KR20100102652A

KR20100102652A - 고체- 및 용액-상 조합 기법을 사용한 인슐린친화성 펩타이드 합성

Info

Publication number: KR20100102652A
Application number: KR1020107015264A
Authority: KR
Inventors: 린 첸; 연-퀘이 한; 크리스토퍼 알 로버츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2007-12-11
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2010-09-24
Also published as: BRPI0820765A2; CN101903400B; TW200927756A; PE20091214A1; TWI374890B; AU2008334783A1; US8227571B2; JP2011506376A; EP2222695A2; CN101903400A; CA2707132A1; ZA201003849B; CL2008003660A1; RU2010128247A; WO2009074483A3; MX2010006044A; WO2009074483A2; US20090292108A1; AR069608A1; IL205932A0

Abstract

본 발명은 고체-상 및 용액-상("혼성") 접근법을 이용하여 합성되는 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이 접근법은 고체-상 화학을 이용하여 3가지 상이한 펩타이드 중간체 단편을 합성함을 포함한다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 제 3 단편에 부가하고, 이를 이어서 제 2 단편에 커플링 시키고, 이 후 용액 상태의 제 1 단편과 커플링시킨다. 다르게는, 상이한 제 2 단편을 용액-상인 제 1 단편과 커플링 시킨다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 상이한 제 3 단편에 부가한다. 이어서, 이러한 상이한 제 3 단편을 용액-상인 커플링된 제 1 및 상이한 제 2 단편에 커플링시킨다. 단편 중 하나에 슈도프롤린을 사용하면 그 단편의 고체-상 합성이 용이해지고, 또한 이 단편과 다른 단편의 후속 용액-상 커플링도 용이해진다. 본 발명은 GLP-1(7-36) 및 이들의 천연 및 비-천연 대응물과 같은 인슐린친화성 펩타이드를 생성시키는데 매우 유용하다.

Description

고체- 및 용액-상 조합 기법을 사용한 인슐린친화성 펩타이드 합성{INSULINOTROPIC PEPTIDE SYNTHESIS USING SOLID AND SOLUTION PHASE COMBINATION TECHNIQUES}

본 발명은 고체-상(solid-phase) 및 용액-상(solution-phase) 방법을 이용하여 인슐린친화성(insulinotropic) 펩타이드, 구체적으로는 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 그의 대응물(counterpart)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 방법에 사용될 수 있는 중간체 펩타이드 단편에 관한 것이다.

많은 펩타이드 합성 방법이 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,015,881 호, 및 문헌[Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; 및 Andersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250]을 참고). 다양한 합성 방법은 합성이 이루어지는 상의 물리적 상태, 즉 액체-상 또는 고체-상에 의해 구분된다.

고체-상 펩타이드 합성(SPPS)에서는, 아미노산 또는 펩타이드 기를 고체 지지체 수지에 결합시킨다. 이어, 연속적인 아미노산 또는 펩타이드 기를 관심 있는 펩타이드 물질이 형성될 때까지 지지체-결합된 펩타이드에 부착한다. 지지체-결합된 펩타이드를 전형적으로 지지체로부터 절단하고 추가로 가공시키고/시키거나 정제시킨다. 몇몇 경우에서, 고체-상 합성은 성숙 펩타이드 생성물을 생성시키고; 다른 경우에서는 지지체로부터 절단된 펩타이드(즉, "펩타이드 중간체 단편")를 더 큰 성숙 펩타이드 생성물을 제조하는데 사용한다.

고체-상 방법으로부터 생성된 펩타이드 중간체 단편을 고체-상 또는 액체-상 합성 방법(본원에서는 "용액-상 합성"이라고 함)에서 함께 커플링할 수 있다. 용액-상 합성은 고체-상에 의한 유용한 성숙 펩타이드의 합성이 불가능하거나 실용적이지 못한 경우에 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 고체-상 합성에서는, 보다 긴 펩타이드가 고체 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안 궁극적으로 불규칙한 형상을 갖게 되어 성장하는 쇄에 추가적인 아미노산 또는 펩타이드 물질을 부가하기 어렵게 될 수 있다. 펩타이드 쇄가 지지체 수지 상에서 더 길어짐에 따라, 커플링 및 탈보호 같은 공정 단계의 효율이 희생될 수 있다. 이로 인해 다시, 활성화가능한 아미노산, 보조 시약 및 용매 같은 출발 물질의 증가된 소실 외에도, 상기 문제점을 상쇄시키기 위해 가공 시간이 길어질 수 있다. 펩타이드의 길이가 증가함에 따라 이러한 문제점이 더 커질 수 있다.

따라서, 고체-상 절차만을 이용하여 단일 단편에서 합성된, 아미노산 30개보다 더 큰 길이의 성숙 펩타이드를 찾기는 비교적 드문 일이다. 대신, 고체-상에서 개별 단편을 별도로 합성한 다음 고체-상 및/또는 용액 상에서 커플링하여 목적하는 펩타이드 생성물을 구축할 수 있다. 이 접근법에서는 후보 단편을 조심스럽게 선택해야 한다. 몇몇 일반적인 원리에 따라 단편을 선택할 수 있지만, 후보 단편을 상당히 자주 실험에 의해 시험해야 한다. 한 상황에서 작용하는 단편 전략이 다른 상황에서는 작용하지 않을 수도 있다. 적당한 후보 단편이 밝혀진 경우에라도, 상업적으로 적당한 조건하에 작용하는 합성 전략을 위해 공정 개혁이 여전히 요구될 수 있다. 그러므로, 혼성 체계를 이용하는 펩타이드 합성이 흔히 요구되며, 많은 경우 실제 합성을 수행할 때까지는 어떤 문제점이 합성 반응에 내재하는지를 예측하기가 어렵다.

용액-상 커플링에서는, 통상 커플링 반응의 효율 및 품질을 증진시키는 추가적인 시약의 존재하에서, 2개의 펩타이드 중간체 단편, 또는 펩타이드 중간체 단편 및 반응성 아미노산을 적절한 용매 중에서 커플링시킨다. 한 단편의 N-말단이 다른 단편의 C-말단에 커플링되도록, 또는 그 반대가 되도록 펩타이드 중간체 단편을 반응성 있게 배열한다. 또한, 고체-상 합성 동안 존재하는 측쇄 보호기는 통상 용액-상 커플링 동안 단편 상에 보유되어, 단편의 말단의 특이적인 반응성을 보장한다. 이들 측쇄 보호기는 전형적으로 성숙 펩타이드가 생성된 후에야 제거된다.

전체적인 합성 반응의 하나 이상의 단계에서의 최근 개선에 의해 성숙 펩타이드의 제조에서 상당한 개선을 이룰 수 있다. 이러한 개선에 의해 시간 및 시약을 전체적으로 크게 절약할 수 있고, 또한 최종 생성물의 순도 및 수율을 크게 개선할 수 있다.

혼성 합성에서의 개선의 중요성에 대한 논의는 이들 절차를 이용하여 생성되는 임의의 종류의 펩타이드에 적용할 수 있으면서, 치료 면에서 유용하고 상업적 의료 용도의 규모로 제조되는 펩타이드와 관련하여서는 특히 중요하다. 치료용 펩타이드 같은 보다 큰 생물 분자 약제의 합성은 비용이 매우 비쌀 수 있다. 시약의 비용, 합성 시간, 다수의 합성 단계 및 다른 요인으로 인해, 이러한 보다 큰 생물 분자 약제의 합성 방법에서의 매우 작은 개선은 이러한 약제를 생성시키는 것이 경제적인 면에서 실행가능한지의 여부에 대해 상당한 영향력을 가질 수 있다. 다수의 경우, 존재한다면 이러한 유형의 보다 큰 생물 분자 약제에 대한 적합한 치료 대안이 매우 소수라는 사실에 의해 뒷받침되는 바와 같이, 보다 큰 생물 분자 약제의 높은 생산 비용으로 인해, 상기 개선이 필요하다.

이는 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 그의 대응물의 경우에 명백히 보여진다. 이들 펩타이드는 유형 2 비-인슐린-의존성 진성 당뇨병 및 관련 대사 장애(예컨대, 비만)의 치료에 가능한 치료제로서 관련되어 왔다. 문헌[Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994:17:1039-44].

로페즈(Lopez) 등은 천연 GLP-1의 길이가 37개 아미노산 잔기임을 밝혀내었다. 문헌[Lopez, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80:5485-5489 (1983)]. 이러한 발견은 우텐탈(Uttenthal, L. O.) 등의 문헌[J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61:472-479 (1985)]의 연구에 의해 확인되었다. 천연 GLP-1은 GLP-1(1-37)이라는 표기로 표시될 수 있다. 이 표기는 펩타이드가 1(N-말단) 내지 37(C-말단)의 아미노산을 모두 가짐을 나타낸다. 천연 GLP-1(1-37)은 다음과 같은 서열 식별 번호: 1에 따른 아미노산 서열을 갖는다:

서열 식별 번호: 1

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

천연 GLP-1(1-37)은 통상 인슐린 생합성을 매개할 수 없으나 이 펩타이드의 생물학적으로 중요한 단편은 인슐린친화성 특성을 갖는 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, 하기 서열 식별 번호: 2에 따른 길이가 31개 아미노산인 천연 펩타이드 GLP-1(7-37)은 인슐린친화성이고 천연 GLP-1의 7(N 말단) 내지 37(C 말단) 위치의 아미노산을 갖는다:

서열 식별 번호: 2

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

GLP-1(7-37)은 말단 글리신을 갖는다. 이 글리신이 존재하지 않는 경우, 생성된 펩타이드는 여전히 인슐린친화성을 나타내고, 하기 서열 식별 번호: 3에 따른 GLP-1(7-36)로 불린다:

서열 식별 번호: 3

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

GLP-1(7-36)은 흔히 아마이드화된(amidated) 형태에서 C-말단 아르기닌을 갖는 상태로 존재하고, 이 형태는 GLP-1(7-36)-NH₂라는 표기로 표시될 수 있다.

GLP-1(1-37)은 통상 생체 내에서 그의 인슐린친화성 대응물로 전환된다. 예를 들어, GLP-1(1-37)은 생체 내에서 자연적으로 GLP-1(7-37)로 전환된다. 이 펩타이드는 다시 C-말단 글리신의 단백질 분해성 제거에 의해 추가적으로 처리되어 GLP-1(7-36)을 생성시킬 수 있으며, 이는 흔히 아마이드화된 형태인 GLP-1(7-36)-NH₂로 존재한다. 따라서, 치료를 위한 처치는 생체 내에서 그의 인슐린친화성 유도체가 형성된다는 예상에 의해 GLP-1(1-37) 또는 그의 대응물을 투여함을 포함할 수 있다. 그러나, 더욱 통상적으로, 연구되고 있는 치료를 위한 처치는 인슐린친화성을 나타내는 GLP-1 단편 자체를 투여함을 포함한다.

미국 특허 제 6,887,849 호에 따라, GLP-1(7-37), GLP-1(7-36) 및 GLP-1(7-36)-NH₂의 인슐린친화성은 췌장 베타 세포에 특이적인 것으로 보이며, 여기에서 이들 펩타이드는 인슐린의 생합성을 유도하는 것으로 보인다. 이로 인해, 이들 펩타이드 및 그의 약학적으로 허용가능한 대응물은 성인기 발증형 진성 당뇨병, 즉 인슐린 분비의 역학이 비정상적인 고혈당증을 그 특징으로 하는 질병의 병인 연구에 유용하다. 뿐만 아니라, 이들 글루카곤-유사 펩타이드는 이 질환의 치료 및 처치에, 또한 고혈당증의 치료 및 처치에 유용하다. 유럽 특허 제 1137667 B1 호에 따라, 이들 펩타이드 및 이들의 약학적으로 허용가능한 대응물은 또한 다른 유형의 당뇨병, 비만, 글루카곤종, 기도의 분비 장애, 대사 장애, 관절염, 골다공증, 중추신경계 질환, 재협착증, 신경 변성 질환, 신부전, 울혈성 심부전, 신증후군, 간경변, 폐부종, 고혈압 및/또는 음식 섭취 감소가 요구되는 장애를 치료하는 데에도 유용할 수 있다.

서열 식별 번호: 1 내지 3에 따른 천연 GLP-1(1-37) 및 그의 인슐린친화성 천연 대응물은 대사 면에서 불안정하여 생체 내에서 겨우 1 내지 2분의 혈장 반감기를 갖는다. 외부에서 투여된 GLP-1도 급속하게 분해된다. 이 대사 불안정성이 천연 GLP-1 및 그의 천연 단편의 치료능을 한정하였다.

개선된 안정성을 갖는 GLP-1 펩타이드의 합성 대응물이 개발되었다. 예를 들어, 하기 서열 식별 번호: 4에 따른 펩타이드가 유럽 특허 제 1137667 B1 호에 기재되어 있다:

서열 식별 번호: 4

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

이 펩타이드는 알파-아미노아이소뷰티르산(약어 Aib로 개략적으로 표시됨)의 비키랄(achiral) 잔기가 8 및 35 위치에서 상응하는 천연 아미노산 대신 이들 위치에 나타난다는 것을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36)과 유사하다. 비키랄 알파-아미노아이소뷰티르산은 또한 메틸알라닌으로도 알려져 있다. 이 펩타이드는 식 (Aib^8,35)GLP-1(7-36) 또는 아마이드화된 형태인 (Aib^8,35)GLP-1(7-36)-NH₂로 표시될 수 있다.

유럽 특허 제 1137667 B1 호는 고체-상 기법을 이용하여 서열 식별 번호: 4에 따른 펩타이드 및 그의 대응물을 단일 단편으로서 구축할 수 있다고 기재하고 있다. 유럽 특허 제 1137667 B1 호에서 제안된 이 단일 단편 합성 접근법은 문제가 많다. 한 논쟁점으로서, 이 접근법은 최종 아미노산 커플링, 예를 들어 (Aib^8,35)GLP-1(7-36)의 경우 히스티딘 커플링에서 높은 수준의 에피머화를 야기할 수 있다. 또한, 크로마토그래피에 의한 정제 동안 불순물을 제거하기 어려울 수 있고, 수율이 너무 낮은 경향이 있을 수 있다. 결과적으로, 이 펩타이드 및 그의 대응물을 상업적으로 허용가능한 수율, 순도 및 양으로 제조하기 위해서는, 서열 식별 번호: 4에 따른 펩타이드를 합성하기 위한 개선된 전략이 필요하다.

이들 우려 외에도, 펩타이드의 대규모 생산을 위한 생성물 회수 및 생성물 순도뿐만 아니라 시약 취급, 저장 및 폐기와 관련된 논쟁점은 펩타이드 합성 반응의 실행가능성에 크게 영향을 끼칠 수 있다. 그러므로, 개선된 수율로 큰 배치량의 상업적으로 관심을 끄는 펩타이드 물질을 효율적으로 생성시킬 수 있는 펩타이드 합성 방법이 지속적으로 요구되고 있다.

본 발명은 고체-상 및 용액-상("혼성") 접근법을 이용하여 합성되는 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이 접근법은 고체-상 화학을 이용하여 3가지 상이한 펩타이드 중간체 단편을 합성함을 포함한다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 단편 중 하나에 부가한다. 이어, 단편을 용액-상에서 함께 커플링시킨다. 단편 중 하나에 슈도프롤린을 사용하면 그 단편의 고체-상 합성이 용이해지고, 또한 이 단편과 다른 단편의 후속 용액-상 커플링도 용이해진다. 본 발명은 GLP-1, GLP-1(7-36) 및 이들의 천연 및 비-천연 대응물, 특히 GLP-1(7-36) 및 그의 천연 및 비-천연 대응물 같은 인슐린친화성 펩타이드를 생성시키는데 매우 유용하다.

한 양태에서, 본 발명은

(a) 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 5

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 -OH이고;

상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)

(b) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 6

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

(c) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 6

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

(d) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 7

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 -OH이고;

(e) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(f) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(g) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 7 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 9

Z-HX⁸EX¹⁰-B'

(여기에서,

X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 -OH이고;

H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및

(h) 제 7 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 6 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;

를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법을 제공한다.

"N-말단 보호기"는 Acr(아크릴릴), Bz(벤조일), Ac(아세틸), Trt(트리틸) Boc(t-뷰틸옥시카보닐), CBz(벤질옥시-카보닐 또는 Z), Dts(다이티아석시노일), Rdtc(R= 알킬 또는 아릴, dtc = 다이티오카바메이트), DBFmoc(2,7-다이-t-뷰틸Fmoc 또는 1,7-다이-t-뷰틸플루오렌-9-일메톡시카보닐), Alloc(알릴옥시카보닐), pNZ(p-나이트로벤질옥시카보닐), Nsc([[2-[(4-나이트로페닐)설포닐]-에톡시]카보닐]), Msc(2-메틸설포닐에톡시카보닐), MBz(4-메톡시CBz), Poc(2-페닐프로필(2)-옥시카보닐), Bpoc[(1-[1,1'-바이페닐]-4-일-1-메틸에톡시)카보닐], Bnpeoc[[2,2-비스(4-나이트로페닐)-에톡시]카보닐], CBz[(페닐메톡시)카보닐], Aoc[(1,1-다이메틸프로폭시)카보닐] 및 Moz[[(4-메톡시페닐)메톡시]카보닐]로 이루어진 군 중에서 선택된 기를 의미한다. 바람직한 N-말단 기는 Fmoc, Bpoc, Trt, Poc 및 Boc가 있다.

"비키랄의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기"는 천연 비키랄 글리신 또는 다른 비키랄 아미노산으로부터 유도될 수 있는 아미노산이다. 바람직하게는, 비키랄의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기는 글리신(G), 2-메틸알라닌(Aib) 및 2-페닐메틸-페닐알라닌으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 비키랄의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기는 G 및 Aib 중에서 선택된다.

바람직한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 5

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 -OH이고;

서열 식별 번호: 6

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

서열 식별 번호: 6

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

서열 식별 번호: 7

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 -OH이고;

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 9

Z-HX⁸EX¹⁰-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 -OH이고;

H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

다른 양태에서, 본 발명은 상기 방법에서

(i) 인슐린친화성 펩타이드의 N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및

(j) 단계 (i)로부터 생성된 인슐린친화성 펩타이드를 산과 접촉시켜 아미노산 측쇄를 탈보호함으로써 하기 서열 식별 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 11

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이다)

를 추가로 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 방법에서 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드가 하기 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다:

서열 식별 번호: 12

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 5

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

(b) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 5

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 H-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

(c) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 7

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 -OH이고;

(d) 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편을 고체-상인 제 2 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 13

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(e) 고체-상 수지로부터 제 4 펩타이드 단편을 제거하고, 용액 상태의 제 4 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 9

Z-HX⁸EX¹⁰-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 -OH이고;

H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

바람직한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 5

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 5

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 H-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

(c) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 7

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 -OH이고;

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(f) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 9

Z-HX⁸EX¹⁰-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 -OH이고;

H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 방법에서

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 11

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

를 추가로 포함하는 방법을 제공한다.

서열 식별 번호: 12

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

"고체-상 수지"는 하나 이상의 중합체, 공중합체 또는 중합체들의 조합, 예를 들면 폴리아마이드, 폴리설프아마이드, 치환된 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글라이콜, 페놀성 수지, 다당류 또는 폴리스타이렌으로부터 제조될 수 있고, 전형적으로 성장하는 펩타이드가 합성 동안 커플링될 수 있는 연결기를 포함하는 고체-상 펩타이드 합성의 실시에 적합한 임의의 유형의 지지체를 의미한다. 바람직하게는, 고체-상 수지는 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지, 트리틸 클로라이드 수지, 4-메틸트리틸 클로라이드 수지, 4-메톡시트리틸 클로라이드 수지, 4-아미노뷰탄-1-올 2-클로로트리틸 수지, 4-아미노메틸벤조일 2-클로로트리틸 수지, 3-아미노프로판-1-올 2-클로로트리틸 수지, 브로모아세트산 2-클로로트리틸 수지, 사이아노아세트산 2-클로로트리틸 수지, 4-사이아노벤조산 2-클로로트리틸 수지, 글리시놀 2-클로로트리틸 수지, 프로피오닉 2-클로로트리틸 수지, 에틸렌글라이콜 2-클로로트리틸 수지, N-Fmoc 하이드록실아민 2-클로로트리틸 수지, 하이드라진 2-클로로트리틸 수지, 4-하이드록시메틸페닐옥시메틸 부착기를 갖는 폴리스타이렌-다이비닐벤젠 수지(PS 수지), 및 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시뷰티르산 수지로 이루어진 군 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 고체-상 수지는 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지이다.

한 양태에서, 본 발명은

(a) 하기 서열 식별 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편 또는 그의 대응물을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 13

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 -OH이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(b) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(c) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(d) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 9

Z-HX⁸EX¹⁰-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 -OH이고;

H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및

(e) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

바람직한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 13

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 -OH이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 8

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 9

Z-HX⁸EX¹⁰-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 -OH이고;

H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 방법에서

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 11

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

를 추가로 포함하는 방법을 제공한다.

서열 식별 번호: 12

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

상기 방법이 무엇이든지 Boc(t-뷰틸옥시카보닐), CBz(벤질옥시카보닐 또는 Z), Dts(다이티아석시노일), Rdtc(R= 알킬 또는 아릴, dtc = 다이티오카바메이트), DBFmoc(2,7-다이-t-뷰틸Fmoc 또는 1,7-다이-t-뷰틸플루오렌-9-일메톡시카보닐), Alloc(알릴옥시카보닐), pNZ(p-나이트로벤질옥시카보닐), Nsc([[2-[(4-나이트로페닐)설포닐]-에톡시]카보닐]), Msc(2-메틸설포닐에톡시카보닐), MBz(4-메톡시CBz), Bpoc[(1-[1,1'-바이페닐]-4-일-1-메틸에톡시)카보닐], Bnpeoc[[2,2-비스(4-나이트로페닐)-에톡시]카보닐], CBz[(페닐메톡시)카보닐], Aoc[(1,1-다이메틸프로폭시)카보닐] 및 Moz[[(4-메톡시페닐)메톡시]카보닐]로 이루어진 군 중에서 선택된 N-말단 히스티딘 보호기(N-말단 보호기)를 사용할 수 있으며, 이때 N-말단 히스티딘 보호기가 산을 사용하여 전체적인 측쇄 탈보호 단계에서 제거될 수 있는 경우, N-말단 히스티딘 보호기의 우선 제거는 요구되지 않는다.

한 양태에서, 본 발명은 하기 서열 식별 번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다:

서열 식별 번호: 14

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAib-B'

(여기에서,

Z는 H- 및 Fmoc- 중에서 선택되고;

B'는 -OH 또는 고체-상 수지이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다).

다른 양태에서, 본 발명은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기가 Ser-Ser 잔기인 상기 펩타이드를 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 하기 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다:

서열 식별 번호: 15

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

(여기에서,

Z는 H- 및 Fmoc- 중에서 선택되고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

본 발명은 고체-상 및 용액-상("혼성") 접근법을 이용하여 합성되는 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이 접근법은 고체-상 화학을 이용하여 3가지 상이한 펩타이드 중간체 단편을 합성함을 포함한다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 단편 중 하나에 부가한다. 이어, 단편을 용액-상에서 함께 커플링시킨다. 단편 중 하나에 슈도프롤린을 사용하면 그 단편의 고체-상 합성이 용이해지고, 또한 이 단편과 다른 단편의 후속 용액-상 커플링도 용이해진다. 본 발명은 GLP-1, GLP-1(7-36) 및 이들의 천연 및 비-천연 대응물, 특히 GLP-1(7-36) 및 그의 천연 및 비-천연 대응물과 같은 인슐린친화성 펩타이드를 생성시키는데 매우 유용하다.

한 양태에서, 본 발명은

(a) 하기 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

(b) 단계 (a)의 제 1 펩타이드 단편을 고체-상 수지로부터 절단시켜 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편(하기 서열 식별 번호: 16)을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

(c) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

(d) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

"N-말단 보호기"는 Acr(아크릴릴), Bz(벤조일), Ac(아세틸), Trt(트리틸), Boc(t-뷰틸옥시카보닐), CBz(벤질옥시카보닐 또는 Z), Dts(다이티아석시노일), Rdtc(R= 알킬 또는 아릴, dtc = 다이티오카바메이트), DBFmoc(2,7-다이-t-뷰틸Fmoc 또는 1,7-다이-t-뷰틸플루오렌-9-일메톡시카보닐), Alloc(알릴옥시카보닐), pNZ(p-나이트로벤질옥시카보닐), Nsc([[2-[(4-나이트로페닐)설포닐]-에톡시]카보닐]), Msc(2-메틸설포닐에톡시카보닐), MBz(4-메톡시CBz), Poc(2-페닐프로필(2)-옥시카보닐), Bpoc[(1-[1,1'-바이페닐]-4-일-1-메틸에톡시)카보닐], Bnpeoc[[2,2-비스(4-나이트로페닐)-에톡시]카보닐], CBz[(페닐메톡시)카보닐], Aoc[(1,1-다이메틸프로폭시)카보닐] 및 Moz[[(4-메톡시페닐)메톡시]카보닐]로 이루어진 군 중에서 선택된다. 바람직한 N-말단 보호기는 Fmoc, Bpoc, Trt, Poc 및 Boc가 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

한 양태에서, 본 발명은 하기 서열 식별 번호: 17의 아미노산 서열을 갖는, 상기 방법에 따라 제조된 펩타이드를 제공한다:

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

상기 펩타이드의 한 변이형에서, X³⁵는 Aib이다.

한 양태에서, 본 발명은 하기 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는, 상기 방법에 따라 제조된 펩타이드를 제공한다:

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 고체-상 수지 또는 -OH이고;

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

상기 펩타이드의 한 변이형에서, X³⁵는 Aib이다.

한 양태에서, 본 발명은

(a) 하기 서열 식별 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

(b) 단계 (a)의 펩타이드 단편을 고체-상 수지로부터 절단시켜 용액 상태의 펩타이드 단편(서열 식별 번호: 18)을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

바람직한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

(b) 단계 (a)의 제 1 펩타이드 단편을 고체-상 수지로부터 절단시켜 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편(서열 식별 번호: 16)을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다),

(e) 하기 서열 식별 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

(f) 단계 (e)의 제 4 펩타이드 단편을 고체-상 수지로부터 절단시켜 용액 상태의 제 4 펩타이드 단편(서열 식별 번호: 18)을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

를 포함하는, 방법을 제공한다.

바람직한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

(d) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

를 포함하는, 방법을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은

(a) 제 1 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 2 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X⁸및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

바람직하게는, N-말단 보호기는 Fmoc이다.

한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다), 및

(g) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

를 포함하는, 방법을 제공한다.

바람직하게는, N-말단 보호기는 Fmoc이다.

한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다),

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(h) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

를 포함하는, 방법을 제공한다.

바람직하게는, N-말단 보호기는 Fmoc이다.

한 양태에서, 본 발명은

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 16

Z-FIAWLVKX³⁵-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다)

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

서열 식별 번호: 17

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;

B'는 고체-상 수지이고;

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

B'는 -OH이다),

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 N-말단 보호기이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

서열 식별 번호: 10

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

(i) 단계 (h)로부터 생성된 인슐린친화성 펩타이드를 산과 접촉시켜 아미노산 측쇄를 탈보호시킴으로써 하기 서열 식별 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:

서열 식별 번호: 11

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

(여기에서,

Z는 H-이고;

X⁸, X¹⁰및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이다)

를 포함하는, 방법을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 상기 방법에서 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드가 하기 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 방법을 제공한다:

서열 식별 번호: 12

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

한 양태에서, 본 발명은 하기 서열 식별 번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다:

서열 식별 번호: 18

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'

(여기에서,

Z는 H- 및 Fmoc- 중에서 선택되고;

B'는 -OH 또는 고체-상 수지이고;

X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;

상기 펩타이드의 한 변이형에서, 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기는 Ser-Ser 잔기이다.

한 양태에서, 상기 방법이 무엇이든지 Boc(t-뷰틸옥시카보닐), CBz(벤질옥시카보닐 또는 Z), Dts(다이티아석시노일), Rdtc(R= 알킬 또는 아릴, dtc = 다이티오카바메이트), DBFmoc(2,7-다이-t-뷰틸Fmoc 또는 1,7-다이-t-뷰틸플루오렌-9-일메톡시카보닐), Alloc(알릴옥시카보닐), pNZ(p-나이트로벤질옥시카보닐), Nsc([[2-[(4-나이트로페닐)설포닐]-에톡시]카보닐]), Msc(2-메틸설포닐에톡시카보닐), MBz(4-메톡시CBz), Bpoc[(1-[1,1'-바이페닐]-4-일-1-메틸에톡시)카보닐], Bnpeoc[[2,2-비스(4-나이트로페닐)-에톡시]카보닐], CBz[(페닐메톡시)카보닐], Aoc[(1,1-다이메틸프로폭시)카보닐] 및 Moz[[(4-메톡시페닐)메톡시]카보닐]로 이루어진 군 중에서 선택된 N-말단 히스티딘 보호기(N-말단 보호기)를 사용할 수 있으며, 이때 N-말단 히스티딘 보호기가 산을 사용하여 전체적인 측쇄 탈보호 단계에서 제거될 수 있는 경우, N-말단 히스티딘 보호기의 우선 제거는 요구되지 않는다.

하기 기재되는 본 발명의 실시양태는 총망라하고자 하는 의도가 아니거나, 또는 본 발명을 하기 상세한 설명에 개시되는 정밀한 형태로 한정하고자 하지는 않는다. 그보다는, 실시양태는 당해 분야의 숙련자가 본 발명의 원리 및 실시를 인지하고 이해할 수 있도록 선택 및 기재된다.

본 발명은 고체-상 및/또는 용액-상 기법을 이용하여, 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1), 및 그의 천연 및 비-천연 인슐린친화성 대응물과 같은 펩타이드를 제조하는 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 분자는 보호되거나, 보호되지 않거나 또는 부분적으로 보호될 수 있다. 보호는 N-말단 보호, 측쇄 보호 및/또는 C-말단 보호를 포함할 수 있다. 본 발명은 일반적으로 이들 글루카곤-유사 펩타이드, 이들의 대응물, 단편 및 이들의 대응물, 및 융합 생성물 및 이들의 대응물의 합성에 관한 것이지만, 본원의 발명의 교시내용은 또한 다른 펩타이드, 특히 고체-상 및 용액-상 접근법의 조합을 이용하여 합성되는 다른 펩타이드의 합성에도 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 불순물, 특히 피로글루타메이트 불순물이 결합된 펩타이드 중간체 단편의 합성에도 적용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 바람직한 GLP-1 분자는 천연 및 비-천연 GLP-1(7-36) 및 그의 대응물을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "아미노산 서열을 포함하는"은 바람직하게는 "아미노산 서열을 갖는"을 의미한다.

본원에 사용되는 "대응물"은 펩타이드의 천연 및 비-천연 유사체, 유도체, 융합 화합물, 염 등을 가리킨다. 본원에 사용되는 펩타이드 유사체는 통상 다른 펩타이드 또는 펩타이드 대응물과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 역전 및/또는 부가에 의해서와 같이 변형된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 나타낸다. 치환은 하나 이상의 천연 또는 비-천연 아미노산에 관련될 수 있다. 치환은 바람직하게는 보존성일 수 있거나 또는 매우 보존성일 수 있다. 보존성 치환은 아미노산을 보통 동일한 순전하 및 통상 동일한 크기 및 형상을 갖는 다른 아미노산으로 치환함을 말한다. 예를 들어, 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 측쇄의 탄소 및 헤테로원자의 총수가 약 4개 이하로 상이한 경우 거의 동일한 크기를 갖는다. 이들은 측쇄의 분지의 수가 약 1 또는 2개 이하로 상이한 경우 거의 동일한 형상을 갖는다. 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐 기를 갖는 아미노산은 거의 동일한 크기 및 형상을 갖는 것으로 생각된다. 아래에 나열된 것은 5가지 아미노산 군이다. 화합물의 아미노산을 동일한 군으로부터의 다른 아미노산으로 대체하면 통상 보존성 치환이 야기된다.

군 I: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌 및 C₁-C₄ 지방족 또는 C₁-C₄ 하이드록실 치환된 지방족 측쇄(직쇄 또는 하나의 분지를 가짐)를 갖는 비-천연 아미노산.

군 II: 글루탐산, 아스파르트산 및 카복실산 치환된 C₁-C₄ 지방족 측쇄(분지되지 않거나 또는 하나의 분지점을 가짐)를 갖는 비-천연 아미노산.

군 III: 리신, 오르니틴, 아르기닌 및 아민 또는 구아니디노 치환된 C₁-C₄ 지방족 측쇄(분지되지 않거나 또는 하나의 분지점을 가짐)를 갖는 비-천연 아미노산.

군 IV: 글루타민, 아스파라긴 및 아마이드 치환된 C₁-C₄ 지방족 측쇄(분지되지 않거나 또는 하나의 분지점을 가짐)를 갖는 비-천연 아미노산.

군 V: 페닐알라닌, 페닐글리신, 티로신 및 트립토판.

본원에 사용되는 용어 "대응물"은 더욱 바람직하게는 펩타이드의 염, 또는 C-말단에서 아마이드화된 그의 유도체를 나타낸다.

"매우 보존성인 치환"은 아미노산을 측쇄에 동일한 작용기를 갖고 거의 동일한 크기 및 형상을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 이들의 측쇄의 탄소 및 헤테로원자의 총수가 2개 이하로 상이한 경우 거의 동일한 크기를 갖는다. 이들은 측쇄에 동일한 수의 분지를 갖는 경우에 거의 동일한 형상을 갖는다. 매우 보존성인 치환의 예는 류신에 대해 발린, 세린에 대해 트레오닌, 글루탐산에 대해 아스파르트산, 페닐알라닌에 대해 페닐글리신을 포함한다.

"펩타이드 유도체"는 일반적으로 펩타이드, 펩타이드 유사체, 또는 그의 측기, 알파 탄소 원자, 말단 아미노 기, 및/또는 말단 카복실산 기 중 하나 이상이 화학적으로 변형된 다른 펩타이드 대응물을 말한다. 예를 들어, 화학적 변형은 화학적 잔기의 부가, 새로운 결합 형성 및/또는 화학적 잔기 제거를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 아미노산 측기에서의 변형은 리신 e-아미노 기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 카복실산 기의 알킬화 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아마이드화를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 말단 아미노 기의 변형은 데스-아미노, N-저급 알킬, N-다이-저급 알킬 및 N-아실(예컨대, -CO-저급 알킬) 변형을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 말단 카복실 기의 변형은 아마이드, 저급 알킬 아마이드, 다이알킬 아마이드 및 저급 알킬 에스터 변형을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 그러므로, 부분적으로 또는 완전히 보호된 펩타이드는 펩타이드 유도체를 구성한다.

본 발명을 실시함에 있어서, 화합물이 호르몬 인슐린의 합성 또는 발현을 자극시키거나 또는 자극을 야기하거나 또는 자극을 야기하는데 도움이 될 수 있다면, 이 화합물은 "인슐린친화성" 활성을 갖는다. 바람직한 실시 방식에 있어서, 인슐린친화성 활성은 미국 특허 제 6,887,849 호 및 제 6,703,365 호에 기재되어 있는 분석에 따라 입증될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 서열 식별 번호: 19를 갖는 합성(X⁸, X¹⁰, X³⁵)GLP-1(7-36) 펩타이드 및 그의 대응물을 합성하는 방법을 제공한다:

서열 식별 번호: 19

HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

여기에서, 8, 10 및 35 위치에서 기호 X 각각은 독립적으로 비키랄의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기를 나타낸다. 임의의 X⁸, X¹⁰및/또는 X³⁵잔기는 선택적으로 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 이러한 서열에 따른 펩타이드는 적어도 비키랄의, 선택적으로 입체 장애된 X⁸및 X³⁵ 잔기가 천연 아미노산 잔기의 8 및 35 위치에 치환된다는 점에서 천연 GLP-1(7-36)과는 상이하다. X¹⁰ 잔기는 천연 비키랄 글리신 또는 다른 비키랄 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 비키랄 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵ 아미노산의 사용은 생성되는 펩타이드를 안정화시키는데 도움이 될 뿐만 아니라, 최근 구축 블록의 연결기로서 이들 아미노산의 사용이 또한 반응식 1에 도시되고 아래에서 추가로 기재되는 바와 같이 본 발명의 합성 경로를 촉진시키는 것으로도 밝혀졌다.

본 발명의 원리에 따라 합성될 수 있는 (X⁸, X¹⁰, X³⁵)GLP-11(7-36) 펩타이드의 특히 바람직한 실시양태는 하기 서열 식별 번호: 12에 따른 펩타이드 및 그의 대응물을 포함하며, 바람직하게는 (나타낸 바와 같이) C-말단에서 아마이드화된다:

서열 식별 번호: 12

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

이 펩타이드는 X⁸ 및 X³⁵로서 알파-아미노아이소뷰티르산(또는 약어 Aib로 개략적으로 나타냄)의 비키랄 잔기를 사용하고, 바람직하게는 C-말단에 아마이드를 가지며, 10 위치에 천연 G의 잔기를 사용하고, 식 (Aib^8,35)GLP-1(7-36)-NH₂로 표시될 수 있다. 이 표기는 천연 알라닌 대신 8 및 35 위치에 아미노산 "Aib"에 상응하는 아미노산 잔기가 존재함을 나타낸다. 비키랄 알파-아미노아이소뷰티르산은 또한 메틸알라닌으로도 알려져 있다. 서열 식별 번호: 12에 따른 펩타이드는 유럽 특허 제 1137667 B1 호에 기재되어 있다. 8 및 35 위치에 Aib 잔기가 존재하면 체내에서의 대사 분해가 느려져서, 이 펩타이드가 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드보다 체내에서 훨씬 더 안정해진다.

본 발명은 (Aib^8,35)GLP-1(7-36)-NH₂와 같은 GLP-1(7-36) 펩타이드를 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 예로서, 반응식 1 및 2는 GLP-1(7-36) 펩타이드 및 이들의 대응물을 합성하는 두 가지 예시적인 반응을 도시한다. 반응식 1 및 2는 GLP-1(7-36) 펩타이드의 규모-확장 합성에 특히 적합한 것으로 생각된다. 전형적으로는 상업적인 분배에 유용한 양의 펩타이드를 제공하기 위하여 규모-확장 절차를 수행한다. 예를 들어, 규모-확장 절차에서 펩타이드의 양은 배치 당 500g 또는 1kg, 더욱 전형적으로는 배치 당 수십kg 내지 수백kg 이상일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 가공(합성) 시간의 감소, 생성물 수율의 개선, 생성물 순도의 개선 및/또는 요구되는 시약 및 출발물질의 양 감소 같은 개선을 제공할 수 있다.

반응식 1에 도시된 합성은 고체-상 및 용액-상 기법의 조합을 이용하여 펩타이드 생성물을 제조한다.

[반응식 1]

도시된 바와 같이, 반응식 1은 고체-상에서 펩타이드 중간체 단편 1, 2 및 3을 합성함을 포함한다. 단편 1은 하기 서열 식별 번호: 20에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편이거나, 또는 X⁸ 및 X¹⁰ 잔기를 포함하는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 20

HX⁸EX¹⁰

여기에서, X⁸ 및 X¹⁰은 상기 정의된 바와 같다.

아미노산 잔기 중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 단편 12는 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 가질 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기인 것으로 밝혀졌다. 또한, Trt(트리틸)는 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기인 것으로 밝혀졌다. Boc, CBz, DTS, Rdtc(R = 알킬 또는 아릴), DBFmoc(2,7-다이-t-뷰틸Fmoc), Alloc, pNZ(p-나이트로벤질 에스터), Nsc([[2-[(4-나이트로페닐)설포닐]에톡시]카보닐]-), Msc(2-메틸설포닐에톡시카보닐) 및 MBz(4-메톡시CBz)가 또한 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기이다. [(1-[1,1'-바이페닐]-4-일-1-메틸에톡시)카보닐], [[2,2-비스(4-나이트로페닐)-에톡시]카보닐], [(페닐메톡시)카보닐], [(1,1-다이메틸프로폭시)카보닐] 및 [[(4-메톡시페닐)메톡시]카보닐]은 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기이다.

단편 1은 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 7 내지 10 위치의 아미노산에 상응하는 4개의 아미노산 잔기를 포함하고, 따라서 (X⁸, X¹⁰)GLP-1(7-10)이라는 표기로 표시될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 하기 서열 식별 번호: 21에 따라 X⁸은 Aib이고, X¹⁰은 글리신이거나, 또는 그의 대응물은 10 위치에 Aib 잔기를 포함한다:

서열 식별 번호: 21

H⁷AibEG¹⁰

서열 식별 번호: 7에 따른 펩타이드 단편은 (Aib⁸)GLP-1(7-10)이라는 표기에 의해 표시되어, 천연 GLP-1(7-10)의 8 위치에서 천연 알라닌이 Aib로 치환됨을 나타낼 수 있다.

고체-상 합성은 통상 단편 1의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 그러므로, 단편의 C-말단부에 존재하는 X¹⁰ 아미노산은 고체-상 수지 지지체에 연결되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 히스티딘 잔기(H))가 초기 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다.

서열 식별 번호: 20 및 21에 따른 펩타이드 단편의 선택 및 사용은 반응식 1에서 상당한 이점을 제공한다. 첫번째로, H(히스티딘)는 적어도 부분적으로 에피머화 문제로 인해 성장하는 펩타이드 쇄에 아미노산 잔기를 부가하기가 어려운 경향이 있다. 그러나, 단편 1은 이러한 우려를 크게 경감시키기에 충분히 작다. 또한, 단편 1은 2개의 키랄 중심을 가지기에 충분히 길다. 따라서, 간단히 결정화시킴으로써 단편을 정제시킬 수 있다. 단편 1이 Aib에서 종결되면, 단편은 하나의 키랄 중심만을 갖게 되고, 그 결과 정제시키기가 더욱 어렵다. 비키랄 G를 C-말단에 위치시키면, 단편 1이 C-말단에서 키랄 E로 종결되는 경우 우려가 될 수 있는 라세미화 우려를 피하게 된다. 간단히, 단편 1을 펩타이드 구축 블록으로서 선택하면 단편을 구축하고 정제하며 이를 다른 펩타이드 물질에 커플링시키기가 더욱 용이해진다. 단편 선택은 또한 H의 낮은 라세미화를 야기한다. 놀랍게도, H는 매우 낮은 에피머화 수준으로, 예를 들어 일부 실시 방식에서 약 0.5중량%로 이 단편에 부가된다.

단편 2는 하기 서열 식별 번호: 22에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편이거나, 또는 17 및 18 위치에 X^17-18을 포함하는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 22

T¹¹FTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EG

여기서, X^17-18로 표시되는 잔기는 아래에서 추가로 정의되는 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이다. 단편 2는 통상 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 상응하는 17 및 18 위치를 점유하는 SS(Ser-Ser) 잔기 대신 슈도프롤린 다이펩타이드 잔기 X^17-18을 사용함을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 11 내지 22 위치에 있는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.

단편 2의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 단편 2는 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 가질 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성과 관련하여 특히 유용한 N-말단 보호기인 것으로 밝혀졌다. 서열 식별 번호: 22에 따른 펩타이드 단편은 표기 (X^17-18)GLP-1(11-22)로 표시되어, 17 및 18 위치의 Ser-Ser 잔기가 X^17-18 슈도프롤린 잔기로 치환됨을 나타낼 수 있다.

본 발명의 실시에 사용되는 용어 슈도프롤린은 하이드록실 작용성 측쇄가 알파-아미노와 측쇄 하이드록실 사이에서 프롤린-유사, TFA 불안정성 옥사졸리딘 고리로서 보호되는 Ser 또는 Thr과 같은 하이드록실 작용성 아미노산의 잔기를 포함하는 다이펩타이드를 일컫는다. 옥사졸리딘 고리의 결과, 다이펩타이드는 가역적인 프롤린 모방체(mimetic)로서 기능한다.

일반적으로, 펩타이드 내로 도입되는 전형적인 슈도프롤린 잔기는 하기 화학식으로서 표시될 수 있다:

상기 식에서, Φ는 임의의 아미노산의 잔기를 나타내고, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 적합한 2가 연결 잔기이다.

흔히, R¹은 하기 화학식으로 표시되는 2가 잔기이다:

상기 식에서, R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬(예: 메틸)과 같은 1가 잔기이다. R³ 및 R⁴는 또한 고리 구조체의 공동-일원일 수도 있다. 바람직하게는, R³ 및 R⁴는 각각 메틸이다. 옥사졸리디닌 고리-보호된 Ser의 경우에는 R²가 2가 잔기인 CH₂인 반면, Thr의 경우에는 R²가 2가 잔기인 (CH₃)CH이다.

용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 1가 알킬 라디칼을 가리킨다. 이 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, s-뷰틸, 아이소뷰틸, 3급-뷰틸, n-펜틸, 3-메틸뷰틸, n-헥실, 2-에틸뷰틸 등과 같은 라디칼로 추가로 예시된다. 바람직한 저급 알킬 잔기는 메틸 및 에틸이고, 메틸이 특히 바람직하다.

탈보호 동안, R¹ 잔기가 절단되어 하기 화학식에 따른 다이펩타이드 잔기를 제공한다:

상기 식에서, Φ 및 R²는 상기 정의된 바와 같다.

단편 2에 적용될 때, 슈도프롤린 잔기는 바람직하게는 C-말단에 더욱 근접한 Ser이 옥사졸리딘 고리로 보호되는 Ser-Ser 잔기에 상응하고, 하기 화학식의 구조를 갖는다:

N-말단에 더 가까운 Ser의 하이드록실-함유 측쇄는 3급-뷰틸 보호기에 의해서와 같이 보호된다. 보호하는 옥사졸리딘 고리 구조체 및 3급-뷰틸이 절단될 때, Ser-Ser 잔기가 생성된다.

단편 2의 합성시 구축 블록으로서 이러한 프롤린 모방체를 사용하면 본 발명과 관련하여 상당한 이점이 제공된다. 첫째, 단편 2의 고체-상 합성이 엄청나게 용이해진다. 단편 2의 고체-상 합성 과정에 슈도프롤린이 사용되지 않는 경우에는, 잔기(11)를 통해 잔기(13)로부터 Fmoc를 제거하는데 상당한 문제가 있을 수 있다. 이러한 어려움은 베타 시트 형성에 기인할 수 있는 것으로 생각된다. 슈도프롤린의 사용은 베타 시트 형성 정도를 감소시키는 것으로 여겨지므로 이러한 Fmoc 제거를 훨씬 더 용이하게 만든다. 둘째, 상기 반응식 1에 나타낸 바와 같은 단편 2의 단편 3으로의 후속 고체-상 커플링이 훨씬 용이해진다. 슈도프롤린 잔기의 부재시에는, 전형적인 용액-상 커플링 용매 중에서의 단편의 용해도가 매우 불량하다. 슈도프롤린은 단편 2의 용해도 특성(단편 2를 혼입하는 보다 긴 단편)을 향상시켜, 단편 1의 후속 용액-상 커플링이 용이해진다.

고체-상 합성은 통상 단편 1의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 따라서, 단편의 C-말단부에 존재하는 G 아미노산이 고체-상 수지 지지체에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. 그러나, 17 및 18 위치에 한 쌍의 천연 Ser 잔기를 연속적으로 부가하는 대신에, GLP-1(7-36)의 17 및 18 위치에 상응하는 위치에서 X^17-18 슈도프롤린 다이펩타이드를 성장하는 쇄에 부가한다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 트레오닌 잔기(T))가 초기 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다.

단편 3은 하기 서열 식별 번호: 23에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 대응물이거나, 또는 X³⁵잔기를 포함하는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 23

Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵

여기서, X³⁵는 상기 정의된 바와 같다. 아미노산 잔기 중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 단편 3은 X³⁵가 위치 35의 천연 아미노산 대신 그 위치에 존재함을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 23 내지 35 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 단편 3은 표기 (X³⁵)GLP-1(23-35)로 표시될 수 있다.

일부 실시양태에서, 펩타이드 단편 3은 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 선택적으로 측쇄, N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 가질 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성과 관련하여 특히 유용한 N-말단 보호기인 것으로 밝혀졌다.

바람직한 실시양태에서, X³⁵는 하기 서열 식별 번호: 24에 따른 35 위치에 Aib를 포함하는 Aib 또는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 24

Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKAib³⁵

서열 식별 번호: 10에 따른 펩타이드 단편은 표기 (Aib³⁵)GLP-1(23-35)로 표시되어, 천연 GLP-1(7-36)의 35 위치에 있는 천연 아미노산이 Aib로 치환됨을 나타낼 수 있다.

서열 식별 번호: 23 및 24에 따른 단편 3이 C 말단의 36 위치에 R(Arg) 잔기를 아직 포함하지 않음에 주목한다. 바람직하게는 측쇄 보호 없이 Arg를 사용하여 용액-상에서 단편 3의 C 말단에 Arg를 후속 커플링시킨다. 이 전략은 반응식 1에서 상당한 이점을 제공하는데, 왜냐하면 이로 인해 보호된 Arg를 사용한 결과로서 발생되는 경향이 있는 바람직하지 못한 부반응이 피해지기 때문이다. 예를 들어, 보호된 Arg의 탈보호시에는, 탈보호의 부산물이 펩타이드의 다른 성분, 예컨대 트립토판과 반응하는 경향이 있을 수 있다. 이로 인해, 조질 물질 중 정제에 이용될 수 있는 목적하는 펩타이드의 양이 감소된다.

고체-상 합성은 통상 단편 3의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 따라서, 단편의 C-말단부에 존재하는 X³⁵ 아미노산이 고체-상 수지 지지체에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 글루타민 잔기(Q))가 초기 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다. 단편 3의 합성에 사용되는 임의의 아미노산은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다.

X³⁵-로딩된(loaded) 지지체 수지에 근접한 입체 장애로 인해, 리신(34) 및 발린(33)의 성장하는 펩타이드 쇄로의 커플링이 문제가 될 수 있다. 과량의 아미노산을 사용하는 경우에라도, 이들 커플링 반응은 완료되기가 어렵다. 용매 선택 및/또는 말단-캡핑이 이 문제를 경감시키는데 도움이 될 수 있다. 커플링 용매의 특성이 커플링이 완료되는 정도에 영향을 줄 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 한 세트의 실험에서 3:1 NMP/DCM, 1:1 NMP/DCM, 1:1 DMF/DCM 및 3:1 DMF/DCM 중에서 커플링 반응을 수행하였다. 이들 용매 조합의 비는 부피 기준이다. NMP는 N-메틸피롤리돈을 나타내고, DCM은 다이클로로메테인을 나타내며, DMF는 다이메틸포름아마이드를 나타낸다. 1:1 DMF/DCM을 사용하는 경우에 커플링 반응이 완료를 위해 더 진행된 것으로 밝혀졌다.

각각의 리신 및 발린 커플링 후의 말단-캡핑을 이용하여서도 추가적인 커플링 반응에서 미반응 수지-지지된 물질이 생기는 것을 방지할 수 있다. 말단-캡핑된 물질은 필요한 경우 정제되는 동안 더욱 용이하게 제거된다. 통상적인 말단-캡핑 기법을 이용할 수 있다.

계속 반응식 1을 보면, Arg와 함께 단편 1, 2 및 3을 조합하여 목적하는 펩타이드를 완성시킨다.

반응식 1은 Arg가 용액-상인 단편 3의 C-말단에 부가되어 중간체 단편 3'가 수득됨을 보여준다. 바람직하게는, 이러한 방식으로 펩타이드 단편에 부가되는 Arg는 측쇄 보호를 포함하지 않는다. 이어서, 단편 2가 단편 3'에 부가되어 17 및 18 위치에서 Ser-Ser이 여전히 보호된 슈도프롤린 형태로 있는 하기 서열 식별 번호: 25에 따른 아미노산 잔기를 혼입한 보다 큰 중간체 단편이 생성된다:

서열 식별 번호: 25

TFTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EG Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵R-NH₂

여기서, X³⁵는 상기 정의된 바와 같고, 바람직하게는 Aib이며, X^17-18은 상기 정의된 바와 같은 슈도프롤린 다이펩타이드 잔기이다. 중간체 단편은 표기 (X^17-18,X³⁵)GLP-1(11-36)으로 표시될 수 있다. 아미노산이 측쇄 보호를 갖는 정도로, 이러한 보호는 바람직하게는 이 단계 내내 유지된다.

추가로, 반응식 1은 단편 1이 용액 상태의 중간체 단편에 부가되어 목적하는 펩타이드(서열 식별 번호: 26)가 생성됨을 보여준다:

서열 식별 번호: 26

HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 서열 식별 번호: 19를 갖는 합성(X⁸, X¹⁰, X³⁵)GLP-1(7-36) 펩타이드 및 그의 대응물을 합성하는 방법을 제공한다:

서열 식별 번호: 19

HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

여기에서, 8, 10 및 35 위치에서 기호 X 각각은 독립적으로 비키랄의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기를 나타낸다. 임의의 X⁸, X¹⁰및/또는 X³⁵잔기는 선택적으로 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 이러한 서열에 따른 펩타이드는 적어도 비키랄의, 선택적으로 입체 장애된 X⁸및 X³⁵ 잔기가 천연 아미노산 잔기의 8 및 35 위치에 치환된다는 점에서 천연 GLP-1(7-36)과는 상이하다. X¹⁰ 잔기는 천연 비키랄 글리신 또는 다른 비키랄 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 비키랄 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵ 아미노산의 사용은 생성되는 펩타이드를 안정화시키는데 도움이 될 뿐만 아니라, 최근 구축 블록으로서 이들 아미노산의 사용이 또한 반응식 1에 도시되고 아래에서 추가로 기재되는 바와 같이 본 발명의 용이한 합성 경로를 촉진시키는 것으로도 밝혀졌다.

서열 식별 번호: 12

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

이 펩타이드는 X⁸ 및 X³⁵로서 알파-아미노아이소뷰티르산(또는 약어 Aib로 개략적으로 나타냄)의 비키랄 잔기를 사용하고, 바람직하게는 C-말단에 아마이드를 가지며, 10 위치에 천연 G의 잔기를 사용하고, 식 (Aib^8,35)GLP-1(7-36)-NH₂로 표시될 수 있다. 이 표기는 천연 알라닌 대신 8 및 35 위치에 아미노산 "Aib"에 상응하는 아미노산 잔기가 존재함을 나타낸다. 비키랄 알파-아미노아이소뷰티르산은 또한 메틸알라닌으로도 알려져 있다. 서열 식별 번호: 4에 따른 펩타이드는 유럽 특허 제 1137667 B1 호에 기재되어 있다. 8 및 35 위치에 Aib 잔기가 존재하면 체내에서의 대사 분해가 느려져서, 이 펩타이드가 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드보다 체내에서 훨씬 더 안정해진다.

반응식 2에 도시된 합성은 고체-상 및 용액-상 기법의 조합을 이용하여 펩타이드 생성물을 제조한다.

[반응식 2]

도시된 바와 같이, 반응식 2는 고체-상에서 펩타이드 중간체 단편 1+2 및 3을 합성함을 포함한다. 단편 1+2는 하기 서열 식별 번호: 27에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편이거나, 또는 X⁸ 및 X¹⁰ 잔기를 포함하는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 27

HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE

여기에서, X⁸및 X¹⁰은 상기 정의된 바와 같다.

아미노산 잔기 중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 단편 12는 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 가질 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기인 것으로 밝혀졌다. 또한, Trt(트리틸)는 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기인 것으로 밝혀졌다. Boc(t-뷰틸옥시카보닐), CBz(벤질옥시-카보닐 또는 Z), Dts(다이티아석시노일), Rdtc(R= 알킬 또는 아릴, dtc = 다이티오카바메이트), DBFmoc(2,7-다이-t-뷰틸Fmoc 또는 1,7-다이-t-뷰틸플루오렌-9-일메톡시카보닐), Alloc(알릴옥시카보닐), pNZ(p-나이트로벤질옥시카보닐), Nsc([[2-[(4-나이트로페닐)설포닐]-에톡시]카보닐]), Msc(2-메틸설포닐에톡시카보닐) 및 MBz(4-메톡시CBz)가 또한 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기이다. Bpoc[(1-[1,1'-바이페닐]-4-일-1-메틸에톡시)카보닐], Bnpeoc[[2,2-비스(4-나이트로페닐)-에톡시]카보닐], CBz[(페닐메톡시)카보닐], Aoc[(1,1-다이메틸프로폭시)카보닐] 및 Moz[[(4-메톡시페닐)메톡시]카보닐]는 펩타이드 단편의 고체-상 합성 및 용액- 또는 고체-상 커플링과 관련하여 특히 유용한 N-말단 히스티딘 보호기이다.

단편 1+2는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 7 내지 27 위치의 아미노산에 상응하는 20개의 아미노산 잔기를 포함하고, 따라서 (X⁸, X¹⁰, X^17-18)GLP-1(7-27)이라는 표기로 표시될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 하기 서열 식별 번호: 28에 따라 X⁸은 Aib이고, X¹⁰은 글리신이거나, 또는 그의 대응물은 10 위치에 Aib 잔기를 포함한다:

서열 식별 번호: 28

H⁷AibEGTFTSDVX^17-18YLEGQAAKE²⁷

서열 식별 번호: 28에 따른 펩타이드 단편은 (Aib⁸, X^17-18)GLP-1(7-27)이라는 표기에 의해 표시되어, 천연 GLP-1(7-36)의 8 위치에서 천연 알라닌이 Aib로 치환됨을 나타낼 수 있다. 기호 X^17-18에 의해 정의되는 잔기는 하기에서 추가로 정의되는 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기 또는 17 및 18 위치에서 X^17-18을 포함하는 그의 대응물이다.

단편 2는 통상 천연 GLP-1(7-36)의 상응하는 17 및 18 위치를 점유하는 SS(Ser-Ser) 잔기 대신 슈도프롤린 다이펩타이드 잔기 X^17-18을 사용함을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 11 내지 27 위치에 있는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.

단편 2의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 단편 2는 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 가질 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성과 관련하여 특히 유용한 N-말단 보호기인 것으로 밝혀졌다. 서열 식별 번호: 29에 따른 펩타이드 단편 2는 표기 (X^17-18)GLP-1(11-27)로 표시되어, 17 및 18 위치의 Ser-Ser 잔기가 X^17-18 슈도프롤린 잔기로 치환됨을 나타낼 수 있다:

서열 식별 번호: 29

TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE²⁷

본 발명의 실시에 사용되는 용어 슈도프롤린은 하이드록실 작용성 측쇄가 알파-아미노와 측쇄 하이드록실 사이에서 프롤린-유사, TFA 불안정성, 옥사졸리딘 고리로서 보호되는 Ser 또는 Thr과 같은 하이드록실 작용성 아미노산의 잔기를 포함하는 다이펩타이드를 일컫는다. 옥사졸리딘 고리의 결과, 다이펩타이드는 가역적인 프롤린 모방체로서 기능한다.

단편 1+2의 합성시 구축 블록으로서 이러한 프롤린 모방체를 사용하면 본 발명과 관련하여 상당한 이점이 제공된다. 첫째, 단편 2의 고체-상 합성이 엄청나게 용이해진다. 단편 2의 고체-상 합성 과정에 슈도프롤린이 사용되지 않는 경우에는, 잔기(11)를 통해 잔기(13)로부터 Fmoc를 제거하는데 상당한 문제가 있을 수 있다. 이러한 어려움은 베타 시트 형성에 기인할 수 있는 것으로 생각된다. 슈도프롤린의 사용은 베타 시트 형성 정도를 감소시키는 것으로 여겨지므로 이러한 Fmoc 제거를 훨씬 더 용이하게 만든다. 슈도프롤린 잔기의 부재시에는, 전형적인 용액-상 커플링 용매 중에서의 단편의 용해도가 매우 불량하다. 슈도프롤린은 단편 2 (및 단편 2를 혼입하는 보다 긴 단편, 예컨대 단편 1+2)의 용해도 특성을 향상시켜, 단편 1+2의 후속 용액-상 커플링이 용이해진다.

고체-상 합성은 통상 단편 1+2의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 따라서, 단편의 C-말단부에 존재하는 E²⁷ 아미노산이 고체-상 수지 지지체에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. 그러나, 17 및 18 위치에 한 쌍의 천연 Ser 잔기를 연속적으로 부가하는 대신에, GLP-1(7-36)의 17 및 18 위치에 상응하는 위치에서 X^17-18 슈도프롤린 다이펩타이드를 성장하는 쇄에 부가한다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 트레오닌 잔기(T))가 초기 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다.

단편 3은 하기 서열 식별 번호: 30에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 대응물이거나, 또는 X³⁵잔기를 포함하는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 30

FIA³⁰WLVKX³⁵

여기서, X³⁵는 상기 정의된 바와 같다. 아미노산 잔기 중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 단편 3은 X³⁵가 위치 35의 천연 아미노산 대신 그 위치에 존재함을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 28 내지 35 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 서열 식별 번호: 30에 따른 단편 3은 표기 (X³⁵)GLP-1(28-35)로 표시될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, X³⁵는 하기 서열 식별 번호: 31에 따른 35 위치에 Aib를 포함하는 Aib 또는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 31

FIA³⁰WLVKAib³⁵

서열 식별 번호: 31에 따른 펩타이드 단편은 표기 (Aib³⁵)GLP-1(28-35)로 표시되어, 천연 GLP-1(7-36)의 35 위치에 있는 천연 아미노산이 Aib로 치환됨을 나타낼 수 있다.

서열 식별 번호: 30 및 31에 따른 단편 3이 C 말단의 36 위치에 R(Arg) 잔기를 아직 포함하지 않음에 주목한다. 바람직하게는 측쇄 보호 없이 Arg를 사용하여 용액-상에서 단편 3의 C 말단에 Arg를 후속 커플링시킨다. 이 전략은 반응식 2에서 상당한 이점을 제공하는데, 왜냐하면 이로 인해 보호된 Arg를 사용한 결과로서 발생되는 경향이 있는 바람직하지 못한 부반응이 피해지기 때문이다. 예를 들어, 보호된 Arg의 탈보호시에는, 탈보호의 부산물이 펩타이드의 다른 성분, 예컨대 트립토판과 반응하는 경향이 있을 수 있다. 이로 인해, 조질 물질 중 정제에 이용될 수 있는 목적하는 펩타이드의 양이 감소된다.

단편 3'는 하기 서열 식별 번호: 32에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 대응물이거나, 또는 X³⁵잔기를 포함하는 그의 대응물이다:

서열 식별 번호: 32

FIA³⁰WLVKX³⁵R-NH₂

여기서, X³⁵는 상기 정의된 바와 같다. 아미노산 잔기 중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 단편 3'는 X³⁵가 위치 35의 천연 아미노산 대신 그 위치에 존재함을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 28 내지 36 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 서열 식별 번호: 32에 따른 단편 3'는 표기 (X³⁵)GLP-1(28-36)로 표시될 수 있다.

고체-상 합성은 통상 단편 3의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 따라서, 단편의 C-말단부에 존재하는 X³⁵ 아미노산이 고체-상 수지 지지체에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 글루타민 잔기(Q))가 초기 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다. 단편 3의 합성에 사용되는 임의의 아미노산은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호를 포함할 수 있다.

X³⁵-로딩된 지지체 수지에 근접한 입체 장애로 인해, 리신(34) 및 발린(33)의 성장하는 펩타이드 쇄로의 커플링이 문제가 될 수 있다. 과량의 아미노산을 사용하는 경우에라도, 이들 커플링 반응은 완료되기가 어렵다. 용매 선택 및/또는 말단-캡핑이 이 문제를 경감시키는데 도움이 될 수 있다. 커플링 용매의 특성이 커플링이 완료되는 정도에 영향을 줄 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 한 세트의 실험에서 3:1 NMP/DCM, 1:1 NMP/DCM, 1:1 DMF/DCM 및 3:1 DMF/DCM 중에서 커플링 반응을 수행하였다. 이들 용매 조합의 비는 부피 기준이다. NMP는 N-메틸피롤리돈을 나타내고, DCM은 다이클로로메테인을 나타내며, DMF는 다이메틸포름아마이드를 나타낸다. 1:1 DMF/DCM을 사용하는 경우에 커플링 반응이 완료를 위해 더 진행된 것으로 밝혀졌다.

계속 반응식 2를 보면, Arg와 함께 단편 1, 2 및 3을 조합하여 목적하는 펩타이드를 완성시킨다.

반응식 2는 Arg가 용액-상인 단편 3의 C-말단에 부가되어 하기 서열 식별 번호: 32에 따른 중간체 단편 3'가 수득됨을 보여준다.

서열 식별 번호: 32

FIA³⁰WLVKX³⁵R-NH₂

여기서, X³⁵는 상기 정의된 바와 같고, 바람직하게는 Aib이다. 바람직하게는, 이러한 방식으로 펩타이드 단편에 부가된 Arg는 측쇄 보호를 포함하지 않는다.

이어서, 17 및 18 위치에서 Ser-Ser이 여전히 보호된 슈도프롤린 형태로 있고, 표기 (X^17-18, X³⁵)GLP-1(11-36)으로 표시될 수 있는 하기 서열 식별 번호: 27에 따른 단편 1+2는 용액-상의 단편 3'에 커플링된다:

서열 식별 번호: 27

HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE

아미노산이 측쇄 보호를 갖는 정도로, 이러한 보호는 바람직하게는 이 단계 내내 유지된다. 이어서, 하기 서열 식별 번호: 26에 따른 단편 1+2+3을 혼입하는 목적하는 펩타이드가 형성되며, 이때 바람직한 실시양태에서, X⁸은 Aib이고, X¹⁰은 천연 G이고, X^17-18은 상기 정의된 바와 같은 슈도프롤린 다이펩타이드 잔기이다:

서열 식별 번호: 26

HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

반응식 1 및 2의 반응을 수행함에 있어서는, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 방법에 의해 고체-상 및 용액-상 합성을 수행할 수 있다. 대표적인 실시 방식에서는, 아미노산이 C-말단으로부터 N-말단으로 부가되는 화학적 수단을 이용하여 고체-상에서 펩타이드를 합성한다. 따라서, 특정 단편의 C-말단에 근접한 아미노산 또는 펩타이드 기가 먼저 수지에 부가되어야 한다. 아미노산 또는 펩타이드 기의 C-말단 작용기를 수지 지지체 상의 상보적인 작용기와 반응시킴으로써 이를 수행한다. 아미노산 또는 펩타이드 기의 N-말단부를 마스킹하여 바람직하지 못한 부반응을 방지한다. 아미노산 또는 펩타이드 기는 바람직하게는 또한 측쇄 보호도 포함한다. 이어, 관심 있는 펩타이드가 생성될 때까지 연속적인 아미노산 또는 펩타이드 기를 지지체-결합된 펩타이드 물질에 부착시킨다. 이들 중 대부분은 또한 통상적인 실시에 따라 측쇄 보호를 포함한다. 각각의 연속적인 커플링시, 수지 결합된 펩타이드 물질의 N-말단에 있는 마스킹 기를 제거한다. 이어, 이를 N-말단이 마스킹된, 다음 아미노산의 C-말단과 반응시킨다. 따라서, 고체-상 합성의 생성물은 수지 지지체에 결합된 펩타이드이다.

분석 또는 품질면에서 잔류 용매, 잔류 다이벤조풀벤 또는 변이형의 양과 같은 단편의 품질 차이로 인한 영향을 최소화하기 위하여, 계산을 위한 기초로서 각 단편의 총 펩타이드 분석을 사용하는 개념이 있다. 대부분의 단편 2의 펩타이드성 불순물이 단편 2와 다소 동일한 중량을 갖고 단편 2로서 반응하며 대부분의 단편 3'의 펩타이드성 불순물이 단편 3'와 다소 동일한 중량을 갖고 단편 3'로서 반응하기 때문에, 총 펩타이드 개념은 반응물의 비율을 조정하기 위해 허용된다. 계산을 위해서, 다이벤조풀벤은 펩타이드가 아닌 UV-신호(단편과 동일한 반응 인자)에 의해 대규모로 과평가되는 덩어리로서 간주되기 때문에 일반적으로 고려되지 않는다. 따라서, 단편의 총 펩타이드 분석은 다음과 같은 수학식에 따라 계산될 수 있다:

[수학식 a]

분석(%-mm) × (100 - 다이벤조풀벤의 양(%-면적))/[품질(%-면적)]

[수학식 b]

주 성분 및 총 펩타이드성 불순물의 합(%-(w/w)) - 다이벤조풀벤(%-(mm))(펩타이드와 동일한 반응 인자)

고체-상 펩타이드 합성을 실시하는데 적합한 임의의 유형의 지지체를 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지지체는 폴리아마이드, 폴리설프아마이드, 치환된 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글라이콜, 페놀 수지, 다당류, 또는 폴리스타이렌 같은 하나 이상의 중합체, 중합체의 공중합체 또는 조합으로부터 제조될 수 있는 수지를 포함한다. 중합체 지지체는 또한 펩타이드 합성에 사용되는 용매에 충분히 불용성이고 불활성인 임의의 고체일 수 있다. 고체 지지체는 전형적으로 성장하는 펩타이드가 합성 동안 이에 커플링되고 목적하는 조건하에서 절단되어 지지체로부터 펩타이드를 방출할 수 있는 연결 잔기를 포함한다. 적합한 고체 지지체는 광-절단성, TFA-절단성, HF-절단성, 플루오라이드 이온-절단성, 환원-절단성; Pd(O)-절단성; 친핵성-절단성; 또는 라디칼-절단성인 연결기를 가질 수 있다. 바람직한 연결 잔기는 절단된 펩타이드의 측쇄 기가 여전히 실질적으로 전체적으로 보호되도록 하는 조건하에서 절단될 수 있다.

하나의 바람직한 합성 방법에서는, 트리틸 기를 포함하는 산 감수성 고체 지지체 상에서, 더욱 바람직하게는 펜던트 염소 기를 갖는 트리틸 기를 포함하는 수지, 예를 들어 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지 상에서 펩타이드 중간체 단편을 합성한다(문헌[Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946]). 예는 또한 트리틸 클로라이드 수지, 4-메틸트리틸 클로라이드 수지, 4-메톡시트리틸 클로라이드 수지, 4-아미노뷰탄-1-올 2-클로로트리틸 수지, 4-아미노메틸벤조일 2-클로로트리틸 수지, 3-아미노프로판-1-올 2-클로로트리틸 수지, 브로모아세트산 2-클로로트리틸 수지, 사이아노아세트산 2-클로로트리틸 수지, 4-사이아노벤조산 2-클로로트리틸 수지, 글리시놀 2-클로로트리틸 수지, 프로피오닉 2-클로로트리틸 수지, 에틸렌글라이콜 2-클로로트리틸 수지, N-Fmoc 하이드록실아민 2-클로로트리틸 수지, 하이드라진 2-클로로트리틸 수지를 포함한다. 몇몇 바람직한 고체 지지체는 다이비닐벤젠과 공중합되어 반응성 기가 고정되는 지지체 물질을 생성시킬 수 있는 폴리스타이렌을 포함한다.

고체-상 합성에 사용되는 다른 수지는 4-하이드록시메틸페닐옥시메틸 고정기를 갖는 스타이렌과 다이비닐벤젠의 공중합체를 포함하는 "왕(Wang)" 수지(문헌[Wang, S.S., 1973, J. Am. Chem. Soc]); 및 4-하이드록시-메틸-3-메톡시페녹시뷰티르산 수지(문헌[Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706])를 포함한다. 왕 수지, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 및 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시뷰티르산 수지는 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 칼바이오켐-노바바이오켐 코포레이션(Calbiochem-Novabiochem Corp.)에서 구입할 수 있다.

고체-상 합성용 수지를 제조하기 위하여, 수지를 적합한 용매(들) 중에서 선-세척할 수 있다. 예를 들어, 2-CTC 수지 같은 고체-상 수지를 펩타이드 챔버에 첨가하고 적합한 용매로 선-세척한다. 커플링 반응에 사용되는 용매(또는 용매의 혼합물)의 유형에 기초하여 선-세척 용매를 선택할 수 있거나, 또는 그 역으로 한다. 세척, 및 후속 커플링 반응에 적합한 용매는 다이클로로메테인(DCM), 다이클로로에테인(DCE), 다이메틸포름아마이드(DMF) 등, 및 이들 시약의 혼합물을 포함한다. 다른 유용한 용매는 DMSO, 피리딘, 클로로폼, 다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, N-메틸피롤리돈 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 경우에는, 부피비 9:1 내지 1:9, 더욱 통상적으로는 4:1 내지 1:4의 DMF와 DCM의 혼합물 같은 2원 용매 시스템에서 커플링을 수행할 수 있다.

달리 표시되지 않는 한 적절한 보호기의 존재하에서 본 발명의 합성을 바람직하게 수행한다. 보호기의 특성 및 용도는 당해 분야에 널리 알려져 있다. 일반적으로, 적합한 보호기는 그가 부착되는 원자 또는 잔기, 예를 들어 산소 또는 질소가 가공 및 합성 동안 바람직하지 못한 반응에 참여하지 못하도록 방지하는데 도움을 줄 수 있는 임의의 종류의 기이다. 보호기는 측쇄 보호기 및 아미노- 또는 N-말단 보호기를 포함한다. 보호기는 또한 카복실산, 티올 등의 반응 또는 결합도 방지할 수 있다.

측쇄 보호기는 측쇄의 일부가 펩타이드 합성, 가공 등의 단계에 사용되는 화학약품과 반응하지 못하도록 방지하는데 도움을 주는, 아미노산의 측쇄(즉, 일반적인 아미노산의 화학식 H₂N-C(R)(H)-COOH에서 R 기)에 연결된 화학적 잔기를 일컫는다. 측쇄-보호기의 선택은 다양한 인자, 예를 들어 수행되는 합성의 유형, 펩타이드에 가해지는 가공, 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 따라 달라질 수 있다. 측쇄 보호기의 특성은 또한 아미노산 자체의 특성에 따라 달라진다. 일반적으로는, 고체-상 합성시 α-아미노기의 탈보호 동안 제거되지 않는 측쇄 보호기가 선택된다. 따라서, α-아미노 보호기와 측쇄 보호기는 전형적으로 동일하지 않다.

일부 경우, 또한 고체-상 합성 및 다른 펩타이드 가공에 사용되는 시약의 유형에 따라, 아미노산은 측쇄 보호기의 존재를 필요로 하지 않을 수 있다. 일부 아미노산은 전형적으로 측쇄에 반응성 산소, 질소 또는 다른 반응성 잔기를 포함하지 않는다.

측쇄 보호기의 예는 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 3급-뷰틸, 트라이페닐메틸(트리틸), 테트라하이드로피란일, 벤질 에터(Bzl) 및 2,6-다이클로로벤질(DCB), 3급-뷰톡시카보닐(Boc), 나이트로, p-톨루엔설포닐(Tos), 아다만틸옥시카보닐, 잔틸(Xan), 벤질, 2,6-다이클로로벤질, 메틸, 에틸 및 3급-뷰틸 에스터, 벤질옥시카보닐(Bz 또는 Z), 2-클로로벤질옥시카보닐(2-Cl-Z), 3급-아밀옥시카보닐(Aoc), 및 방향족 또는 지방족 우레탄-형 보호기, 나이트로 베라트릴옥시카보닐(NVOC)과 같은 광불안정성 기; 및 2-트라이메틸실릴에톡시카보닐(TEOC)과 같은 플루오라이드 불안정성 기를 포함한다.

본 발명을 실시함에 있어서 GLP-1 펩타이드를 합성하는데 통상적으로 사용되는 아미노산에 바람직한 측쇄 보호기가 하기 표 A에 기재된다:

[표 A]

아미노-말단 보호기는 아미노산의 알파 아미노 기에 커플링되는 화학적 잔기를 포함한다. 전형적으로, 아미노-말단 보호기는 성장하는 펩타이드 쇄에 부가되어야 하는 다음 아미노산의 부가 전에 탈보호 반응에서 제거되지만, 펩타이드가 지지체로부터 절단될 때에는 유지될 수 있다. 아미노 말단 보호기의 선택은 다양한 인자, 예컨대 수행되는 합성의 유형 및 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 따라 달라질 수 있다.

아미노-말단 보호기의 예는 (1) 폼일, 아크릴릴(Acr), 벤조일(Bz) 및 아세틸(Ac) 같은 아실-형 보호기; (2) 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 Z(예컨대, p-클로로벤질옥시카보닐, p-나이트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐) 같은 방향족 우레탄-형 보호기; (3) 3급-뷰틸옥시카보닐(Boc), 다이아이소프로필메톡시카보닐, 아이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 알릴옥시카보닐 같은 지방족 우레탄 보호기; (4) 9-플루오렌일-메틸옥시카보닐(Fmoc), 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐 및 사이클로헥실옥시카보닐 같은 사이클로알킬 우레탄-형 보호기; 및 (5) 페닐티오카보닐 같은 티오우레탄-형 보호기를 포함한다. 바람직한 보호기는 9-플루오렌일-메틸옥시카보닐(Fmoc), 2-(4-바이페닐릴)-프로필(2)옥시카보닐(Bpoc), 2-페닐프로필(2)-옥시카보닐(Poc) 및 3급-뷰틸옥시카보닐(Boc)을 포함한다.

Fmoc 또는 Fmoc-유사 화학적 수단이 고체-상 펩타이드 합성에 매우 바람직한데, 보호된 상태의 생성된 펩타이드의 절단이 약산성 절단제를 사용하여 수행하기에 비교적 간단하기 때문이다. 이러한 종류의 절단 반응은 생성되는 부산물, 불순물 등의 면에서 비교적 깨끗하여, 팽윤 및 수축 세척으로부터 펩타이드를 대규모로 회수하기가 기술적으로나 경제적으로 용이해지는 바, 수율이 향상된다. 본원에 사용되는, 펩타이드 합성과 관련된 "대규모"는 통상 배치당 500g 이상, 더욱 바람직하게는 배치당 2kg 이상의 펩타이드 합성을 포함한다. 대규모 합성은 전형적으로 수지, 용매, 아미노산, 커플링 및 탈보호 반응용 화학약품 같은 시약을, kg 내지 톤 범위의 펩타이드를 생성시킬 수 있도록 하는 크기의 양으로 수용할 수 있는 강 반응 용기 같은 큰 반응 용기에서 수행된다.

또한, Fmoc 보호기는 측쇄 보호기에 대해 펩타이드로부터 선택적으로 절단되어, Fmoc가 절단될 때 측쇄 보호기가 제 자리에 유지되도록 할 수 있다. 이러한 종류의 선택성은 측쇄 반응을 최소화하기 위하여 아미노산 커플링 동안 중요하다. 또한, 측쇄 보호기는 Fmoc에 대해 선택적으로 절단되어 제거될 수 있어서, Fmoc를 제 자리에 남길 수 있다. 아래에 더 기재되는 정제 반응 동안 이 후자의 선택성에 매우 유리하게 의존한다.

커플링 반응을 향상 또는 개선시키는 하나 이상의 화합물의 존재하에서 고체-상 커플링 반응을 수행할 수 있다. 반응 속도를 증가시킬 수 있고 부반응 속도를 감소시킬 수 있는 화합물은 3급 염기, 예컨대 다이아이소프로필에틸아민(DIEA) 및 트라이에틸아민(TEA)의 존재하에서 보호된 아미노산을 활성화된 부류로 전환시킬 수 있는(예를 들어, BOP, PyBOPO, HBTU 및 TBTU는 모두 HOBt 에스터를 생성시키고, DEPBT는 HOOBt 에스터를 생성시킴) 포스포늄 및 우로늄 염을 포함한다. 다른 시약은 보호 시약을 제공함으로써 라세미화를 방지하는데 도움을 준다. 이들 시약은 보조 친핵체(예를 들어, 1-하이드록시-벤조트라이아졸(HOBt), 1-하이드록시-아자벤조트라이아졸(HOAt) 또는 HOSu)가 첨가된 카보다이이미드(예컨대, DCC 또는 WSCDI)를 포함한다. 아자이드 방법과 마찬가지로, 그에 연관되는 낮은 라세미화 덕분에, 보조 친핵체가 첨가되거나 첨가되지 않은 아이소뷰틸 클로로포름에이트를 사용하는 혼합된 무수물 방법을 또한 이용할 수 있다. 이들 유형의 화합물은 또한 카보다이이미드-매개되는 커플링의 속도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 Asn 및 Gln 잔기의 탈수를 방지할 수도 있다.

커플링이 완료된 것으로 결정된 후에는, 커플링 반응 혼합물을 용매로 세척하고, 펩타이드 물질의 후속 아미노산 잔기 각각에 대해 커플링 사이클을 반복한다. 다음 아미노산을 커플링시키기 위하여, 전형적으로는 N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 다이메틸포름아마이드(DMF)와 같은 용매 중에서 피페리딘 20 내지 50%(중량 기준)를 포함하는 시약으로 처리함으로써, 수지-결합된 물질로부터 N-말단 보호기(예컨대, Fmoc 기)를 제거한다. Fmoc 보호기를 제거한 후, 전형적으로 수회 세척하여 잔류 피페리딘 및 Fmoc 부산물(예컨대, 다이벤조풀벤 및 그의 피페리딘 부가물)을 제거한다.

수지 지지체 상의 펩타이드 물질의 로딩 계수에 비해 아미노산이 화학량론적 과량이 되도록 후속 아미노산을 사용할 수 있다. 일반적으로, 커플링 단계에 사용되는 아미노산의 양은 수지 상의 첫번째 아미노산의 로딩 계수에 적어도 상응한다(1당량 이상). 바람직하게는, 커플링 단계에 사용되는 아미노산의 양은 1.3당량(0.3 과량) 이상, 가장 바람직하게는 약 1.5당량(0.5 과량) 이상이다. 일부 경우에는, 예컨대 커플링 단계에서 1 내지 3당량의 아미노산을 사용한다.

최종 커플링 사이클을 수행한 후, 수지를 NMP와 같은 용매로 세척한 다음, DCM 같은 불활성 제 2 용매로 세척한다. 수지로부터 합성된 펩타이드 물질을 제거하기 위하여, 절단된 펩타이드 물질이 여전히 충분한 측쇄 및 말단 보호기를 갖도록 하는 방식으로 절단 처리를 수행한다. 보호기를 제 자리에 유지시키는 것은 수지 절단 동안 또는 후에 펩타이드 단편의 바람직하지 못한 커플링 또는 다른 바람직하지 못한 반응을 방지하는데 도움을 준다. Fmoc 또는 유사한 화학적 수단을 사용하여 펩타이드를 합성하는 경우에는, DCM 같은 용매 중에서 아세트산 또는 묽은 TFA 같은 비교적 약산 시약을 사용하는 것과 같은 임의의 목적하는 방식으로 보호된 절단을 달성할 수 있다. DCM 중 0.5 내지 10중량%, 바람직하게는 1 내지 3중량%의 TFA를 사용하는 것이 전형적이다. 예컨대 미국 특허 제 6,281,335 호 참조.

고체-상 수지로부터 펩타이드 중간체 단편을 절단하는 단계는 다음과 같은 예시적인 공정 라인을 따라 진행될 수 있다. 그러나, 펩타이드 중간체 단편을 수지로부터 효과적으로 절단하는 임의의 적합한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 산성 절단 시약을 함유하는 용매 약 5 내지 20, 바람직하게는 약 10부피를 수지-결합된 펩타이드 물질을 함유하는 용기에 첨가한다. 그 결과, 전형적으로 비드 형태의 수지가 시약에 침지된다. 액체 내용물을 적합한 온도에서 적합한 시간 동안 진탕시킬 때 절단 반응이 이루어진다. 진탕은 비드가 뭉치지 않도록 하는데 도움을 준다. 적합한 시간 및 온도 조건은 사용되는 산 시약, 펩타이드의 특성, 수지의 특성 등과 같은 인자에 따라 달라진다. 일반적인 지침으로서, 약 -15 내지 약 5℃, 바람직하게는 약 -10 내지 약 0℃에서 약 5분 내지 2시간, 바람직하게는 약 25분 내지 약 45분 동안 교반하는 것이 적합하다. 절단 시간은 약 10분 내지 약 2시간 또는 하루 정도로 더 길 수 있다. 반응 동안 전형적으로 발생되는 반응시의 발열을 조절하기 위해 이렇게 냉각된 온도 범위에서 바람직하게 절단을 수행한다. 또한, 절단 반응의 온도가 더 낮으면 트리틸 기 같은 산 감수성 측쇄 보호기가 이 단계에서 제거되지 않도록 방지하게 된다.

절단 처리 후, 반응을 급냉시킨다. 예를 들어 절단제를 피리딘 등과 같은 적합한 염기와 합치고, 추가로 5분 내지 2시간, 바람직하게는 약 20분 내지 약 40분 같은 추가적인 시간 동안 계속 진탕 및 교반함으로써 이를 달성할 수 있다. 염기 첨가 및 계속되는 진탕은 용기 내용물의 온도를 높인다. 진탕 후, 용기 내용물은 약 0 내지 약 15℃, 바람직하게는 약 5 내지 약 10℃로 될 수 있다.

펩타이드 회수 양상을 개선하기 위하여 수지의 팽윤 및 수축 같은 요소를 전체적인 합성 공정에 선택적으로 도입시킬 수 있다. 이들 기법은 예를 들어 미국 특허 공개 제 2005/0164912 A1 호에 기재되어 있다.

일부 양태에서는, 다른 펩타이드 단편 및/또는 아미노산으로의 용액-상 커플링을 위해 절단된 펩타이드 단편을 제조할 수 있다. 용액-상에서의 펩타이드 커플링 반응은 예를 들어 문헌[New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; and Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303]에서 개괄된 바 있다.

동일 반응계내 커플링 시약, 예컨대 벤조트라이아졸-1-일-옥시-트리스-(다이메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(BOP), 벤조트라이아졸-1-일-옥시-트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), o-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), o-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로보레이트(HATU), o-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3-3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로포스페이트(TATU), o-(1H-6-클로로-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU), o-(1H-6-클로로-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU), o-(벤조트라이아졸-1-일)옥시비오스-(피롤리디노)-우로늄 헥사플루오로포스페이트(HAPyU), 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 다이아이소프로필카보다이이미드, 3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4(3H)-온(DEPBT), 수용성 카보다이이미드(WSCDI), o-(사이아노-에톡시카보닐-메틸렌아미노)-N,N,N',N"-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TOTU) 또는 o-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU)를 사용하여, 펩타이드 중간체 단편을 용액-상에서 다른 단편 또는 아미노산(들)에 커플링시킬 수 있다. 다른 커플링 기법에서는 하이드록시석신이미드(HOSu) 및 p-나이트로페놀(HONp) 에스터 같은 미리 제조된 활성 에스터; 미리 제조된 대칭 무수물; N-카복시무수물(NCA) 같은 비-대칭 무수물; 또는 아실 플루오라이드 및 아실 클로라이드 같은 산 할라이드를 사용한다.

적합한 커플링 용매를 용액-상 커플링 반응에 사용할 수 있다. 사용되는 커플링 용매(들)는 생성되는 펩타이드 결합의 라세미화 정도; 펩타이드 및/또는 펩타이드 단편의 용해도; 및 커플링 반응 속도에 영향을 끼칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 커플링 용매는 하나 이상의 수혼화성 시약을 포함한다. 수혼화성 용매의 예는 예컨대 DMSO, 피리딘, 클로로폼, 다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, N-메틸피롤리돈, 다이메틸포름아마이드, 다이옥세인 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

다른 실시양태에서, 커플링 반응은 하나 이상의 비-수혼화성 시약을 포함할 수 있다. 예시적인 비-수혼화성 용매는 염화메틸렌이다. 이들 실시양태에서, 비-수혼화성 용매는 바람직하게는 탈보호 반응에 적합하며; 예를 들어 비-수혼화성 용매가 사용되는 경우 바람직하게는 이는 탈호보 반응에 불리한 영향을 끼치지 않는다.

서열 식별 번호: 10의 펩타이드가 생성된 후에는, 필요에 따라 생성물을 탈보호, 정제, 동결건조, 추가적인 가공(예컨대 다른 펩타이드와 반응시켜 융합 단백질을 형성함); 이들의 조합 등을 거치게 할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따라, 측쇄 보호기는 전형적으로 고체-상 합성 및 용액-상 커플링 반응 전체에서 펩타이드 중간체 단편 상에 보유된다. 일반적으로, 용액-상 커플링 단계가 완료된 후에는, 하나 이상의 탈보호 단계를 수행하여 펩타이드로부터 하나 이상의 보호기를 제거할 수 있다.

전체적인 탈보호에 의해 측쇄 보호기를 제거하는 데에는, 전형적으로 측쇄 보호기를 절단하기 위하여 산분해제를 포함하는 탈보호 용액을 사용한다. 전체적인 탈보호에 통상적으로 사용되는 산분해 시약은 순수한 트라이플루오로아세트산(TFA), HCl, BF₃Et₂O 또는 Me₃SiBr 같은 루이스산, 액체 플루오르화수소산(HF), 브롬화수소(HBr), 트라이플루오로메테인설폰산 및 이들의 조합을 포함한다. 탈보호 용액은 또한 하나 이상의 적합한 양이온 소거제, 예컨대 다이티오트레이톨(DTT), 아니솔, p-크레솔, 에테인다이티올 또는 다이메틸 설파이드를 포함한다. 탈보호 용액은 또한 물을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는, 탈보호 조성물에 존재하는 시약의 양은 전형적으로 비로 표현되는데, 여기에서 개별적인 성분의 양은 "중량부" 또는 "부피부" 같은 부로 표시되는 분자로서 표현되고, 분모는 조성물의 총 부이다. 예를 들어, 비 90:5:5(중량/중량/중량)의 TFA:H₂O:DTT를 함유하는 탈보호 용액은 90/100중량부의 TFA, 5/100중량부의 H₂O 및 5/100중량부의 DTT를 갖는다.

에터, 예를 들어 다이에틸 에터 또는 MTBE(메틸 3급 뷰틸 에터)를 사용하여 전형적으로 침전을 수행한다. 침전 후, 펩타이드를 바람직하게 다른 성분과 합치기 전에 단리 및 건조시키고, 동결건조, 포장, 저장, 추가 가공 및/또는 달리 처리한다. 임의의 적합한 방식으로 이를 달성할 수 있다. 하나의 적합한 접근법에 따라, 여과에 의해 펩타이드를 모으고 다량의 MTBE 세척액으로 세척하여 최종 염 함량을 적합한 수준으로 감소시킨 다음 건조시킨다.

본 발명은 또한 GLP-1 펩타이드 및 이들의 대응물을 비롯한 광범위한 펩타이드를 정제시키는 유용한 기법을 제공한다.

특히 바람직한 정제 방법은 크로마토그래피 매질을 통한 2회 이상의 정제 실행을 포함하며, 이때 적어도 첫번째 실행은 제 1 pH에서 이루어지고 적어도 두번째 실행은 제 2 pH에서 이루어진다. 더욱 바람직하게는, 첫번째 실행은 산성 pH에서 이루어지는 반면, 두번째 실행은 염기성 pH에서 이루어진다. 바람직한 실시양태에서는, 염기성 조건하에서 실행하기 전에 적어도 한 번의 실행이 산성 조건하에서 이루어진다. 이 정제 접근법을 실시하는 예시적인 방식은 완전 보호된 펩타이드(11)를 정제함에 관련되어 기재될 수 있다. 먼저, 펩타이드를 전체적으로 탈보호시킨다. N-말단 및 측쇄 보호기 둘 다를 절단한다. 약 1 내지 5, 바람직하게는 약 2의 pH를 제공하기에 충분한 TFA를 사용하여 물/ACN(아세토나이트릴) 구배로 첫번째 크로마토그래피를 실행한다. 이어, 약 8 내지 9, 바람직하게는 8.5 내지 8.9의 pH를 제공하기 위해 소량의 암모니아 및/또는 아세트산암모늄 등을 사용하여 물/ACN 구배로 두번째 실행을 수행한다.

산인지 염기인지에 관계없이 pH 값은 각각의 경우에 균일한 이온 종류가 존재한다는 점에서 균일성을 조장한다. 따라서, 산성 pH는 바람직하게는 펩타이드 물질 중의 아미노산 잔기가 실질적으로 모두 양성자화되도록 하기에 충분히 낮다. 염기성 pH는 바람직하게는 펩타이드 물질 중의 아미노산 잔기가 실질적으로 모두 탈양성자화되도록 하기에 충분히 높다. 산 및 염기 크로마토그래피를 임의의 순서대로 수행할 수 있다. 펩타이드 아세테이트가 목적하는 생성물인 경우에는 아세테이트가 크로마토그래피의 생성물일 수 있기 때문에 염기성 크로마토그래피를 마지막에 수행하는 것이 편리하다.

통상적으로 사용되는 약어는 다음과 같다: 아세틸(Ac), 아조-비스-아이소뷰티릴나이트릴(AIBN), 기압(Atm), 9-보라바이사이클로[3.3.1]노네인(9-BBN 또는 BBN), 3급-뷰톡시카보닐(Boc), 다이-3급-뷰틸 피로카보네이트 또는 boc 무수물(BOC₂O), 벤질(Bn), 뷰틸(Bu), 화학 초록 등록 번호(CASRN), 벤질옥시카보닐(CBZ 또는 Z), 카보닐 다이이미다졸(CDI), 1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥테인(DABCO), 다이에틸아미노설퍼 트라이플루오라이드(DAST), 다이벤질리덴아세톤(dba), 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔(DBN), 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 1,2-다이클로로에테인(DCE), 다이클로로메테인(DCM), 다이에틸 아조다이카복실레이트(DEAD), (3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4(3H)-온)(DEPBT), 다이-아이소-프로필아조다이카복실레이트(DIAD), 다이-아이소-뷰틸알루미늄하이드라이드(DIBAL 또는 DIBAL-H), 다이-아이소-프로필에틸아민(DIPEA), N,N-다이메틸 아세트아마이드(DMA), 4-N,N-다이메틸아미노피리딘(DMAP), 에틸렌 글라이콜 다이메틸 에터(DME), N,N-다이메틸포름아마이드(DMF), 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 1,1'-비스-(다이페닐포스피노)에테인(dppe), 1,1'-비스-(다이페닐포스피노)페로센(dppf), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDCI), 에틸(Et), 에틸 아세테이트(EtOAc), 에탄올(EtOH), 2-에톡시-2H-퀴놀린-1-카복실산 에틸 에스터(EEDQ), 다이에틸 에터(Et₂O), O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 아세트산(HATU), 아세트산(HOAc), 1-N-하이드록시벤조트라이아졸(HOBt), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 아이소-프로판올(IPA), 리튬 헥사메틸 다이실라잔(LiHMDS), 메탄올(MeOH), 융점(mp), MeSO₂-(메실 또는 Ms), 메틸(Me), 아세토나이트릴(MeCN), m-클로로퍼벤조산(MCPBA), 질량 스팩트럼(ms), 메틸 t-뷰틸 에터(MTBE), N-브로모석신이미드(NBS), N-카복시무수물(NCA), N-클로로석신이미드(NCS), N-메틸모르폴린(NMM), N-메틸피롤리돈(NMP), 피리디늄 클로로크로메이트(PCC), 피리디늄 다이크로메이트(PDC), 페닐(Ph), 프로필(Pr), 아이소-프로필(i-Pr), 제곱 인치 당 파운드(psi), 피리딘(pyr), (벤조트라이아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 실온(rt 또는 RT), 3급-뷰틸다이메틸실릴 또는 t-BuMe₂Si(TBDMS), 트라이에틸아민(TEA 또는 Et₃N), 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 1-옥실(TEMPO), 트라이플레이트 또는 CF₃SO₂-(Tf), 트라이플루오로아세트산(TFA), 1,1'-비스-2,2,6,6-테트라메틸헵테인-2,6-다이온(TMHD), O-벤조트라이아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 박층 크로마토그래피(TLC), 테트라하이드로퓨란(THF), 트라이메틸실릴 또는 Me₃Si(TMS), p-톨루엔설폰산 일수화물(TsOH 또는 pTsOH), 4-Me-C₆H₄SO₂- 또는 토실(Ts), N-우레탄-N-카복시무수물(UNCA). 알킬 잔기와 함께 사용되는 경우 접두사 노르말(n), 아이소(i-), 2급(s-), 3급(t-) 및 네오를 포함한 통상적인 명명법은 통상적인 의미를 갖는다(문헌[J. Rigaudy and D. P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979 Pergamon Press, Oxford.]).

이제, 하기 예시적인 실시예와 관련하여 본 발명의 원리를 추가로 설명한다. 하기에서, 백분율 및 비는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 모두 부피 기준이다.

실시예

실시예 1 내지 18은 반응식 1에 기재된 커플링 반응식 및 그 안에 정의된 단편 1, 2, 3 및 3'에 관한 것이다.

실시예 1

N-말단에서 Fmoc 보호기를 갖고 His 및 Glu 상에 측쇄 보호기를 갖는 단편 1의 고체-상 합성

A. Fmoc-Gly-로딩된 2CTC 수지의 제조

먼저, Fmoc-Gly-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 사용된 수지의 양은 하기 표에 기재된다:

2-CTC 수지를 500㎖ 펩타이드 반응기에 넣고 25℃에서 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 상을 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(87.5:12.5) 중 Fmoc-Gly-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다.

상을 배수시키고, DMF 350㎖로 1회, 또한 DMF 175㎖로 1회 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지 상의 잔류 활성 부위를 1시간 동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 350㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 250㎖로 2회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤(de-swell)시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 38.20g을 수득하였다. 분석 결과 0.18mmol/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

본 실시예 1의 A부에서 제조된 0.18mmol/g으로 로딩된 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 20.0g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(200㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 5부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20부피%의 피페리딘(각 처리시 5부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 5부피)로 5회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(2.85당량) 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT, 2.85당량)을 칭량하고, NMP 2.55배 부피에 용해시킨 다음 5 내지 10℃의 DIEA(3.25당량)와 합쳤다. TBTU(2.85당량)를 5 내지 10℃의 NMP 1.3배 부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 플라스크를 DCM 1.3배 부피로 반응기 내로 세정하였으며, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간 동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험(Kaiser Test)을 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 3시간 후에 커플링 반응이 완료되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 비우고 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 5부피) 세척하였다. 이어, 단편중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 보호기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Glu(OtBu)→Aib→His(trt)의 순서대로).

활성화된 Fmoc-His(trt)-OH와 H-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC 사이의 커플링 반응의 어려움 및 활성화된 Fmoc-His(trt)-OH의 불안정성 때문에, 1시간 후에 반응 용액을 배수시키고 두번째의 새로운 활성화된 Fmoc-His(trt)-OH 용액으로 재커플링 반응을 즉시 수행함으로써, 커플링 반응을 완료시켰다.

본 실시예의 B부에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

수지-결합된 펩타이드 단편을 NMP(5부피)로 4회, DCM(6부피)으로 5회, IPA(5부피)로 3회 세척하였다. 이어, 탈-팽윤된 수지를 35℃에서 진공하에 건조시켜, 수지 및 수지-결합된 펩타이드 22.58g을 수득하였다.

C. 수지로부터 Fmoc 및 측쇄 보호된 단편의 절단

상기 B부로부터 구축된 수지를 25℃에서 30분간 DCM(사용되는 수지의 중량에 대해 12.5부피; 수지 1g당 DCM 12.5㎖ 또는 1kg당 12.5리터)으로 팽윤시킨 다음, DCM으로 2회(각 세척시 6.25부피) 세척하여 임의의 NMP 잔류물을 제거하였다. 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시키고 1% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 -10℃, 10부피)을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 반응기에 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 절단 용액을 여과해내고 플라스크에 모았다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 7회(7.5부피) 세척하였다. 세척액을 절단 용액과 합쳤다. DCM 절단 용액을 물(7.5부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 펩타이드 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH 총 4.73g을 수득하였다.

실시예 2

A. Fmoc-Gly-로딩된 2CTC 수지의 제조

Fmoc-Gly-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 사용된 시약의 양은 아래 표에 기재된다:

2-CTC 수지를 500㎖ 펩타이드 반응기에 넣고 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 수지를 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(부피 기준 87.5:12.5)중 Fmoc-Gly-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다.

수지 상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, 또한 DMF 200㎖로 1회 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지상의 잔류 활성 부위를 1시간 동안 MeOH:DIEA(부피 기준 9:1) 용액 390㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 350㎖로 2회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 진공하에 35℃에서 건조시켜, 로딩된 수지 48.51g을 수득하였다. 분석 결과 0.54mmol/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.54mmol/g으로 로딩된 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 27.59g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(300㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 5부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20부피%의 피페리딘(각 처리시 5부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 5부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(1.7당량) 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT, 1.7당량)을 칭량하고, NMP 4.6배 부피에 용해시킨 다음 10 내지 5℃의 DIEA(1.9당량)와 합쳤다. TBTU(1.7당량)를 10 내지 5℃의 NMP 2.28배 부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 플라스크를 DCM 2.28부피로 반응기 내로 세정하였으며, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간 동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 커플링 반응이 완료되면, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 5부피) 세척하였다. 이어, 단편 중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Glu(OtBu)→Aib→His(trt)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

C. 수지로부터 단편의 절단

구축된 수지를 NMP(5부피)로 6회, 이어 DCM(6부피)으로 8회 세척하여 NMP 잔류물을 제거하였다. 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1% TFA/DCM의 차가운(-5 내지 -10℃) 용액을 첨가하고 생성된 포트(pot) 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 반응기에 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 절단 용액을 플라스크에 모았다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM(7.5부피)으로 11회 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(10부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH 총 11.12g(78.8% 수율)을 수득하였다.

실시예 3

A. Fmoc-Gly-로딩된 2CTC 수지의 제조

2-CTC 수지를 500㎖ 펩타이드 반응기에 넣고 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 상을 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(87.5:12.5) 중 Fmoc-Gly-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다.

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지 상의 임의의 잔류 활성 부위를 1시간 동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 390㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 350㎖로 2회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 4×250㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 진공하에 35℃에서 건조시켜, 로딩된 수지 52.02g을 수득하였다. 분석 결과 0.72mmol/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.72mmol/g으로 로딩된 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 24.43g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(250㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 5부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20%의 피페리딘(각 처리시 5부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 5부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT)을 칭량하고, NMP에 용해시킨 다음 5 내지 10℃에서 DIEA와 합쳤다. TBTU를 5 내지 10℃에서 NMP에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 플라스크를 DCM(양에 대해서는 하기 표 참조)으로 반응기 내로 세정하였으며, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 6시간 동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 3시간 후에 커플링 반응이 완료되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 배수시키고 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 5부피) 세척하였다. 이어, 단편 중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Glu(OtBu)→Aib→His(trt)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

C. 수지로부터 단편 Fmoc-AA(7-10)-OH의 절단

구축된 수지를 NMP(5부피)로 6회, 이어 DCM(6부피)으로 7회 세척하여 NMP를 제거하였다. 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 수지 상을 1% TFA/DCM의 차가운(-5 내지 -10℃) 용액(11.26부피)으로 0℃에서 5분간 세척하였다. 절단 용액을 플라스크에 모으고, 여기에 피리딘(총 TFA의 1.3당량)을 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 이어, 차가운 1% TFA/DCM의 두번째 분량(6.14부피)을 반응기에 첨가하고 2분간 교반하였다. 두번째 절단 용액을 다시 수거 플라스크 내로 배수시켰다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM(8.2부피)으로 9회 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(8.2부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 서열 식별 번호: 7에 따른 Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH 총 14.02g(86.6% 수율)을 수득하였다. 분석 결과, 94.3% AN의 순도를 나타내었다.

실시예 4

Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ΨMe,Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH

GPA 단편 2의 고체-상 합성

0.43mmol/g으로 로딩된 H-Gly-2-CT 수지 20.0g으로 출발하여 Fmoc-AA(11-22)-OH의 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(200㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 6부피)로 3회 세척하였다. 모든 규모의 부피는 초기 수지 중량(20.0g) 또는 수지에 로딩된 아미노산의 몰 수(8.6mmol)에 비례한다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(1.7당량) 및 1-하이드록시벤조트라이아졸(HOBT, 1.7당량)을 칭량하고, NMP 3.4부피에 용해시킨 다음 NMP(1.32부피) 중 HBTU(1.7당량)와 합치고 0 내지 5℃에서 DIEA(3.5당량)를 첨가함으로써 활성화시켰다. 생성된 용액을 수지를 함유하는 반응 용기에 첨가하고, 활성화 플라스크를 DCM 1.57부피로 반응기 내로 세정하였으며, 이어 이를 25 내지 27℃에서 4시간 동안 교반하였다. 커플링 반응 혼합물을 4시간 교반한 후에, 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다. 이어, 수지를 NMP중 20%의 피페리딘(각 처리시 6부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 9회 세척하였다. 단편 중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 보호기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Glu(OtBu)→Leu→Tyr(tBu)→Ser(OtBu)-Ser(ΨMe,Me)→Val→Asp(OtBu)→Ser(OtBu)→Thr(tBu)→Phe→Thr(tBu)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

구축된 수지를 NMP(6부피)로 4회, DCM(6부피)으로 7회 세척하였다.

구축된 수지로부터 단편 2(Fmoc-AA(11-22)-OH)의 절단

상기로부터 구축된 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1%v/v TFA/DCM의 차가운(-5 내지 -10℃) 용액(10부피)을 0℃에서 첨가하고 교반하였다. 피리딘(TFA에 대해 1.38당량)을 절단 회수기에 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 30분간 교반한 후, 절단 용액을 절단 회수기에서 모았다. 이어, 또 다른 차가운 1% TFA/DCM 용액(5부피, -5 내지 -10℃)을 첨가하고 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 피리딘(TFA에 대해 1.38당량)을 절단 용기에 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM(6부피)으로 6회 세척하고 절단 용액 회수기 중으로 배수시켰다. 생성된 DCM 절단 및 세척 용액을 농축시키고(7.5부피), 이어 물(5부피)과 합쳤다. 하부의 DCM 층을 더욱 농축시키고(1.5부피), 헵테인(20부피)으로 공급하여 생성물이 침전되어 나왔다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 남아있는 DCM을 제거하였다(25℃에서 350 내지 100토르). DCM이 제거될 때 헵테인으로부터 단편 2가 침전되어 나왔다. 단편 2를 헵테인으로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 88.4% AN의 순도를 갖는 GPA Fmoc-AA(11-22)-OH 총 14.35g(85.5% 수율)을 수득하였다.

실시예 5

상기 배치 구축을 반복하였다. 구축 수지로부터 단편 2를 절단한 후, DCM 용액을 7.5부피로 농축시키고 물로 세척하였다(각각 5부피로 3회). 하부의 DCM 층을 다시 3.75부피로 농축시켰다. 이 DCM 용액을 물(20부피)과 합치고, 남아있는 DCM을 25℃에서 진공하에 제거하였다. 이어, 침전된 생성물을 여과하고, 35℃에서 진공하에 건조하였다. 이에 의해 93.1% AN 순도를 갖는 단편 2 14.95g(89% 수율)이 수득되었다.

실시예 6

측쇄 보호된 Fmoc-(Aib ³⁵ )GLP-1(23-35)-OH(단편 3)의 고체-상 합성

A. Fmoc-Aib-로딩된 2CTC 수지의 제조

Fmoc-Aib-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 사용된 시약의 양은 아래 표에 기재된다:

2-CTC 수지를 500㎖ 펩타이드 반응기에 넣고 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 상을 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(87.5:12.5) 중 Fmoc-Aib-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다.

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, 또한 200㎖로 2회 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지 상의 임의의 잔류 활성 부위를 1시간 동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 400㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시켰다. 수지를 DMF/MeOH/DIEA(4:0.9:0.1) 450㎖로 1회, DMF 200㎖로 1회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 45.15g을 수득하였다. 분석 결과 0.24mmol/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.24mmol/g의 로딩 계수를 갖는 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 10.01g을 반응 용기에 넣고, DCM(120㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 6부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 5부피%의 피페리딘(각 처리시 6부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 5% 피페리딘/NMP 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 4회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(1.875당량) 및 1-하이드록시벤조트라이아졸 일수화물(HOBT 수화물, 2.07당량)을 5 내지 10℃의 NMP 3.5배 부피에 용해시킨 다음 NMP(1.5배 부피)중 HBTU(2.0당량)의 16.1㎖ 용액과 합쳤다. 이어, DIEA(2.63당량) 2.2㎖를 10 내지 5℃에서 활성화 용기에 첨가하였다. 생성된 용액을 반응 용기에 옮겨넣었다. 활성화 용기를 DCM 1.5배 부피로 반응기 내로 세정하고, 이어 이를 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용기를 배수시켰다. 활성화된 아미노산(1.875당량)의 새로운 용액으로 커플링 반응을 한번 더 반복하였다. 두번째 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다. 이어, 단편 중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

구축된 수지를 NMP(6부피)로 4회, DCM(6부피)으로 4회, 또한 아이소프로판올(IPA, 6부피)로 3회 세척함으로써 단리하였다. 구축된 수지를 진공하에 35℃에서 건조시켰다. 구축된 수지 14.3g을 수득하였다.

C. 구축된 수지로부터 중간체 단편의 절단

상기로부터 구축된 수지 6.6g을 10배 부피의 DCM으로 30분간 팽윤시키고 -10℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1% TFA/DCM(-5 내지 -10℃에서 12부피)의 차가운 용액을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 2 내지 3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 모았다. 25℃까지 가온하면서, 수지를 1% TFA/DCM(10배 부피)과 함께 5분간 교반하고 피리딘(2 내지 3당량)을 첨가하였다. 추가로 5분 후, 용액을 모았다. 수지를 DCM으로 4회(10부피) 세척하였다. 모든 DCM 세척액을 물과 합쳤다(물/DCM=1/4). 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 절단 절차를 한 번 더 반복하였다. Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH 총 2.36g(92% 수율)을 수득하였다.

실시예 7

A. Fmoc-Aib-로딩된 2CTC 수지의 제조

Fmoc-Aib-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 본 실시예에서 사용된 시약의 양은 아래 표에 기재된다:

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지 상의 임의의 잔류 활성 부위를 1시간 동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 400㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, DMF 200㎖로 1회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 45.32g을 수득하였다. 분석 결과 0.30mmol/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.30mmol/g으로 로딩된 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 15.0g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(150㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 DCM으로 2회(각 세척시 6부피) 및 NMP로 3회(각각의 세척시 6부피) 세척하였다.

이어, 수지를 NMP 중 20%의 피페리딘(각 처리시 6부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(1.7당량) 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT, 1.7당량)을 칭량하고, 10 내지 5℃에서 NMP 2.6배 부피에 용해시킨 다음 DIEA(1.9 내지 3.0당량)와 합쳤다. TBTU 또는 HBTU(1.7당량)를 10 내지 5℃에서 NMP 1.33부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합 플라스크를 DCM 1.33배 부피로 반응기 내로 세정하고, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간 동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 커플링 반응이 3시간 후에 완료되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 배수시키고, 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다. 이어, 단편 중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)의 순서대로).

2-메틸알라닌(Aib)과 2-CTC 수지 사이의 가능한 지지 효과로 인해, 처음 두 아미노산 커플링 반응(Lys(Boc)-34 및 Val-33)을 완료시키는 데에는 상당한 어려움이 있다. 따라서, (Lys(Boc)-34, Val-33)에 대한 두 커플링 반응을 모두 3회 수행하였다(즉, 커플링 후에 재커플링을 2회 수행하였음). 또한, Lys(Boc)-34와 Val-33의 커플링 반응 후 미반응 수지-결합된 물질을 말단-캡핑시키는데 아세트산 무수물을 사용하였다. 이는 크로마토그래피에 의한 정제 동안 목적하는 생성물로부터 불순물을 멀리 이동시킴으로써 후속 정제의 효율을 개선시켰다.

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

C. 구축된 수지로부터 단편의 절단

상기로부터 구축된 수지를 DCM으로 7회(각 세척시 6부피) 세척하여 NMP 잔류물을 제거하고, 수지를 마지막 DMC 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 -10℃에서 12부피)을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 모았다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 9회(10부피) 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(6부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 본 실시예의 경우, 절단 절차를 한 번 더 반복하였다. Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH 총 6.78g(68.1% 수율)을 87.3% AN의 순도로 수득하였다.

실시예 8

A. Fmoc-Aib-로딩된 2CTC 수지의 제조

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지 상의 임의의 잔류 활성 부위를 1시간 동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 400㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, DMF 200㎖로 1회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 47.56g을 수득하였다. 분석 결과 0.37mmol/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.37mmol/g으로 로딩된 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 25.0g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(250㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 DCM으로 2회(각 세척시 6부피) 및 NMP로 3회(각각의 세척시 6부피) 세척하였다.

이어, 수지를 NMP 중 20부피%의 피페리딘(각 처리시 6부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT)을 칭량하고, NMP(또는 Lys-34, Val-33 및 Gln-23의 경우 DMF) 3.2배 부피에 용해시킨 다음 10 내지 5℃에서 DIEA와 합쳤다. TBTU를 10 내지 5℃에서 NMP(또는 Lys-34, Val-33 및 Gln-23의 경우 DMF) 1.6배 부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고 플라스크를 DCM 1.6배 부피로 반응기 내로 세정하고, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간 동안 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 커플링 반응이 3시간 후에 완료되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 배수시키고, 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다. 이어, 단편 중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 탈보호 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)의 순서대로).

2-메틸알라닌(Aib)과 2-CTC 수지 사이의 가능한 지지 효과로 인해, 처음 두 아미노산 커플링 반응(Lys(Boc)-34 및 Val-33)을 완료시키는 데에는 상당한 어려움이 있다. 아미노산 및 6-Cl-HOBT 둘 다의 사용량을 1.7당량에서 2.5당량으로 증가시키고 DIEA의 사용량을 1.9당량에서 3.0당량으로 증가시킴으로써, Lys(Boc)-34, Val-33 및 Gln(trt)-23에 대한 커플링 조건을 변경시켰다. 커플링 반응용 용매도 커플링 반응을 완료시키기 위하여 NMP에서 DMF로 변화시켰다. 또한, 본 실시예에서는, Lys(Boc)-34와 Val-33의 커플링 반응 후 미반응 수지-결합된 물질을 말단-캡핑시키는데 아세트산 무수물을 사용하였다. 이는 크로마토그래피에 의한 정제 동안 목적하는 생성물로부터 불순물을 멀리 이동시킴으로써 후속 정제의 효율을 개선시켰다.

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

C. 구축된 수지로부터 단편의 절단

상기로부터 구축된 수지를 DCM으로 6회(각 세척시 6부피) 세척하여 NMP를 제거하고, 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 -10℃에서 10부피)을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 모았다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 7회(6부피) 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(10부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 본 실시예의 경우, 완전한 절단을 달성하기 위하여 절단 절차를 한 번 더 반복하였다. Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH 총 12.36g(59.35% 수율)을 84.3% AN의 순도로 수득하였다.

GPA 단편 2+3', Fmoc-AA(11-36)-NH ₂ 의 제 1 GPA 용액-상 합성

Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ΨMe,Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH₂

실시예 9

GAP 단편 3'의 용액-상 합성

GPA 단편 3, Fmoc-AA(23-35)-OH(10.0g, 1.0당량)(제품 번호 BO705P001) 및 L-아르기닌아마이드 다이하이드로클로라이드(2.14g, 2.0당량)를 DMSO(42ml)와 혼합하고, 30분 동안 23 내지 25℃에서 교반하였다. 이 용액에, DMSO(42ml) 및 DIEA(5.0당량) 중 1-하이드록시벤조트라이아졸 수화물(HOBT, 2.0당량) 및 HBTU(2.0당량)을 가하였다. 반응을 25℃에서 진탕하고, HPLC에 의해 모니터링하였다. 22시간 후, 반응을 완료시켰다. 이어, 피페리딘(5.0당량)을 반응 용액에 첨가하였다. 25℃에서 95분 후에 Fmoc 보호기를 제거하였다. MTBE(60ml) 및 헵테인(60ml)의 용액을 첨가하여 반응 용액을 추출함으로써 과량의 피페리딘을 제거하였다. 이어, 이러한 2상 혼합물을 물(240ml)에 첨가하여 20 내지 22℃에서 생성물을 침전시켰다. 침전 후, 상부의 MTBE/헵테인 층 및 하부의 수성 DMSO 층을 분리하고, 생성물을 여과하고, 추가의 MTBE/헵테인으로 세척하였다. 35℃에서 진공 건조시킨 후, 여과 케이크는 GPA 단편 3' 11.1g을 제공하였다. HPLC 분석에 의해 72.9% AN 단편 3' 및 17% 다이벤조풀벤(DBF)이 나타났다.

실시예 10

GPA 단편 2+3'의 용액-상 합성

GPA 단편 3'(5.0g) 및 단편 2(4.35g)를 DMF(30ml)에 용해시켰다. 이 용액에, DMF(20ml) 중 HOBT 수화물(1.55당량) 및 HBTU(1.56당량)의 용액 및 DIEA(2.55당량)를 DMF(10ml)로 세정하면서 가하였다. 반응을 25℃에서 교반하고, HPLC에 의해 모니터링하였다. 145분 후에, 추가로 단편 3'(0.5g), HBTU(0.5당량) 및 DIEA(1.3당량)를 DMF(5ml)로 세정하면서 첨가하였다. 밤새 교반한 후 반응을 완료시켰다. 피페리딘(1.4g)을 반응 혼합물에 가하였다. 3시간 후에, Fmoc가 제거되었다. 반응 혼합물을 물(140ml)로 18 내지 26℃에서 급냉시켰다. 혼합물을 40℃로 가열한 후 20℃로 냉각하였다. 형성된 백색 고체를 여과하고, 물(각각 100ml, 2회)로 세척하였다. 여과 케이크를 공기 건조시킨 후 15분 동안 40℃에서 MTBE/헵테인(1:1, 100ml)과 함께 교반하였다. 25℃로 냉각한 후, 생성물을 여과하고, MTBE/헵테인(1:1, 4×50ml)으로 세척하고, 35 내지 40℃에서 진공 건조시켰다. 총 8.64g, 97.7% 수율이 67.3% AN의 순도와 함께 수득되었다.

GPA 단편 1+2+3'의 용액-상 합성 및 전체적인 탈보호:

실시예 11

단편 1(0.93g)을 DCM(20ml)에 용해시켰다. 이 용액에, 단편 2+3'(4.02g)를 DCM(20ml)으로 세정하면서 첨가하였다. HOBt 수화물(0.23g, 1.5당량) 및 HBTU(0.57g, 1.5당량)를 DCM(5ml)과 함께 가하였다. 이어, DIEA(0.95ml, 2.0당량)를 진탕된 반응 혼합물에 가하였으며, 이는 현탁액이었다. 반응을 25℃에서 진탕하고, HPLC에 의해 모니터링하였다. 16시간 후, 반응 완료 점검에 의해 과량의 단편 2+3'가 나타났다. 추가로 단편 1(0.081g) 및 HBTU(0.068g)를 DCM(5ml)으로 세정하면서 첨가하였다. 반응을 추가로 68시간 동안 교반하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 피페리딘(0.6ml)을 반응 혼합물에 가하였다. 18시간 동안 교반한 후, Fmoc 제거를 완료하였다. 이어, 잔류 부피가 약 15ml가 될 때까지 DCM을 반응 혼합물로부터 진공하에 제거하였다. 농축된 혼합물을 15℃에서 TEA(40ml), DTT(2.1g) 및 물(2.1ml)을 함유하는 용액에 가한 후 DCM(2×5ml)으로 세정하였다. 6시간 동안 진탕한 후에 반응 혼합물을 5℃ 미만으로 냉각시켰다. 차가운 MTBE(160ml, 드라이아이스에서 냉각됨)를 절단 용액에 7분에 걸쳐 가하였다. 급냉된 반응 혼합물을 15℃로 가온시켰다. 생성된 고체 생성물을 여과하고, MTBE(3×30ml)로 세척하고, 주변 온도에서 밤새 공기 건조시켰다. 59.7% AN의 순도(113% 수율)를 갖는 GPA 조질(28.73% wt/wt) 3.82g을 수득하였다.

대안 단편 1의 합성:

실시예 12

단편 1(Trt-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH)

미리 로딩된 Fmoc-Gly-O-2-CT 수지(0.43mmol/g 로딩)로 출발하여, 표준 Fmoc 화학을 적용하였다. 수지를 먼저 DCM 10부피(수지 중량에 대해)로 30분간 팽윤시켰다. 이어, DCM을 배수시키고 수지를 NMP 10부피로 4회(각각 5분) 세척하였다.

NMP 중 20% 피페리딘(v/v)의 용액 10부피로 2회 처리(10 내지 20분)함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. 각각의 처리 후 피페리딘/NMP 용액을 배수시켰다. 이어, 수지를 NMP로 6회(10부피, 각각 5분) 세척하였다. 커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산 및 HOBt를 칭량하고(2당량), HBTU(2당량)를 함유하는 NMP 25ml에 용해시킨 후 NMP/DCM(10ml/15ml)으로 세정하였다. 생성된 용액을 NMP(5ml) 중 DIEA(2당량)와 합치고, 수지를 함유하는 반응 용기에 첨가하고 3시간 동안 수지와 혼합하였다. 커플링 반응을 완료시킨 후, 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(10배 부피, 각각 5분) 세척하였다.

구축된 펩타이드-수지를 DCM(4×70ml, 각각 5분)으로 세척하고 -5℃로 냉각시켰다. DCM을 배수시키고, 1% TFA/DCM(70ml, 드라이아이스에서 냉각됨) 용액을 첨가하고 15분 동안 교반하였다. 절단 용액을 피리딘(2ml) 함유 플라스크에서 모았다. 20℃로 가온시키면서, 수지를 드라이아이스 냉각된 1% TFA/DCM(70ml)으로 20분에 걸쳐 세척하고, 피리딘(4ml)을 첨가하였다. 또 다시 10분 동안 진탕한 후, 용액을 모았다. 이어, 수지를 DCM(4×70ml, 각각 5분)으로 세척하였다. 모든 세척액 및 절단 용액의 합한 혼합물을 감압하에 약 100ml의 부피에 이를 때까지 증류시켰다. 생성된 용액을 물(100ml)과 혼합하고, 다시 감압하에 증류시켰다. DCM이 제거될 때 펩타이드 단편을 물로부터 떨어뜨려, 여과해 냈다. 고체 펩타이드 단편을 물(3×50ml)로 세척하고, 주변 온도에서 밤새 공기 건조시켰다. 생성물(대안 단편 1) 중량은 0.58g(20% 수율)이었다.

GPA의 GPA 고체-상 합성, 수지 상에서 전부 커플링

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ΨMe,Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-OH

2CT 수지 상에서 GPA 단편 3의 고체-상 합성

Fmoc-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-2-CT

실시예 13

0.46mmol/g으로 로딩된 H-Aib-2-CT 수지 15.0g으로 출발하여 Fmoc-AA(23-35)-OH의 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(120㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP로 3회(각 세척시 6부피) 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산 및 1-하이드록시벤조트라이아졸 수화물(HOBT)을 칭량하고, NMP(Lys-34, Val-33, Lys-26, Ala-25, Ala-24 및 Gln-23에 대해서 4부피; Leu-32 내지 Glu-27에 대해서 4.2부피)에 용해시킨 다음 -5 내지 0℃에서 NMP(178.4g/L) 중 HBTU 용액 및 DIEA와 합쳤다. 생성된 용액을 수지 함유 반응 용기에 첨가하고, DCM 2.0부피로 세정된 플라스크를 반응기에 넣고, 이를 25 내지 27℃에서 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험 및/또는 HPLC를 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 커플링 반응이 완료된 후(커플링 시간은 하기 표에서와 같이 달라진다), 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다(주: Lys-34 및 Val-33에 대해서 커플링 후 3시간 동안 수지는 NMP(100ml) 중 아세트산 무수물(5.0당량) 및 DIEA(10당량)로 말단 캡핑된다). 이어, 수지를 NMP(각 처리시 6부피) 중 20% 피페리딘으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다(주: Glu-27 및 Ala-24에 대해서, 수지를 NMP(각 처리시 6부피) 중 20% 피페리딘 30% DMSO로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다). 두번째 20% 피페리딘/NMP(또는 피페리딘/DMSO/NMP) 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 9회 세척하였다. 이어, 단편에 남아있는 아미노산에 대해 커플링 반응, 4회 NMP 세척, 탈보호 및 9회 NMP 세척 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

상기로부터 구축된 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피), DCM으로 7회(각 세척시 6부피) 및 IPA로 3회(각 세척시 6부피) 세척하고, 35℃에서 진공하에 건조시켰다. 88.7% AN의 순도를 갖는 Fmoc-AA(23-35)-O-2CT 수지 27.01g이 생성되었고, 이는 수지의 중량 증가를 기준으로 78.9% 수율이었다.

GPA 단편 1+2+3의 고체-상 합성

실시예 14

Fmoc-AA(23-35)-O-2-CT 수지 12.0g으로 출발하여 Fmoc-AA(7-35)-OH의 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(120㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP로 3회(각 세척시 4.16부피) 세척하였다.

이어, 수지를 NMP(각 처리시 6부피) 중 20% 피페리딘 30% DMSO로 4회(각각 30분) 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 네번째 NMP 중 20% 피페리딘 30% DMSO 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 4.16부피)로 9회 세척하였다.

단편 2에 대한 커플링 용액을 제조하기 위하여:

단편 2(7.83g, 1.3당량) 및 6-Cl-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT; 0.69g, 1.3당량)을 칭량하고, DMSO(4.16부피)에 용해시킨 후 플라스크에서 15℃에서 NMP(174.07g HBTU/L 용액 10.7ml, 1.3당량) 및 DIEA(1.9ml) 중 HBTU 용액과 합쳤다. 생성된 용액을 수지 함유 반응 용기에 첨가하고, 플라스크를 DCM(11.1ml)으로 반응기 내로 세정하고, 이를 25℃에서 교반하였다. 샘플에 대해 HPLC를 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 17시간 진탕한 후, 분석하여 커플링 반응에 대해 73.8% 전환율이 나타났다. HBTU(1.58g) 및 DIEA(0.706g)의 키커 차지(Kicker charge)를 첨가하고, 포트 혼합물을 30℃에서 교반하였다. 또 다시 25.5시간 동안 진탕한 후, 반응 샘플을 HPLC 분석하여 커플링 반응이 92% 완료되었음이 나타났다. 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 4.166부피) 세척하였다. NMP(각 처리시 4.16부피) 중 20%v/v 피페리딘 및 30%v/v DMSO로 2회(각각 30분) 처리함으로써 Fmoc 기를 탈보호시켰다. 두번째 NMP 중 20% 피페리딘 30% DMSO 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 4.16부피)로 9회 세척하였다.

단편 1에 대한 커플링 용액을 제조하기 위하여:

단편 1(3.81g, 1.3당량) 및 6-Cl-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT; 0.70g, 1.3당량)을 칭량하고, DMSO(4.16부피)에 용해시킨 후 플라스크에서 15℃에서 NMP(174.07g HBTU/L 용액 10.7ml, 1.3당량) 및 DIEA(1.9ml) 중 HBTU 용액과 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고, 플라스크를 DCM(11.1ml)으로 반응기 내로 세정하고, 이를 25℃에서 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 HPLC를 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 16.5시간 진탕한 후, 분석하여 커플링 반응의 완료 전환율이 나타났다. 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 4.166부피) 세척하였다.

상기로부터 구축된 수지를 DCM으로 7회(각 세척시 4.16부피) 세척하여 NMP를 제거하고, 수지를 마지막 DCM으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 2% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 0℃에서 5부피)을 첨가하고 0℃에서 15분간 교반하였다. 피리딘(사용되는 총 TFA에 대해 1.33당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 모았다. 이어, 또 다른 2% TFA/DCM(-5 내지 0℃에서 5부피)을 첨가하고, 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘을 함유하는 플라스크에 두번째 절단 용액을 모았다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 7회(5부피) 세척하고 절단 용액 회수기 중으로 배수시켰다. 두번째 DCM 세척 동안 피리딘(사용되는 총 TFA에 대해 0.37당량)을 절단 용기에 첨가하였다. 합한 DCM 용액을 10부피로 농축하고, 물(5부피)로 세척하고, 또 다른 5부피의 물과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 단편 1+2+3 8.76g을 수득하였으며, H-Aib-O-2CT 수지로부터 63.3% 수율 또는 Fmoc-AA(23-35)-O-2CT 수지로부터 80.2%의 실제 수율이었다. 분석에 의해 64.6% AN의 순도가 나타났다.

단편 1+2+3'의 합성 및 전체적인 탈보호

실시예 15a

GPA 단편 1+2+3(4.48g)을 DMSO(50ml)에 용해시켰다. 이 용액에, H-Arg(2HCl)-NH₂(0.99g, 4당량), HOBt 수화물(0.61g, 4당량), HBTU(1.52g, 4당량) 및 DIEA(0.87ml, 5당량)를 충전하였다. 반응을 25℃에서 진탕하고, HPLC로 모니터링하였다. 밤새 반응이 완료되었는지를 점검하여 커플링 반응이 수행되었는지를 나타내었다. 피페리딘(1ml)을 반응 혼합물에 가하였다. 밤새 교반한 후, Fmoc 제거를 수행하였다. 이어, 반응 혼합물을 5분에 걸쳐 15℃에서 물(150ml)을 함유하는 용기에 가하였다. 급냉된 혼합물을 0.5시간 동안 40℃로 가온시킨 후 15℃로 냉각시켰다. 고체를 여과하고, 물로 세척하고(3×30ml), 공기 건조시켜 4.34g 고체, 98% 수율을 제공하였다. 이 고체 4.0g을 DMC(18ml)에 용해시켰다. 이 용액에, TFA(40ml), DTT(2.1g) 및 물(2.1ml)을 함유하는 용액을 가하였다. 생성된 혼합물을 6시간 동안 15℃에서 교반한 후 -1℃로 냉각하였다. 차가운 MTBE(160ml, 드라이아이스에서 냉각됨)를 15분에 걸쳐 절단 용액에 가하였다. 급냉된 반응 혼합물을 15℃로 가온시켰다. 고체 생성물을 여과하고, MTBE(3×30ml)로 세척하고, 주변 온도에서 밤새 공기 건조시켰다. 44.9% AN의 순도를 갖는 GPA 조질 3.33g, 100% 수율, 23.08%wt/wt가 수득되었다.

단편 1+2+3'의 합성 및 전체적인 탈보호

실시예 15b

자성 교반기 및 온도계가 장착된 100ml 플라스크에 아르곤 하에 THF 30.0ml 중 단편 1 1.40g을 첨가하였다. 이어, HOBt 232mg 및 HBTU 917.3mg을 첨가하였다. 이어, DIEA 436.5μl를 첨가하였으며, 반응은 약한 발열성이고, 온도는 약 1℃로 상승되었다. 이어, THF 중 단편 2+3'를 첨가하였다. 또 다른 THF 중 단편 2+3' 3.00g을 첨가하였다. 이어, 피페리딘 1.2ml를 첨가하였으며, 반응은 약한 발열성이고, 온도는 약 1.5℃로 상승되었고, 맑은 황색 용액이 형성되었고, 이를 밤새 교반하였다. 이어, 용액을 250ml 플라스크에서 42℃/200-100mbar에서 증류시켰다. 이어, DCM 26.25ml를 첨가하고, 용액을 42℃/400-100mbar에서 증류시켰다. 이어, DCM을 20분에 걸쳐 제거하였다. 500 내지 1000ml 이중 자켓식 플라스크에서 물 4.313ml 및 TFA 76.9ml 용액과 함께 DTT 4.313g을 첨가하였다. 이어, 용액을 15℃로 냉각한 후 DCM 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응은 발열성이고, 온도는 17℃로 상승되었으며, 백색 연기가 발생하였고, 용액이 진한 황색이 되었다. 이어, DCM 3.75ml를 첨가하여 세정하였다. 이어, 혼합물을 6시간 동안 15℃에서 교반하였다. 침전이 발생하였고, 이후 혼합물을 여과하여 거의 백색인 페이스트 0.237g을 제조하였다. 이어, MTBE 360ml를 5분에 걸쳐 여과 케이크에 적가하여 백색 현탁액을 만들었고, 온도는 18℃로 상승되었다. 이어, 현탁액을 30분간 교반한 후 여과하였다. 이어, MTBE 225ml를 페이스트에 첨가하고, 다시 여과하고, 14시간에 걸쳐 42℃/20mbar에서 건조하여 백색 분말로서 총 생성물 5.787g을 수득하였다. HPLC(분석): 51.2%(m/m%), 79.8%(면적%) 물:: 2.0%; 에탄올: <100%, DCM:<60ppm; MTBE: 3.2%; THF: <70ppm; TFA: 8.4%.

GPA 단편 2+3', Fmoc-AA(11-36)-NH ₂ 의 GPA 용액-상 합성:

H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ΨMe,Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH₂

실시예 16

GPA 단편 2+3의 용액-상 합성:

Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ΨMe,Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-OH

Fmoc-AA(23-35)-O-2-CT 수지 12.53g으로 출발하여 Fmoc-AA(7-35)-OH의 용액-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(100㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP로 3회(각 세척시 4.4부피) 세척하였다.

이어, 수지를 NMP(각 처리시 4.4부피) 중 20% 피페리딘 30% DMSO로 2회(각각 60분) 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 NMP 중 20% 피페리딘 30% DMSO 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 4.4부피)로 9회 세척하였다.

단편 2에 대한 커플링 용액을 제조하기 위하여: 단편 2(8.10g, 1.3당량) 및 6-Cl-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT; 0.74g, 1.3당량)을 칭량하고, DMSO(2.66부피)에 용해시킨 후 플라스크에서 15℃에서 다이아이소프로필카보다이이미드(DIC; 0.52g, 1.3당량)와 합쳤다. 생성된 용액을 수지 함유 반응 용기에 첨가하고, 플라스크를 DCM(12.7ml)으로 반응기 내로 세정하고, 이를 30℃에서 교반하였다. 샘플에 대해 HPLC를 수행하여 반응 완료를 점검하였다. 25시간 진탕한 후, 분석하여 커플링 반응에 대해 65.6% 전환율이 나타났다. DIC(0.55g)의 키커 차지를 첨가하고, 30℃에서 계속 교반하였다. 또 다시 21시간 동안 진탕한 후, 반응 샘플을 HPLC 분석하여 커플링 반응이 86% 완료되었음이 나타났다. 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 4.166부피) 세척하였다. 이어, 48시간 동안 30℃에서 수지를 또 다른 DMSO(33ml) 중 단편 2(4.04g, 0.65당량), 6-Cl-HOBT(0.43g, 0.65당량) 및 DCM(12.7ml) 중 DIC(0.26g, 0.65당량)의 용액으로 처리하여 재커플링 반응을 수행하였다. HPLC 분석에 의해 90.8% 전환이 나타났다.

재커플링 용액을 배수시킨 후, 상기로부터 구축된 수지를 NMP로 4회(각각 4.4부피), DCM으로 7회(각각 4.4부피) 세척하여 NMP를 제거하고, 수지를 마지막 DCM으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 2% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 0℃에서 4.96부피)을 첨가하고 0℃에서 15분간 교반하였다. 피리딘(사용되는 총 TFA에 대해 1.3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 모았다. 이어, 또 다른 2% TFA/DCM(-5 내지 0℃에서 4.96부피)을 첨가하고, 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘을 함유하는 플라스크에 두번째 절단 용액을 모았다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 7회(5부피) 세척하고, 각 세척액을 절단 용액 회수기 중으로 배수시켰다. 두번째 DCM 세척 동안 피리딘(사용되는 총 TFA에 대해 0.25당량)을 절단 용기에 첨가하였다. 합한 DCM 용액을 10부피(125ml)로 농축하고, 물(4부피)로 세척하고, 또 다른 10부피의 물과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350-75토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 단편 2+3(Fmoc-AA(11-35)-OH) 8.19g을 수득하였으며, H-Aib-O-2CT 수지로부터 64.2% 수율 또는 Fmoc-AA(23-35)-O-2CT 수지로부터 79.5%의 실제 수율이었다. 분석에 의해 64.7% AN의 순도가 나타났다.

실시예 17

GPA 단편 2+3'의 용액-상 합성:

GPA 단편 2+3, Fmoc-AA(11-35)-OH(4.00g, 1.0당량) 및 L-아르기닌아마이드 다이하이드로클로라이드(0.498g, 2.0당량)를 DMSO(30ml)와 혼합하고, 30분간 23 내지 25℃에서 교반하였다. 이 용액에, 1-하이드록시벤조트라이아졸 수화물(HOBT, 2.0당량) 및 DMSO(15ml) 중 HBTU(2.0당량) 및 DIEA(5.5당량)를 가하였다. 반응을 25℃에서 진탕하고, HPLC로 모니터링하였다. 16시간 후, 단편 2+3의 9.1% AN에 여전히 도달되지 않았다. 아르기닌아마이드 다이하이드로클로라이드(0.136g), HBTU(0.193g) 및 DIEA(0.166g)의 키커 차지를 반응 용액에 첨가하고, 이어서 이를 또 다시 15.3시간 동안 진탕하였다. 커플링 반응이 97.6% 완료되었다. 이어, 피페리딘(7.7당량)을 반응 용액에 첨가하였다. 27℃에서 90분 후에 Fmoc 보호기의 제거가 완료되었다. 반응 혼합물을 15 내지 27℃에서 물(100ml)로 급냉시켰다. 혼합물을 40℃로 가열한 후 25℃로 냉각시켰다. 형성된 백색 고체를 여과하고, 물로 세척하였다(2회, 각각 50ml). 여과 케이크를 공기 건조한 후, 3시간 동안 25℃에서 MTBE/헵테인(1:1, 100ml)과 함께 교반하면서 세척하였다. 포트 혼합물을 40℃로 가열하고, 15분 동안 교반하였다. 25℃로 냉각한 후, 생성물을 여과하고, MTBE/헵테인(1:1, 2×50ml)으로 세척하고, 35 내지 40℃에서 진공 건조시켰다. 총 4.22g, 107.2% 실제 수율이 63.7% AN의 순도와 함께 수득되었다.

GPA 단편 2+3', Fmoc-AA(11-36)-NH ₂ 의 GPA 용액-상 합성

실시예 18

단편 2(15.0g, 7.211mmol)(총 펩타이드 7.211mmol, 1.0당량)를 반응기에서 DMF 7.23mL 중 HOBT(0.1104g, 0.721mmol)를 함유하는 용액 7.32mL로 처리하고 실온에서 2-메틸-테트라하이드로퓨란(MeTHF) 150ml에 용해시켰다. 반응기는 베이스에서의 콕마개, 교반기, PT-100 온도계, 자켓식 코일 응축기, 질소 블랭킷, 적하 깔때기 및 자동 온도 조절 장치를 갖춘 1000ml 이중 벽 반응기이다. 생성된 용액을 0 내지 5℃의 내부 온도로 냉각시키고, 교반하였다.

DMF 138ml 및 MeTHF 30ml를 함유하는 별도의 반응기에서, 단편 3'(총 펩타이드 7.355mmol, 1.02당량)를 첨가하고 35 내지 40℃로 가열하고, 용해될 때까지 교반하였다. 반응기는 베이스에서의 콕마개, 교반기, PT-100 온도계, 질소 블랭킷, 적하 깔때기 및 자동 온도 조절 장치를 갖춘 250ml 이중 벽 반응기이다. 생성된 용액을 0 내지 5℃의 내부 온도로 냉각시키고, 교반하였다.

이어, 용액을 0 내지 5℃의 내부 온도에서 제 1 반응기 중 단편 2를 함유하는 용액에 첨가하고, 제 2 반응기를 DMF 30ml로 세정하였다. 이어, 차가운 용액을 HBTU(3.56g, 9.37mmol) 및 DMF 14ml를 함유하는 용액 17.45ml로 15분에 걸쳐 처리한 후, 연이어 10분에 걸쳐 DMF 30ml 중 DIEA(1.72ml, 10.09mmol)로 처리하고, 이때 Fmoc-보호된 중간체가 형성되었다. 생성된 용액을 반응이 완료될 때까지 30분간 0 내지 5℃에서 교반하였다. 이어, 피페리딘(3.06mL, 31.0mmol)을 첨가하고, 35±2℃로 가열함으로써 Fmoc-보호기를 절단하고, 절단이 완료될 때까지 대략 1.5 내지 2시간 동안 교반하였다.

급냉시키고 추출하기 위해, 물 375ml를 반응기 중 준비된 용액에 첨가하고, 20 내지 25℃의 내부 온도에서 대략 5 내지 15분(약 pH 9.9) 동안 교반한 후, 60분 이상 동안 교반하지 않고 정치시키고, 이어서 상을 분리하였다(유기 상 = 약 100ml). 하부의 수성 상을 90ml 메틸-THF로 2회 처리하고, 혼합물을 25±2℃의 내부 온도에서 대략 5 내지 15분(약 pH 9.9) 동안 교반한 후 60분 이상 동안 교반하지 않고 정치시키고, 이어서 두 개의 맑은 상을 분리하였다(수성 상 대략 690g).

이어, 두 개의 유기 상을 합하고(대략 180 내지 200ml), 잔류물이 여전히 유동성인 한 감압(대략 120mbar) 및 40℃의 최대 자켓 온도에서 농축시켰다. 이어, 잔류물을 180ml 메틸-THF 중 20 내지 40℃의 내부 온도 및 40℃의 최대 자켓 온도에서 용해시켰다. 이어, 용액을 감압(대략 120mbar) 및 40℃의 최대 자켓 온도에서 농축시켰으며 그 동안 잔류물은 여전히 유동성이다. 이어, 잔류물을 180ml 메틸-THF 중 20 내지 40℃의 내부 온도 및 40℃의 최대 자켓 온도에서 용해시켰다. 이어, 용액을 잔류물이 여전히 교반성인 한(오일) 감압(대략 120mbar) 및 40℃의 최대 자켓 온도에서 농축시켰다. 이어, 잔류물을 130ml 메틸-THF 중 20 내지 40℃의 내부 온도 및 40℃의 최대 자켓 온도에서 용해시킨 후 25±2℃로 냉각시키고, 샘플링하였다. 샘플이 일치될 때까지 공비 증류 및 Me-THF에 의한 희석(상기 참고)을 반복하였다.

이어, n-헵테인(750ml)을 결정화기(베이스에서의 콕마개, 교반기, PT-100 온도계, 자켓식 코일 응축기, 질소 블랭킷, 증류 헤드, 적하 깔때기 및 자동 온도 조절 장치를 갖춘 1000ml 이중 벽 반응기)에 첨가하고, 상기 제조된 Me-THF 중 생성물 용액(약 200ml)을 1 내지 2시간에 걸쳐 25±3℃ 또는 내부 온도에서 첨가하였다. 생성물이 즉시 침전되었고, 전달 라인을 최대 10ml 메틸-THF로 세정하였다. 이어, 혼합물을 25±3℃에서 1시간 이상 동안 교반하였다. 이어, 생성물을 흡입 필터를 사용하여 여과하고, n-헵테인(150ml)으로 세척하고, 생성물을 12시간 동안 35℃ 이하의 외부 온도에서 진공(<20mbar)하에 건조시켰다. 이 과정에 의해 약한 회백색 생성물 약 30 내지 32g이 수득되었다. 수율: 단편 2로부터 약 75% 또는 단편 3'로부터 77%.

실시예 19 내지 29는 반응식 2에 기재된 커플링 반응식에 관한 것이며, 단편 1, 2, 3 및 3'는 그 안에 정의되어 있다.

GPA 대안 단편 3, Fmoc-AA(28-35)-OH의 고체-상 합성

Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-OH

실시예 19

GPA 대안 단편 3, Fmoc-AA(28-35)-O-2CT 수지의 고체-상 합성

Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-2-CT 수지

로슈 펩타이드 합성기(Roche Peptide Synthesizer) 상에서 Fmoc-AA(28-35)-O-2CT 수지의 고체-상 합성을 수행하였다. 0.36mmol/g으로 로딩된 Fmoc-Aib-2-CT 수지(15.02g)를 반응 용기에 가하고, 25℃에서 30분간 DCM(150ml)에서 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고, 수지를 DMF(각 세척시 90ml)로 3회 세척하였다.

DMF(각 처리시 90ml) 중 20%(v/v) 피페리딘으로 수지를 2회 처리함으로써 수지의 모든 Fmoc 탈보호를 수행하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 피페리딘/DMF 처리 후, 수지를 DMF(각 세척시 100ml)로 9회 세척하였다.

활성화된 에스터 용액을 제조하기 위해, 아미노산 및 1-하이드록시벤조트라이아졸 수화물(HOBT·H₂O)을 칭량하고, 플라스크에서 DMF에 용해시킨 후, 연이어 0 내지 5℃에서 DMF 및 DIEA 중 HBTU 원료 용액(0.503mmol/ml)과 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고, 제조 플라스크를 DCM으로 반응기 내로 세정하였고, 이어서 이를 25℃에서 4 내지 16시간 동안 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험 또는 HPLC 분석을 하여 반응이 완료되었는지를 확인하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 100ml) 세척하였다. 커플링이 완료되지 않는 경우, 16시간 후에 수지를 3시간 동안 DMF 및 DCM 중 아세트산 무수물 및 DIEA와 반응시켜 말단 캡핑시켰다. 단편에 남아있는 아미노산에 대해 Fmoc 기의 제거 및 다음 아미노산과의 커플링 순서를 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

고체-상 합성을 완료한 후, 수지를 DMF(4 × 100ml), DCM(7 × 100ml) 및 아이소프로판올(3 × 100ml)로 세척하였다. 구축된 수지를 진공 건조시키고(19.35g), 절단을 유지시켰다.

실시예 20

구축된 수지로부터 GPA 중간 단편 Fmoc-AA(28-35)-OH의 절단

실시예 19로부터의 구축된 수지 19.0g을 25℃에서 30분간 DCM(150ml)에서 팽윤시켰다. 이어, 혼합물을 -5℃로 냉각시켰다. DCM을 배수시키고, 수지를 0℃에서 30분간 교반하면서 2% TFA/DCM(2 × 7.5부피)의 차가운 용액으로 2회 처리하였다. 절단 용액을 피리딘(사용되는 총 TFA에 대해 1.3당량)을 함유하는 플라스크에서 모았다. 용기를 25℃로 가온시키면서, 수지를 DCM으로 6회(150ml) 세척하고, 반응 용기로 배수시켰다. DCM 용액을 모으고, 농축시키고, 물(150ml)과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 다시 감압하에 증류시켜 남아있는 DCM을 제거하였다(25℃에서 350-50토르). DCM으로서 물로부터 침전된 단편을 제거하였다. 단편을 여과하고, 세척하고, 진공하에 30 내지 35℃에서 건조하였다. 92.7%의 수율의 GPA 대안 단편 3(Fmoc-AA(28-35)-OH)이 95.2% AN의 순도와 함께 수득되었다.

실시예 21

GPA 대안 단편 3 Fmoc-AA(28-35)-O-2CT 수지의 고체-상 합성:

Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-O-2CT 수지

로슈 펩타이드 합성기 상에서 Fmoc-AA(28-35)-O-2CT 수지의 고체-상 합성을 수행하였다. 0.59mmol/g으로 로딩된 H-Aib-2-O-CT 수지(25.01g)(배치 번호 BO06010051)를 반응 용기에 가하고, 25℃에서 30분간 DCM(250ml)에서 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고, 수지를 NMP(각 세척시 150ml)로 3회 세척하였다.

NMP(각 처리시 140ml) 중 20%(v/v) 피페리딘으로 수지를 2회 처리함으로써 수지의 모든 Fmoc 탈보호를 수행하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 피페리딘/NMP 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 140ml)로 9회 세척하였다.

활성화된 에스터 용액을 제조하기 위해, Fmoc 아미노산 및 HOBT·H₂O를 칭량하고, NMP에 용해시킨 후, 연이어 0 내지 5℃에서 NMP 및 DIEA 중 HBTU 용액(0.46mmol/ml)과 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고, 플라스크를 NMP로 반응기 내로 세정하였고, 이어서 이를 25℃에서 4 내지 16시간 동안 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험 또는 HPLC 분석을 하여 반응이 완료되었는지를 확인하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 100ml) 세척하였다. 16시간에 커플링이 여전히 완료되지 않는 경우, 수지를 세척하고(4 × 140ml, NMP), 2시간 동안 아세트산 무수물 및 DIEA와 반응시켜 말단 캡핑시킨 후, NMP로 4회(각 세척시 140ml) 세척하였다. 그 후, 단편에 남아있는 아미노산에 대해 Fmoc 기의 제거, 세척, 커플링 반응 및 세척 순서를 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

고체-상 합성을 완료한 후, 수지를 NMP(4 × 150ml) 및 DCM(7 × 150ml)으로 세척하였다.

구축된 수지로부터 GPA 대안 단편 3(Fmoc-AA(28-35)-OH)의 절단:

실시예 21로부터의 구축된 수지를 DCM(150ml)에서 30분에 걸쳐 -5℃로 냉각시켰다. 이어, DCM을 배수시키고, 수지를 0℃에서 30분간 교반하면서 2% TFA/DCM(2 × 250ml)의 차가운 용액으로 2회 처리하였다. 절단 용액을 피리딘(사용되는 총 TFA에 대해 1.3당량)을 함유하는 플라스크에서 모았다. 용기를 25℃로 가온시키면서, 수지를 DCM으로 6회(각 세척시 150ml) 세척하고, 세척액을 절단 용액과 합쳤다. 합한 DCM 용액을 진공하에 농축시키고 물(150ml)과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(25℃에서 350-50토르). DCM으로서 물로부터 침전된 단편을 제거하였다. 단편을 여과하고, 세척하고, 진공하에 30 내지 35℃에서 건조하였다. 96.9%의 수율의 GPA 대안 단편 3(Fmoc-AA(28-35)-OH)이 96.1% AN의 순도와 함께 수득되었다.

GPA 대안 단편 1+2, Fmoc-AA(7-27)-OH의 고체-상 합성

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ΨMe,Me pro)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH

실시예 22

GPA 대안 단편 1+2, Fmoc-AA(7-27)-O-2CT 수지의 고체-상 합성

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ΨMe,Me pro)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-O-2CT 수지

로슈 펩타이드 합성기 상에서 Fmoc-AA(7-27)-O-2CT 수지의 고체-상 합성을 수행하였다. 0.41mmol/g의 로딩 계수(393-150)를 갖는 Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT 수지(10.04g)를 반응 용기에 가하고, 25℃에서 30분간 DCM(150ml)에서 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고, 수지를 DMF(각 세척시 90ml)로 3회 세척하였다.

이어, 팽윤되고 세척된 Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT 수지를 DMF 중 피페리딘으로 탈보호시켰다. 30분 동안 DMF(80ml) 중 20% 피페리딘으로 수지를 2회 처리함으로써 수지의 모든 Fmoc 탈보호를 수행하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 피페리딘/DMF 처리 후(30분), 수지를 DMF(각 세척시 90ml)로 9회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위해, 아미노산 2.0 당량 및 HOBT·H₂O 2.0당량을 칭량하고, 플라스크에서 DMF에 용해시킨 후, 연이어 0 내지 5℃에서 DMF 중 HBTU 용액 2.0당량(0.503mmol/ml) 및 DIEA 4.5 당량과 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고, 플라스크를 DCM으로 반응기 내로 세정하였고, 이어서 이를 25℃에서 4시간 동안 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험 또는 HPLC 분석을 하여 반응이 완료되었는지를 확인하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 90ml) 세척하였다. 그 후, 단편에 남아있는 아미노산에 대해 Fmoc 기의 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)→Gly→Glu(OtBu)→Leu→Tyr(tBu)→Ser(tBu)-Ser(ΨMe,Me)→Val→Asp(OtBu)→Ser(tBu)→Thr(tBu)→Phe→Thr(tBu)→단편 1의 순서대로).

최종 커플링을 위해, GPA 단편 1(Fmoc-AA(7-10)-OH, Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH) 1.6당량, HOBT·H₂O 1.5당량, HBTU 1.5당량 및 DIEA 3.38당량을 사용하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하여 완료시켰다.

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

고체-상 합성의 완료 후, 수지를 DMF(6 × 90ml), DCM(7 × 90ml) 및 아이소프로판올(3 × 90ml)로 세척하였다. 이어, 구축된 수지를 진공 건조시키고, 절단을 위해 유지하였다.

실시예 23

구축된 수지로부터 GPA 중간체 단편 1+2 Fmoc-AA(7-27)-OH의 절단

실시예 22로부터의 구축된 수지(18.24g)를 DCM(200ml)에서 30분 동안 25℃에서 팽윤시켰다. 이어, 혼합물을 -5℃로 냉각시켰다. DCM을 배수시키고, 수지를 0℃에서 30분간 교반하면서 1% TFA/DCM(3 × 100ml)의 차가운 용액으로 처리하였다. 절단 용액을 피리딘(총 TFA에 대해 1.4당량)을 함유하는 플라스크에서 모았다. 용기를 25℃로 가온시키면서, 수지를 DCM으로 3회(100ml) 세척하였다. 모든 DCM 용액을 합하고, 농축하고, 물(100ml)과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(25℃에서 350-50토르). DCM으로서 물로부터 침전된 단편을 제거하였다. 단편을 여과하고, 물로 세척하고, 진공하에 30 내지 35℃에서 건조하였다. 67.6%의 수율의 GPA 대안 단편 1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)가 85.3% AN의 순도와 함께 수득되었다.

실시예 24

GPA 대안 단편 1+2, Fmoc-AA(7-27)-O-2CT 수지의 고체-상 합성

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)Ser(ΨMe,Me pro)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-O-2CT

0.50mmol/g의 로딩 계수(393-53)를 갖는 Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT 수지 20.0g의 규모로 로슈 펩타이드 합성기 상에서 Fmoc-AA(7-27)-O-2CT 수지의 고체-상 합성을 반복하였다. 수지를 25℃에서 30분간 DCM(200ml)에서 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고, 수지를 DMF(각 세척시 120ml)로 3회 세척하였다.

이어, 팽윤되고 세척된 Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT 수지를 DMF 중 피페리딘으로 탈보호시켰다. 30분 동안 DMF(각 처리시 120ml) 중 20% 피페리딘으로 수지를 2회 처리함으로써 수지의 모든 탈보호를 수행하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 피페리딘/DMF 처리 후(30분), 수지를 DMF(각 세척시 120ml)로 9회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위해, 아미노산(또는 GPA 단편 1) 2.0 당량 및 HOBT·H₂O 2.0당량을 칭량하고, DMF에 용해시킨 후, 연이어 0 내지 5℃에서 DMF 중 HBTU 용액 2.0당량(0.503mmol/ml) 및 DIEA 4.5당량과 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고, 플라스크를 DCM으로 반응기 내로 세정하였고, 이어서 이를 25℃에서 4시간 동안 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험 또는 HPLC 분석을 하여 반응이 완료되었는지를 확인하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 4회(각 세척시 180ml) 세척하였다. 그 후, 단편에 남아있는 아미노산에 대해 Fmoc 기의 탈보호 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)→Gly→Glu(OtBu)Leu→Tyr(tBu)→Ser((tBu)Ser(ΨMe,Me)→Val→Asp(OtBu)→Ser(tBu)→Thr(tBu)→Phe→Thr(tBu)→단편 1의 순서대로).

최종 커플링을 위해, 단편 1(Fmoc-AA(7-10)-OH) 1.5당량, HOBT·H₂O, HBTU 및 DIEA 3.38당량 만을 사용하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하였다.

본 실시예에 사용된 모든 시약의 양이 아래 표에 기재된다:

120m 고체-상 합성의 완료 후, 수지를 DMF(4 × 120ml) 및 DCM(8 × l)으로 세척하였다. 절단을 위한 제조시 마지막 DCM으로 세척하는 동안 혼합물을 -5℃로 냉각시켰다.

구축된 수지로부터 GPA 중간체 단편 Fmoc-AA(7-27)-OH의 절단:

상기로부터 DCM 중 구축된 수지의 반응기 온도가 -5℃에 도달한 후, DCM을 배수시키고, 수지를 0℃에서 30분간 교반하면서 1% TFA/DCM(3 × 200ml)의 차가운 용액으로 3회 처리하였다. 절단 용액을 피리딘(사용되는 총 TFA에 대해 1.4당량)을 함유하는 플라스크에서 모았다. 용기를 25℃로 가온시키면서, 수지를 DCM으로 5회(각각 200ml) 세척하였다. 모든 DCM 용액을 합하고, 농축하고, 물(200ml) 및 아이소프로판올(80ml)과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(25℃에서 350-50토르). DCM으로서 침전된 단편을 제거하였다. 단편을 여과하고, 물로 세척하고, 진공하에 30 내지 35℃에서 건조하였다. 77.7%의 수율의 GPA 대안 단편 1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)가 86.4% AN의 순도와 함께 수득되었다.

GPA 대안 단편 3', H-AA(28-36)-NH ₂ 의 용액-상 합성

H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH₂

실시예 25

대안 단편 3(Fmoc-AA(28-35)-OH, 6.11g, 4.42mmol 실시예 20) 및 아르기닌아마이드 다이하이드라이드(H-Arg (2HCl)-NH₂, 2.18g, 8.84mmol, 2당량)를 DMF(42ml)에 용해시켰다. 이 용액에 DMF(42ml) 중 HOBt·H₂O(0.67g, 1당량) 및 HBTU(3.38g, 2당량)의 용액 및 DIEA(3.44ml, 4당량)를 DMF 15ml와 함께 연이어 가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 진탕하고 HPLC에 의해 모니터링하였다. 21시간 동안 교반한 후 반응을 완료시켰다. 이어, 피페리딘(2.26g, 6당량)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 1시간 동안 35℃에서 교반한 후에도 Fmoc 제거가 완료되지 않았다. 추가의 피페리딘(2.33g, 6.2당량)을 첨가하고 또 다시 1.75시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(240ml)로 급냉시켜 백색 고체를 형성시켰다. 피리딘 하이드로클로라이드(8.33g, 16.3당량)를 침전된 반응 혼합물에 가하여 피페리딘을 중화시켰다. 백색 고체를 여과하고, 물(400ml)로 세척하고, 밤새 부분적으로 건조시켰다. 습윤 여과 케이크를 100ml MTBE/n-헵테인(1:1 = 부피:부피)으로 재슬러리하고, 여과하고, MTBE/n-헵테인(1:1 = 부피:부피; 2 × 25ml)으로 세척하고, 진공 건조하여 GPA 대안 단편 3' H-AA(28-36)-NH₂(6.22g, 106.9% 수율)를 제조하였다. HPLC 분석에 의해 87% AN의 순도가 나타났다.

실시예 26

대안 단편 3(Fmoc-AA(28-35)-OH, 6.12g, 4.42mmol 실시예 21) 및 아르기닌아마이드 다이하이드라이드(H-Arg (2HCl)-NH₂, 2.19g, 8.84mmol, 2당량)를 DMF(42ml)에 용해시켰다. 이 용액에 DMF(42ml) 중 HOBt·H₂O(0.67g, 1당량) 및 HBTU(3.38g, 2당량)의 용액 및 DIEA(3.44ml, 4당량)를 DMF 15ml와 함께 연이어 가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 진탕하고 HPLC에 의해 모니터링하였다. 반응을 밤새 수행하였다(16.3시간). 이어, 피페리딘(4.52g, 12당량)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 35분 동안 25℃에서 교반한 후에 Fmoc 제거가 완료되었다. 반응 혼합물을 물(200ml)로 급냉시켰다. DCM(180ml)을 가하여 침전된 생성물을 추출하였다. 하부의 DCM 층을 물로 2회(2 × 100ml) 세척하고, 50ml 부피로 농축시켰다. 농축된 DCM 용액을 헵테인 150ml에 조금씩 공급하여 생성물을 침전시켰다. DCM을 진공하에 증류시켰다. MTBE 120ml를 침전 혼합물에 가하였다. 형성된 백색 고체를 여과하고, MTBE/n-헵테인(1:1 = 부피:부피; 2 × 50ml)으로 세척하고 진공 건조시켜 GPA 대안 단편 3' H-AA(28-36)-NH₂(6.54g, 112.4% 수율)를 제조하였다. HPLC 분석에 의해 92.1% AN의 순도가 나타났다.

GPA 조질의 용액-상 합성:

실시예 27

실시예 23으로부터의 GPA 단편 1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)(0.383g) 및 실시예 24로부터의 단편 3'(H-AA(28-36)-NH ₂ )(0.203g)를 DMSO(2ml) 및 NMP(4ml)의 용액에 용해시키고, 1시간 동안 교반하였다. 이 용액에, HOBt 수화물(0.040g) 및 HBTU(0.092g)를 가하였다. 이어, DIEA(0.080ml)를 반응 혼합물에 가하였다. 반응을 주변 온도에서 진탕하고 HPLC에 의해 모니터링하였다. 68시간 동안 교반한 후, 반응이 완료되었는지 검사하여 반응이 수행되었음을 가리켰다. 피페리딘(0.1ml)을 반응 혼합물에 가하였다. 16시간 교반한 후, Fmoc 제거를 수행하였다. 이어, 물(40ml)을 가함으로써 반응 혼합물을 급냉시켰다. 30분 동안 교반한 후, 여과하고, 물(20ml)로 세척하고 밤새 건조시킴으로써 고체를 단리하였다. 이어, 단리된 고체를 주변 온도에서 TFA(4ml), DCM(1.5ml), 다이티오트레이톨(DTT)(0.2g) 및 물(0.2ml)을 함유하는 용액에 가하였다. 6시간 진탕한 후, 차가운(-20℃) MTBE(40ml)를 가함으로써 반응 혼합물을 급냉시켰다. 급냉된 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 고체 생성물을 여과하고, MTBE(2 × 10ml)로 세척하고, 주변 온도에서 밤새 건조시켰다. 49.5% AN(D-Glu-27 이성질체, 7.9%)의 순도를 갖는 GPA 조질 0.42g(28.2%wt/wt)을 수득하였다.

실시예 28

배치 실시예 23으로부터의 GPA 단편 1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)(0.382g) 및 실시예 25로부터의 단편 3'(H-AA(28-36)-NH ₂ )(0.202g)를 DMSO(2ml) 및 NMP(4ml)의 용액에 용해시키고, 0.5시간 동안 교반하였다. 이 용액에, HOBt 수화물(0.041g) 및 DEPBT(0.085g)를 가하였다. 이어, DIEA(0.080ml)를 반응 혼합물에 가하였다. 반응을 주변 온도에서 교반하고 HPLC에 의해 모니터링하였다. 밤새 반응이 완료되었는지 검사하여 반응이 완료되었음을 가리켰다. 피페리딘(0.1ml)을 반응 혼합물에 가하였다. 68시간 교반한 후, Fmoc 제거를 수행하였다. 이어, 물(40ml)을 가함으로써 반응 혼합물을 급냉시켰다. 15분 동안 교반한 후, 여과하고, 물(20ml)로 세척하고 밤새 건조시킴으로써 고체를 단리하였다. 이어, 단리된 고체를 주변 온도에서 TFA(4ml), DCM(1.5ml), DTT(0.2g) 및 물(0.2ml)을 함유하는 용액에 가하였다. 6시간 진탕한 후, 차가운(-20℃) MTBE(40ml)를 가함으로써 반응 혼합물을 급냉시켰다. 급냉된 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 고체 생성물을 여과하고, MTBE(2 × 10ml)로 세척하고, 주변 온도에서 밤새 건조시켰다. 51.3% AN(D-Glu-27 에피머, 4.5%)의 순도를 갖는 GPA 조질 0.43g(31.4%wt/wt)을 수득하였다.

실시예 29

단계 A . 단편 1+2와 THF 중 단편 3'의 HOBt, HBTU 및 DIEA와의 커플링 반응

22 내지 27℃의 내부 온도에서 THF 37.5ml를 갖는 100ml 4목 플라스크로, 단편 1+2(6.20g, 2.32mmol)를 10분 이내에 3부분으로 첨가하였다. 20ml 둥근 바닥 플라스크로 HOBt 수화물(309mg, 1.98mmol) 및 HBTU(1223mg, 3.16mmol)를 첨가하였다. THF 10.0ml를 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 22 내지 27℃의 내부 온도에서 교반하였다. 이 커플링 반응 현탁액을 펩타이드 용액에 첨가하고, 플라스크를 THF 3.0ml로 세정하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 이어, DIEA(0.582ml, 3.31mmol)를 첨가하고 10분 동안 교반하였다. 1시간 이내에, 단편 3'(6.10g, 2.72mmol)를 3부분으로 첨가하였다. 단편 잔여물을 THF 10.0ml로 세정하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 25 내지 27℃의 내부 온도로 강하게 교반하였다.

단계 B . 피페리딘을 사용한 FMOC-기의 제거

이어, 피페리딘(1.60mL, 16.0mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 25 내지 27℃의 내부 온도에서 6시간 동안 강하게 교반하였다. 이어, 반응 혼합물을 250ml 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 용매를 42℃ 배치 온도/200-100mbar에서 진공하에 제거하였다.

단계 C . 염화메틸렌을 사용한 용매 교환

이어, 잔류물을 염화메틸렌 35.0ml에 용해시키고, 이어서 이를 42℃ 배치 온도/400-100mbar에서 진공하에 제거하였다. 이어서, 잔류물을 염화메틸렌 30.0ml에 용해시켰다.

단계 D . TFA/DTT/물을 사용한 전체적인 탈보호

1000ml 이중 자켓식 플라스크로, DTT(5.75g, 37.1mmol), H₂O 5.75ml 및 TFA(102.5ml, 1220mmol)를 첨가하고, 용액을 15℃의 내부 온도로 냉각시켰다. 이어, 펩타이드 용액을 10 내지 15분 이내에 첨가하고, 첨가 깔때기를 염화메틸렌 5.0ml로 세정하였다. 진한 황색 반응 용액을 10.5시간 동안 14 내지 16℃의 내부 온도에서 교반하였다.

단계 E . MTBE의 첨가시 펩타이드의 침전

이어, 반응 혼합물을 0℃의 내부 온도로 냉각시키고, MTBE 480ml(0 내지 5℃로 미리 냉각됨)를 10분 이내에 연속적으로 첨가하고, 내부 온도를 22℃로 상승시켰다. 이어, 현탁액을 16 내지 18℃의 내부 온도에서 2시간 동안 교반한 후 여과하였다. 여전히 습기가 있는 여과 케이크를 MTBE 300ml로 3회(3 × 100ml) 세척하였다. 이어, 플라스크를 세정하고, 여과 케이크를 슬러리화하고 여과하였다. 이어, 마지막 세척 후 여과 케이크를 건조하게 흡수시키고, 잔류물을 38 내지 42℃/20 내지 30mbar에서 밤새 건조시켰다(화학 수율: 58-65%, 분석: 39-43%).

특정한 형태로 표현하거나 개시된 기능을 수행하기 위한 수단 또는 적절한 경우 개시된 결과를 달성하기 위한 방법 또는 공정 면에서, 상기 상세한 설명 또는 하기 청구범위에 개시된 특징은 본 발명을 그의 다양한 형태로 실현시키기 위해 별도로 또는 상기 특징들을 조합하여 이용될 수 있다.

상기한 발명은 예시로서, 예를 들면 명확하게 이해하기 위해서 상세하게 기재하였다. 첨부된 청구범위 내에서 변화 및 변경이 이루어질 수 있음을 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 따라서, 상기 설명은 예시하고자 함이며 제한하고자 함이 아님을 이해해야 한다. 그러므로, 본 발명의 범위는 상기 설명이 아닌 하기 첨부된 청구범위 및 청구범위에 의해 주어지는 모든 등가 범위를 참고로 결정되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Insulinotropic Peptide Synthesis using Solid and Solution Phase Combination Techniques <130> Case 24689 <140> PCT/EP2008/066585 <141> 2008-12-02 <150> US 61/007238 <151> 2007-12-11 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 20 25 30 Val Lys Gly Arg Gly 35 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..() <223> Xaa is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..() <223> Xaa is Aib <400> 4 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> is substituted by B' being a solid phase resin or -OH <400> 5 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> amidated Arginine (Argininamide) <400> 6 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> is substituted by B' being a solid phase resin or -OH <400> 7 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> amidated Arginine (Argininamide) <400> 8 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> is substituted by B' being a solid phase resin or -OH <400> 9 His Xaa Glu Xaa 1 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> amidated arginine (Argininamide) <400> 10 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> amidated arginine (argininamide) <400> 11 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> amidated Arginine (Argininamide) <400> 12 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> is substituted by B' being a solid phase resin or -OH <400> 13 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 20 25 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> is substituted by B' being a solid phase resin or -OH <400> 14 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 20 25 <210> 15 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> amidated arginine (Argininamide) <400> 15 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized petide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> is substituted by B' being a solid phase resin or -OH <400> 16 Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> amidated arginine (argininamide) <400> 17 Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 1 5 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> is substituted by Z being an N-terminal protecting group or hydrogen <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> is substituted by B' being a solid phase resin or -OH <400> 18 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu 20 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> amidated arginine (argininamide) <400> 19 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 20 His Xaa Glu Xaa 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <400> 21 His Xaa Glu Gly 1 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <400> 22 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 23 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemicallly synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Aib <400> 24 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 10 <210> 25 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> amidated arginine (argininamide) <400> 25 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> amidated arginine (argininamide) <400> 26 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <400> 27 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu 20 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <400> 28 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu 20 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <400> 29 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 30 Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Aib <400> 31 Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> amidated arginine (argininamide <400> 32 Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 1 5

Claims

(a) 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 5
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 -OH이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(b) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 6
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(c) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 6
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(d) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 7
Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'
(여기에서,
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 -OH이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(e) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(f) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 14
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(g) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 7 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 9
Z-HX⁸EX¹⁰-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 -OH이고;
H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(h) 제 7 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 6 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
(a) 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 5
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(b) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 6
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(c) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 6
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(d) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 7
Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'
(여기에서,
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(e) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(f) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(g) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 7 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 9
Z-HX⁸EX¹⁰-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(h) 제 7 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 6 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
(i) 인슐린친화성 펩타이드의 N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(j) 단계 (i)로부터 생성된 인슐린친화성 펩타이드를 산과 접촉시켜 아미노산 측쇄를 탈보호함으로써 하기 서열 식별 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 11
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이다)
를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
탈보호된 인슐린친화성 펩타이드가 하기 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 방법:
서열 식별 번호: 12
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂
(a) 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 5
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 고체-상 수지이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(b) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 5
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
Z는 H-이고;
B'는 고체-상 수지이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(c) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 7
Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'
(여기에서,
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 -OH이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(d) 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편을 고체-상인 제 2 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 13
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 고체-상 수지이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(e) 고체-상 수지로부터 제 4 펩타이드 단편을 제거하고, 용액 상태의 제 4 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(f) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(g) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 7 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 9
Z-HX⁸EX¹⁰-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(h) 제 7 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 6 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 5 항에 있어서,
(a) 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 5
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 고체-상 수지이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(b) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 5
Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
Z는 H-이고;
B'는 고체-상 수지이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(c) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 용액 상태의 제 3 펩타이드를 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 7
Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B'
(여기에서,
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(d) 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편을 고체-상인 제 2 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 13
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 고체-상 수지이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(e) 고체-상 수지로부터 제 4 펩타이드 단편을 제거하고, 용액 상태의 제 4 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(f) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(g) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 7 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 9
Z-HX⁸EX¹⁰-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(h) 제 7 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 6 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
(i) 인슐린친화성 펩타이드의 N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(j) 단계 (i)로부터 생성된 인슐린친화성 펩타이드를 산과 접촉시켜 아미노산 측쇄를 탈보호함으로써 하기 서열 식별 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 11
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이다)
를 추가로 포함하는 방법.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
탈보호된 인슐린친화성 펩타이드가 하기 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 방법:
서열 식별 번호: 12
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂
(a) 하기 서열 식별 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편 또는 그의 대응물을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 13
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 -OH이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(b) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(c) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(d) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 9
Z-HX⁸EX¹⁰-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 -OH이고;
H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(e) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 9 항에 있어서,
(a) 하기 서열 식별 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편 또는 그의 대응물을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 13
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(b) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(c) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 8
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(d) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 9
Z-HX⁸EX¹⁰-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 -OH이고;
H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(e) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
(i) 인슐린친화성 펩타이드의 N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(j) 단계 (i)로부터 생성된 인슐린친화성 펩타이드를 산과 접촉시켜 아미노산 측쇄를 탈보호함으로써 하기 서열 식별 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 11
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이다)
를 추가로 포함하는 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
탈보호된 인슐린친화성 펩타이드가 하기 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 방법:
서열 식별 번호: 12
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂
하기 서열 식별 번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드:
서열 식별 번호: 14
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAib-B'
여기에서,
Z는 H- 및 Fmoc- 중에서 선택되고;
B'는 -OH 또는 고체-상 수지이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다.
제 13 항에 있어서,
슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기가 슈도프롤린의 Ser-Ser 잔기인 펩타이드.
하기 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드:
서열 식별 번호: 15
Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂
여기에서,
Z는 H- 및 Fmoc- 중에서 선택되고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다.
제 15 항에 있어서,
슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기가 슈도프롤린의 Ser-Ser 잔기인 펩타이드.
(a) 하기 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 16
Z-FIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기이고;
B'는 고체-상 수지이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
(b) 단계 (a)의 제 1 펩타이드 단편을 고체-상 수지로부터 절단시켜 용액 상태의 하기 서열 식별 번호: 16의 제 1 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 16
Z-FIAWLVKX³⁵-B'
(여기에서,
B'는 -OH이다)
(c) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 17
Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(d) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 17
Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
(a) 하기 서열 식별 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 18
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 고체-상 수지이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(b) 단계 (a)의 펩타이드 단편을 고체-상 수지로부터 절단시켜 용액 상태의 하기 서열 식별 번호: 18의 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 18
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'
(여기에서,
B'는 -OH이다)
를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 17 항에 있어서,
(e) 하기 서열 식별 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 18
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'
(여기에서,
X⁸ 및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
B'는 고체-상 수지이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및
(f) 단계 (e)의 제 4 펩타이드 단편을 고체-상 수지로부터 절단시켜 용액 상태의 하기 서열 식별 번호: 18의 제 4 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 18
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'
(여기에서,
B'는 -OH이다)
를 추가로 포함하는 방법.
제 19 항에 있어서,
(g) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 N-말단 보호기이고;
X⁸및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 추가로 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서,
(h) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 10
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X⁸및 X¹⁰은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)
를 추가로 포함하는 방법.
제 21 항에 있어서,
(i) 단계 (h)로부터 생성된 인슐린친화성 펩타이드를 산과 접촉시켜 아미노산 측쇄를 탈보호시킴으로써 하기 서열 식별 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 탈보호된 인슐린친화성 펩타이드를 수득하는 단계:
서열 식별 번호: 11
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂
(여기에서,
Z는 H-이고;
X⁸, X¹⁰및 X³⁵는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이다)
를 추가로 포함하는 방법.
제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
탈보호된 인슐린친화성 펩타이드가 하기 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 방법:
서열 식별 번호: 12
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂
하기 서열 식별 번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드:
서열 식별 번호: 18
Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B'
여기에서,
Z는 H- 및 Fmoc- 중에서 선택되고;
B'는 -OH 또는 고체-상 수지이고;
X^17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다.
제 24 항에 있어서,
슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기가 슈도프롤린의 Ser-Ser 잔기인 펩타이드.
하기 서열 식별 번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드:
서열 식별 번호: 17
Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂
여기에서,
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다.
제 26 항에 있어서,
X³⁵가 Aib인 펩타이드.
하기 서열 식별 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드:
서열 식별 번호: 16
Z-FIAWLVKX³⁵-B'
여기에서,
B'는 고체-상 수지 또는 -OH이고;
Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;
X³⁵는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;
상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다.
제 28 항에 있어서,
X³⁵가 Aib인 펩타이드.
본원에서 정의된 인슐린 친화성 펩타이드의 제조 방법 및 펩타이드.