세테이트기, 벤질에테르기, 벤조에이트기, 4-메톡시벤질에테르기, 2-나프틸메틸에테르기, 메톡시메틸아세탈기, 2-메톡시에톡시메틸에테르기, 에톡시에틸아세탈기, 메톡시프로필아세탈기 및 벤질옥시메틸아세탈기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
한 구체예에서, 레진은 이에 제한되는 것은 아니나, 트리틸클로라이드 레진, 2-클로로트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진일 수 있다. 예를 들어, 레진은 트리틸클로라이드 레진 또는 2-클로로트리틸 레진일 수 있으며, 바람직하게는 2-클로로트리틸 레진일 수 있다.
한 구체예에서, 레진의 제거는 온화한 산성 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 유기 용매 및 산을 포함하는 혼합물의 존재 하에서 수행될 수 있다. 레진의 제거에 사용되는 유기 용매 및 산의 종류는 특별히 제한되지 않고, 통상의 유기산, 무기산, 유기 용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 산은, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 아세트산, 디클로로아세트산, 아미노옥시아세트산, 트리플루오로아세트산 등의 각종 아세트산, 염산, 질산 및 황산 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 유기 용매는 이에 제한되는 것은 아니나, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메탄올 및 에탄올 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 한 구체예에서, 레진의 제거는 0.1 내지 100 부피%, 0.5 내지 80 부피%, 0.5 내지 50 부피%, 0.5 내지 30 부피%, 0.5 내지 20 부피%, 0.5 내지 15 부피% 또는 0.5 내지 10 부피%의 산이 포함된 유기 용매 하에서 수행될 수 있다. 상기 조건에서, 레진의 아미노산 서열의 측쇄 보호기를 보존하면서 레진을 제거할 수 있다.
한 구체예에서, 커플링 반응은 유기 용매 및 커플링 시약의 존재 하에서 수행될 수 있다. 또한, 필요한 경우, 염기를 추가로 포함하는 조건 하에서 커플링 반응을 수행할 수 있다.
한 구체예에서, 유기 용매는 디메틸설폭시드(DMSO), N-메틸포름아미드(NMP), N-메틸피롤리돈, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄, 디클로로에탄 및 클로로포름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 유기 용매는 DMSO, NMP 및 DMF, DMAC(디메틸아세트아마이드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, DMF 또는 DMSO일 수 있고, DMF가 바람직하다.
한 구체예에서, 커플링 시약은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide: DCC), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide: DIC), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate: BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate: PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate: HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate: TBTU), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate: HATU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(0-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate: TATU), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole: CDI), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 (3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one: DEPBT), 브로모-트리스-피롤이디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate: PyBrOP), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸 (1-hydroxy-7-azabenzotriazole: HOAt), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole: HOBt), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate: HBTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(3,4-디하이드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)유라니움 테트라플루오로보레이트 (N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)uranium tetrafluoroborate: TDBTU), O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸 우라니움 테트라플루오로보레이트 (O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyl uranium tetrafluoroborate: TSTU), 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 헥사플루오로포스페이트(2-(6-chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate: HCTU) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride: EDC.HCl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, HATU 및 HOBt의 혼합물, HBTU 및 HOBt의 혼합물일 수 있으며, HATU 및 HOBt의 혼합물이 바람직하다.
한 구체예에서, 염기는 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 트라이에틸아민 등의 아민 염기, 피페리딘, 피롤리딘, 피리딘, N-메틸모르폴린(NMM) 및 콜리딘(Collidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, DIPEA 또는 콜리딘일 수 있으며, DIPEA가 바람직하다.
한 구체예에서, 커플링 반응은 -5 내지 45℃, 또는 0 내지 25℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 고체상 합성방법과 액체상 합성방법을 결합하여 손쉽고 경제적으로 TDM-621을 제조할 수 있다. 또한, 순도 높은 TDM-621의 생산이 가능하여 분리 및 정제가 용이해지므로 대량생산에도 적합하다.
본 발명은 또한, 하기 화학식 II로 표시되는 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
[화학식 II]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기이다.
상기 화학식 II로 표시되는 펩타이드 및 이의 제조방법은, TDM-621의 제조 과정에서 화학식 II로 표시되는 펩타이드 및 이의 제조방법과 관련하여 기술된 내용이 모두 적용 또는 준용될 수 있다.
본 발명은 또한, 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 하기 화학식 I로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하고 상기 레진을 제거하는 것을 포함하는 하기 화학식 II로 표시되는 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
[화학식 I]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-레진
[화학식 II]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기이다.
본 발명은 또한, 하기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드를 제공한다.
[화학식 VI]
H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
상기 화학식에서, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
본 발명은 또한, 고체상 합성 방법으로 하기 화학식 III으로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하는 제1단계;
상기 제1단계에서 제조된 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 IV로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제2단계:
상기 제2단계에서 제조된 펩타이드 및 H-Ala-NHR5를 액체상 합성 방법으로 커플링 반응시켜 하기 화학식 V로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제3단계; 및
상기 제3단계에서 제조된 펩타이드를 탈보호화하는 제4단계를 포함하는 하기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
[화학식 III]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-레진
[화학식 IV]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-R4
[화학식 V]
R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
[화학식 VI]
H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
상기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드 및 이의 제조방법은, TDM-621의 제조 과정에서 화학식 VI로 표시되는 펩타이드 및 이의 제조방법과 관련하여 기술된 내용이 모두 적용 또는 준용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 ]
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %를 의미한다.
[ 실시예 1] TDM-621의 제조
[ 실시예 1-1] Ac-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-2-클로로트리틸 레진(화학식 I)의 제조
(a) 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-2-클로로트리틸 레진의 제조
여과막이 장착된 고상(solid-phase)합성 반응기(부일켐택)에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(f=1.24 mmol/g의 레진, 10g, 사이언스엣홈) 및 디클로로메탄 (100㎖, 대정화금)을 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다.
용매가 제거된 레진에 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (11.58 g, 37.2mmol, 3.0당량, GLBiochem Ltd.)이 포함된 디클로로메탄(100ml)을 첨가하고, 이어서 디이소프로필에틸아민(12.96ml, 74.4mmol, 6.0당량, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물에 메탄올(10ml, 디클로로메탄의 10%, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회, N,N-디메틸포름아미드로 3회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(b) H-Ala-2-클로로트리틸 레진의 제조
상기 반응 (a)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-2-클로로트리틸 레진에 10% (v/v) 피페리딘(대정화금)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(100ml)를 넣어 20분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드 100ml로 3회, 디클로로메탄 100ml로 3회 세척하여 H-Ala-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(c) 9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-Ala-2-클로로트리틸 레진의 제조
상기 반응 (b)에서 얻은 H-Ala-2-클로로트리틸 레진에 9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-OH (10.2g, 24.8mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(3.35 g, 24.8 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 24.8mmol, 2당량, GL Biochem Ltd.)를 포함하는 N,N-디메틸포름아미드(100ml)를 가하고, 디이소프로필에틸아민(8.64ml, 49.6mmol, 4당량, 대정화금) 을 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 N,N-디메틸포름아미드 100ml로 3회, 디클로로메탄 100ml로 3회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-Ala-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(d) H-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-2-클로로트리틸 레진의 제조
상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 서열을 순차적으로 결합하였다.
9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (7.72g, 24.8mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(3.35 g, 24.8 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 24.8mmol, 2당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필에틸아민(8.64ml, 49.6mmol, 4당량, 대정화금), 1시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH (16.09g, 24.8mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(3.35 g, 24.8 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 24.8mmol, 2당량, GL Biochem Ltd.), Collidine(6.56ml, 49.6mmol, 4당량, 대정화금), 2시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (7.72g, 24.8mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(3.35 g, 24.8 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 24.8mmol, 2당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필에틸아민(8.64ml, 49.6mmol, 4당량, 대정화금), 1시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-OH (10.2g, 24.8mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(3.35 g, 24.8 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 24.8mmol, 2당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필에틸아민(8.64ml, 49.6mmol, 4당량, 대정화금), 2시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (9.65g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(4.19g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 31.0mmol, 2.5당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필에틸아민(10.8ml, 62.0mmol, 5당량, 대정화금), 1시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH (20.11g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(4.19g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 31.0mmol, 2.5당량, GL Biochem Ltd.), Collidine(8.20ml, 62.0mmol, 5당량, 대정화금), 4시간 반응
(e) Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-2-클로로트리틸 레진의 제조
상기 반응 (d)에서 얻은 H-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-2-클로로트리틸 레진에 아세틱언하이드라이드 (6.3ml, 62.0mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.)를 포함하는 N,N-디메틸포름아미드(100ml)를 가하고, 디이소프로필에틸아민(8.64ml, 49.6mmol, 4당량, 대정화금) 을 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 N,N-디메틸포름아미드 100ml로 3회, 디클로로메탄 100ml로 3회 세척하여 Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
[ 실시예 1-2] Ac-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-OH(화학식 II)의 제조
상기 실시예 1-1에서 얻은 펩타이드에 디클로로메탄:트리플루오로아세트산=98.5:1.5의 혼합액 (300 ㎖)을 넣고 30분 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 반응기 1에 모았다. 남은 레진에 다시 디클로로메탄:트리플루오로아세트산=98.5:1.5의 혼합액 (300 ㎖)을 넣고 30분 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 반응기 1에 모았다. 반응기 1에 이소프로필에테르(4.5L)를 적가하고, 1시간 동안 교반한 후 여과 및 실온 진공건조를 진행하여 18.3g의 펩타이드를 얻었다. 수율은 98%였고, HPLC 순도는 96.60%였다.
얻어진 펩타이드의 NMR 데이터 및 mass데이터를 확인하여, 도 1(NMR 데이터) 및 도 2(mass 데이터)에 나타내었다.
[ 실시예 1-3] 9- 플루오레닐옥시카보닐 -Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg( Pbf )-Ala-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진(화학식 III)의 제조
(a) 9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진의 제조
여과막이 장착된 고상(solid-phase)합성 반응기(부일켐택)에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(f=1.24 mmol/g의레진, 10g, 사이언스엣홈) 및 디클로로메탄 (100㎖, 대정화금)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다.
상기 용매가 제거된 레진에 9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-OH (15.3g, 37.2mmol, 3.0당량, GLBiochem Ltd.)이 포함된 디클로로메탄(100ml)을 가하고, 이어서 디이소프로필에틸아민(12.96ml, 74.4mmol, 6.0당량, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물에 메탄올(10ml, 디클로로메탄의 10%, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 30분간 반응시켰다.
상기 반응결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회, N,N-디메틸포름아미드로 3회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(b) H-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진의 제조
상기 반응 (a)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진에 10% (v/v) 피페리딘(대정화금)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(100ml)를 가하고, 20분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과 하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드 100ml로 3회, 디클로로메탄 100ml로 3회 세척하여 H-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(C) 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진의 제조
상기 반응 (b)에서 얻은 H-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진에 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (9.65g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(4.19g, 31.0 mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 11.76g, 31.0mmol, 2.5당량, GL Biochem Ltd.)를 포함한 N,N-디메틸포름아미드(100ml)를 가하고, 디이소프로필에틸아민(8.64ml, 62.0mmol, 5당량, 대정화금) 을 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드 100ml로 3회, 디클로로메탄 100ml로 3회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(d) 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-2-클로로트리틸 레진의 제조
상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 서열을 순차적으로 결합하였다.
9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH (20.11g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(4.19g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 11.76g, 31.0mmol, 2.5당량, GL Biochem Ltd.), Collidine(8.19ml, 62.0mmol, 5당량, 대정화금), 1시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (7.72g, 24.8mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(3.35 g, 24.8 mmol, 2 당량), GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 24.8mmol, 2당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필에틸아민(8.64ml, 49.6mmol, 4당량, 대정화금), 1시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-OH (12.75g, 31.0mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(4.19 g, 31.0 mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 11.76g, 31.0mmol, 2.5당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필에틸아민(10.80ml, 62.0mmol, 5당량, 대정화금), 2시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (11.58g, 37.2mmol, 2.5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(5.03g, 37.2mmol, 3.0 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 14.11g, 37.2mmol, 3.0당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필에틸아민(12.96ml, 74.4mmol, 5당량, 대정화금), 1시간 반응
9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH (16.09g, 24.8mmol, 2.0 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(3.35g, 24.8mmol, 2.0 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 9.41g, 24.8mmol, 2.0당량, GL Biochem Ltd.), Collidine(6.56ml, 49.6mmol, 5당량, 대정화금), 1시간 반응
[ 실시예 1-4] 9- 플루오레닐옥시카보닐 -Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg( Pbf )-Ala-Asp(tBu)-OH(화학식 IV)의 제조
상기 실시예 1-3에서 얻은 펩타이드에 디클로로메탄:트리플루오로아세트산=98.5:1.5의 혼합액 (300 ㎖)를 가하고 30분 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 반응기 1에 모았다. 남은 레진에 다시 디클로로메탄:트리플루오로아세트산=98.5:1.5의 혼합액 (300 ㎖)를 넣고 30분 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 반응기 1에 모았다. 반응기 1에 이소프로필이서(4.5L)를 적가하고, 1시간 동안 교반한 후 여과 및 실온 진공건조를 진행하여 18.07g의 펩타이드를 얻었다. 수율은 90.4%였고, HPLC 순도는 95.29%였다.
[ 실시예 1-5] 9- 플루오레닐옥시카보닐 -Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg( Pbf )-Ala-Asp(tBu)-Ala-NH 2 (화학식 V)의 제조
L-알라닌아마이드 하이드로클로라이드(L-Alaninamide hydrochloride, H-Ala-NH2 ·HCl, 2.78g, 22.34mmol, 2.0 당량, GL Biochem Ltd.)을 N,N-디메틸포름아미드 180ml에 용해하여 반응기에 투입하고, 상기 실시예 1-4에서 얻은 펩타이드(18.0g, 11.17mmol)와 1-히드록시벤조트리아졸(3.02g, 22.34mmol, 2.0 당량, GL Biochem Ltd.), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(HATU, 8.5g, 22.34mmol, 2.0 당량, GL Biochem Ltd.)을 투입하여 용해하였다. 디이소프로필에틸아민(7.8ml, 44.68mmol, 4당량, 대정화금)을 마지막으로 투입하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완결되면, 물 1.80L에 반응액을 적가하고, 1시간 교반하였다. 감압여과, 상온 진공건조를 진행하여 17.9g의 펩타이드를 얻었다. 수율은 95.2%였고, HPLC 순도는 96.58%였다.
[ 실시예 1-6] H-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-NH 2 (화학식 VI)의 제조
상기 실시예 1-5에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-NH2(16g, 9.51mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(160ml)에 투입 및 용해한 후 피페리딘(2.82ml, 28.53mmol, 3.0 당량)을 투입하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응액과 헥산(160ml)을 분별 깔대기에 투입하여 분리한 후 헥산층을 제거하였다. 상기 헥산 워크업 과정을 2회 더 반복하였다. 이소프로필에테르(1.6L)에 반응액을 적가하고, 1시간 교반하였다. 감압여과, 상온 진공건조를 진행하여 13.16g의 펩타이드를 얻었다. 수율은 94.68%였고, HPLC 순도는 93.26%였다.
얻어진 펩타이드의 NMR 데이터 및 mass데이터를 확인하여, 도 3(NMR 데이터) 및 도 4(mass 데이터)에 나타내었다.
[ 실시예 1-7] Ac-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg( Pbf )-Ala-Asp( tBu )-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-NH 2 (화학식 VII)의 제조
상기 실시예 1-6에서 얻은 펩타이드(9.72g, 6.65mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(200ml)에 투입 및 용해한 후 상기 실시예 1-2에서 얻은 펩타이드(10g, 6.65mmol, 1당량), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU, 2.78g, 7.32mmol, 1.1당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(0.99g, 73.2mmol, 1.1 당량)을 차례로 투입 및 용해하였다. 디이소프로필에틸아민(2.55ml, 14.63mmol, 2.2당량, 대정화금)을 마지막으로 투입하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완결되면 물(2.0L)에 반응액을 적가하고 30분동안 교반하였다. 감압여과, 상온 진공건조를 진행하여 16.67g의 펩타이드를 얻었다. 수율은 85.09%, HPLC 순도는 87.25%였다.
[ 실시예 1-8] TDM-621의 제조
상기 실시예 1-7에서 얻은 펩타이드 2 g에 트리플루오로아세트산:트리이소프로필실렌:물=95:2.5:2.5 (20 ㎖) 혼합용액을 가하고, 2시간 동안 탈보호화 반응을 수행하였다. 반응이 완결되면 이소프로필에테르(200mL)에 반응액을 적가하고, 1시간동안 교반하였다. 감압여과, 상온 진공건조를 진행하여 크루드 TDM-621을 1.51g를 얻었다. 수율은 130%, 함량은 72.8%, 함량 수율은 94.7% HPLC 순도는 74.3%였다. 이후 분리 및 정제된 TDM-621을 얻었고, 수율은 40%, HPLC 순도 94%였다.
얻어진 TDM-621의 NMR 데이터 및 mass데이터를 확인하여, 도 5(NMR 데이터) 및 도 6(mass 데이터)에 나타내었다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 II로 표시되는 펩타이드 및 하기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드를 액체상(solution-phase) 합성 방법으로 커플링 반응시켜 하기 화학식 VII로 표시되는 펩타이드를 수득하고 탈보호화 하는 것을 포함하는 TDM-621의 제조방법:
    [화학식 II]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
    [화학식 VI]
    H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
    [화학식 VII]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5

    상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
  2. 제1항에 있어서,
    화학식 II로 표시되는 펩타이드는 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 하기 화학식 I로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하고 상기 레진을 제거하여 수득되는 것인 TDM-621의 제조방법:
    [화학식 I]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-레진
    상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, 및 R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기이다.
  3. 제1항에 있어서, 화학식 VI로 표시되는 펩타이드는
    고체상 합성 방법으로 하기 화학식 III으로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하는 제1단계;
    상기 제1단계에서 제조된 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 IV로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제2단계:
    상기 제2단계에서 제조된 펩타이드 및 H-Ala-NHR5를 액체상 합성 방법으로 커플링 반응시켜 하기 화학식 V로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제3단계; 및
    상기 제3단계에서 제조된 펩타이드를 탈보호화하는 제4단계를 포함하여 수득되는 것인 TDM-621의 제조방법:
    [화학식 III]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-레진
    [화학식 IV]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-R4
    [화학식 V]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
    상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1은 수소, 카복시벤질기, 벤질옥시카바메이트기, t-부틸카바메이트기, 아세틸기, 벤질기, 파라메톡시 페닐기, 벤질아민기, 트리플루오로아세트아미드기, 포름 아미드기 및 메틸 카바메이트기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    R2는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기, 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기 및 토루엔설포닐기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며,
    R3는 내지 R5는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 8의 알킬기, 트리메틸실릴에테르기, 트리에틸에테르기, 트리이소프로필실릴에테르기, t-부틸디페닐실릴에테르기, 아세테이트기, 벤질에테르기, 벤조에이트기, 4-메톡시벤질에테르기, 2-나프틸메틸에테르기, 메톡시메틸아세탈기, 2-메톡시에톡시메틸에테르기, 에톡시에틸아세탈기, 메톡시프로필아세탈기 및 벤질옥시메틸아세탈기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 TDM-621의 제조방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    레진은 트리틸클로라이드 레진, 2-클로로트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진인 TDM-621의 제조방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    레진의 제거는 유기 용매 및 산을 포함하는 혼합물의 존재 하에서 수행되는 것인 TDM-621의 제조방법.
  7. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    커플링 반응은 유기 용매 및 커플링 시약의 존재 하에서 수행되는 것인 TDM-621의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    커플링 반응은 추가로 염기의 존재 하에서 수행되는 것인 TDM-621의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    유기 용매는 디메틸설폭시드, N-메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 디클로로에탄 및 클로로포름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 TDM-621의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    커플링 시약은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(0-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 (3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one), 브로모-트리스-피롤이디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸 (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(3,4-디하이드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)유라니움 테트라플루오로보레이트 (N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)uranium tetrafluoroborate), O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸 우라니움 테트라플루오로보레이트 (O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyl uranium tetrafluoroborate), 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 헥사플루오로포스페이트(2-(6-chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 TDM-621의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서,
    염기는 디이소프로필에틸아민, 트라이에틸아민, 피페리딘, 피롤리딘, 피리딘, N-메틸모르폴린 및 콜리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 TDM-621의 제조방법.
  12. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    커플링 반응은 -5 내지 45℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것인 TDM-621의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    탈보호화는 산 및 안정화제를 포함하는 혼합물의 존재 하에서 수행되는 것인 TDM-621의 제조방법.
  14. 제3항에 있어서,
    탈보호화는 염기의 존재 하에서 수행되는 것인 TDM-621의 제조방법.
  15. 하기 화학식 II로 표시되는 펩타이드:
    [화학식 II]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
    상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기이다.
  16. 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 하기 화학식 I로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하고 상기 레진을 제거하는 것을 포함하는 하기 화학식 II로 표시되는 펩타이드의 제조방법:
    [화학식 I]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-레진
    [화학식 II]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-O-R4
    상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기이다.
  17. 하기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드:
    [화학식 VI]
    H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
    상기 화학식에서, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
  18. 고체상 합성 방법으로 하기 화학식 III으로 표시되는 레진이 부착된 펩타이드를 제조하는 제1단계;
    상기 제1단계에서 제조된 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 IV로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제2단계:
    상기 제2단계에서 제조된 펩타이드 및 H-Ala-NHR5를 액체상 합성 방법으로 커플링 반응시켜 하기 화학식 V로 표시되는 펩타이드를 제조하는 제3단계; 및
    상기 제3단계에서 제조된 펩타이드를 탈보호화하는 제4단계를 포함하는 하기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드의 제조방법:
    [화학식 III]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-레진
    [화학식 IV]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-O-R4
    [화학식 V]
    R1-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
    [화학식 VI]
    H-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-Arg(R2)-Ala-Asp(R3)-Ala-NH-R5
    상기 화학식에서, R1은 수소 또는 아민기 보호기, R2는 수소 또는 구아니딘 보호기, R3는 수소 또는 하이드록시기 보호기, R4는 수소 또는 하이드록시기 보호기, 및 R5는 수소 또는 아민기 보호기이다.
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US5670483A (en) 1992-12-28 1997-09-23 Massachusetts Insititute Of Technology Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor

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