BRPI0609555A2 - sìntese de peptìdeo de alfa-espirais sobre resina peg - Google Patents

Abstract

SìNTESE DE PEPTìDEO DE ALFA-ESPIRAIS SOBRE RESINA PEG. é descrito um novo método para síntese de peptídeo em fase sólida, O método é especificamente útil para peptídeos ou segmentos de peptideo que possuam propensão forte em formar elemento de estrutura secundária a-espiral.

Description

SÍNTESE DE PEPTÍDEO DE ALFA-ESPIRAIS SOBRE RESINA PEG

A presente invenção refere-se a um método parasintetizar tipos específicos de peptídeo sobre uma fasesólida, e aos conjugados respectivos de fase sólida dopeptídeo.

Uma droga de peptídeo bem sucedida, que atua como uminibidor de uma doença viral humana amplamente difundidadessa natureza tal como infecção por HIV, é T-2 0 (tambémdenominada DP-178), que é: Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-He-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2. A seqüência do peptídeo é derivada de um segmentode seqüência a-helicoidal fusogênica, denominada "repetiçãode átomo heptavalente", que corresponde a aminoácidos 638-673 da proteína receptora de transmembrana gp41 provenientede HIV-1. gp41 é crucial para mediar a infecção viral decélulas.

Conseqüentemente, a produção eficaz em larga escala énecessária, porém só foi conseguida até o momento por umacombinação de síntese parcial de segmentos de T-20 sobrefase sólida seguida de condensação de segmento tipicamentena fase líquida (vide WO 99/48513) . A síntese eficaz decomprimento total sobre fase sólida não tem demonstrado atéagora, tal abordagem tipicamente não conseguindo maisproduto adequado do que produtos suplementares inúteis,purificação de impurezas provocando mais problemas enovamente diminuindo rendimentos finais.

Tam, J. e outros (Dep. De Microbiologia daUniversidade de Vanderbilt; Organic Letters, 2002, Vol. 4:4167-4170) descreve entre outros a preparação de peptídeosDP-178 e 30-mer correlatos com a finalidade de prepararfeixes de três espirais.

Os autores apenas mencionam que é aplicado um métodode síntese genérico FMOC, dando os reagentes de acoplamento e as condições de clivagem de resina utilizadas. Nada édito sobre o tipo de resina e/ou manipulação de resinaempregada, bem como o excesso de reagentes utilizado. Não éapresentado qualquer cromatograma e não são fornecidosdetalhes de purificação ou pureza final. Não é fornecidaqualquer indicação de rendimentos obtidos e estes sãodeixados inteiramente sujeitos a especulação. Uma vez que otrabalho se refere apenas à experimentação em escalalaboratorial, não foi pensada qualquer necessidade aparentepara planejar um processo sintético eficiente.

É um objetivo da presente invenção planejar um métodoaperfeiçoado, eficiente para síntese de tais proteínas a-helicoidais e em específico T-20. Este objetivo ésolucionado através do método da presente invenção.

De acordo com o método da presente invenção para preparar um peptídeo, o mesmo compreende a etapa em que o

referido peptídeo que pode possuir cadeias suplementares deaminoácidos protegidas e/ou desprotegidas é preparadoligado a uma fase sólida cuja fase sólida é uma resinaanfifílica PEG e em que o peptídeo compreende um segmento formador-de-espiral, isento de prolina que consiste em umasérie de seis resíduos contíguos de aminoácidos quecompreende pelo menos quatro resíduos de aminoácidosformadores-de-espirais protegidos ou desprotegidos.

A Fig. 1 mostra o cromatograma de HPLC e níveis baixos de impurezas obtidos a partir de produto sintetizadodeste modo, permitidos por síntese de rendimentos elevados.Resinas PEG são fornecidas por empresas diferentes, porexemplo, Matrix Innovations Inc. de Quebec, Canadá (marca"ChemMatrix") ou Versamatrix A.S. da Dinamarca. Taisresinas foram descritas, por exemplo, em US2003078372 Alou, no que se refere aos tipos preferidos de resinas PEG,em WO 02/40559. Para encadeamento de peptídeo, tal resinaPEG pode compreender radicais terminais "nativos" dehidroximetila ou seus derivados radicais "quase-nativos" deamino-metila, carboxila ou bromometila ou iodometila, porexemplo, ou podem ser derivados por encadeadores oumanipulações integrais ou enxertados para encadeamento defase sólida tais como, por exemplo, resinas Wang, ácido 4-hidroximetilbenzóico (o último requerendo ligação doprimeiro aminoácido por meio de esterificação catalisadacom p-dimetilaminopiridina, vide Atherton e outros, 1981,J. Chem. cos. Chem. Commun., p.336ff), 2-cloro-tritil-cloreto (CTC) e resinas correlatas halogênicas de tritila,de preferência alcoxilada, encadeador de 4-carboxitritilada Bayer, resina de 4-metilbenzil-hidrilamina, ou, porexemplo, a amida que gera encadeadores de amida PAL ou Rinkou Sieber conforme são utilizados em química Fmec, ou emque a química Boc deve ser utilizada, por exemplo,manipulação de Pam ou manipulação de BHA gerador de amida.

De preferência, a resina PEG utilizada na presenteinvenção compreende um encadeador que contém um radical NH-reativo que gera uma amida ácida sob clivagem de peptídeoproveniente de resina, seja após acoplamento inicial dafunção de ácido Ca-carboxilico do resíduo de aminoácido determinal-C do peptídeo a tal encadeador ou seja a partir dafunção de cadeia suplementar de ácido co-carboxílico deácido aspártico ou glutâmico, produzindo asparagina ouglutamina sob clivagem após suporte inicial de cadeiasuplementar e proteção do terminal-C do peptídeo. No presente contexto, tais encadeadores são denominadosencadeadores geradores de amida. Mais preferivelmente, e emespecifico para síntese de T-20, tal encadeador de geraçãode amida é PAL (Albericio e outros, 1987, Int. J. Pept.Protein Research 30, 206-216), Siebr (Tetrahedron Lett.1987, 28, 2107-2110) ou encadeador similar de resina tipo9-amino-xantenila, ou encadeador de amida Rink (4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometila)fenoxi; Rink e outros, 1987,Tetrahedron Lett. 28, 3787 ff).

Também é possível que tal resina PEG possa ser umaresina de poliéter-poliéster ou poliéter-poliamidamisturada tal como descrita, por exemplo, em Kempe eoutros, J. Am. Chem. Soe. 1996, 118, 7083 e em U.S.5.910.554.

De preferência, a resina PEG é uma resina PEGsubstancialmente pura que é desprovida ainda de porções depoliestireno eventualmente substituído como um elementoestrutural definidor e, mais preferivelmente, nãocompreende quaisquer grupos funcionais de éster ou amidainternos, porém apenas grupos funcionais de poliéteres.

Notadamente, na última definição ligações terminais deéster ou amida que unem a resina diretamente ou através deuma manipulação ao peptídeo não são levadas em conta, umavez que as mesmas não são características de encadeamentoestrutural interno e conseqüentemente não afetam a definição de "PEG pura" neste sentido.Resinas PEG oferecem estabilidade química ótima alémde boa compatibilidade e facilidade de manipulação comsolventes padrão durante síntese de Fmoc normal. De acordocom a presente invenção, as mesmas permitem sintetizar, porexemplo, T-20 com rendimento e pureza excepcionais.

Um segmento formador de espirais compreende resíduosde aminoácido formadores de espirais conforme definidoacima; resíduos formadores de espirais em seu significadono presente contexto são aqueles que correspondem aformadores de espirais fortes, isto é denominados comoaminoácidos tipo-Ha ou ha na determinação de propensão deespirais e esquema de previsão de acordo com Cho e Fasman,Ann. Ver. Biochem. 47, 258 (1978) . Tais formadores deespirais fortes apenas possuem uma propensão helicoidaldeterminada empiricamente de >1 que indica que tal espiralforte que forma resíduo de aminoácido ocorre com maiorfreqüência do que a freqüência média em uma Espiral a emestruturas de raio-x de proteína. Para cada um dos 20aminoácidos naturais, pode ser encontrado tabulado um valorde propensão empírica numérica em Chou, acima.Conseqüentemente, são formadores de espirais fortes Ala,Gln, Glu, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Trp e Vai. Ao contrário,His, Arg e Asp ocorreram com freqüência satisfatória,significando uma propensão de aproximadamente 1, emespirais-a, enquanto Asn foi verificado possuir um impactoverdadeiramente negativo sobre a formação de espirais, istoé, uma propensão de 0,67 apenas. Para a previsão desegmentos de peptídeo formadores de espirais ouhelicoidais, um algoritmo de previsão comparativamentesimples porém confiável foi definido por Chou e outros,1978.: Um agrupamento de 4 resíduos de aminoácidosformadores de espirais fortes, com a regra excepcional deque dois His e/ou Asp feitos para um resíduo de formação deespirais fortes, dentro de seis resíduos contíguos deaminoácidos nuclearão uma espiral. Ao calcular a propensãomédia de espiral para cada sobreposição de segmento detetrapeptídeo de tal segmento helicoidal, tal espiral podeem seguida ser prevista para estender-se até ambas asdireções até a propensão média para o segmento detetrapeptídeo terminal cair abaixo de 1,00. Prolinas sãointerruptores de espiral e podem apenas ocorrer nasterminações de uma espiral. De preferência, um segmento deformação de espiral conseqüentemente previsto possui umapropensão a espiral média que é maior do que um valor depropensão beta-folha média similarmente previsível deacordo com Chou, acima. Enquanto seja freqüentementecontemplado no campo de síntese peptídica que estruturasbeta-folha, que conduzem à agregação de cadeias depeptídeos adjacentes por aglutinação intercadeia, possamafetar negativamente reações de acoplamento durante asíntese e reações de desproteção após a mesma, a formaçãode espiral de intracadeia não foi percebida como umobstáculo provável para a síntese de fase sólida linear.

Reações de acoplamento, reagentes de acoplamentoutilizados e clivagem proveniente de desproteção de cadeiade resina/suplementar devem ser conduzidos com protocolosde síntese de fase sólida padrão, utilizando, por exemplo,química Boc ou, de preferência, Fmoc. Notadamente, aeficiência de acoplamento após cada etapa de acoplamentodeveria ser controlada durante a síntese por meio de, porexemplo, teste de Ninidrina, e acoplamentos individuais quemostram eficiência de acoplamento baixa inesperada deveriamser repetidos antes de continuar com ciclo posterior dedesproteção e acoplamento; especificamente após etapas deacoplamento crítico, igualação preemptiva de funções Naainda não reagidas poderia ser favoravelmente realizadaantes do ciclo sintético seguinte.

Após síntese sobre-resina, especificamente no caso deT-20, poderia ser realizada acetilação N-terminal quecomumente utiliza anidrido acético ou modificação similar.Após clivagem global usualmente de uma-etapa proveniente deresina PEG e desproteção onde não utiliza grupos deproteção ortogonal especial para cadeias suplementares, opeptídeo é coletado e isolado ou ainda processado pormétodos costumeiros.

De preferência, o peptídeo a ser sintetizado é T20.Contudo, outros peptídeos que compreendem segmentosformadores de espirais são também acessíveis pelo presentemétodo. Além do T-20, exemplos adicionais de peptídeossimilares que possuem tais segmentos formadores de espiraissão sobrepostos ou relacionados, porém não peptídeosidênticos provenientes dos domínios repetidos do referidoátomo heptavalente gp41 que possui 15-40 resíduos deaminoácidos e sobreposição com T-20 por pelo menos 10resíduos de aminoácidos.

De preferência, além da exigência de compreender umsegmento de peptídeo helicoidal, o comprimento total dopeptídeo a ser sintetizado e cujos peptídeos compreendemsegmento de peptídeo helicoidal antes mencionado comoespecificado é de pelo menos 15 aminoácidos, maispref erivelmente é de pelo menos 24 aminoácidos, e aindamais preferivelmente é de pelo menos 30 aminoácidos decomprimento.

De preferência, o peptídeo a ser sintetizado éThymosin ai que possui a seqüência

1-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-GluIle-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-28

em que as cadeias de aminoácidos individuais sãodesprotegidas e são adequadamente protegidas, conforme anecessidade, por um resíduo de aminoácido individualdeterminado como é de conhecimento comum na técnica (videBodansky, abaixo, por exemplo). Mais preferivelmente, talpeptídeo é N-terminalmente acetilado em uma etapasubseqüente à síntese linear, porém antes de clivagemproveniente de resina. Timalfasina natural como é também,utilizada como um farmacêutico é N-terminalmente acetilada.

Notadamente, os presentes inventores verificaram queé principalmente a metade de terminal-C do peptídeo detimalfasina, próximo aos resíduos 19-28, que incorre amaior parte das impurezas por anulação de cadeia econseqüentemente perdas na produção de produto final geradadurante síntese de fase linear. Esta parte do peptídeo foidescoberta como sendo extremamente difícil de sintetizar.

Vice-versa, durante a síntese linear, também épossível utilizar tais dipeptídeos de oxazolidina de acordocom Wõhr e outros, (Wõhr e outros, J. Am. Chem. Soe. 118,9218).

EXEMPLOS

Síntese de T-20 de fase sólidaProcedimentos gerais. Resina ChemMatrix de MatrixInnovation (Quebec, Canadá), HCTU de Luxembourg IndustriesLtd. (Tel Aviv, Israel), derivados de aminoácido-Fmocprotegido e manipulações Rink de IRIS Biotech(Marktredwitz, Alemanha).

Foram realizadas sínteses de fase sólida manuais emuma seringa de polipropileno (10 mL) preenchida com umdisco poroso de polietileno. Foram removidos solventes ereagentes solúveis através de sucção. A remoção de grupoFmoc foi realizada com piridina-DMF (2:8, v/v) (1x2 min,2 x 10 min) . Lavagens entre as etapas de desproteção,acoplamento, e, novamente, desproteção foram realizadas comDMF (5 x 0,5 min) e CH2C12 (5 x 0,5 min) utilizando a cadavez 10 mL de solvente/g de resina. Transformações desíntese de peptídeo e lavagens foram realizadas a 25°C.Sínteses de fase sólida automáticas foram realizadas em umsintetizador de peptídeo ABI 433A que utiliza um programaFastMoc que utiliza 0,10 mmol de resina.

A Remoção do Fmoc foi realizada com 22% depiperidieno em DMF por 2 + 7,6 min. A resina é lavada comDCM (6 vezes por 0,5 min) e DMF (4 vezes).

Acoplamento. Em uma cápsula, foi dissolvidoaminoácido-Fmoc (0,9 mmol, 10 equivalentes) em DMF e foiadicionado 0,9 mmol de 0,45 M HCTU em DMF ao cartucho. Emseguida, foi adicionado 1 mL de 2 M DIEA em NMP e a soluçãofoi transferida para o recipiente de reação. O acoplamentotomou lugar por 3 0 min, em que a resina foi lavada (6vezes) com DMF.

Colunas de fase reversa de HPLC Symmetry C18 de 4,6 x150 mm, 5 um (coluna A) e foram de Waters (Irlanda) . HPLCanalítico foi realizado em um instrumento Waters quecompreende duas bombas de entrega de solvente (Waters1525), injetor automático (Waters 717 auto-amostrador) ,detector duplo de comprimento de onda (Waters 2487), econtrolador de sistema (Breeze V3,20). A detecção UV foi a220 nm, e gradientes lineares de CH3CN ( + 0,036% TFA) paradentro de H20 (+0,045% TFA), de 30% a 70% em 15 min.

A análise MALDI-TOF e ES-MS de amostras de peptídeoforam realizadas em um PerSeptive Biosystems Voyager DE RP,que utiliza matriz ACH. A Fig. 1 mostra a pureza erendimento de produto em a) cromatograma HPLC e b,c)espectros MS. 0 resultado de produto puro (RT 7,078) foi50% relativo a impurezas na análise HPLC.

Exemplo 1

Ac-Tyr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2 (T-20)

Etapa 1

Fmoc-Rink-ChemMatrix-resina

A resina ChemMatrix (0,1, 0,45 mmol/g) foi colocadana seringa de polipropileno. A resina foi submetida àsseguintes lavagens/tratamentos com CH2C12 (3 x 0,5 min),DMF (3 x 0,5 min), e DMF (5 x 0,5 min). Em seguida, foramadicionados manipulação Fmoc-Rink (3 equivalentes) e DIEA(6 equivalentes) em DMF (1 mL) , seguidos por PyBOP (3equivalentes) e HOAt (3 equivalentes) em DMF (5 mL) . Amistura foi deixada para agitar mecanicamente por 2 horas ea resina foi lavada com DMF (3 x 0,5 min e o teste deninidrina foi negativo.

Etapa 2H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu-(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln-(Trt)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Gkn(Trt)-Glu(OtBu)-Lys-(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu) -

Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys-(Boc) -Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Phe-NH-Rink-ChemMatrxi-resina

O grupo Fraoc foi removido e Fmoc-aa-OH's foramseqüencialmente adicionados à resina peptidílica (etapa 1)no sintetizador automático ABI 433A conforme descritoacima.

Etapa 3

Ac-Tyr-(Bu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(Trt) -Asn- (Trt) -Gln (Trt) -Gln (Trt) -Glu(OtBu) -Lys (Boc) -Asn (Trt) -Glu(OtBu) -Gln (Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(Trt) -Trp(Boc)-Phe-NH-Rink-ChemMatrix-resina

A acetilação final foi realizada com uma soluçãoAc20-DIEA-DMF (10:5:85) em DMF (5 mL) por 15 min comagitação manual esporádica, em que ninidrina foi negativa.

Etapa 4

Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys -Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2 (T-20)

A resina de peptídeo foi suspensa em TFA-iPr3SiH-H20(95:2,5:2,5) e permitiu-se que a mistura fosse agitada por2 horas. Em seguida, foi adicionado éter/hexano, o peptídeoprecipitou, o solvente foi removido após a centrifugação, efoi adicionado éter/hexano extra e removido após acentrifugação. Esta operação foi repetida diversas vezes.Finalmente, foi adicionado H20 -(5 mL) e liofilizado.

EI-MS, calculado 4489. Encontrado: m/z [M+2H]2+/22248

Claims (11)

1. Método de preparação de um peptídeo sobre umafase sólida cujo peptídeo tem pelo menos 24 resíduos deaminoácidos de comprimento e cujo peptídeo pode possuircadeias suplementares de aminoácidos individualmenteprotegidas e/ou desprotegidas, caracterizado pelo fato doreferido peptídeo ser preparado aglutinado a uma fasesólida cuja fase sólida é uma resina PEG substancialmentepura, anfifílica que compreende apenas grupos funcionais depoliéter como um elemento estrutural, encadeador interno eem que o peptídeo compreende um segmento de formação deespiral, isento de prolina que possui pelo menos 12resíduos de comprimento.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da capacidade de carregamento daresina PEG ser de pelo menos 0,5 mmol/g.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do comprimento total do peptídeo aser sintetizado e cujo peptídeo compreende segmentosanteriores de referido peptídeo helicoidal ter pelo menos-30 aminoácidos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do peptídeo ser T-20, T-20 N-terminalmente acetilado, Timosina-al ou ser um peptídeo derepetição de átomo heptavalente de resíduos de aminoácido-15-4 0 que possuem um elemento de seqüência fusogênico, a-helicoidal que é sobreposto com T-20 por pelo menos 10resíduos.

5. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato dopeptídeo ser encadeado à fase sólida através de umencadeador ou manipulação funcional.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato do encadeador ser um encadeadorgerador de amida, de preferência um encadeador de amidaSieber ou Rink.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da resina PEG ser uma resina PEGaamino-alquil-funcionalizada a cuja função de amino opeptídeo é aglutinado formando um Ca-terminal peptidil-carboxamida.

8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 ou 5, caracterizado pelo fato da resinaser uma resina PEG em que a resina não é um poliestireno-PEG misturado ou copolímero ou copolímero bloqueado, depreferência pelo fato da resina ser substancialmente resinaPEG pura.

9. Conjugado de um peptídeo de pelo menos 24resíduos de aminoácidos e de uma resina PEG pura de fasesólida caracterizado pelo fato de que a resina é uma resinaPEG substancialmente pura, anfifílica que compreende apenasgrupos funcionais de poliéter como um elemento estrutura,encadeador, e onde o peptídeo compreende um segmentoformador de espirais, isento de prolina que tem pelo menos-12 resíduos de comprimento.

10. Conjugado de resina peptídeo-PEG, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato da porção dopeptídeo possuir a seqüência de aminoácido que é Rl-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Glu-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe e em que RI é H, acetil- ougrupo de proteção removível, mais preferivelmente RI éacetil, em que os resíduos de aminoácido individuais podemcompreender ainda um grupo de proteção de suplemento-cadeia.

11. Conjugado de resina peptídeo-PEG, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato da porção dopeptídeo ser Thymosin-al.