ES2336245T3 - Sintesis peptidica de helices alfa sobre resina de peg. - Google Patents
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Abstract
Método para preparar un péptido sobre una fase sólida, péptido que tiene al menos 24 residuos de aminoácido de longitud y péptido que puede tener cadenas laterales de aminoácido individualmente protegidas y/o desprotegidas, caracterizado porque dicho péptido se prepara unido a una fase sólida, fase sólida que es una resina de PEG anfifílica que comprende sólo grupos funcionales poliéter como un elemento estructural de reticulación interna y en donde el péptido comprende un segmento formador de hélice, libre de prolina, que tiene al menos 12 residuos de longitud.
Description
Síntesis peptídica de hélices alfa sobre resina
de PEG.
La presente invención se refiere a un método
para sintetizar tipos particulares de péptido sobre una fase
sólida, y a los conjugados de péptido-fase sólida
respectivos.
Un fármaco peptídico de éxito, que actúa como un
inhibidor de una enfermedad viral humana extendida tal como la
infección por HIV, es T-20 (también llamado
DP-178), que es
Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Tip-Asn-Trp-Phe-NH_{2}.
La secuencia del péptido se toma de un segmento de secuencia fusogénica \alpha-helicoidal, la llamada "repetición heptádica", correspondiente a los aminoácidos 638-673 de la proteína receptora de transmembrana gp41 de HIV-1. Gp41 es crucial para mediar en la infección viral de células.
La secuencia del péptido se toma de un segmento de secuencia fusogénica \alpha-helicoidal, la llamada "repetición heptádica", correspondiente a los aminoácidos 638-673 de la proteína receptora de transmembrana gp41 de HIV-1. Gp41 es crucial para mediar en la infección viral de células.
De acuerdo con esto, es necesaria la producción
eficaz a gran escala, pero hasta ahora sólo se ha alcanzado
mediante una combinación de síntesis parcial de segmentos de
T-20 sobre una fase sólida, seguida por condensación
de segmentos típicamente en fase líquida (véase WO 99/48513). La
síntesis eficaz de longitud completa sobre una fase sólida no se ha
demostrado hasta ahora, fallando típicamente tal sistema en la
producción de más producto apropiado que productos secundarios
inútiles, planteando la purificación de impurezas problemas
adicionales y disminuyendo de nuevo los rendimientos finales.
Tam, J. et al. (Dep. Microbiology
Vanderbilt University; Organic Letters 2002, Vol. 4;
4167-4170) describen, entre otras cosas, la
preparación de DP-178 y péptidos
30-me relacionados con el propósito de preparar
haces de tres hélices. Los autores solo mencionaban que se aplica
un método de síntesis general con FMOC, dando los reactivos de
acoplamiento y las condiciones de escisión de la resina usados. No
se menciona nada sobre el tipo de resina y/o asidero de resina
empleado, como tampoco del exceso de reactivos usado. No se muestra
el cromatograma y no se dan detalles de la purificación ni la pureza
final. No se da una indicación de los rendimientos obtenidos y se
deja que sean totalmente objeto de especulación. Puesto que el
trabajo trataba sólo de la experimentación a escala de laboratorio,
no se daba una necesidad evidente de idear un procedimiento
sintético eficaz.
Un objetivo de la presente invención es idear un
método eficaz mejorado para la síntesis de tales proteínas
\alpha-helicoidales y en particular
T-20. Este objetivo se soluciona mediante el método
de la presente invención.
De acuerdo con el método de la presente
invención para preparar un péptido, comprende la etapa en la que
dicho péptido que puede tener cadenas laterales de aminoácidos
protegidas y/o desprotegidas se prepara unido a una fase sólida,
fase sólida que es una resina de PEG anfifílica y en donde el
péptido comprende un segmento formador de hélice, libre de prolina,
que consiste en una serie de seis residuos de aminoácido contiguos
que comprenden al menos cuatro residuos de aminoácido formadores de
hélice protegidos o desprotegidos.
La Fig. 1 muestra el cromatograma de HPLC y el
bajo nivel de impurezas obtenido del producto sintetizado de este
modo, admitida una síntesis de alto rendimiento.
Las resinas de PEG son ofrecidas por diferentes
compañías, p. ej. Matrix Innovations Inc. de Quebec, Canadá (marca
"ChemMatrix") o Versamatrix A.S. de Dinamarca. Tipos preferidos
de resinas de PEG se han descrito en WO 02/40559. Para la conexión
del péptido, tal resina de PEG puede comprender radicales
hidroximetilo "naturales" terminales o derivados de los
mismos, por ejemplo radicales aminometilo, carboxilo o bromometilo o
yodometilo "cuasi naturales", o puede derivarse mediante
conectores o asideros integrales o injertados conocidos para la
conexión en fase sólida, tales como, p. ej., resinas de Wang, ácido
4-hidroximetilbenzoico (requiriendo el último la
ligazón del primer aminoácido por medio de esterificación catalizada
por p-dimetilaminopiridina, véase Atherton et
al., 1981, J. Chem. Soc. Chem. Commun., p. 336 y siguientes),
cloruro de 2-clorotritilo (CTC) y resinas de haluro
de tritilo relacionadas, preferiblemente alcoxiladas, conector de
4-carboxitritilo de Bayer, resina de
4-metilbencilhidrilamina, o, p. ej., los conectores
amídicos PAL, Rink o Sieber generadores de amida que se usan en la
química del Fmoc, o cuando ha de usarse la química del Boc, p. ej.
el asidero Pam o el asidero de BHA generador de amida.
Preferiblemente, la resina de PEG usada en la
presente invención comprende un conector que comprende un radical
NH reactivo que genera durante la escisión del péptido de la resina
una amida de ácido, serlo después del acoplamiento inicial de la
función ácido C\alpha-carboxílico del residuo de
aminoácido C-terminal del péptido a tal conector o
serlo a partir de la función de la cadena lateral de ácido
\omega-carboxílico de ácido aspártico o
glutámico, dando asparagina o glutamina durante la escisión después
del anclaje inicial de la cadena lateral y la protección del
extremo C del péptido. En el presente contexto, tales conectores se
denominan conectores generadores de amida. Más preferiblemente, y
particularmente para la síntesis de T-20, tal
conector generador de amida es PAL (Albericio et al., 1987,
Int. J. Pept. Protein Research 30, 206-216), Sieber
(Tetrahedron Lett. 1987, 28, 2107-2110) o un
conector de resina de tipo 9-aminoxantenílico, o un
conector de amida de Rink
(4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi;
Rink et al, 1987, Tetrahedron Lett. 28 3787 y
siguientes).
La resina de PEG es una resina de PEG
sustancialmente pura que carece de restos poliestireno finalmente
más sustituidos como un elemento estructural definitorio y, además,
tampoco comprende ningún grupo funcional éster o amida interno sino
solo grupos funcionales poliéter. Notablemente, en la última
definición, no se tienen en cuenta los enlaces éster o amida
terminales que sirven de puente a la resina directamente o a través
de un asidero con el péptido, ya que no son elementos reticuladores
estructurales internos y, de acuerdo con esto, no afectan a la
definición de "PEG puro" a este respecto.
Las resinas de PEG ofrecen una estabilidad
química óptima junto con buena compatibilidad y facilidad de manejo
con disolventes estándar durante la síntesis normal con Fmoc. De
acuerdo con la presente invención, permiten sintetizar, p. ej.,
T-20 con un rendimiento y una pureza
excepcionales.
Un segmento formador de hélice comprende
residuos de aminoácido formadores de hélice según se definieron
anteriormente; residuos formadores de hélice en su significado en
el presente contexto son los que equivalen a formadores de hélice
fuertes, es decir, que están indicados como Ha o aminoácido tipo ha
en el esquema de indicación y predicción de la propensión de la
hélice de acuerdo con Chou y Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47, 25 8
(1975). Tales formadores de hélice fuertes simplemente tienen una
propensión helicoidal determinada empíricamente de >1 que indica
que tal residuo de aminoácido formador de hélice fuerte se presenta
con una frecuencia mayor que la media en una hélice \alpha en
estructuras proteínicas determinadas por rayos X. Para cada uno de
los 20 aminoácidos naturales, un valor numérico empírico de
propensión puede encontrarse tabulado en Chou, anteriormente. De
acuerdo con esto, formadores de hélice fuertes son Ala, Gln, Glu,
Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Trp y Val. En contraste, His, Arg y Asp se
presentaban con frecuencia estadística, significando una propensión
de aproximadamente 1, en hélices \alpha, mientras que se encontró
que Asn tiene un impacto verdaderamente negativo sobre la formación
de hélices, a saber, una propensión de solamente 0,67. Para la
predicción de segmentos peptídicos helicoidales o formadores de
hélice, un algoritmo de predicción comparativamente simple pero
fiable fue definido por Chou et al, 1978: Una agrupación de 4
residuos de aminoácido fuertemente formadores de hélice, con la
regla de excepción de que dos His y/o Asp suplen a un residuo
formador de hélice fuerte, dentro de los seis residuos de
aminoácido contiguos nucleará una hélice. Calculando la propensión
media de la hélice para cada segmento tetrapeptídico solapado de
tal segmento helicoidal puede predecirse entonces que tal hélice se
extenderá en ambas direcciones hasta que la propensión promediada
para el segmento tetrapeptídico terminal caiga por debajo de 1,00.
Las prolinas son rompedores de hélice y solo pueden presentarse en
los extremos de una hélice. Preferiblemente, un segmento formador
de hélice predicho de acuerdo con esto tiene una propensión de
hélice media que es mayor que un valor de la propensión de lámina
beta promediada predecible de forma similar, de acuerdo con Chou,
anteriormente. Aunque a menudo se ha contemplado en el campo de la
síntesis de péptidos que las estructuras de lámina beta, que
conducen a la agregación de cadenas peptídicas adyacentes mediante
unión intercatenaria, puede afectar negativamente a las reacciones
de acoplamiento durante y las reacciones de desprotección después
de la síntesis, la formación de hélices intracatenarias no se ha
percibido como un obstáculo probable para la síntesis lineal en fase
sólida.
Las reacciones de acoplamiento, los reactivos de
acoplamiento y la escisión de la resina/desprotección de la cadena
lateral deben efectuarse con protocolos de síntesis en fase sólida
estándar, empleando, p. ej., la química del Boc o, preferiblemente,
el Fmoc. Notablemente, la eficacia del acoplamiento después de cada
etapa de acoplamiento debe controlarse durante la síntesis por medio
de, p. ej., la prueba de la ninhidrina y los acoplamientos
individuales que muestran una baja eficacia de acoplamiento
inesperada deben repetirse antes de continuar con un ciclo
adicional de desprotección y acoplamiento. En particular, después de
las etapas de acoplamiento críticas, el resguardo preferente de
funciones N\alpha todavía sin reaccionar podría llevarse a cabo
favorablemente antes del siguiente ciclo
sintético.
sintético.
Después de la síntesis sobre la resina, en
particular en el caso de T-20; puede llevarse a cabo
acetilación N-terminal usando comúnmente anhídrido
acético o una modificación similar. Después de la escisión global de
la resina de PEG y la desprotección habitualmente en una etapa
donde no se usan grupos protectores ortogonales especiales para
cadenas laterales, el péptido se recoge y se aísla o se procesa
adicionalmente mediante métodos habituales.
Preferiblemente, el péptido que ha de
sintetizarse es T-20. Sin embargo, otros péptidos
que comprenden segmentos formadores de hélice también son
accesibles mediante el presente método. Aparte de
T-20, ejemplos adicionales de péptidos similares
que tienen tales segmentos formadores de hélice son péptidos
solapados o relacionados, pero no idénticos, de dichos dominios de
repetición heptádica de gp41 que tienen 15-40
residuos de aminoácido y que se solapan con T-20 en
al menos 10 residuos de aminoácido.
Preferiblemente, además del requisito de
comprender un segmento peptídico helicoidal, la longitud total del
péptido que ha de sintetizarse, y péptido que comprende el segmento
peptídico helicoidal mencionado anteriormente según se especifica,
es al menos 15 aminoácidos, más preferiblemente es al menos 24
aminoácidos, lo más preferiblemente tiene al menos 30 aminoácidos
de longitud.
Preferiblemente, el péptido que ha de
sintetizarse es timosina \alpha_{1} que tiene la secuencia
1-Ser-Asp-Ala-Ala-Va1-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-28,
en donde las cadenas de aminoácidos individuales
están desprotegidas o están protegidas adecuadamente, según sea
necesario para un residuo de aminoácido individual dado como se
conoce comúnmente en la técnica (véase Bodanseky, anteriormente,
por ejemplo). Más preferiblemente, tal péptido se acetila
N-terminalmente en una etapa posterior a la
síntesis lineal, pero antes de la escisión de la resina. La
himalfasina natural que también se usa como un producto
farmacéutico está acetilada N-terminalmente.
Notablemente, los presentes inventores han
encontrado que es principalmente la mitad
C-terminal del péptido de timalfasina,
aproximadamente los residuos 19-28, la que sufre la
mayoría de las impurezas por deleciones de cadena y, de ahí,
pérdidas en el rendimiento final del producto generado durante la
síntesis en fase lineal. Se ha encontrado que esta parte del
péptido es extremadamente difícil de sintetizar.
Por el contrario, durante la síntesis lineal,
también es factible usar tales dipéptidos de oxazolidina de acuerdo
con Wohr et al., (Wohr et al., J. Am. Chem. Soc. 118,
9218).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos Generales. Resina ChemMatrix de
Matrix Innovation (Quebec, Canadá), HCTU de Luxembourg Industries
Ltd. (Tel Aviv, Israel), derivados de
Fmoc-aminoácido protegidos y asidero de Rink de IRIS
Biotech (Marktredwitz, Alemania).
Las síntesis en fase sólida manuales se llevaron
a cabo en jeringas de polipropileno (10 ml) equipadas con un disco
poroso de polietileno.
Los disolventes y los reactivos solubles se
retiraron mediante succión. La retirada del grupo Fmoc se llevó a
cabo con piperidina-DMF (2:8, v/v) (1 x 2 min, 2 x
10 min). Se llevaron a cabo lavados entre las etapas de
desprotección, acoplamiento y, de nuevo, desprotección con DMF (5 x
0,5 min) y CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min) usando cada vez 10 ml de
disolvente/g de resina. Las transformaciones y los lavados de la
síntesis de péptidos se realizaron a 25ºC. Las síntesis en fase
sólida automáticas se llevaron a cabo en un sintetizador de
péptidos ABI 433A que usa un programa FastMoc usando 0,10 mmol de
resina.
La retirada del Fmoc se llevó a cabo con
piperidina al 22% en DMF durante 2 + 7,6 min. La resina se lavó con
DCM (6 veces durante 0,5 min y 4 veces).
Acoplamiento. En un cartucho,
Fmoc-aminoácido (0,9 mmol, 10 equiv) se disolvió en
DMF y se añadieron al cartucho 0,9 mmol de HCTU 0,45 M en DMF. A
continuación, se añadió 1 ml de DIEA 2 M en NMP y la solución se
transfirió al recipiente de reacción. El acoplamiento tiene lugar
durante 30 min, cuando la resina se lavaba (6 veces) con DMF.
Las columnas en fase inversa de HPLC
Symmetry^{TM} C18 4,6 x 150 mm, 5 \mum (columna A) eran de
Waters (Irlanda). La HPLC analítica se llevó a cabo en un
instrumento de Waters que comprende dos bombas de aporte de
disolvente (Waters 1525), un inyector automático (automuestreador
Waters 717), un detector de doble longitud de onda (Waters 2487) y
un controlador del sistema (Breeze V3.20). La detección UV era a 220
nm, y gradientes lineales de CH_{3}CN (+ TFA al 0,036%) en H2O (+
TFA al 0,045%), de 30% a 70% en 15 min.
Se realizaron análisis por
MALDI-TOF y ES-MS de muestras de
péptidos en un PerSeptive Biosystems Voyager DE RP, usando matriz
ACH. La Fig. 1 muestra la pureza y el rendimiento del producto en a)
cromatograma de HPLC y b, c) espectros de MS. El rendimiento del
producto puro (RT 7.078) era 50% con relación a las impurezas en el
análisis por HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Etapa
1
Se puso resina ChemMatrix (0,1 mmol, 0,45
mmol/g) en la jeringa de polipropileno. La resina se sometió a los
siguientes lavados/tratamientos con CH_{2}Cl_{2} (3 x 0,5 min),
DMF (3 x 0,5 min) y DMF (5 x 0,5 min). A continuación, se añadieron
Fmoc-asidero de Rink (3 equiv) y DIEA (6 equiv) en
DMF (1 ml), seguido por Py-BOP (3 equiv) y HOAt (3
equiv) en DMF (5 ml). La mezcla se dejó agitar mecánicamente durante
2 h y la resina se lavó con DMF (3 x 0,5 min) y la prueba de
ninhidrina era negativa.
\newpage
Etapa
2
El grupo Fmoc se retiró y se añadió
secuencialmente Fmoc-aa-OH a la
peptidil-resina anterior (etapa 1) en el
sintetizador automático ABI 433A que se describe anteriormente.
Etapa
3
La acetilación final se llevó a cabo con una
solución de Ac_{2}O-DIEA-DMF
(10:5:85) en DMF (5 ml) durante 15 min con agitación manual
esporádica, cuando la ninhidrina era negativa.
Etapa
4
El péptido-resina se suspendió
en TFA-iPr_{3}SiH-H_{2}O
(95:2,5:2,5) y la mezcla se dejó agitar durante 2 h. A
continuación, se añadió éter/hexano, el péptido se precipitó, el
disolvente se retiró después de la centrifugación y se añadieron
éter/hexano adicionales y se retiraron después de la centrifugación.
Esta operación se repitió varias veces. Finalmente, se añadió
H_{2}O (5 ml) y se lio filizó.
EI-MS, calc. 4489. Encontrado:
m/z [M+2H]^{2+}/2 2248
<110> Lonza AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de síntesis de péptidos
<130> LP2045
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
Claims (11)
1. Método para preparar un péptido sobre una
fase sólida, péptido que tiene al menos 24 residuos de aminoácido
de longitud y péptido que puede tener cadenas laterales de
aminoácido individualmente protegidas y/o desprotegidas,
caracterizado porque dicho péptido se prepara unido a una
fase sólida, fase sólida que es una resina de PEG anfifílica que
comprende sólo grupos funcionales poliéter como un elemento
estructural de reticulación interna y en donde el péptido comprende
un segmento formador de hélice, libre de prolina, que tiene al menos
12 residuos de longitud.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la capacidad de carga de la resina de
PEG es al menos 0,5 mmol/g.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la longitud total del péptido que ha de
sintetizarse, y péptido que comprende los segmentos peptídicos
helicoidales mencionados anteriormente, es al menos 30
aminoácidos.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el péptido es T-20,
T-20 acetilado N-terminalmente,
timosina-\alphaI o es un péptido de repetición
heptádica de 15-40 residuos de aminoácido que tiene
un elemento de secuencia fusogénica
\alpha-helicoidal que está solapado con
T-20 en al menos 10 residuos.
5. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el péptido
se conecta a la fase sólida a través de un conector o asidero
funcional.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 5,
caracterizado porque el conector es un conector generador de
amida, preferiblemente es un conector de amida de Sieber o Rink.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la resina de PEG es una resina de PEG
funcionalizada con aminoalquilo, función amino a la que el péptido
está unido formando una peptidilcarboxamida
C\alpha-terminal.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 2 ó
5, caracterizado porque la resina es una resina de PEG, en
donde la resina no es un poliestireno-PEG mixto o un
copolímero o un copolímero de bloques, preferiblemente porque la
resina es una resina de PEG sustancialmente pura.
9. Conjugado de un péptido de al menos 24
residuos de aminoácido y una fase sólida de resina de PEG
sustancialmente pura, resina que es una resina de PEG anfifílica
que comprende sólo grupos funcionales poliéter como un elemento
estructural de reticulación interna y en donde el péptido comprende
un segmento formador de hélice, libre de prolina, que tiene al
menos 12 residuos de longitud.
10. Conjugado de péptido-resina
de PEG de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado
porque el resto peptídico tiene la secuencia de aminoácidos R1
Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Oln-Gln-Glu-Lys-Asn-Gln-Glu-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala=Ser-Leu-Tip=Asn-Trp-Phe
y en el que R1 es H, acetilo o un grupo protector retirable, lo más
preferiblemente R1 es acetilo, y en el que los residuos de
aminoácido individuales pueden comprender además un grupo protector
de cadena lateral.
11. Conjugado de péptido-resina
de PEG de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado
porque el resto peptídico es
timosina-\alpha1.
Applications Claiming Priority (6)
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|---|---|---|---|
| EP05007694 | 2005-04-08 | ||
| EP05007694 | 2005-04-08 | ||
| EP05010051 | 2005-05-09 | ||
| EP05010051 | 2005-05-09 | ||
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06724190T Active ES2336245T3 (es) | 2005-04-08 | 2006-04-10 | Sintesis peptidica de helices alfa sobre resina de peg. |
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