CN101903400A

CN101903400A - 使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成

Info

Publication number: CN101903400A
Application number: CN2008801198008A
Authority: CN
Inventors: 陈林; 韩渊奎; 克里斯托夫·R·罗伯茨
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-12-11
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2028-12-02
Also published as: US20090292108A1; CN101903400B; ZA201003849B; AU2008334783A1; JP2011506376A; WO2009074483A2; EP2222695A2; BRPI0820765A2; US8227571B2; WO2009074483A3; IL205932A0; MX2010006044A; TWI374890B; AR069608A1; KR20100102652A; PE20091214A1; CA2707132A1; RU2010128247A; CL2008003660A1; TW200927756A

Abstract

本发明涉及促胰岛素肽的制备，所述促胰岛素肽利用固相和液相(“杂合”)方法合成。一般地，所述方法包括利用固相化学合成3种不同的肽中间体片段。然后，利用液相化学将额外的氨基酸物质添加到第三片段上，然后将所述第三片段与第二片段偶联，再接着与溶液中的第一片段偶联。备选地，将不同的第二片段与固相中的第一片段偶联。接着，使用液相化学来将另外的氨基酸物质加到不同的第三片段上。随后，将这种不同的第三片段与液相中的偶联的第一片段和不同的第二片段偶联。在一个片段中使用假脯氨酸使得所述片段的固相合成更容易，并且还使得将这一片段后续液相偶联到其它片段上更容易。本发明非常有效地用于制成促胰岛素肽如GLP-1(7-36)以及它的天然的和非天然的负体。

Description

使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成

本发明涉及利用固相和液相方法制备促胰岛素肽、特别是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其负体的方法。本发明还涉及可以用在这些方法中的中间体肽片段。

在文献中描述了很多肽合成方法(例如，参见美国专利号6,015,881；Mergler等.(1988)四面体通讯(Tetrahedron Letters)29：4005-4008；Mergler等.(1988)四面体通讯(Tetrahedron Letters)29：4009-4012；Kamber等.(编)，肽、化学和生物学(Peptides，Chemistry and Biology)，ESCOM，Leiden(1992)525-526；Riniker等.(1993)四面体通讯(Tetrahedron Letters)49：9307-9320；Lloyd-Williams等.(1993)四面体通讯(Tetrahedron Letters)49：11065-11133；和Andersson等.(2000)生物聚合物(Biopolymers)55：227-250)。许多合成方法以所述合成在其中发生的相的物理状态，即液相或固相，进行区分。

在固相肽合成(SPPS)中，将氨基酸或肽基团结合到固体支持物树脂上。然后，将连续的氨基酸或肽基团附着到结合在支持物上的肽上，直到形成目的肽物质。然后结合在支持物上的肽典型地被从所述支持物上裂解，并且进行进一步的加工和/或纯化。在一些情形中，固相合成产生成熟的肽产物；在另一些情形中，从所述支持物上裂解下的肽(即，“肽中间体片段”)用于制备更大的、成熟的肽产物。

从固相方法生成的肽中间体片段可以在固相或在液相合成过程(本文叫作“液相合成”)中偶联在一起。液相合成可以特别有效地用于通过固相合成有用的成熟肽是不可能的或不实际的情形中。例如，在固相合成中，更长的肽尽管仍然附着在固体支持物上，但是最终可能采取不规则的构象，使得很难将其它的氨基酸或肽物质添加到延长的链上。由于肽链在支持物树脂上变得更长，加工步骤诸如偶联和去保护的效率可能受到损害。除了起始材料如活化的氨基酸、辅助试剂和溶剂的增加的损失之外，这又可能导致更长的加工时间来弥补这些问题。这些问题可能随着肽长度的增加而增加。

因此，仅利用固相方法，发现以单一片段合成长度大于30个氨基酸的成熟的肽相对是不常见的。相反，可以在固相上分开合成个体片段，然后在固相和/或液相中偶联，以构建需要的肽产物。这种方法需要仔细选择片段候选物。尽管一些通用原理可以指导片段选择，但是通常非常需要凭经验检测片段候选物。在一种情形中作用的片段策略可能在其它情形中不起作用。甚至在不包括合理的片段候选物时，对于合成策略仍然可能需要加工创新，以在商业合理条件下作用。因此，利用杂合方案的肽合成通常是具有挑战性的，并且在许多情形中，在进行实际合成之前很难预测在合成方案中固有什么样的问题。

在液相偶联中，两种肽中间体片段、或肽中间体片段和活性氨基酸在适当的溶剂中偶联，通常在促进偶联反应的效率和质量的其它试剂的存在下进行偶联。所述肽中间体片段是反应性排列的，因此一个片段的N端偶联到另一个片段的C端，或者反之亦然。另外，在液相偶联过程中，在固相合成过程中存在的侧链保护基通常保留在所述片段上，以确保所述片段末端的特异性反应性。这些侧链保护基典型地直到形成成熟的肽之后才去除。

在综合合成方案中的一个步骤或多个步骤中的适度改进可以汇集成制备成熟的肽中的显著的改进。这样的改进可以导致时间和试剂的更大、全面的节约，并且还可以显著提高终产物的纯度和产量。

尽管关于在杂合合成中的改进的重要性的讨论适用于利用这些方法生产的任何种类的肽，但是在治疗有用性的肽和以商业医药用途规模制造的肽的情形中特别重要。合成更大的生物分子药物，诸如治疗性肽，可能是非常昂贵的。由于试剂的成本、合成时间，许多合成步骤，除了其它因素之外，在这些更大生物分子药剂的合成过程中的很小的改进可能对于生产这样的药剂是否甚至是经济可行的具有显著影响。这样的改进是必需的，原因在于对于更大的生物分子药剂的这些高生产成本，这是得到这样的事实的支持的，即，在许多情形中，对于这些类型的更大生物分子药剂，存在很少，如果有一些的话，适当的治疗性备选物。

这在胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其负体的情形中可以清楚的看出。这些肽已经作为可能的治疗剂参与治疗2型非胰岛素依赖型糖尿病以及相关的代谢病症，诸如肥胖症。Gutniak，M.K.，等，糖尿病基因(Diabetes Care)1994：17：1039-44。

Lopez等确定天然的GLP-1长度是37个氨基酸残基。Lopez，L.C.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，80：5485-5489(1983)。这一确定得到Uttenthal，L.O.，等，临床内分泌学和代谢学杂志(J.Clin.Endocrinal.Metabol.)，61：472-479(1985)的工作的证实。天然GLP-1可以由符号GLP-1(1-37)表示。这一符号表示所述肽具有从1(N端)到37(C端)的全部氨基酸。天然的GLP-1(1-37)具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列：

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

已经报道天然GLP-1(1-37)通常不能调控胰岛素的生物合成，但是该肽的生物学重要的片段确实具有促胰岛素特征。例如，SEQ ID NO.2所述的长度为31个氨基酸的天然肽GLP-1(7-37)：

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

是促胰岛素的，并且具有天然GLP-1的7(N-端)-37(C-端)的氨基酸。GLP-1(7-37)具有末端甘氨酸。当这个甘氨酸不存在时，得到的肽仍然是促胰岛素活性的，并且叫作GLP-1(7-36)，其为SEQ ID NO.3：

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

GLP-1(7-36)通常以C端精氨酸为酰胺化的形式存在，并且这种形式可以由符号GLP-1(7-36)-NH₂表示。

GLP-1(1-37)通常在体内转化成它的促胰岛素活性的负体。例如，GLP-1(1-37)在体内自然转化成GLP-1(7-37)。该肽又还可以进行蛋白水解去除C端甘氨酸的额外的加工以产生GLP-1(7-36)，其通常以酰胺化形式GLP-1(7-36)-NH₂存在。因此，治疗性治疗可以包括施用GLP-1(1-37)或其负体，期望在体内形成它的促胰岛素活性的衍生物。然而，更普遍地，在研究中的治疗性治疗包括施用促胰岛素活性GLP-1片段本身。

依据US 6,887,849，GLP-1(7-37)，GLP-1(7-36)和GLP-1(7-36)-NH₂的促胰岛素活性似乎是对胰腺β细胞特异性的，在其中这些肽似乎诱导胰岛素的生物合成。这使得这些肽和它们的药用负体有效用于成年发病型糖尿病的病理研究，成年发病型糖尿病是一种以胰岛素分泌的动力学异常的高血糖症为特征的病症。此外，这些胰高血糖素样肽将有效用于这种疾病的治疗和处理，并且有效用于高血糖症的治疗和处理。依据EP 1137667B1，这些肽或它们的药用负体还可以有效用于治疗其它类型的糖尿病、肥胖症、胰高血糖症(glucagonomas)、呼吸的分泌紊乱、代谢紊乱、关节炎、骨质疏松症、中枢神经系统病、再狭窄、神经变性病、肾衰竭、充血性心脏衰竭、neophrotic综合征、硬化、肺水肿、高血压、和/或需要减少食物摄入量的病症。

SEQ ID NO.1-3的天然GLP-1(1-37)和它的天然促胰岛素活性负体是代谢不稳定的，在体内仅有1-2分钟的血浆半衰期。外源施用的GLP-1也快速地降解。这种代谢不稳定性已经限制了天然GLP-1和其天然片段的治疗潜力。

已经开发了具有提高的稳定性的GLP-1肽的合成负体。例如，在EP1137667 B1中描述了SEQ ID NO.4的肽：

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

除了在位置8和35出现α-氨基异丁酸(示意性表示为缩写Aib)的非手性残基取代在这些位置的相对应的天然氨基酸之外，该肽与天然GLP-1(7-36)相似。非手性α-氨基异丁酸还叫作甲基丙氨酸。该肽可以表示为式(Aib^8，35)GLP-1(7-36)或酰胺化形式，(Aib^8，35)GLP-1-(7-36)-NH₂。

EP 1137667B1陈述SEQ ID NO.4的肽及其负体可以利用固相技术构建为单一片段。由EP 1137667B1提出的单一片段合成方法是有问题的。一个问题是，这种方法可能在最后的氨基酸偶联中导致高水平的差向异构，例如，在例如(Aib^8，35)GLP-1(7-36)的情形中的组氨酸。另外，在层析纯化过程中很难去除杂质，并且产量倾向于太低。因此，为了能够以商业接受的产量、纯度和数量制造该肽及其负体，需要用于合成SEQ ID NO.4的肽的改进的策略。

除了这些考虑之外，关于肽的大规模生产的产物回收和产物纯度的问题，以及试剂处理、储存和出售的问题可极大地影响肽合成方案的可行性。因此，对于能够以具有提高的产量的大批次数量有效生产商业目的的肽物质的肽合成方法存在持续的需求。

本申请涉及利用固相和液相(“杂合”)方法合成的促胰岛素肽的制备。在一种方法中，所述方法包括利用固相化学原理合成3个不同的肽中间体片段。然后，利用液相化学原理将额外的氨基酸物质添加到一个片段上。然后，将所述片段在液相中偶联在一起。在一个片段中使用假脯氨酸使得所述片段的固相合成更容易，并且还使得将这一片段随后液相偶联到其它片段更容易。本发明非常有效地用于制成促胰岛素肽如GLP-1、GLP-1(7-36)以及这些的天然的和非天然的负体，特别是GLP-1(7-36)以及它的天然的和非天然的负体。

在一方面，本申请提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)将溶液中的第一肽片段与精氨酰胺(arginine amide)偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.6)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.6)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.7)

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

e)将所述第四肽片段与所述第三肽片段在溶液中偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第七肽片段，

其中：

X⁸和X¹⁰每个独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是-OH；且

H和E的每个任选地包含侧链保护；且

h)将所述第七肽片段与所述第六肽片段在溶液中偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的促胰岛素肽，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X⁸，X¹⁰和X³⁵每个独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

“N-端保护基”意指选自由下列组成的组的基团：Acr(烯丙酰)、Bz(苯甲酰基)、Ac(乙酰基)、Trt(三苯甲基)Boc(叔丁氧基羰基)、CBz(苄氧基-羰基或Z)、Dts(dithiasuccinoyl)、Rdtc(R＝烷基或芳基、dtc＝二硫代氨基甲酸盐)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)、Alloc(烯丙氧基羰基)、pNZ(对硝基苄氧基羰基)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]-乙氧基]羰基])、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、MBz(4-甲氧基CBz)、Poc(2-苯丙基(2)-氧基羰基)、Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]、Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)-乙氧基]羰基]、CBz[(苯基甲氧基)羰基]、Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]、和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]。优选的N-端保护基是Fmoc，Bpoc，Trt，Poc和Boc。

“非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基”是这样的氨基酸，其可以衍生自天然的非手性甘氨酸，或另外的非手性氨基酸。优选地，所述非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基选自由下列各项组成的组：甘氨酸(G)、2-甲基丙氨酸(Aib)和2-苯甲基-苯丙氨酸。最优选地，所述非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基选自G或Aib。

在优选的方面，本申请提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)将溶液中的第一肽片段与精氨酰胺偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.6)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.6)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.7)

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第七肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；和

h)将所述第七肽片段与所述第六肽片段在溶液中偶联从而提供这样的促胰岛素肽，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X⁸，X¹⁰和X³⁵每个独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

在另一个方面，本申请提供上述方法，所述方法还包括下述步骤：

i)去除所述促胰岛素肽的N-端保护基以提供这样的促胰岛素肽，其包括氨基酸序列(SFQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

j)使由步骤i)得到的促胰岛素肽与酸接触以对氨基酸侧链进行去保护，从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.11)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；并且

X⁸，X¹⁰和X³⁵每个独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。

在又一个方面，本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.12)

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂。

在一个方面，本申请提供一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第二肽片段，

其中：

Z是H-；

B’是固相树脂；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)提供在溶液中的第三肽片段，所述第三肽片段包括氨基酸序列(SEQ ID NO.7)

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)使溶液中的第三肽片段与固相中的第二肽片段偶联从而提供这样的第四肽片段，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.13)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’，

其中：

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

e)将所述第四肽片段从固相树脂中去除并将溶液中的第四肽片段与精氨酰胺偶联，从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供这样的第七肽片段，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

其中：

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

在一个优选的方面，本申请提供一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第二肽片段，

其中：

Z是H-；

B’是固相树脂；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)提供在溶液中的第三肽片段，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.7)

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供这样的第七肽片段，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

其中：

X⁸和X¹⁰每个独立地是非手性的，任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

i)去除所述促胰岛素肽的N-端保护基以提供这样的促胰岛素肽，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；且

在又一个方面中，本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.12)

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂。

“固相树脂”意指适合于实施固相肽合成的任何类型的支持物，其可以由一种或多种聚合物、聚合物的共聚物或组合制备，所述聚合物如聚酰胺、聚硫酰胺、取代的聚乙烯、聚乙二醇、酚醛树脂、多糖、或聚苯乙烯，并且其典型地包括连接部分，在合成过程中正在延长的肽与其偶联。优选地，所述固相树脂选自由下列各项组成的组：2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂、三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂、4-氨基丁-1-醇2-氯三苯甲基树脂、4-氨基甲基苯甲酰基2-氯三苯甲基树脂，3-氨基丙-1-醇2-氯三苯甲基树脂、溴乙酸2-氯三苯甲基树脂、氰基乙酸2-氯三苯甲基树脂、4-氰基苯甲酸2-氯三苯甲基树脂、glicinol 2-氯三苯甲基树脂、丙酸2-氯三苯甲基树脂、乙二醇2-氯三苯甲基树脂、N-Fmoc羟基胺2-氯三苯甲基树脂、肼2-氯三苯甲基树脂、具有4-羟甲基苯基氧基甲基锚定基团的聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂(PS树脂)、和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂。最优选地，所述固相树脂是2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂。

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.13)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

第一肽片段或其负体，

其中：

Z是N-端保护基；

B’是-OH；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)将溶液中的第一肽片段与精氨酰胺偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第四肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；并且

e)将所述第四肽片段与所述第三肽片段在溶液中偶联以提供这样的促胰岛素肽，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.13)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段或其负体，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第四肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；和

e)将所述第四肽片段与第三肽片段在溶液中偶联以提供这样的促胰岛素肽，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

j)使由步骤i)得到的促胰岛素肽与酸接触以对氨基酸侧链进行去保护从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.11)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；并且

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂。

上述任一种方法可以利用选自由下列各项组成的组的N-端组氨酸保护基(N-端保护基)：Boc(叔丁氧基羰基)、CBz(苄氧基羰基或Z)、Dts(dithiasuccinoyl)、Rdtc(R＝烷基或芳基、dtc＝二硫代氨基甲酸盐)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)、Alloc(烯丙氧基羰基)、pNZ(对硝基苄氧基羰基)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]-乙氧基]羰基])、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、MBz(4-甲氧基CBz)、Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]、Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]-羰基]、CBz[(苯基甲氧基)羰基]、Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]，其中如果可以使用酸在完全侧链去保护步骤中去除N-端组氨酸保护基，不需要先去除N-端组氨酸保护基。

在一个方面，本申请提供氨基酸序列(SEQ.ID NO.14)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAib-B’

的肽，

其中：

Z选自H-和Fmoc-；

B’是-OH或固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

在另一个方面，本申请提供上述肽，其中假脯氨酸的二肽残基是Ser-Ser残基。

在一个方面，本申请提供氨基酸序列(SEQ.ID NO.15)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

的肽，

其中：

Z选自H-和Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；和

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

本申请涉及利用固相和液相(“杂合”)方法合成的促胰岛素肽的制备。所述方法通常包括利用固相化学原理合成3个不同的肽中间体片段。然后，利用液相化学原理将额外的氨基酸物质添加到一个片段上。然后，将所述片段在液相中偶联在一起。在一个片段中使用假脯氨酸使得所述片段的固相合成更容易，并且还使得将这一片段随后液相偶联到其它片段更容易。本发明非常有效地用于制成促胰岛素肽如GLP-1、GLP-1(7-36)以及这些的天然的和非天然的负体，特别是GLP-1(7-36)以及它的天然的和非天然的负体。

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)将步骤a)的第一肽片段从固相树脂裂解下来从而形成溶液中的第一肽片段(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’，

其中B’是-OH；

c)将溶液中的第一肽片段与精氨酰胺偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

所述“N-端保护基”选自由下列各项组成的组：Acr(烯丙酰)、Bz(苯甲酰基)、Ac(乙酰基)、Trt(三苯甲基)、Boc(叔丁氧基羰基)、CBz(苄氧基羰基或Z)、Dts(dithiasuccinoyl)、Rdtc(R＝烷基或芳基、dtc＝二硫代氨基甲酸盐)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)、Alloc(烯丙氧基羰基)、pNZ(对硝基苄氧基羰基)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基])、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、MBz(4-甲氧基CBz)、Poc(2-苯丙基(2)-氧基羰基)、Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]、CBz[(苯基甲氧基)羰基]、Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]、和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]。优选的N-端保护基是Fmoc，Bpoc，Trt，Poc和Boc。

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)将步骤a)的第一肽片段从固相树脂裂解下来从而产生溶液中的第一肽片段(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’，

其中B’是-OH；

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

在一个方面，本申请提供具有氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的根据上述方法制备的肽，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；并且

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

在上述肽的一个变体中，X³⁵是Aib。

在一个方面，本申请提供具有氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的根据上述方法制备的肽，

其中：

B’是固相树脂或-OH；

Z是N-端保护基Fmoc-；并且

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

在上述肽的一个变体中，X³⁵是Aib。

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

b)将步骤a)的肽片段从固相树脂上裂解下来从而产生溶液中的肽片段(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

其中B’是-OH。

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

其中B’是-OH。

在一个方面，本申请提供一种包括下述步骤的方法：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

其中B’是-OH；

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

e)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

f)将步骤e)的第四肽片段从固相树脂上裂解下来从而产生溶液中的第四肽片段(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

其中B’是-OH。

在一个优选的方面，本申请提供包括下述步骤的方法：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

其中B’是-OH；

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

e)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’，

其中B’是-OH。

a)将第一肽片段与第二肽片段在溶液中偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

优选地，所述N-端保护基是Fmoc。

在一个方面，本申请提供包括下述步骤的方法：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

其中B’是-OH；

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

e)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’，

其中B’是-OH；

g)将所述第四肽片段与所述第三肽片段在溶液中偶联从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

优选地，所述N-端保护基是Fmoc。

在一个方面，本申请提供包括下述步骤的方法：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-FIAWLVKX³⁵-B’，

其中B’是-OH；

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

e)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

其中B’是-OH；

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

h)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

优选地，所述N-端保护基是Fmoc。

在一个方面，本申请提供包括下述步骤的方法：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-FIAWLVKX³⁵-B’，

其中B’是-OH；

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

e)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

其中B’是-OH；

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

h)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

i)使来自步骤h)的促胰岛素肽与酸接触以对氨基酸侧链进行去保护从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.11)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；并且

在一个方面，本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.12)

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR。

在一个方面，本申请提供氨基酸序列(SEQ.ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的肽，

其中：

Z选自H-和Fmoc-；

B’是-OH或固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

在上述肽的一个变体中，假脯氨酸的二肽残基是Ser-Ser残基。

在一个方面，上述任一种方法可以利用选自由下列各项组成的组的N-端组氨酸保护基(N-端保护基)：Boc(叔丁氧基羰基)、CBz(苄氧基羰基或Z)、Dts(dithiasuccinoyl)、Rdtc(R＝烷基或芳基、dtc＝二硫代氨基甲酸盐)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)、Alloc(烯丙氧基羰基)、pNZ(对硝基苄氧基羰基)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基])、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、MBz(4-甲氧基CBz)、Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]、Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]-羰基]、CBz[(苯基甲氧基)羰基]、Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]，其中如果可以使用酸在完全侧链去保护步骤中去除N-端组氨酸保护基，不需要先去除N-端组氨酸保护基。

下文所述的本发明的实施方案不是意欲是详尽的或者意欲将本发明限制为在下述详细描述中公开的具体形式。而是，选择并描述实施方案，以致本领域的技术人员可以领会和理解本发明的原理和实施。

本发明针对利用固相和/或液相技术制备肽如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)以及它的天然和非天然的促胰岛素活性负体的合成方法。本发明的肽分子可以是被保护的、未被保护的、或部分保护的。保护可以包括N端保护，侧链保护，和/或C端保护。尽管本发明通常针对这些胰高血糖素样肽、它们的负体、片段以及它们的负体、和融合产物以及它们的这些的负体的合成，但是本发明的创造性教导还可以适用于合成其它肽，特别是利用固相和液相方法的组合合成的那些。本发明还适用于合成与杂质特别是与焦谷氨酸杂质缔合的肽中间体片段。用于实施本发明的优选的GLP-1分子包括天然的和非天然的GLP-1(7-36)以及它们的负体。

当用于本文时，术语“包括氨基酸序列”优选地意指“具有氨基酸序列”。

当用于本文时，“负体”是指肽的天然的和非天然的类似物、衍生物、融合化合物、盐等。当用于本文时，肽类似物通常是指相对于另一种肽或肽负体具有修饰的氨基酸序列的肽，诸如通过一个或多个氨基酸取代、删除、翻转、和/或添加而进行的修饰。取代可以包括一个或多个天然的或非天然的氨基酸。取代优选地可以是保守的或高度保守的。保守取代是指用通常具有相同的净电荷和通常相同的大小和形状的另一种氨基酸取代氨基酸。例如，当在它们的侧链中的碳和杂原子总数的差别不多于约4个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有近似相同的大小。当在它们侧链中的分支数目的差别不多于约一个或两个时，它们具有近似相同的形状。认为在它们的侧链中具有苯基或取代的苯基的氨基酸具有大约相同的大小和形状。以下列出的是5组氨基酸。用同一组的另一种氨基酸取代化合物中的氨基酸通常导致保守取代。

组I：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，和具有C₁-C₄脂肪族或C₁-C₄羟基取代的脂肪族侧链的(直链或单分支的)非天然存在的氨基酸。

组II：谷氨酸，天冬氨酸和具有羧酸取代的C₁-C₄脂肪族侧链的(无分支或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。

组III：赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍取代的C₁-C₄脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。

组IV：谷氨酰胺，天冬酰胺，和具有酰胺取代的C₁-C₄脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。

组V：苯丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。

当用于本文时，术语“负体”更优选地是指肽的盐，或指它的在C端酰胺化的衍生物。

“高度保守的取代”是用在侧链上具有相同的官能团并且几乎相同大小和形状另一种氨基酸取代氨基酸。当在它们侧链中的碳和杂原子的总数的差别不多于2个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有几乎相同的大小。当它们在它们的侧链中具有相同数目的分支时，它们具有几乎相同的形状。高度保守的取代的实例包括缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，和苯基甘氨酸取代苯丙氨酸。

“肽衍生物”通常是指具有其侧链基团、α碳原子、末端氨基、和/或末端羧基中的一个或多个的化学修饰的肽、肽类似物，或其它肽负体。例如，化学修饰包括，但不限于，添加化学部分，生成新的键，和/或去除化学部分。在氨基酸侧链基团的修饰包括，但不限于，赖氨酸ε-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括，但不限于，脱氨基，N-低级烷基、N-二-低级烷基、和N-酰基(例如，-CO-低级烷基)修饰。末端羧基的修饰包括，但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺、和低级烷基酯修饰。因此，部分或完全保护的肽组成了肽衍生物。

在本发明的实施中，如果化合物能够刺激、或引起刺激、或辅助引起刺激激素胰岛素的合成或表达，那么该化合物具有“促胰岛素”活性。在优选的实施方式中，促胰岛素活性可以依据在美国专利号6,887,849和6,703,365中所述的测定证明。

在优选的实施方案中，本发明提供用于合成具有下式(SEQ.ID NO.19)：

HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的合成(X⁸，X¹⁰，X³⁵)GLP-1(7-36)肽及其负体的方法，其中在位置8、10和35的符号X的每个独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。X⁸，X¹⁰，和/或X³⁵残基中的任一个任选地可以包含侧链保护基。依据该式所述的肽与天然GLP-1(7-36)不同，不同至少在于，所述非手性的、任选地是空间位阻的X⁸和X³⁵残基取代在位置8和35的天然氨基酸残基。X¹⁰残基可以衍生自天然非手性甘氨酸或另一种非手性氨基酸。非手性X⁸，X¹⁰和X³⁵氨基酸的应用不但帮助稳定得到的肽，而且现在发现使用这些氨基酸作为结构单元的接头还有利于如在方案1所示和在下文进一步描述的本发明的合成途径。

可以按照本发明的原理合成的(X⁸，X¹⁰，X³⁵)GLP-11(7-36)肽的特别优选的实施方案包括依据式(SEQ ID NO.12)：

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

所述的肽及其负体，其优选地在C端酰胺化(如所示)。该肽使用非手性α-氨基异丁酸(示意性表示为缩写Aib)残基作为X⁸和X³⁵，优选地在C端具有酰胺，在位置10使用天然G残基，并且可以指定为式(Aib^8，35)GLP-1(7-36)-NH₂。这种符号表示与氨基酸“Aib”相对应的氨基酸残基出现在位置8和35，取代天然的丙氨酸。非手性α-氨基异丁酸也叫作甲基丙氨酸。SEQ ID NO.12的肽在EP 1137667 B1中描述。在位置8和35存在Aib残基减缓了在体内的代谢降解，使得该肽在体内比天然GLP-1(7-36)肽更稳定得多。

本发明提供用于制备GLP-1(7-36)肽如(Aib^8，35)GLP-1(7-36)-NH₂的改进的方法。例如，方案1和方案2显示用于合成GLP-1(7-36)肽以及它们的负体的两个示例性方案。据信方案1和方案2特别适用于GLP-1(7-36)肽的按比例增加合成。典型地进行按比例增加的步骤，以提供用于商业分布数量的肽。例如，在按比例增加步骤中的肽的量可以是500g或1kg/批次，并且更典型地数十kg/批次-数百kg/批次或更多。在优选实施方案中，所述创造性方法可以提供这样的改进：减少加工(合成)时间，提高产物产量，提高产物纯度，和/或减少需要的试剂和起始原料的量。

在方案1所示的合成利用固相和液相技术的组合来制备肽产物。

方案1

如所示，方案1包括在固相上合成肽中间体片段1、2和3。片段1是包括SEQ ID NO.20，即HX⁸EX¹⁰的氨基酸残基的肽片段，其中X⁸和X¹⁰如上文所定义，或者是其包括X⁸和X¹⁰残基的负体。依据常规实施，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。在一些实施方案中，肽片段12可以通过C端与树脂结合。这一片段任选地可以携带N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N端组氨酸保护基。已经发现Trt(三苯甲基)是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N-端组氨酸保护基。Boc、CBz、DTS、Rdtc(R＝烷基或芳基)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc)、Alloc、pNZ(对硝基苄酯)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基]-)、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、和MBz(4-甲氧基CBz)也是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N-端组氨酸保护基。[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]，[(苯基甲氧基)羰基]，[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]是关于肽片段的

固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N-端组氨酸保护基。片段1包括与天然GLP-1(7-36)肽的位置7-10的氨基酸相对应的4个氨基酸残基，并且因此可以用符号(X⁸，X¹⁰)GLP-1(7-10)表示。在优选实施方案中，依据SEQ ID NO.21：H⁷AibEG¹⁰，X⁸是Aib，并且X¹⁰是甘氨酸，或者是在位置10包括Aib残基的它的负体。SEQ ID NO.7的肽片段可以用符号(Aib⁸)GLP-1(7-10)表示，以表示用Aib取代天然GLP-1(7-10)位置8的天然丙氨酸。

固相合成通常以片段1的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的X¹⁰氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端组氨酸残基(H))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。

SEQ ID NOS.20和21所述的肽片段的选择和使用在方案1内提供显著的优点。首先，由于，至少部分由于差向异构问题，H(组氨酸)倾向于是难以添加到正在增长的肽链上的氨基酸残基。然而，片段1足够小，足以减轻在大片段中的这些考虑。然而，片段1足够长，足以具有两个手性中心。因此，简单的结晶允许所述片段被纯化。如果片段1在Aib终止，那么所述片段将只具有一个手性中心，并且结果，将更难以进行纯化。使得非手性的G位于C端也避免了外消旋考虑，如果片段1在C端以手性的E终止，则其可能另外是考虑的问题。简言之，选择片段1作为肽结构单元使得构建所述片段、纯化其、和将其偶联到其它肽物质上更容易。片段的选择还喜欢H的低外消旋性。令人惊讶地，H添加到具有非常低的差向异构水平的这一片段上，例如，在一些实施模式中，约0.5重量％。

片段2是包括SEQ ID NO.22：T¹¹FTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EG的氨基酸残基的肽片段，其中由符号X^17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，其由下文进一步定义，或是在位置17和18包括X^17-18的它的负体。除了使用假脯氨酸二肽残基X^17-18代替占据天然GLP-1(7-36)中对应的位置17和18的SS(Ser-Ser)残基之外，片段2包括通常与天然GLP-1(7-36)肽的位置11-22中的氨基酸残基相对应的氨基酸残基。

依据常规实施，片段2的氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。在一些实施方案中，肽片段2可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成的特别有效的N端保护基。SEQ ID NO.22所述的肽片段可以由符号(X^17-18)GLP-1(11-22)表示，以表示X^17-18假脯氨酸残基取代在位置17和18的Ser-Ser残基。

当用于本发明的实施中时，术语假脯氨酸是指包括羟基官能氨基酸诸如Ser或Thr的残基的二肽，其中羟基官能侧链被保护成为在α-氨基和侧链羟基之间的脯氨酸样的、TFA易变的、噁唑烷环。作为噁唑烷环的结果，所述二肽作用为可逆的脯氨酸模拟物。

通常，结合到肽中的典型的假脯氨酸残基可以表示为式：

其中Φ表示任何氨基酸残基，并且R¹和R²分别独立地是适当的二价连接部分。通常，R¹是下式的二价部分：

其中R³和R⁴分别独立地是单价部分，如H，或低级烷基，如甲基。R³和R⁴还可以是环结构的共同成员。理想地，R³和R⁴分别是甲基。在噁唑烷环-保护的Ser的情形中，R²是二价部分CH₂，而在Thr的情形中，R²是二价部分(CH₃)CH。

术语“低级烷基”是指1-6个碳原子、优选1-4个碳原子的分支的或支链的单价烷基自由基。这一术语进一步示例为如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、3-甲基丁基、正己基、2-乙基丁基等的自由基。优选的低级烷基残基是甲基和乙基，甲基是特别优选的。

在去保护过程中，裂解R¹部分，以提供下式所述的二肽残基：

其中Φ和R²如上文所定义。当用于片段2时，假脯氨酸残基优选地对应这样的Ser-Ser残基，其中更接近C端的Ser用噁唑烷环保护，并且具有下述结构：

更接近N端的Ser的携带羟基的侧链被保护，诸如通过t-Bu保护基保护。当保护的噁唑烷环结构和t-Bu被裂解时，形成Ser-Ser残基。

在本发明的情形中，使用这样的脯氨酸模拟物作为合成片段2的结构单元提供了显著的优点。首先，片段2的固相合成变得极容易。当在片段2的固相合成中不使用假脯氨酸时，可能存在关于从残基13-11去除Fmoc的显著问题。据信这种困难可能是由于β折叠的形成。据信，通过减少β折叠形成的程度，使用假脯氨酸使得这些Fmoc去除容易得多。其次，如上述方案1中所述的片段2与片段3的随后液相偶联变得更容易。在不存在假脯氨酸残基时，该片段在典型的液相偶联溶剂中的溶解度是极低的。假脯氨酸提高了片段2(和结合片段2的更长片段)的溶解性特性，使得片段1随后的液相偶联更容易。

固相合成通常以从片段1的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的G氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。然而，将X^17-18假脯氨酸二肽添加到正在增长的链的与GLP-1(7-36)的位置17和18相对应的位置，替代在位置17和18连续添加一对天然的Ser残基。在N端残基(例如，N端苏氨酸残基(T))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成)。

片段3是包括其中X³⁵如上文定义的根据SEQ ID NO.23：Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵所述的氨基酸残基的肽片段或其负体，或其包括X³⁵残基的负体。依据常规实施，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。除了在位置35是X³⁵替代在该位置的天然氨基酸之外，片段3包括与天然GLP-1(7-36)肽的位置23-35中的氨基酸相对应的氨基酸残基。片段3可以表示为符号(X³⁵)GLP-1(23-35)。

在一些实施方案中，肽片段3可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带侧链、N端和/或C-端保护基。已经发现Fmoc是关于所述肽片段固相合成的特别有效的N端保护基。

在优选实施方案中，依据SEQ ID NO.24：Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKAib³⁵或在位置35包括Aib的它的负体，X³⁵是Aib。SEQ ID NO.10所述的肽片段可以用符号(Aib³⁵)GLP-1(23-35)表示，以表示用Aib取代在天然GLP-1(7-36)的位置35的天然氨基酸。

注意到SEQ ID NOS.23和24所述的片段3在C端的位置36并不包括R(Arg)残基。随后在液相中，将Arg偶联到片段3的C端，优选地使用没有侧链保护的Arg。这一策略在方案1中提供显著的优点，因为它避免了作为使用保护的Arg的后果而倾向于发生的不需要的副反应。例如，当去保护被保护的Arg时，去保护作用副产物可能倾向于与肽的其它组成例如色氨酸反应。这减少了可从用于纯化的原始物质中获得的需要的肽的量。

固相合成通常以从片段3的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的X³⁵氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端谷氨酰胺残基(Q))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。依据常规实施，用于片段3合成的任何一个氨基酸可以包含侧链保护。

由于与负载X³⁵的支持物树脂邻近的空间位阻，将赖氨酸(34)和缬氨酸(33)偶联到正在增长的肽链上可能是有问题的。即使使用过量的氨基酸，也难以促使这些偶联反应完成。溶剂选择和/或末端-封端可以帮助减轻这一问题。已经发现偶联溶剂的性质可以影响偶联继续完成的程度。在一组试验中，例如，偶联反应在3∶1 NMP/DCM，1∶1 NMP/DCM，1∶1 DMF/DCM，和3∶1 DMF/DCM中进行。这些溶剂组成中的比例是基于体积基础的。NMP是指N-甲基吡咯烷酮，DCM是指二氯甲烷，和DMF是指二甲基甲酰胺。发现当使用1∶1 DMF/DCM时，偶联反应进行得更远至完成。

在赖氨酸和缬氨酸分别偶联后的末端-封端还可以用来防止未反应的树脂-支持的物质在进一步的偶联反应中继续反应。在纯化过程中，如果需要纯化的话，末端-封端的物质更容易去除。可以利用常规末端-封端技术。

继续参考方案1，组装片段1、2和3以及Arg，以完成需要的肽。

方案1显示将Arg添加到液相中的片段3的C端，以产生中间体片段3′。优选地，以这种方式加入肽片段中的Arg不包含侧链保护。接着，将片段2添加到片段3′以产生更大的，结合根据SEQ ID NO.25所述的氨基酸残基的中间体片段，其中在17和18位置的Ser-Ser仍旧以保护的假脯氨酸形式存在：

TFTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EGQ²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵R-NH₂

其中X³⁵如上定义并且更优选地是Aib，X^17-18是如上定义的假脯氨酸二肽残基。所述中间体片段可以用符号(X^17-18，X³⁵)GLP-1(11-36)表示。在所述氨基酸具有侧链保护的程度，理想地在整个该步骤过程中维持该保护。

方案1还显示接着将片段1添加到溶液中的该中间体片段上以产生需要的肽(SEQ ID NO.26)：

HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂。

在备选优选的实施方案中，本发明提供用于合成具有下式(SEQ.IDNO.19)：

HX⁸EX¹⁰TFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的合成(X⁸，X¹⁰，X³⁵)GLP-1(7-36)肽及其负体的方法，其中在位置8、10和35的符号X的每个独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。X⁸，X¹⁰，和/或X³⁵残基中的任一个任选地可以包含侧链保护基。依据该式所述的肽与天然GLP-1(7-36)不同，不同至少在于，所述非手性的、任选地是空间位阻的X⁸和X³⁵残基取代在位置8和35的天然氨基酸残基。X¹⁰残基可以衍生自天然非手性甘氨酸或另一种非手性氨基酸。非手性X⁸，X¹⁰和X³⁵氨基酸的应用不但帮助稳定得到的肽，而且现在发现使用这些氨基酸作为结构单元还有利于如在方案1所示和在下文进一步描述的本发明容易的合成途径。

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

所述的肽及其负体，其优选地在C端酰胺化(如所示)。该肽使用非手性α-氨基异丁酸(示意性表示为缩写Aib)残基作为X⁸和X³⁵，优选地在C端具有酰胺，在位置10使用天然G残基，并且可以指定为式(Aib^8，35)GLP-1(7-36)-NH₂。这种符号表示与氨基酸“Aib”相对应的氨基酸残基出现在位置8和35，取代天然的丙氨酸。非手性α-氨基异丁酸也叫作甲基丙氨酸。SEQ ID NO.4的肽在EP 1137667 B1中描述。在位置8和35存在Aib残基减缓了在体内的代谢降解，使得该肽在体内比天然GLP-1(7-36)肽更稳定得多。

在方案2中显示的合成使用固相和液相技术的组合来制备肽产物。

方案2

如所显示，方案2包括在固相上合成肽中间体片段1+2和3。片段1+2是包括根据SEQ ID NO.27，即HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE的氨基酸残基的肽片段：

其中X⁸和X¹⁰如上文所定义，或者是其包括X⁸和X¹⁰残基的负体。依据常规实施，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。在一些实施方案中，肽片段12可以通过C端与树脂结合。这一片段任选地可以携带N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N端组氨酸保护基。已经发现Trt(三苯甲基)是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N-端组氨酸保护基。Boc(叔丁氧基羰基)、CBz(苄氧基羰基或Z)、Dts(dithiasuccinoyl)、Rdtc(R＝烷基或芳基，dtc＝二硫代氨基甲酸盐)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)、Alloc(烯丙氧基羰基)、pNZ(对硝基苄氧基羰基)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基])、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、和MBz(4-甲氧基CBz)也是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N-端组氨酸保护基。Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]，CBz[(苯基甲氧基)羰基]，Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有效的N-端组氨酸保护基。

片段1+2包括对应于天然GLP-1(7-36)肽的7-27位置的氨基酸的20个氨基酸残基，并且因此可以由符号(X⁸，X¹⁰，X^17-18)GLP-1(7-27)表示。在优选的实施方案中，根据SEQ ID NO.28，即

H⁷AibEGTFTSDVX^17-18YLEGQAAKE²⁷，X⁸是Aib，X¹⁰是甘氨酸，或是在10位置包括Aib残基的其负体所述。根据SEQ ID NO.28所述的肽片段可以由符号(Aib⁸，X^17-18)GLP-1(7-27)表示，从而表示Aib取代在天然GLP-1(7-36)8位置的天然丙氨酸。由符号X^17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，如下文定义，或是其在17和18位置包含X^17-18的其负体。

除了使用假脯氨酸二肽残基X^17-18代替占据天然GLP-1(7-36)中对应的位置17和18的SS(Ser-Ser)残基之外，片段2包括通常与天然GLP-1(7-36)肽的位置11-27中的氨基酸残基相对应的氨基酸残基。

依据常规实施，片段2的氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。在一些实施方案中，肽片段2可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成的特别有效的N端保护基。SEQ ID NO.29

TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE²⁷

所述的肽片段2可以由符号(X^17-18)GLP-1(11-27)表示，以表示X^17-18假脯氨酸残基取代在位置17和18的Ser-Ser残基。

在本发明的情形中，使用这样的脯氨酸模拟物作为合成片段1+2的结构单元提供了显著的优点。首先，片段2的固相合成变得极容易。当在片段2的固相合成中不使用假脯氨酸时，可能存在关于从残基13-11去除Fmoc的显著问题。据信这种困难可能是由于β折叠的形成。据信，通过减少β折叠形成的程度，使用假脯氨酸使得这些Fmoc去除容易得多。在不存在假脯氨酸残基时，该片段在典型的液相偶联溶剂中的溶解度是极低的。假脯氨酸提高了片段2(和结合片段2的更长片段，如片段1+2)的溶解性特性，使得该片段1+2随后的液相偶联更容易。

固相合成通常以从片段1+2的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的E²⁷氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。然而，将X^17-18假脯氨酸二肽添加到正在增长的链的与GLP-1(7-36)的位置17和18相对应的位置，替代在位置17和18连续添加一对天然的Ser残基。在N端残基(例如，N端苏氨酸残基(T))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。

片段3是包含根据SEQ ID NO.30，即FIA³⁰WLVKX³⁵所述的氨基酸残基的肽片段，或其负体，其中X³⁵如上定义，或是其包含X³⁵残基的负体。依据常规实施，氨基酸残基的一个或多个可以包括侧链保护基。除了X³⁵在35位置，取代在该位置的天然氨基酸之外，片段3包括对应于天然GLP-1(7-36)肽的28-35位置的氨基酸的氨基酸残基。根据SEQ ID NO.30所述的片段3可以由符号(X³⁵)GLP-1(28-35)表示。

在一些实施方案中，所述肽片段3可以通过C-端结合树脂。该片段任选地具有侧链，N-端和/或C-端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成的特别有用的N-端保护基。

在优选的实施方案中，依据SEQ ID NO.31：FIA³⁰WLVKAib³⁵，或其在35位置包括Aib的负体，X³⁵是Aib。根据SEQ ID NO.31的肽片段可以由符号(Aib³⁵)GLP-1(28-35)表示，以表示Aib取代在天然GLP-1(7-36)的35位置的天然氨基酸。

注意到SEQ ID NOS.30和31所述的片段3在C端的位置36并不包括R(Arg)残基。随后在液相中，将Arg偶联到片段3的C端，优选地使用没有侧链保护的Arg。这一策略在方案2中提供显著的优点，因为它避免了作为使用保护的Arg的后果而倾向于发生的不需要的副反应。例如，当去保护被保护的Arg时，去保护作用副产物可能倾向于与肽的其它组成例如色氨酸反应。这减少了可从用于纯化的原始物质中获得的需要的肽的量。

根据SEQ ID NO.32所述的片段3’是包括其中X³⁵如上定义的根据SEQ ID NO.32：FIA³⁰WLVKX³⁵R-NH₂的氨基酸残基的肽片段，或其负体，或是包括X³⁵残基的其负体。依据常规实施，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。片段3’包括对应于天然GLP-1(7-36)肽的28-36位置的氨基酸的氨基酸残基，除了X³⁵在35位置取代在该位置的天然氨基酸。根据SEQ ID NO.32的片段3’可以由符号(X³⁵)GLP-1(28-36)表示。

固相合成通常以从片段3的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的X³⁵氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端谷氨酰胺残基(Q))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。用于合成片段3的任何氨基酸可以包括依据常规实施的侧链保护。

继续参考方案2，组装片段1、2和3以及Arg，以完成需要的肽。

方案2显示将Arg添加到液相中的片段3的C-端，从而产生根据SEQID NO.32

FIA³⁰WLVKX³⁵R-NH₂

的中间体片段3’，其中X³⁵如上定义并且更优选地是Aib。优选地，以这种方式添加到肽片段中的Arg不包含侧链保护。

将根据SEQ ID NO.27：HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE，可以由符号(X^17-18，X³⁵)GLP-1(11-36)表示的片段1+2接着与液相中的片段3’偶联，在所述片段1+2中，在17和18位置的Ser-Ser仍旧以保护的假脯氨酸形式存在。对于其它氨基酸具有侧链保护的程度，理想地在整个该步骤中维持该保护。接着，形成结合片段1+2+3，根据SEQ ID NO.26：HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂的需要的肽，其中在优选的实施方案中，X⁸是Aib，X¹⁰是天然G，并且X^17-18是如上定义的假脯氨酸二肽残基。

在进行方案1和2的反应方案中，固相和液相合成可以通过工业上已知的标准方法进行。在代表性实施模式中，利用化学法在固相中合成肽，通过化学法将氨基酸从C-端添加到N-端。因此，最接近特定片段的C端的氨基酸或肽基团是第一个添加到树脂上的。这通过将氨基酸或肽基团C端的官能度与树脂支持物上的互补官能度反应而发生的。所述氨基酸或肽基团的N端侧被掩蔽，以防止不需要的副反应。所述氨基酸或肽基团理想地还包含侧链保护。然后，将连续的氨基酸或肽基团附着到与支持物结合的肽物质上，直到形成目的肽。依据常规实施，这些中的大部分还包含侧链保护。随着每次连续的偶联，在与树脂结合的肽物质的N末端掩蔽基被去除。然后，这与N端被掩蔽的下一个氨基酸的C端反应。因此，固相合成的产物是与树脂支持物结合的肽。

为了使对片段的质量差异如残余溶剂的量、残余二苯并富烯或测定或质量中的变化的影响最小，概念是使用每个片段的总肽测定作为计算的基础。因为片段2的大部分肽杂质具有或多或少与片段2相同的重量，并且象片段2一样反应，并且片段3’的大部分肽杂质具有或多或少与片段3’相同的重量，并且象片段3’一样反应，总肽概念容许调节反应物的比率。为了计算目的，通常不考虑二苯并富烯，因为它不是肽，并且通过其UV-信号(与片段相同的反应因子)，其质量通常被过度的过高评价。因此可以如下计算所述片段的总肽测定：

a)测定(％-mm)*(100-以％面积表示的二苯并富烯的量/[质量(％-面积)]或

b)以％-(w/w)表示的主要成分和所有肽杂质的总和-以％-(mm)表示的二苯并富烯(与肽相同的反应因子)。

可以使用适合实施固相肽合成的任何类型的支持物。在优选实施方案中，所述支持物包括可以由一种或多种聚合物、聚合物的共聚物或组合制成的树脂，所述聚合物诸如聚酰胺、聚硫酰胺、取代的聚乙烯、聚乙二醇、酚醛树脂、多糖、或聚苯乙烯。聚合物支持物还可以是对肽合成中所用的溶剂是充分不溶和惰性的任何固体。固体支持物典型地包括连接部分，在合成过程中正在增长的肽与其偶联，并且所述连接部分可以在需要的条件下裂解，以将肽从支持物上释放。适当的固体支持物可以具有接头，所述接头是光-可裂解性的、TFA-可裂解性的、HF-可裂解性的、氟化物离子-可裂解性的、还原剂-可裂解性的；Pd(O)-可裂解性的；亲核-可裂解性的；或自由基-可裂解性的。优选的连接部分是在某些条件下可裂解的，以致被裂解的肽的侧链基团仍然是基本上完全被保护的。

在一种优选的合成方法中，肽中间体片段在包含三苯甲基基团的酸敏性固体支持物上合成，并且更优选地在包含具有悬垂的氯基团的三苯甲基基团的树脂，例如2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂(Barlos等.(1989)四面体通讯(Tetrahedron Letters)30(30)：3943-3946)上合成。实例还包括三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂、4-氨基丁-1-醇2-氯三苯甲基树脂、4-氨基甲基苯甲酰基2-氯三苯甲基树脂、3-氨基丙-1-醇2-氯三苯甲基树脂、溴乙酸2-氯三苯甲基树脂、氰基乙酸2-氯三苯甲基树脂、4-氰基苯甲酸2-氯三苯甲基树脂、glicinol 2-氯三苯甲基树脂、丙酸2-氯三苯甲基树脂、乙二醇2-氯三苯甲基树脂、N-Fmoc羟胺2-氯三苯甲基树脂、肼2-氯三苯甲基树脂。一些优选的固体支持物包含聚苯乙烯，其可以与二乙烯基苯共聚，形成反应基团与其锚定的支持物物质。

用于固相合成的其它树脂包括“Wang”树脂，其包含苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，所述共聚物具有4-羟甲基苯基氧基甲基锚定基团(Wang，S.S.1973，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.))，和4-羟甲基3-甲氧基苯氧丁酸树脂(Richter等.(1994)，四面体通讯(Tetrahedron Letters)35(27)：4705-4706)。所述Wang、2-氯三苯甲基氯和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂可以购自，例如，加利福尼亚州圣地亚哥的Calbiochem-Novabiochem公司(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，California)。

为了准备用于固相合成的树脂，树脂可以在适当的溶剂中预先洗涤。例如，将固相树脂如2-CTC树脂添加到肽室中，并且用适当的溶剂预先洗涤。预洗的溶剂可以基于偶联反应中所用的溶剂(或溶剂混合物)的类型进行选择，或反之亦然。适用于洗涤以及随后的偶联反应的溶剂包括二氯甲烷(DCM)，二氯乙烷(DCE)，二甲基甲酰胺(DMF)，等，以及这些试剂的混合物。其它有用的溶剂包括DMSO，吡啶，氯仿，二噁烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷酮，以及它们的混合物。在一些情形中，偶联可以在二元溶剂系统中进行，诸如在以在9∶1-1∶9、更普遍的4∶1-1∶4范围内的体积比的DMF和DCM的混合物中进行。

除非另外指明，本发明的合成优选地在适当的保护基的存在下进行。保护基的性质和应用是本领域公知的。通常，适当的保护基是可以在加工和合成过程中帮助防止附着在其上的原子或部分如氧或氮参与不需要的反应的任何种类的基团。保护基包含侧链保护基和氨基-或N端保护基。保护基还可以防止羧酸、硫醇等的反应或键合。

侧链保护基是指与氨基酸的侧链(即，在通用氨基酸式H₂N-C(R)(H)-COOH中的R基团)偶联的化学部分，其帮助防止所述侧链部分与肽合成、加工等步骤中所用的化学试剂反应。侧链-保护基的选择可以取决于许多因素，例如，进行的合成的类型、肽要进行的加工、和需要的中间体产物或终产物。侧链保护基的性质还取决于氨基酸自身的性质。通常，选择这样的侧链保护基，即，所述侧链保护基在固相合成过程中在α-氨基基团的去保护过程中不被去除。因此，所述α-氨基保护基和所述侧链保护基典型地是不相同的。

在一些情形中，并且取决于固相合成和其它肽加工中所用的试剂的类型，氨基酸可以不需要存在侧链保护基。这样的氨基酸在侧链中典型地不包含活性氧、氮、或其它活性部分。

侧链保护基的实例包括乙酰基(Ac)，苯甲酰基(Bz)，叔-丁基，三苯基甲基(三苯甲基)，四氢吡喃基，苯甲醚(Bzl)和2，6-二氯苯基(DCB)，叔-丁氧基羰基(Boc)，硝基，对甲苯磺酰基(Tos)，金刚烷基氧基羰基(adamantyloxycarbonyl)，呫吨基(Xan)，苄基，2，6-二氯苄基，甲基，乙基和叔-丁基酯，苄氧基羰基(cBz或Z)，2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)，t-戊氧基-羰基(Aoc)，和芳香族或脂肪族尿烷型保护基，光不稳定的基团如硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)；和氟化物易变基团如2-三甲基甲硅烷基氧基羰基(TEOC)。

在本发明的实施中，用于合成GLP-1肽通常所用的氨基酸的优选侧链保护基在下表A中显示：

表A

氨基酸	侧链保护基
		Aib	无
Ala	无
		Arg	无
Asp	叔-丁基酯(OtBu)
		Gln	三苯甲基(trt)
Glu	OtBu
		Gly	无
His	三苯甲基(trt)
		Ile	无
Leu	无
		Lys	叔丁氧基羰基(Boc)

Phe	无
		Ser	叔丁基(tBu)
X^17-18(对应于Ser-Ser)	在更接近C端的Ser的α氮和OH之间的噁唑烷环；在另一个Ser上的tBu
		Thr	tBu
Trp	Boc
		Tyr	tBu
氨基酸	侧链保护基
		Val	无

氨基端保护基包括与氨基酸的α氨基基团偶联的化学部分。典型地，在下一个氨基酸被添加到正在增长的肽链上之前，氨基端保护基在去保护反应中去除，但是当肽从支持物上裂解下来时可以保持。氨基端保护基的选择可以取决于许多因素，例如，进行的合成的类型和需要的中间体产物或终产物。

氨基端保护基的实例包括(1)酰基型保护基，诸如甲酰基，烯丙酰(Acr)，苯甲酰基(Bz)和乙酰基(Ac)；(2)芳香族尿烷型保护基，诸如苄氧基羰基(Z)和取代的Z，诸如对-氯苄氧基羰基，对-硝基苄氧基羰基，对-溴苄氧基羰基，对-甲氧基苄氧基羰基；(3)脂肪族尿烷保护基，诸如叔-丁氧基羰基(Boc)，二异丙基甲氧基羰基，异丙基氧基羰基，乙氧基羰基，烯丙氧基羰基；(4)环烷基尿烷型保护基，诸如9-芴基-甲基氧基羰基(Fmoc)，环戊氧基羰基，金刚烷基氧基羰基，和环己基氧基羰基；和(5)硫代尿烷-型保护基，诸如苯硫羰基。优选的保护基包括9-芴基-甲基氧基羰基(Fmoc)，2-(4-联苯基)-丙基(2)氧基羰基(Bpoc)，2-苯基丙基(2)-氧基羰基(Poc)和叔-丁氧基羰基(Boc)。

Fmoc或Fmoc-样化学试剂是固相肽合成高度优选的，因为利用微酸性裂解试剂裂解处于保护状态的得到的肽相对直接地进行。在得到的副产物、杂质等方面，这种裂解反应相对比较干净，使得以大规模基础从溶胀和收缩洗液中回收肽，增加产量是技术和经济可行的。当用于本文时，关于肽合成的“大规模”通常包括合成在至少500g、更优选至少2kg/批次的范围内的肽。大规模合成典型地在大反应容器中进行，诸如在钢反应容器中，其可以容纳大量试剂如树脂、溶剂、氨基酸、用于偶联的化学试剂、和去保护反应，其被定制允许生产在千克到公制的吨范围内的肽。

另外，Fmoc保护基可以相对于侧链保护基选择性地从肽上裂解下来，以致当裂解Fmoc时，侧链保护留在原位。这种选择性在氨基酸偶联过程中对最小化侧链反应是重要的。另外，所述侧链保护基可以相对于Fmoc选择性地裂解以去除它们，将Fmoc留在原位。在下文所述的纯化方案过程中，非常有利地依赖于后一种选择性。

固相偶联反应可以在增强或提高偶联反应的一种或多种化合物的存在下进行。可以提高反应速率并且减小副反应速率的化合物包括鏻盐和脲盐，在叔碱如二异丙基乙胺(DIEA)和三乙胺(TEA)的存在下，所述鏻盐和脲盐可以将被保护的氨基酸转化成活化的种类(例如，产生HOBt酯的BOP，PyBOP，HBTU，和TBTU，以及产生HOOBt酯的DEPBT)。其它试剂通过提供保护试剂而辅助防止外消旋作用。这些试剂包括具有加入的辅助亲核体(例如，1-羟基-苯并三唑(HOBt)，1-羟基-氮杂苯并三唑(HOAt)，或HOSu)的碳二亚胺(例如，DCC或WSCDI)。还可以使用混合的酐方法，其利用异丁基氯甲酸酯，具有或没有添加的辅助亲核体，由于与叠氮化物相关的低外消旋作用，所述方法可以是叠氮化物方法。这些类型的化合物还可以增加碳二亚胺-介导的偶联的速率，以及防止Asn和Gln残基脱水。

在确定偶联完成后，将偶联反应混合物用溶剂洗涤，并且对于肽物质的后续氨基酸残基的每一个重复偶联循环。为了偶联下一个氨基酸，从与树脂结合的物质去除N端保护基(例如，Fmoc基团)典型地通过用在溶剂如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)中包含20-50％(基于重量)的哌啶的试剂处理而实现。在去除Fmoc保护基之后，典型地进行一些洗涤，以去除残留的哌啶和Fmoc副产物(诸如二苯并富烯和其哌啶加合物)。

后续氨基酸可以以相对于在树脂支持物上的肽物质的负载因子以化学计量过量的氨基酸进行使用。通常，偶联步骤所用的氨基酸的量至少等于在树脂上的第一氨基酸的负载因子(1当量或更多)。优选地，偶联步骤所用的氨基酸的量至少为1.3当量(0.3过量)或更多，并且最优选地约1.5当量(0.5过量)或更多。在一些情形中，例如，偶联步骤利用等于1-3范围内的氨基酸的量。

在最后的偶联循环之后，树脂用溶剂如NMP洗涤，然后用惰性第二溶剂如DCM洗涤。为了从树脂上去除合成的肽物质，裂解处理以这样的方式进行，以致裂解的肽物质仍然携带充分的侧链和末端保护基。在树脂裂解过程中或之后，使得保护基保留在原位帮助防止肽片段的不需要的偶联或其它不需要的反应。在当使用Fmoc或相似的化学试剂合成肽的情形中，被保护的裂解可以以任何需要的方式实现，诸如通过使用相对弱酸试剂如醋酸，或将TFA稀释在如DCM的溶剂中。典型地，在DCM中使用0.5-10重量％、优选1-3重量％的TFA。参见，例如，美国专利号6,281,335。

从固相树脂裂解肽中间体片段的步骤可以按照下述示例性过程的顺序进行。然而，可以利用有效从树脂裂解肽中间体片段的任何适当的方法。例如，将约5-20、优选约10体积的含有酸性裂解试剂的溶剂加入到含有与树脂结合的肽物质的容器中。因此，所述树脂，典型地以珠子的形式，浸没在该试剂中。当液体内容物在适当温度下搅拌适当的时间阶段时，发生裂解反应。搅拌帮助防止珠子结块。适当的时间和温度条件将取决于这样的因素，诸如所用的酸试剂、肽的性质、树脂的性质等。作为通用的指导，在约-5℃-约5℃、优选地约10℃-约0℃持续约5分钟-2小时、优选地约25分钟-约45分钟的搅动将是适宜的。裂解时间可以在约10分钟-约2小时或者甚至如一天一样久的范围内。裂解理想地在这样冷却的温度范围内进行，以调节典型地可能在反应过程中发生的反应放热曲线。另外，裂解反应的更低温度防止酸敏性侧链保护基如trt基团在这一阶段被去除。

在裂解处理结束时，反应被猝灭。这可以，例如，通过将裂解试剂与适当的碱诸如吡啶等结合，并且继续搅拌和搅动额外的时间阶段如额外的5分钟-2小时、优选地约20分钟-约40分钟而实现。加入碱和持续的搅拌使得容器内容物的温度增加。在搅拌结束时，容器内容物可以处于约0℃-约15℃、优选地约5℃-约10℃的范围内的温度。

诸如溶胀和收缩树脂以提高肽回收的方面的因素可以任选地结合在整个合成过程中。例如，这些技术在美国专利公布号2005/0164912 A1中描述。

在一些方面，可以制备裂解的肽片段，用于液相，与其它肽片段和/或氨基酸偶联。在液相的肽偶联反应综述于，例如，在肽偶联试剂的新趋势(New Trends in Peptide Coupling Reagents)；Albericio，Fernando；Chinchilla，Rafeal；Dodsworth，David J.；和Najera，Armen；国际有机制备和方法(Organic Preparations and Procedures International0(2003)，33(3)，203-303。

肽中间体片段与其它片段或氨基酸在液相中的偶联可以使用原位偶联试剂进行，所述原位偶联试剂例如苯并三唑-1-基-氧基-tris-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸酯(phosphate)(BOP)，苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)，o-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟硼酸酯(HATU)，o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟磷酸酯(TATU)，o-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，o-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TCTU)，o-(苯并三唑-1-基)氧基生物活素-(吡咯烷)-脲六氟磷酸酯(HAPyU)，二环己基碳二亚胺(DCC)，二异丙基碳二亚胺，3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)，水溶性碳二亚胺(WSCDI)，o-(氰基-乙氧基羰基-亚甲基氨基)-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸酯(TOTU)或o-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)。其它偶联技术利用预制的活性酯如羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和对-硝基苯酚(HONp)酯；预制的对称酐；不对称酐如N-羧基酐(NCAs)；或酸性卤化物如酰基氟化物和酰基氯化物。

适当的偶联溶剂可以用于液相偶联反应中。应该理解，所用的偶联溶剂可以影响形成的肽键的外消旋程度；肽和/或肽片段的溶解性；和偶联反应速率。在一些实施方案中，偶联溶剂包括一种或多种水易混合性试剂。水易混合性溶剂的实例包括，例如，DMSO，吡啶，氯仿，二噁烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二噁烷，或它们的混合物。

在其它实施方案中，偶联反应可以包括一种或多种非水易混合性试剂。示例性的非水易混合性溶剂是二氯甲烷。在这些实施方案中，所述非水易混合性溶剂优选地与去保护反应相容；例如，如果使用非水易混合性溶剂，则优选它不会不利地影响去保护反应。

在形成SEQ ID No.10的肽后，在需要时，产物可以进行去保护、纯化、冻干、进一步加工(例如，与另一种肽反应以形成融合蛋白)；这些的组合，和/或类似的。

例如，按照本发明，在整个固相合成过程中，并且还在整个液相偶联反应过程中，侧链保护基典型地保留在肽中间体片段上。通常，在液相步骤完成后，可以进行一步或多步去保护步骤，以从肽上去除一个或多个保扩基。

通过完全去保护去除侧链保护基典型地利用包含酸水解试剂的去保护溶液，以裂解侧链保护基。通常用于完全去保护的酸水解试剂包括纯的三氟乙酸(TFA)，HCl，路易斯酸如BF₃Et₂O或Me3SiBr，液体氢氟酸(HF)，氢溴酸(HBr)，三氟甲烷磺酸，以及它们的组合。去保护溶液还包括一种或多种适当的阳离子清除剂，例如，二硫苏糖醇(DTT)，苯甲醚，对甲酚，乙二硫醇，或二甲硫。去保护溶液还可以包含水。当用于本文时，在去保护组合物中存在的试剂的量典型地以比例表示，其中单个成分的量表示为单位为“份”的分子(numerator)，诸如“份重量”或“份体积”，并且分母是该组合物的总份数。例如，包含比例为90∶5∶5(重量/重量/重量)的TFA∶H₂O∶DTT的去保护溶液具有重量为90/100份的TFA，重量为5/100份的H₂O，重量为5/100份的DTT。

沉淀典型地使用醚，例如二乙基醚或MTBE(甲基叔丁醚)进行。沉淀后，在与其它成分组合之前，将肽理想地分离并干燥，冻干，包装，存储，进一步加工，和/或另外处理。这可以以任何适当的方式实现。按照一种适当的方式，肽通过过滤收集，用充足的MTBE洗液洗涤，以将最终盐含量减少到适当水平，然后干燥。

本发明还提供纯化宽泛范围的肽的有用技术，所述肽包括GLP-1肽和它们的负体。

特别优选的纯化方法包括经过层析介质的至少两次纯化，其中至少第一次经过在第一pH发生，并且至少第二次经过在第二pH发生。更优选地，第一次经过在酸性pH发生，而第二次经过在碱性pH发生。在优选实施方案中，至少一次在酸性条件下的经过在发生在碱性条件下的经过之前发生。实施这种纯化方法的示例性模式可以在纯化完全被保护的肽11的示例性情形中描述。首先，肽完全去保护。裂解N端和侧链保护基。经过第一次层析在水/ACN梯度中进行，使用足够的TFA以提供约1-5、优选地约2的pH。然后，第二次经过在水/ACN梯度中进行，使用少量氨水和/或乙酸铵，等等，以提供约8-9、优选8.5-8.9的pH。

pH值，不管是酸性还是碱性，促进了均一性，因为在每种情形中存在均一的离子种类。因此，酸性pH理想地充分低，以致基本上在所述肽物质中的所有氨基酸残基都被质子化。碱性pH理想地足够高，以致基本上在所述肽物质中的所有氨基酸残基都被去质子化。酸性和碱性层析可以以任何顺序进行。当肽醋酸盐是需要的产物时，便利地最后进行碱性层析，因为醋酸盐可能是层析产物。

常用的缩写包括：乙酰基(Ac)，偶氮-双-异丁酰腈(AIBN)，大气(Atm)，9-硼二环[3.3.1]壬烷(9-BBN或BBN)，叔丁氧基羰基(Boc)，二叔丁基焦碳酸酯或boc酐(BOC₂O)，苄基(Bn)，丁基(Bu)，化学摘要注册号(CASRN)，苄氧基羰基(CBZ或Z)，羰二咪唑(CDI)，1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)，二乙基氨基三氟化硫(DAST)，二亚苄基丙酮(dba)，1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)，1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，1，2-二氯乙烷(DCE)，二氯甲烷(DCM)，二乙基偶氮二羧酸酯(DEAD)，(3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)酮)(DEPBT)，二-异丙基偶氮二羧酸酯(DIAD)，二-异-丁基氢化铝(DIBAL或DIBAL-H)，二-异-丙基乙胺(DIPEA)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)，4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)，乙二醇二甲醚(DME)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，1，1′-双-(二苯膦)乙烷(dppe)，1，1′-双-(二苯膦)二茂铁(dppf)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，乙基(Et)，乙酸乙酯(EtOAc)，乙醇(EtOH)，2-乙氧基-2H-喹啉-1-羧酸乙酯(EEDQ)，二乙醚(Et₂O)，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯乙酸(HATU)，乙酸(HOAc)，1-N-羟基苯并三唑(HOBt)，高压液相色谱(HPLC)，异丙醇(IPA)，六甲基二硅氮烷锂(LiHMDS)，甲醇(MeOH)，熔点(mp)，MeSO₂-(甲磺酰基或Ms)，甲基(Me)，乙腈(MeCN)，间氯过苯甲酸(MCPBA)，质谱(ms)，甲基叔丁醚(MTBE)，N-溴琥珀酰亚胺(NBS)，N-羧酐(NCA)，N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)，N-甲基吗啉(NMM)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，吡啶鎓氯铬酸酯(PCC)，吡啶鎓二铬酸酯(PDC)，苯基(Ph)，丙基(Pr)，异丙基(i-Pr)，磅/平方英寸(psi)，吡啶(pyr)，(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)，室温(rt或RT)，叔丁基二甲基甲硅烷基或t-BuMe₂Si(TBDMS)，三乙胺(TEA或Et₃N)，2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)，triflate或CF₃SO₂-(Tf)，三氟乙酸(TFA)，1，1′-双-2，2，6，6-四甲基庚烷-2，6-二酮(TMHD)，O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，薄层层析法(TLC)，四氢呋喃(THF)，三甲基甲硅烷基或Me₃Si(TMS)，对甲苯磺酸-水合物(TsOH或pTsOH)，4-Me-C₆H₄SO₂-或甲苯磺酰基(Ts)，N-尿烷-N-羧酐(UNCA)。当与烷基部分一起使用时，常规命名包括前缀正(n)，异(i-)，仲(sec-)，叔(tert-)和新(neo)具有它们常用的含义。(J.Rigaudy和D.P.Klesney，Nomenclature in Organic Chemistry(有机化学命名)，IUPAC 1979 Pergamon Press，Oxford.)。

现在，将参考下述示例性实施例进一步举例说明本发明的原理。在下文中，除非另外清楚地指明，所有的百分数和比例都是用体积表示的。

实施例

实施例1-18涉及在方案1中所述的偶联反应方案和如本文定义的片段1，2，3，和3’。

实施例1

片段1的固相合成，片段1在N端具有Fmoc保护，并且在His和Glu上具有侧链保护。

A.制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂

首先，制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂。所用的试剂的量在下表中列出：

将2-CTC树脂装入到500mL肽反应器中，并且在25℃用400mLDCM溶胀30分钟。将沉积层(bed)排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Gly-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。

将沉积层排干，并且用350mL DMF洗涤一次，再用175mL DMF洗涤一次。然后，将2-CTC树脂上剩余的活性位点用350mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用250mL DMF洗涤两次，然后用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供38.20g负载的树脂。分析表明负载因子为0.18mmol/g。

B.固相合成

使用20.0g在本实施例1中A部分制备的以0.18mmol/g负载的Fmoc-Gly-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(200mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用5体积)。

然后，将树脂用在NMP中的20体积％的哌啶处理2次(每次处理用5体积)，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤5次(每次洗涤用5体积)至阴性氯醌检测。

为了制备偶联溶液，称重氨基酸(2.85当量)和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT，2.85当量)，将其溶解在2.55x体积的NMP中，然后在5℃-10℃与DIEA(3.25当量)合并。TBTU(2.85当量)在5℃-10℃溶解在1.3x体积的NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。烧瓶用加入到反应器中的1.3x体积的DCM润洗，然后将其在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测(Kaiser Test)以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，用激活的氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用5体积)。然后对于片段中剩余的氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Aib→His(trt)的顺序)，重复Fmoc保护基的去除和偶联反应循环。

由于在活化的Fmoc-His(trt)-OH和H-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC之间的偶联反应的困难以及活化的Fmoc-His(trt)-OH的不稳定性，通过在一小时后排干反应溶液，并立即用第二、新鲜的活化的Fmoc-His(trt)-OH溶液进行再偶联反应，而促使偶联反应完成。

在本实施例B部分所用的所有试剂在下表中列出：

氨基酸	g	6-Cl-HOBT(g)	DIEA(g)	NMP(mL)	TBTU(g)	NMP(mL)	DCM(mL)	偶联时间(分钟)
									Glu(OtBu)	4.34	1.76	1.55	51.0	3.28	26.0	26.0	150
Aib	3.36	1.76	1.51	51.0	3.29	26.0	26.0	155
									His(trt)	6.32	1.78	1.56	51.0	3.29	26.0	26.0	60
His(trt)再偶联	6.32	1.79	1.56	51.0	3.29	26.0	26.0	92

将与树脂结合的肽片段用NMP(5体积)洗涤4次，DCM(6体积)洗涤5次，IPA(5体积)洗涤3次。然后，将消溶胀的树脂在真空下在35℃干燥，以提供22.58g树脂和与树脂结合的肽。

C.从树脂上裂解Fmoc和侧链保护的片段

将由上述B部分构建的树脂在25℃在DCM(相对于所用的树脂重量为12.5体积；12.5ml DCM/g树脂或12.5升/kg)中溶胀30分钟，然后用DCM洗涤2次(每次洗涤用6.25体积)，以去除任何NMP残留物。将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，并且加入1％TFA/DCM(10体积，在-5℃～-10℃)的冰冷溶液并在0℃搅拌30分钟。向反应器中加入吡啶(TFA的1.3当量)以中和TFA。将裂解溶液过滤并且收集在烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM洗涤7次(7.5体积)。将洗液与裂解溶液合并。DCM裂解溶液与水(7.5体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏，以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，肽片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。获得总共4.73g的Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH。

实施例2

A.制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂

制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂。所用的试剂的量在下表中列出：

将2-CTC树脂装入到500-mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将树脂排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(体积比为87.5∶12.5)中的Fmoc-Gly-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。

将树脂沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤一次，再用200mL DMF洗涤一次。然后，将2-CTC树脂上剩余的活性位点用390mL MeOH∶DIEA(体积比为9∶1)溶液末端-封端1小时。再将沉积层排干，用350mL DMF洗涤两次，并用350mL DCM洗涤4次。然后，将所述树脂通过用3x350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂在35℃在真空下干燥至恒定重量，以提供48.51g负载的树脂。分析表明负载因子为0.54mmol/g。

B.固相合成

使用27.59g以0.54mmol/g负载的Fmoc-Gly-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(300mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用5体积)。

然后，将树脂用在NMP中的20体积％的哌啶处理2次(每次处理用5体积)，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用5体积)至阴性氯醌检测。

为了制备偶联溶液，称重氨基酸(1.7当量)和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT，1.7当量)，将其溶解在4.6x体积的NMP中，然后在10℃-5℃与DIEA(1.9当量)合并。TBTU(1.7当量)在10℃-5℃溶解在2.28x体积的NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。烧瓶用加入到反应器中的2.28体积的DCM润洗，然后将其在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测(Kaiser Test)以检测反应是否完成。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用5体积)。然后对于片段中剩余的氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Aib→His(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。

在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：

氨基酸	g	6-Cl-HOBT(g)	DIEA(g)	NMP(mL)	TBTU(g)	NMP(mL)	DCM(mL)	偶联时间(分钟)
									Glu(OtBu)	10.79	4.24	2.67	127	8.13	63	63	156
Aib	8.26	4.32	3.73	125	8.14	65	65	180
									His(trt)	15.68	4.31	3.69	125	8.12	65	65	180

C.从树脂上裂解片段

将构建的树脂用NMP(5体积)洗涤6次，然后用DCM(6体积)洗涤8次，以去除NMP残留物。将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干后，加入1％TFA/DCM(10体积)的冰冷(在-5℃～-10℃)溶液，并将得到的瓶装混合物在0℃搅拌30分钟。向反应器中加入吡啶(TFA的1.3当量)以中和TFA。将裂解溶液收集在烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM(7.5体积)洗涤11次，并且引流到裂解溶液中。将DCM溶液与水(10体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏，以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。获得总共11.12g的Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH(78.8％的产量)。

实施例3

A.制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂

制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂。所用的试剂的量在下表中列出：

将2-CTC树脂装入到500-mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将沉积层排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Gly-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。

将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤一次。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用390mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用350mL DMF洗涤两次，然后用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用4X250mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂在35℃在真空下干燥至恒定重量，以提供52.02g负载的树脂。分析表明负载因子为0.72mmol/g。

B.固相合成

使用24.43g以0.72mmol/g负载的Fmoc-Gly-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(250mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用5体积)。

然后，将树脂用在NMP中的20％的哌啶处理2次(每次处理用5体积)，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用5体积)至阴性氯醌检测。

为了制备偶联溶液，称重氨基酸和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT)，将其溶解在NMP中，然后在5℃-10℃与DIEA合并。TBTU在5℃-10℃溶解在NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。烧瓶用加入到反应器中的DCM(用量参见下表)润洗，然后将其在25℃-27℃搅拌2-6小时。取出样品进行开氏检测(Kaiser Test)以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，并用活化氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用5体积)。然后对于片段中剩余的氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Aib→His(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。

在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：

氨基酸

g/Eq

6-Cl-HOBT(g/Eq)

DIEA(g/Eq)

NMP(mL)

TBTU(g/Eq)

NMP(mL)

DCM(mL)

偶联时间(分钟)

Glu(OtBu)

12.40/1.65

4.95/1.65

4.29/1.85

145

9.37/1.65

70

180

Aib

9.48/1.65

4.96/1.65

4.23/1.85

140

9.33/1.65

70

352

Aib再偶联

4.73/0.83

2.48/0.83

2.15/0.92

72

4.85/0.83

36

120

His(trt)

21.18/1.94

5.80/1.94

4.99/2.14

140

10.98/1.94

70

180

His(trt)再偶联

10.80/0.97

2.90/0.97

2.48/1.07

72

5.49/0.97

36

180

C.从树脂上裂解片段Fmoc-AA(7-10)-OH

将构建的树脂用NMP(5体积)洗涤6次，用DCM(6体积)洗涤7次，以去除NMP。将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，并将树脂沉积层在0℃用1％TFA/DCM(11.26体积)的冰冷(-5℃～-10℃)溶液洗涤5分钟。将裂解溶液收集在烧瓶中，烧瓶中已经加入吡啶(总TFA的1.3当量)以中和TFA。然后，向反应器中加入第二部分冰冷的1％TFA/DCM(6.14体积)，并且搅拌2分钟。再将第二裂解溶液引流到收集烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM(8.2体积)洗涤9次，并且引流到裂解溶液中。将DCM溶液与水(8.2体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏，以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。获得总共14.02g的SEQ ID NO.7所述的Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH(86.6％的产量)。分析表明纯度为94.3％AN。

Example 4

Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ψMe，Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH

GPA片段2的固相合成

用20.0g的以0.43mmole/g负载的H-Gly-2-CT树脂开始进行Fmoc-AA(11-22)-OH的固相合成。将树脂在25℃在DCM(200mL)中溶胀30分钟。将DCM溶剂排干并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用6体积)。体积的所有按比例缩放相对于起始树脂重量(20.0g)或相对于树脂上负载的氨基酸的摩尔数(8.6mmoles)进行。

为了制备偶联溶液，称重氨基酸(1.7当量)和1-羟基苯并三唑水合物(HOBT，1.7当量)，将其溶解在3.4体积的NMP中，接着通过与NMP(1.32体积)中的HBTU(1.7当量)溶液合并，并接着加入0℃-5℃DIEA(3.5当量)来活化。将得到的溶液添加到包含树脂的反应容器中，并用加入到反应器中的1.57体积的DCM润洗活化烧瓶，接着将其在25℃-27℃搅拌4小时。在4小时搅拌偶联反应混合物后，将偶联溶液排干，并将所述树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。接着，将树脂用NMP中的20％哌啶(每次处理用6体积)处理2次，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤9次(每次洗涤用6体积)。对于在片段中剩余的氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Leu→Tyr(tBu)→Ser(OtBu)-Ser(ψMe，Me)→Val→Asp(OtBu)→Ser(OtBu)→Thr(tBu)→Phe→Thr(tBu)的顺序)重复Fmoc保护基的去除和偶联反应循环。

在该实施例中使用的所有试剂列举在下表中：

将构建的树脂用NMP(6体积)洗涤4次，并用DCM(6体积)洗涤7次。

从构建的树脂裂解片段2(Fmoc-AA(11-22)-OH)：

将上述构建的树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干并加入1％v/v TFA/DCM(10体积.在-5°到-10℃)的冰冷溶液，并在0℃搅拌。将吡啶(1.38当量.相对于TFA)添加到裂解收集器中以中和TFA。在搅拌30分钟后，将裂解溶液收集在裂解收集器中。接着，加入1％TFA/DCM(5体积.在-5°到-10℃)另外的冰冷溶液，并将其在0℃搅拌30分钟。将吡啶(1.38当量.相对于TFA)添加到裂解容器中以中和TFA。在将容器加温到25℃时，将树脂用DCM洗涤6次(6体积)，并排干到裂解溶液收集器中。浓缩得到的DCM裂解和洗涤溶液(7.5体积)，然后与水(5体积)合并。进一步浓缩底部DCM层(1.5体积)，并在其中加入庚烷(20体积)以沉淀出产物。在减压下蒸馏得到的混合物从而去除剩余的DCM(350-100托，在25℃)。当去除DCM时，将片段2从庚烷中沉淀出来。将片段2用庚烷洗涤，并且在真空下，在30℃到35℃干燥。获得具有88.4％AN纯度的总量为14.35g的GPA Fmoc-AA(11-22)-OH，产量为85.5％。

实施例5

重复上述批次构建。在将片段2从构建的树脂裂解下来后，将DCM溶液浓缩到7.5体积，并将其用水洗涤(每次用5体积，洗涤3次)。再次将底部DCM层浓缩到3.75体积。将该DCM溶液与水(20体积)合并，并将剩余的DCM在25℃，在真空下去除。接着，过滤沉淀的产物，并在35℃，在真空下干燥。这提供了14.95g片段2，具有93.1％AN纯度的89％产量。

实施例6

固相合成侧链保护的Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH(片段3)：

A.制备Fmoc-Aib-负载的2CTC树脂

制备Fmoc-Aib-负载的2CTC树脂。将所用的试剂的量列举在下表中：

将2-CTC树脂装入到500mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将沉积层排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Aib-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。

将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤第一次，200mL DMF洗涤第二次。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用400mL

MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干。将树脂用450mLDMF/MeOH/DIEA(4∶0.9∶0.1)洗涤一次，用200mL DMF洗涤一次，用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供45.15g负载的树脂。分析表明负载因子为0.24mmol/g。

B.固相合成

将10.01g具有0.24mmol/g负载因子的Fmoc-Aib-2-CTC树脂装入到反应容器中，并且在25℃在DCM(120mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用6体积)。

然后，将树脂用在NMP中的5体积％的哌啶处理2次(每次处理用6体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次5％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。

为了制备偶联溶液，将氨基酸(1.875当量)和1-羟基苯并三唑一水合物(HOBT水合物，2.07当量)在5℃-10℃溶解在3.5x体积的NMP中，然后与16.1mL在NMP(1.5x体积)中的HBTU(2.0当量)溶液合并。然后，将2.2mL DIEA(2.63当量)在10℃-5℃加入到活化容器中。将得到的溶液转移到反应容器中。活化容器用加入到反应器中的1.5x体积DCM润洗，然后将其在25℃搅拌2小时。将反应容器排干。偶联反应用活化氨基酸(1.875当量)的新鲜溶液再重复一次。在第二次偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。然后，对于片段中剩余的氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。

在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：

Lys(Boc)再偶联	2.11	0.76	30.0	1.83	15.0	15.0	1.1	120
									Ala	1.41	0.76	30.0	1.83	15.0	15.0	1.1	120
Ala再偶联	1.40	0.76	30.0	1.83	15.0	15.0	1.1	120
									Ala	1.41	0.76	30.0	1.83	15.0	15.0	1.1	120
Ala再偶联	1.40	0.76	30.0	1.83	15.0	15.0	1.1	120
									Gln(trt)	2.77	0.76	30.0	1.83	15.0	15.0	1.1	120
Gln(trt)再偶联	2.76	0.76	30.0	1.83	15.0	15.0	1.1	120

构建的树脂通过用NMP(6体积)洗涤4次、用DCM(6体积)洗涤4次和用异丙醇(IPA，6体积)洗涤3次而分离。将构建的树脂在35℃在真空下干燥。获得14.3g构建的树脂。

C.从构建的树脂上裂解中间体片段

将6.6g由上文构建的树脂在10x体积DCM中溶胀30分钟，并且冷却到-10℃。将DCM排干，加入1％TFA/DCM(12体积，在-5℃～-10℃)的冰冷溶液，并且在0℃搅拌30分钟。将裂解溶液收集在含有吡啶(TFA的2-3当量)的烧瓶中。当加温到25℃时，树脂与1％TFA/DCM(10x体积)一起搅拌5分钟，并且加入吡啶(2-3当量)。再过5分钟后，收集溶液。树脂用DCM洗涤4次(10体积)。将所有的DCM洗液与水合并(水/DCM＝1/4)。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。裂解步骤再重复一次。获得总共2.36g的Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH(92％的产量)。

实施例7

A.制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂

制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂。本实施例所用的试剂的量在下表中列出：

将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用400mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用400mL DMF洗涤一次，用200mL DMF洗涤一次，用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供45.32g负载的树脂。分析表明负载因子为0.30mmol/g。

B.固相合成

使用15.0g以0.30mmole/g负载的Fmoc-Aib-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(150mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用DCM洗涤2次(每次洗涤用6体积)和用NMP洗涤3次(每次洗涤用6体积)。

然后，将树脂用在NMP中的20％的哌啶处理2次(每次处理用6体积)，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用6体积)至阴性氯醌检测。

为了制备偶联溶液，称重氨基酸(1.7当量)和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT，1.7当量)，在10℃-5℃溶解在2.6x体积的NMP中，然后与DIEA(1.9-3.0当量)合并。将TBTU或HBTU(1.7当量)在10℃-5℃溶解在1.33x体积的NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。混合烧瓶用加入到反应器中的1.33x体积DCM润洗，然后将其与树脂在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测，以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，并用活化氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。然后，对于片段中剩余的氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。

由于在2-甲基丙氨酸(Aib)和2-CTC树脂之间的可能的支撑(buttressing)效应，对于促使前两个氨基酸偶联反应(Lys(Boc)-34和Val-33)完成存在相当大的困难。因此，对于(Lys(Boc)-34，Val-33)的这两次偶联反应进行3次(即，偶联之后是两次再偶联)。此外，在Lys(Boc)-34和Val-33偶联反应之后，使用乙酸酐末端-封端未反应的与树脂结合的物质。通过在层析纯化过程中将杂质移开远离需要的产物，这提高了后续的纯化的效率。

在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：

第三Lys(Boc)	3.61/1.7	1.33/1.7	1.13/1.9	39.0	2.47/1.7	-	20.0	20.0	180
										乙酸酐	2.33/5.0	-	3.22/5.5	60.0	-	-	30.0	-	120
第一Val	2.62/1.7	1.33/1.7	1.13/1.9	39.0	2.51/1.7	-	20.0	20.0	170
										第二Val	2.62/1.7	1.33/1.7	1.17/1.9	39.0	2.49/1.7	-	20.0	20.0	180
第三Val	2.63/1.7	1.32/1.7	3.67/1.9	39.0	2.50/1.7	-	20.0	20.0	141
										乙酸酐	4.69/10.0	-	7.13/12.0	60.0	-	-	30.0	-	153
Leu	2.73/1.7	1.35/1.7	1.12/1.9	39.0	2.50/1.7	-	20.0	20.0	180
										Trp(Boc)	4.03/1.7	1.33/1.7	1.78/3.0	39.0	2.50/1.7	-	20.0	20.0	180

Ala	2.41/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180
										Ile	2.72/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180
Phe	3.00/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180
										Glu(OtBu)	3.28/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180
Lys(Boc)	3.61/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180
										Ala	2.40/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180
Ala	2.41	1.31/	1.78/	39.0	-	2.93/	20.0	20.0	180
											/1.7	1.7	3.0			1.7
Gln(trt)	4.72/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180
										Gln(trt)	4.72/1.7	1.31/1.7	1.78/3.0	39.0	-	2.93/1.7	20.0	20.0	180

C.将所述片段从构建树脂上裂解下来

将由上文构建的树脂在DCM洗涤7次(每次洗涤用6体积)，以去除NMP残留物，并且将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，加入1％TFA/DCM(12体积，在-5℃～-10℃)的冰冷溶液，并且在0℃搅拌30分钟。将裂解溶液收集在含有吡啶(TFA的1.3当量)的烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM洗涤9次(10体积)，并引流到裂解溶液中。将DCM溶液与水(6体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。洗涤该片段，并且在真空下在30℃-35℃干燥。对于本实施例，裂解步骤再重复一次。获得总共6.78g的Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH(68.1％的产量)，纯度为87.3％AN。

实施例8

A.制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂

制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂。本实施例所用的试剂的量在下表列出：

9∶1 甲醇∶DIEA					400
						异丙醇(IPA)					1050

将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用400mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用400mL DMF洗涤一次，用200mL DMF洗涤一次，用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供47.56g负载的树脂。分析表明负载因子为0.37mmol/g。

B.固相合成

使用25.0g以0.37mmol/g负载的Fmoc-Aib-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(250mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用DCM洗涤2次(每次洗涤用6体积)，并用NMP洗涤三次(每次洗涤用6体积)。

然后，将树脂用在NMP中的20体积％的哌啶处理2次(每次处理用6体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用6体积)至阴性氯醌检测。

为了制备偶联溶液，称重氨基酸和6-氯-1-羟基-苯并三唑(6-Cl-HOBT)，在10℃-5℃溶解在3.2x体积的NMP(或者对于Lys-34、Val-33和Gln-23是DMF)中，然后与DIEA合并。将TBTU在10℃-5℃溶解在1.6x体积的NMP(或者对于Lys-34、Val-33和Gln-23是DMF)中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中，并且将烧瓶用加入到反应器中的1.6x体积DCM润洗，其与树脂在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测，以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，并用活化氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。然后，对于片段中剩余的氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。

由于在2-甲基丙氨酸(Aib)和2-CTC树脂之间的可能的支撑效应，对于促使前两个氨基酸偶联反应(Lys(Boc)-34和Val-33)完成存在相当大的困难。通过增加两种氨基酸的应用和将6-Cl-HOBT从1.7当量增加到2.5当量并将DIEA从1.9当量增加到3.0当量，而对Lys(Boc)-34，Val-33和Gln(trt)-23的偶联条件进行改进。用于偶联反应的溶剂还从NMP转换成DMF，以促使偶联反应完成。此外，在本实施例中，在Lys(Boc)-34和Val-33偶联反应之后，使用乙酸酐末端-封端未反应的与树脂结合的物质。通过在层析纯化过程中将杂质移开远离需要的产物，这提高了后续的纯化的效率。

在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：

	1.7	1.7	1.9			1.7
											Trp(Boc)	8.30/1.7	2.70/1.7	2.28/1.9	-	78.6	5.05/1.7	-	39.3	39.3	180
Ala	4.92/1.7	2.68/1.7	2.30/1.9	-	78.6	5.05/1.7	-	39.3	39.3	177
											Ile	5.56/1.7	2.70/1.7	2.26/1.9	-	78.6	5.06/1.7	-	39.3	39.3	168
Phe	6.10/1.7	2.70/1.7	2.31/1.9	-	78.6	5.06/1.7	-	39.3	39.3	168

Glu(OtBu)	6.72/1.7	2.67/1.7	2.29/1.9	-	78.6	5.05/1.7	-	39.3	39.3	168
											Lys(Boc)	7.39/1.7	2.70/1.7	2.29/1.9	-	78.6	5.05/1.7	-	39.3	39.3	165
Ala	4.91/1.7	2.70/1.7	2.41/1.9	-	78.6	5.05/1.7	-	39.3	39.3	180
											Ala	4.92/1.7	2.68/1.7	2.32/1.9	-	78.6	5.03/1.7	-	39.3	39.3	171
Gln(trt)	14.13/2.5	3.94/2.5	3.71/3.0	80.0	-	7.42/2.5	40.0	-	40.0	185

C.从构建的树脂上裂解片段

将由上文构建的树脂在DCM洗涤6次(每次洗涤用6体积)，以去除NMP，并且将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，加入1％TFA/DCM(10体积，在-5°～-10℃)的冰冷溶液，并且在0℃搅拌30分钟。将裂解溶液收集在含有吡啶(TFA的1.3当量)的烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM洗涤7次(6体积)，并引流到裂解溶液中。将DCM溶液与水(10体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。洗涤该片段，并且在真空下在30℃-35℃干燥。对于本实施例，裂解步骤再重复一次以获得完全的裂解。获得总共12.36g的Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH(59.35％的产量)，纯度为84.3％AN。

GPA片段2+3’，Fmoc-AA(11-36)-NH ₂ 的第一GPA液相合成：

Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ψMe，Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH₂

实施例9

GPA片段3’的液相合成：

将GPA片段3，Fmoc-AA(23-35)-OH，(10.0g，1.0当量)(Lot#BO705P001)和L-精氨酰胺二盐酸盐(2.14g，2.0当量)与DMSO(42mL)混合并于23℃-25℃搅拌30分钟。向此溶液中加入DMSO(42mL)中的1-羟基-苯并三唑水合物(HOBT，2.0当量)，和HBTU(2.0当量)和DIEA(5.0当量)。将反应物于25℃搅动并通过HPLC监测。22小时后，完成反应。随后将哌啶(5.0当量)加入到反应溶液中。于25℃95min后去除Fmoc保护基。加入MTBE(60mL)和庚烷(60mL)溶液以抽提反应溶液来去除过量哌啶。随后将这两相混合物加到水(240mL)中以便于20℃-22℃沉淀产物。放置后，将上部的MTBE/庚烷层分离并过滤伴有产物的底部水性DMSO层并用额外的MTBE/庚烷进行洗涤。于35℃真空干燥后滤饼给出11.1g GPA片段3’。HPLC分析显示了72.9％AN片段3’和17％二苯并富烯(DBF)。

实施例10

GPA片段2+3’的液相合成

将GPA片段3’(5.0g)和片段2(4.35g)溶于DMF(30mL)中。向此溶液中，伴随DMF润洗(10mL)加入HOBT水合物(1.55当量)和HBTU(1.56当量)在DMF(20mL)中的溶液和DIEA(2.55当量)。将反应物于25℃搅拌并通过HPLC监测。145分钟后，加入额外的片段3’(0.5g)，HBTU(0.5当量)，和DIEA(1.3当量)，伴随DMF润洗(5mL)。在过夜搅动后完成反应。向反应混合物中加入哌啶(1.4g)。3小时后去除Fmoc。用水(140mL)于18°-26℃将反应混合物猝灭。将混合物加热至40℃随后冷却至20℃。过滤形成的白色固体并用水(两次，每次100mL)洗涤。将滤饼风干并随后与MTBE/庚烷(1∶1，100mL)一起于40℃搅拌15分钟。冷却至25℃后，过滤产物，用MTBE/庚烷(1∶1，4x50mL)洗涤，并于35℃-40℃进行真空干燥。共获得8.64g，97.7％的产量，纯度为67.3％AN。

GPA片段1+2+3’的液相合成和完全去保护：

实施例11

将片段1(0.93g)溶于DCM(20mL)中。向此溶液中，加入片段2+3’(4.02g)，伴随DCM(20mL)润洗。向HOBt水合物(0.23g，1.5当量)和HBTU(0.57g，1.5当量)中加入DCM(5mL)。随后，向作为混悬液的搅动的反应混合物中加入DIEA(0.95mL，2.0当量)。将反应物于25℃搅动并通过HPLC监测。16小时后反应完成，检查表明片段2+3’过量。使用DCM(5mL)润洗加入额外的片段1(0.081g)和HBTU(0.068g)。将反应物再搅拌68小时。在完成偶联反应后，向反应混合物中加入哌啶(0.6mL)。在搅拌18小时后，完成Fmoc去除。随后在真空下将DCM脱离出反应混合物，直到剩余体积为～15mL。将浓缩的混合物于15℃加入到包含TFA(40mL)，DTT(2.1g)和水(2.1mL)的溶液中，随后进行DCM润洗(2x 5mL)。6小时搅动后将反应混合物冷却至＜5℃。在7分钟内向裂解溶液中加入冷MTBE(160mL，在干冰上冷却)。让经猝灭的反应混合物加温至15℃。过滤得到的固体产物，用MTBE(3x30mL)洗涤，并于环境温度下进行风干过夜。获得3.82g的GPA粗制品(28.73％wt/wt)，纯度59.7％AN，113％产量。

备选片段1的合成：

实施例12

片段1(Trt-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH)

用7.0g预先加载的Fmoc-Gly-O-2-CT树脂(加载量0.43mmol/g)起始，应用标准Fmoc化学。首先将树脂在10体积(相对于树脂重量)DCM中溶胀30分钟。随后将DCM排干并用10体积的NMP洗涤树脂4次(5分钟/次)。

通过两次(10和20分钟)用10体积的NMP中的20％(v/v)哌啶溶液处理来实现Fmoc去除。在每次处理后排干哌啶/NMP溶液。随后通过NMP洗涤树脂6次(10体积，5分钟/次)。为了制备偶联溶液，称重氨基酸和HOBt(2当量)，将其溶于包含HBTU(2当量)的25mL NMP中，随后进行NMP/DCM(10mL/15mL)润洗。将得到的溶液与NMP(5mL)中的DIEA(2当量)合并并加入到包含树脂的反应容器中并与树脂混合3小时。在完成偶联反应后，排干偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(10体积，5分钟/次)。

用DCM(4x70mL，5分钟/次)洗涤构建的肽-树脂，并冷却至-5℃。排干DCM并加入1％TFA/DCM(70mL，在干冰中冷却)溶液并搅拌15分钟。在包含吡啶(2mL)的烧瓶中收集裂解溶液。当加温至20℃时，用干冰冷却的1％TFA/DCM(70mL)洗涤树脂20分钟，并加入吡啶(4mL)。再次搅动10分钟后，收集溶液。随后用DCM 4x70mL(5分钟/次)洗涤树脂。将全部洗涤液和裂解溶液的合并混合物在减压下蒸馏直到达到～100mL的体积。将得到的溶液混合以水(100mL)并再次在减压下蒸馏。当除去DCM时，肽片段从水中析出，并将其滤去。用水(3x50mL)洗涤固体肽片段并于环境温度下风干过夜。产物(替代片段1)重量为0.58g，20％产量。

GPA的GPA固相合成，全部偶联在树脂上

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ψMe，Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-OH

在2CT树脂上的GPA片段3的固相合成

Fmoc-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-2-CT

实施例13

用以0.46mmole/g负载的15.0g H-Aib-2-CT树脂开始进行Fmoc-AA(23-35)-OH的固相合成。将树脂在DCM(120mL)中于25℃溶胀30分钟。排干DCM溶剂并用NMP(每次洗涤6体积)将树脂洗涤三次。

为了制备偶联溶液，称重氨基酸和1-羟基-苯并三唑水合物(HOBT)，将其溶于NMP(对于Lys-34，Val-33，Lys-26，Ala-25，Ala-24和Gln-23为4体积；对于Leu-32到Glu-27为4.2体积)中，随后在-5℃到0℃与NMP中的HBTU溶液(178.4g/L)和DIEA合并。将得到的溶液加到包含树脂的反应容器中，向反应器中加入具有2.0体积的DCM的烧瓶润洗液，其在25℃-27℃与树脂一起搅拌。抽出样品进行开氏检验和/或HPLC以检查反应完成。在完成偶联反应后(偶联时间视下表有所变化)，排干偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(6体积/次)。(注：对于Lys-34和Val-33在偶联后用乙酸酐(5.0当量)和NMP(100mL)中的DIEA(10当量)对树脂进行末端封端3小时)。随后用NMP(每次处理6体积)中的20％哌啶将树脂处理两次以除去Fmoc保护基。(注：对于Glu-27到Ala-24，用NMP(每次处理6体积)中的20％哌啶30％DMSO处理树脂两次以除去Fmoc保护基。)在第二次20％哌啶/NMP(或哌啶/DMSO/NMP)处理后，用NMP(每次洗涤6体积)洗涤树脂九次。随后对于片段中的剩余氨基酸重复偶联反应，4次NMP洗涤，去保护和9次NMP洗涤循环(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)的顺序。

此实施例中所用的所有试剂都列在下表中：

材料

wt(g)/Eq

HOBT(g/Eq)

DIEA(mL/Eq)

NMP(mL)

HBTU(g/Eq)

NMP(mL)

DCM(mL)

偶联时间(小时)

DeFmoc时间(分钟)

Lys(Boc)

6.49/2.0

2.14/2.0

6.0/5.0

59.4

5.23/2.0

25.6

30.0

16.0

-

乙酸酐

3.56/5.0

-

12.0/10.0

80.0

-

20.0

-

3.0

2x 30

Val	4.70/2.0	2.13/2.0	6.0/5.0	59.4	5.23/2.0	25.6	30.0	16.0	-
										乙酸酐	3.58/5.0	-	12.0/10.0	80.0	-	20.0	-	3.0	2x 30
Leu	4.16/1.7	1.81/1.7	4.8/4.0	63.0	4.44/1.7	22.0	30.0	5.0	2x 30
										Trp(Boc)	6.21/1.7	1.80/1.7	4.8/4.0	63.0	4.44/1.7	22.0	30.0	5.0	2x 30
Ala	3.89/	1.81/	4.8/	63.0	4.44/	22.0	30.0	5.0	2x30
											1.7	1.7	4.0		1.7
Ile	4.15/1.7	1.83/1.7	4.8/4.0	63.0	4.44/1.7	22.0	30.0	5.0	2x30
										Phe	4.55/1.7	1.82/1.7	4.8/4.0	63.0	4.44/1.7	22.0	30.0	5.0	2x30
Glu(OtBu)	5.22/1.7	1.81/1.7	4.8/4.0	63.0	4.44/1.7	22.0	30.0	5.0	2x30
										Lys(Boc)	6.49/2.0	2.13/2.0	6.0/5.0	59.4	5.23/2.0	25.6	30.0	5.0	2x0
Ala	4.56/2.0	2.13/2.0	6.0/5.0	59.4	5.23/2.0	25.6	30.0	16.0	2x60
										Ala	4.56/2.0	2.13/2.0	6.0/5.0	59.4	5.23/2.0	25.6	30.0	16.0	2x60
Gln(trt)	8.47/2.0	2.14/2.0	6.0/5.0	59.4	5.23/2.0	25.6	30.0	12.0
										Gln(trt)再偶联	7.20/1.7	1.83/1.7	4.8/4.0	63.0	4.44/1.7	22.0	30.0	12.0

用NMP 4次(每次洗涤6体积)，DCM 7次(每次洗涤6体积)，和IPA3次(每次洗涤6体积)洗涤由此构建的树脂，并在真空下于35℃干燥。这产生了27.01g的Fmoc-AA(23-35)-O-2CT树脂，纯度为88.7％AN，基于树脂的重量增加产率为78.9％。

GPA片段1+2+3的固相合成

实施例14

以12.0g Fmoc-AA(23-35)-O-2-CT树脂开始进行Fmoc-AA(7-35)-OH的固相合成。将树脂在DCM(120mL)中于25℃溶胀30分钟。排干DCM溶剂并用NMP洗涤树脂三次(每次洗涤4.16体积)。

随后用NMP(每次处理6体积)中的20％哌啶30％DMSO处理树脂四次(每次30分钟)以除去Fmoc保护基。在第四次NMP中的20％哌啶30％DMSO处理后，用NMP洗涤树脂九次(每次洗涤4.16体积)。

为了制备用于片段2的偶联溶液：

称出片段2(7.83g，1.3当量)和6-Cl-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT；0.69g，1.3当量)，将其溶于DMSO(4.16体积)中，随后于15℃在烧瓶中与NMP中的HBTU溶液(10.7mL的174.07g HBTU/L溶液，1.3当量)和DIEA(1.9mL)合并。将得到的溶液添加到包含树脂的反应容器中，用加入反应器中的DCM(11.1mL)润洗烧瓶，其于25℃搅拌。取出样品进行HPLC以检查反应完成。17小时搅动之后，分析显示偶联反应73.8％的转化。加入HBTU(1.58g)和DIEA(0.706g)的kicker charges，并将罐装混合物于30℃搅拌。再搅动25.5小时后，反应样品的HPLC分析表明偶联反应为92％完成。排干偶联溶液并用NMP 4次(每次洗涤4.166体积)洗涤树脂。通过用NMP(每次处理4.16体积)中的20％v/v哌啶和30％v/v DMSO处理两次(每次30分钟)来实现Fmoc基团的去保护。在第二次NMP中的20％哌啶30％DMSO处理后，用NMP洗涤树脂九次(每次洗涤4.16体积)。

为了制备用于片段1的偶联溶液：

称出片段1(3.81g，1.3当量)和6-Cl-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT；0.70g，1.3当量)，将其溶于DMSO(4.16体积)中，随后于15℃在烧瓶中与NMP中的HBTU溶液(10.7mL的174.07g HBTU/L溶液，1.3当量)和DIEA(1.9mL)合并。将得到的溶液添加到反应容器中，用DCM(11.1mL)加入反应器中来润洗烧瓶，其在25℃与树脂一起搅拌。取出样品进行HPLC以检查反应完成。16.5小时搅动之后，分析显示偶联反应完全转化。排干偶联溶液并用NMP 4次(每次洗涤4.166体积)洗涤树脂。

用DCM 7次(每次洗涤4.16体积)洗涤上述构建的树脂以除去NMP并将树脂用最后的DCM冷却至-5℃。排干DCM并加入2％TFA/DCM(5体积，于-5℃到0℃)的冷溶液并于0℃搅拌15分钟。在包含吡啶(相对于整体所用的TFA来说1.33当量)的烧瓶中收集裂解溶液。随后再加入另外的2％TFA/DCM(5体积，于-5℃到0℃)并于0℃搅拌30分钟。在包含吡啶的烧瓶中收集第二次裂解溶液。当容器加温至25℃时，用DCM 7次(5体积)洗涤树脂并排至裂解溶液收集器中。在第二次DCM洗涤期间向裂解容器中加入吡啶(相对于整体所用的TFA来说0.37当量)。将合并的DCM溶液浓缩至10体积，用水(5体积)洗涤，并再与另外5体积的水相混合。将得到的混合物在减压下蒸馏以除去DCM(350托，在28℃)。当去除DCM时片段从水中沉淀出来。用水洗涤片段并于30℃-35℃在真空下进行干燥。获得8.76g的片段1+2+3，由H-Aib-O-2CT树脂为63.3％产率，或由Fmoc-AA(23-35)-O-2CT树脂为80.2％实际产率。分析显示纯度为64.6％AN。

片段1+2+3’的合成和完全去保护

实施例15a

将GPA片段1+2+3(4.48g)溶于DMSO(50mL)中。向此溶液中加入H-Arg(2HCl)-NH₂(0.99g，4当量)，HOBt水合物(0.61g，4当量)，HBTU(1.52g，4当量)，和DIEA(0.87mL，5当量)。将反应物在25℃搅动并通过HPLC监测。过夜反应完成检查表明进行偶联。向反应混合物中加入哌啶(1mL)。在过夜搅拌后去除Fmoc。随后在15℃，将反应混合物加到包含水(150mL)的容器中，历时5分钟。将猝灭的混合物加热至40℃持续0.5小时，随后冷却降至15℃。过滤固体，用水(3x30mL)洗涤，风干以提供4.34g固体，98％产率。将4.0g这种固体溶于DCM(18mL)中。向此溶液中加入包含TFA(40mL)，DTT(2.1g)和水(2.1mL)的溶液。在将其冷却至-1℃之前将得到的混合物在15℃搅拌6小时。向裂解溶液加入冷MTBE(160mL，在干冰中冷却)，历时15分钟。让猝灭的反应混合物升温至15℃。过滤固体产物，用MTBE(3x30mL)洗涤，于环境温度下风干过夜。获得3.33g GPA粗制品，100％产率，(23.08％wt/wt)，纯度为44.9％AN。

片段1+2+3’的合成和完全去保护

实施例15b

向在氩气下向带有磁力搅拌器和温度计的100mL烧瓶中加入30.0mLTHF中的1.40g片段1。随后加入232mg HOBt和917.3mg HBTU。随后加入436.5μL DIEA并且随着温度升高大约1℃反应物轻微放热。随后加入THF中的3.00g片段2+3’。随后再加入THF中的3.00g片段2+3’。随后加入1.2mL哌啶并随着温度升高大约1.5℃反应物轻微放热，形成澄清的黄色溶液，让它搅拌过夜。随后将溶液在250mL烧瓶中于42℃/200-100mbar进行蒸馏。随后加入26.25mL DCM并将溶液在42℃/400-100mbar进行蒸馏。随后除去22.5mL DCM，历时20分钟。在500-1000mL的双夹套烧瓶中加入4.313g DTT，其添加了4.313mL水和76.9mL TFA溶液。随后将溶液冷却至15℃并且随后逐滴添加DCM溶液，历时10分钟。随着温度升高到17℃反应物放热，形成白色烟雾，并且溶液变成明黄色(intensely yellow)。随后加入3.75mL DCM进行润洗。随后让混合物于15℃搅拌6h。出现沉淀并且随后过滤混合物以给出0.237g几乎白色的糊状物。随后向滤饼逐滴加入360mL MTBE以形成白色混悬液，历时5分钟，伴随温度升至18℃。随后让混悬液搅拌30分钟并且随后过滤。随后向糊状物中加入225mL MTBE，再次过滤，并于42℃/20mbar干燥14h以产生总共5.787g作为白色粉末的产物。HPLC(分析型)：51.2％(m/m％)，79.8％(面积％)水：：2.0％；乙醇：＜100％，DCM：＜60ppm；MTBE：3.2％；THF：＜70ppm；TFA：8.4％。

GPA片段2+3’，Fmoc-AA(11-36)-NH ₂ 的GPA液相合成：

H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ψMe，Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH₂

实施例16

GPA片段2+3的固相合成：

Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(OtBu)-Ser(ψMe，Me)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-OH

以12.53g的Fmoc-AA(23-35)-O-2-CT树脂开始进行Fmoc-AA(7-35)-OH的固相合成。将树脂在DCM(100mL)中于25℃溶胀30分钟。排出DCM溶剂并用NMP(每次洗涤4.4体积)洗涤树脂三次。

随后用NMP(每次4.4体积)中的20％哌啶30％DMSO将树脂处理两次(每次60分钟)以除去Fmoc保护基。在第二次NMP中的20％哌啶30％DMSO处理后，用NMP(每次洗涤4.4体积)洗涤树脂九次。

为了制备用于片段2的偶联溶液：称出片段2(8.10g，1.3当量)和6-Cl-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT；0.74g，1.3当量)，将其溶于DMSO(2.66vol)中，随后于15℃在烧瓶中与二异丙基碳二亚胺(DIC；0.52g，1.3当量)合并。将得到的溶液添加到包含树脂的反应容器中，并用加入反应器中的DCM(12.7mL)润洗烧瓶，其于30℃搅拌。取出样品进行HPLC以检查反应完成。25小时搅动之后，分析显示偶联反应65.6％的转化。加入DIC(0.55g)的kicker charge，并于30℃继续搅拌。再搅动21小时后，反应样品的HPLC分析表明偶联反应为86％完成。排出偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(每次洗涤4.166体积)。随后通过于30℃再用片段2(4.04g，0.65当量)的另外溶液，DMSO(33mL)中的6-Cl-HOBT(0.43g；0.65当量)和DCM(12.7mL)中的DIC(0.26g.0.65当量)处理树脂来进行再次偶联反应48hr。HPLC分析显示90.8％的转化。

在排出再次偶联溶液后，用NMP 4次(每次4.4体积)和DCM 7次(每次4.4体积)洗涤上述构建的树脂以除去NMP并用最后的DCM洗涤将所述树脂冷却到-5℃。排出DCM并加入2％TFA/DCM(4.96体积，在-5°到0℃)的冷溶液并于0℃搅拌15分钟。在包含吡啶(相对对整体所用的TFA来说为1.3当量)的烧瓶中收集裂解溶液。随后再加入2％TFA/DCM(4.96体积，在-5°到0℃)并于0℃搅拌30分钟。将第二次裂解溶液也收集在包含吡啶的烧瓶中。当容器加温至25℃时，用DCM 7次(5体积/次)洗涤树脂并且每次洗涤都排入裂解溶液收集器中。在第二次DCM洗涤期间向裂解容器中加入吡啶(相对于整体所用的TFA来说0.25当量)。将合并的DCM溶液浓缩至10体积(125mL)，用水(4体积)洗涤，并再与10体积的水相混合。将得到的混合物在减压下蒸馏以除去DCM(于28℃350-75托)。当去除DCM时片段从水中沉淀出来。用水洗涤片段并于30℃-35℃在真空下进行干燥。获得8.19g片段2+3(Fmoc-AA(11-35)-OH)，由H-Aib-O-2CT树脂产率为64.2％或由Fmoc-AA(23-35)-O-2CT树脂为79.5％实际产率。分析显示纯度为64.7％AN。

实施例17

GPA片段2+3’的液相合成：

将GPA片段2+3，Fmoc-AA(11-35)-OH，(4.00g，1.0当量)和L-精氨酰胺二盐酸盐(0.498g，2.0当量)与DMSO(30mL)混合并于23℃-25℃搅拌30分钟。向此溶液中加入1-羟基-苯并三唑水合物(HOBT，2.0当量)和DMSO(15mL)中的HBTU(2.0当量)和DIEA(5.5当量)。将反应物于25℃搅动并通过HPLC监测。16小时后，片段2+3的9.1％AN仍然未反应。向反应溶液中加入精氨酰胺二盐酸盐(0.136g)，HBTU(0.193g)，和DIEA(0.166g)的kicker charges，将其随后再搅动15.3小时。这导致97.6％的偶联反应完成。随后向反应溶液中加入哌啶(7.7当量)。在90分钟后于27℃完成去除Fmoc保护基。在15℃-27℃用水(100mL)将反应混合物猝灭。将混合物加热至40℃随后冷却至25℃。过滤形成的白色固体并用水洗涤(两次，每次50mL)。将滤饼风干，随后伴随着搅拌用MTBE/庚烷(1∶1，100mL)于25℃洗涤3小时。将罐装混合物加热至40℃并搅拌15分钟。在冷却至25℃后，过滤产物并用MTBE/庚烷(1∶1，2X50mL)洗涤，并于35℃-40℃进行真空干燥。共获得4.22g，107.2％实际产率，纯度为63.7％AN。

GPA片段2+3’，Fmoc-AA(11-36)-NH ₂ 的GPA液相合成：

实施例18

在反应器中用包含7.23mL DMF中的HOBT(0.1104g，0.721mmol)的7.32mL溶液处理片段2(15.0g，7.211mmol)(7.211mmol总体肽，1.0当量)，并于室温溶于150mL 2-甲基-四氢呋喃(MeTHF)中。该反应器是1000mL双壁反应器，在基部带有调节旋塞，搅拌器，PT-100温度计，带夹套的旋管冷凝器，氮气层，滴液漏斗，和温度调节器。将得到的溶液冷却降至内部温度0℃到5℃并保持搅拌。

在单独的包含138mL DMF和30mL MeTHF的反应器中，加入片段3’(7.355mmol总体肽，1.02当量)并加热至35-40℃并搅拌直到溶解。该反应器是250mL双壁反应器，在基部带有调节旋塞，搅拌器，PT-100温度计，氮气层，滴液漏斗，和温度调节器。将得到的溶液冷却降至内部温度0℃到5℃并保持搅拌。

随后于内部温度0℃到5℃在第一个反应器中将溶液加入到包含片段2的溶液中，并将第二个容器用30mL DMF润洗。随后用包含HBTU(3.56g，9.37mmol)的17.45mL溶液和14mL DMF处理冷的溶液，历时15分钟，随后用30mL DMF中的DIEA(1.72mL，10.09mmol)进行处理，历时10分钟，于是形成Fmoc保护的中间体。将得到的溶液在0℃到5℃搅拌30分钟直到反应完全。随后通过加入哌啶(3.06mL，31.0mmol)和加热至35±2℃来裂解Fmoc保护基并保持搅拌约1.5到2h直到裂解完成。

为了猝灭和进行抽提，在内部温度20℃到25℃将375mL水加入到反应器中回火的溶液(tempered solution)中并搅拌约5到15分钟(pH大约为9.9)，随后让其静置而不搅拌持续至少60分钟，随后各相分离(有机相＝约100mL)。随后用90mL甲基-THF将下部的水相处理第二次并于内部温度25±2℃搅拌混合物约5到15分钟(pH大约为9.9)，并且随后让其静置而不搅拌持续至少60分钟，随后分离出两个清晰的相(水相大约690g)。

随后将两个有机相合并(大约180到200mL)并在减压(大约120mbar)和在40℃的最大夹套温度下浓缩，只要残留物仍是流体即可。随后在20℃到40℃的内部温度和40℃的最大夹套温度下于180mL甲基-THF中将残留物溶解。随后在减压(大约120mbar)和在40℃的最大夹套温度下将溶液浓缩，此时残留物仍是流体。随后在20℃到40℃的内部温度和40℃的最大夹套温度下于180mL甲基-THF中将残余物溶解。随后在减压(大约120mbar)和在40℃的最大夹套温度下将溶液浓缩，只要残余物仍可良好搅拌即可(油状)。随后在20℃到40℃的内部温度和40℃的最大夹套温度下将残余物溶于130mL甲基-THF中，随后冷却至25±2℃并取样。重复恒沸蒸馏和用Me-THF稀释(见上面)，直到样品对应。

随后向结晶器(1000mL的双壁反应器，在基部带有调节旋塞，搅拌器，PT-100温度计，带夹套的旋管冷凝器，氮气层，蒸馏设备，滴液漏斗，和温度调节器)中加入正庚烷(750mL)并于内部温度或25±3℃在1-2小时的时间内加入上面制备的Me-THF中的产物溶液(约200mL)。产物立即沉淀并将输送管线用最多10mL甲基-THF润洗。随后将混合物于25±3℃搅拌至少1h。随后使用抽吸滤器对产物进行过滤并用正庚烷(150ml)洗涤，并在不超过35℃的外部温度下在真空下(＜20mbar)将产物干燥12小时。该过程给出大约30到32g的浅白色(slightly off-white)产物。产率：由片段2大约为75％或由片段3’大约为77％。

实施例19-29涉及如方案2中所述的偶联反应方案和其中所定义的片段1，2，3，和3’。

GPA备选片段3，Fmoc-AA(28-35)-OH的固相合成

Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-OH

实施例19

GPA备选片段3，Fmoc-AA(28-35)-O-2CT树脂的固相合成：

Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-2-CT树脂

在罗氏肽合成仪上进行Fmoc-AA(28-35)-O-2CT树脂的固相合成。将负载量0.36mmol/g的Fmoc-Aib-2-CT树脂(15.02g)装入到反应容器中并于25℃于DCM(150mL)中溶胀30分钟。排出DCM溶剂并用DMF(每次洗涤，90mL)洗涤树脂三次。

通过用DMF(90mL每次处理)中的20％(v/v)哌啶处理树脂两次以除去Fmoc保护基来进行树脂的全部Fmoc去保护作用。在第二次哌啶/DMF处理后，用DMF(每次洗涤100mL)洗涤树脂九次。

为了制备活化的酯溶液，称重氨基酸和1-羟基-苯并三唑水合物(HOBT·H₂O)，在烧瓶中溶于DMF中，随后与DMF中的贮存HBTU溶液(0.503mmoles/mL)和DIEA于0℃-5℃继续合并。将得到的溶液加到反应容器中，用加入反应器中的DCM润洗制备烧瓶，随后将其与树脂于25℃一起搅拌4-16小时。取样进行开氏检验或HPLC分析以确认反应完成。在偶联反应完成后，排出偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(每次洗涤，100mL)。如果16小时后偶联不完全则通过与乙酸酐和DMF中的DIEA和DCM一起反应3小时来对树脂进行末端封端。对于片段中的剩余氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe的顺序)重复去除Fmoc基团和偶联下一个氨基酸的顺序。

用于此实施例中的所有试剂的量列在下表中：

材料

A.Awt(g)/Eq

HOBT·H₂O(g)/Eq

DMF(mL)

DIEA(mL)/Eq

HBTUSol’n(mL)/Eq

DCM(mL)

偶联时间(分钟)

Fmoc-Lys(Boc)-OH

5.97/2.35

1.94/2.35

36.8

4.7/5.0

25.2/2.35

21.4

960

乙酸酐

2.81/5.0

-

82.8

9.4/10.0

-

180

Fmoc-Val-OH

4.31/2.35

1.97/2.35

36.8

4.7/5.0

25.2/2.35

21.4

960

乙酸酐

2.79/5.0

-

82.8

9.4/10.0

-

180

Fmoc-Leu-OH

3.26/1.7

1.42/1.7

-

3.8/4.0

18.2/1.7

21.4

240

Fmoc-Trp(Boc)-OH

4.83/1.7

1.42/1.7

-

3.8/4.0

18.2/1.7

21.4

240

Fmoc-Ala-OH

3.05/1.7

1.42/1.7

-

3.8/4.0

18.2/1.7

21.4

240

Fmoc-Ile-OH

3.27/1.7

1.43/1.7

-

3.8/4.0

18.2/1.7

21.4

240

Fmoc-Phe-OH

3.57/1.7

1.43/1.7

-

3.8/4.0

18.2/1.7

21.4

240

在完成固相合成后，用DMF(4x100mL)，DCM(7x100mL)，和异丙醇(3x100mL)洗涤树脂。将构建的树脂进行真空干燥(19.35g)并保持用来裂解。

实施例20

由构建的树脂裂解GPA中间体片段Fmoc-AA(28-35)-OH：

将由实施例19构建的树脂，19.0g，在25℃于DCM(150mL)中溶胀30分钟。随后将混合物冷却至-5℃。排出DCM并用2％TFA/DCM(2X7.5体积)的冷溶液于0℃来处理树脂两次达30分钟，伴随搅拌。将裂解溶液收集在包含吡啶(相对于所用的总体TFA来说为1.3当量)的烧瓶中。当容器升温至25℃时，用DCM洗涤树脂6次(150mL)并排入收集容器中。合并DCM溶液，浓缩并与水(150mL)混合。在减压下再次蒸馏得到的混合物以除去残留的DCM(350-50托，在25℃)。当去除DCM时片段由水中沉淀。过滤片段，洗涤并在真空下于30℃-35℃进行干燥。获得92.7％产率的GPA备选片段3(Fmoc-AA(28-35)-OH)，纯度为95.2％AN。

实施例21

备选片段3Fmoc-AA(28-35)-O-2CT树脂的固相合成：

Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-O-2CT树脂

在罗氏肽合成仪上进行Fmoc-AA(28-35)-O-2CT树脂的固相合成。将负载为0.59mmol/g(批次号BO06010051)的H-Aib-2-O-CT树脂(25.01g)装入到反应容器中并于25℃于DCM(250mL)中溶胀30分钟。排出DCM溶剂并用NMP(每次洗涤150mL)洗涤树脂三次。

通过用NMP(每次处理140mL)中的20％(v/v)哌啶处理树脂两次以除去Fmoc保护基来进行树脂的全部Fmoc去保护作用。在第二次哌啶/NMP处理后，用NMP(每次洗涤140mL)洗涤树脂九次。

为了制备活化的酯溶液，称重Fmoc氨基酸和HOBT·H₂O，将其溶于NMP中，随后与NMP中的HBTU溶液(0.46mmole/mL)和DIEA于0℃-5℃顺序合并。将得到的溶液加到反应容器中，用加入反应器中的NMP润洗烧瓶，将其与树脂于25℃一起搅拌4-16小时。取样进行开氏检验或HPLC分析以检查反应完成。在偶联反应完成后，排出偶联溶液并用NMP4次(每次洗涤140mL)洗涤树脂。如果16小时时偶联仍然不完全，则(4x140mL NMP)洗涤树脂，通过与乙酸酐和DIEA一起反应2小时来对树脂进行末端封端，随后用NMP洗涤4次(每次洗涤140mL)。对于片段中的残留氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe的顺序)重复去除Fmoc基团，洗涤，偶联反应和洗涤的顺序。

用于此实施例中的所有试剂的量列在下表中：

材料

A.Awt(g/Eq)

HOBT·H₂O(g/Eq)

NMP(mL)

DCM(mL)

DIEA(mL/Eq)

HBTUSol’n(mL/Eq)

偶联时间(分钟)

Fmoc-Lys(Boc)-OH

13.86/2.0

0.24/0.1

88

-

6.4/2.5

64.2/2.0

720

乙酸酐

4.62/3.0

-

112.5

12.8/5.0

-

120

Fmoc-Val-OH

4.31/2.35

0.26/0.1

88

-

6.4/2.5

64.2/2.0

720

乙酸酐

4.60/3.0

-

112.5

12.8/5.0

-

120

Fmoc-Leu-OH

8.85/1.7

0.22/0.085

96

-

5.5/2.13

54.6/1.7

240

Fmoc-Trp(Boc)-OH

13.22/1.7

0.21/0.085

96

-

5.5/2.13

54.6/1.7

240

Fmoc-Ala-OH

8.28/1.7

0.21/0.085

96

-

5.5/2.13

54.6/1.7

240

Fmoc-Ile-OH

8.85/1.7

0.19/0.085

96

-

5.5/2.13

54.6/1.7

240

Fmoc-Phe-OH

9.73/1.7

0.21/0.085

96

-

5.5/2.13

54.6/1.7

240

在完成固相合成后用NMP(4X150mL)和DCM(7X150mL)洗涤树脂。

由构建的树脂裂解GPA备选片段3(Fmoc-AA(28-35)-OH)：

将由实施例21构建的树脂在30分钟内于DCM(150mL)中冷却至-5℃。随后排出DCM并于0℃用2％TFA/DCM(2x250mL)的冷溶液处理树脂两次达30分钟，伴随搅拌。将裂解溶液收集在包含吡啶(相对于总TFA来说为1.3当量)的烧瓶中。当容器升温至25℃时，用DCM 6次(每次洗涤150mL)洗涤树脂并将洗涤液与裂解溶液合并。在真空下浓缩合并的DCM溶液，并混合以水(150mL)。在减压下蒸馏得到的混合物以除去DCM(350-50托，于25℃)。当去除DCM时片段由水中沉淀。过滤片段，洗涤并在真空下于30℃-35℃进行干燥。获得96.9％产率的GPA备选片段3(Fmoc-AA(28-35)-OH)，纯度为96.1％AN。

GPA备选片段1+2，Fmoc-AA(7-27)-OH的固相合成

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ψMe，Mepro)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH

实施例22

GPA备选片段1+2，Fmoc-AA(7-27)-O-2CT树脂的固相合成：

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ψMe，Me pro)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-O-2CT树脂

在罗氏肽合成仪上进行Fmoc-AA(7-27)-O-2CT树脂的固相合成。将负载因子为0.41mmol/g(393-150)的Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂(10.04g)装入到反应容器中并于25℃用DCM(150mL)溶胀30分钟。排出DCM溶剂并用DMF(每次洗涤，90mL)洗涤树脂三次。

随后用DMF中的哌啶来对溶胀和洗涤过的Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂进行去保护。通过用DMF(80mL)中的20％哌啶处理树脂两次30分钟以除去Fmoc保护基来进行树脂的全部Fmoc去保护作用。在第二次哌啶/DMF处理(30分钟)后，用DMF(每次洗涤90mL)洗涤树脂九次。

为了制备偶联溶液，称重2.0当量的氨基酸和2.0当量的HOBT·H₂O，将其在烧瓶中溶于DMF中，随后在0℃-5℃与DMF中的2.0当量HBTU溶液(0.503mmol/mL)和4.5当量DIEA顺序合并。将得到的溶液加到反应容器中，用加入反应器中的DCM润洗烧瓶，将其与树脂在25℃一起搅拌4小时。取样进行开氏检验或HPLC分析以检查反应完成。在偶联反应完成后，排出偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(每次洗涤90mL)。随后对于片段中的残留氨基酸(即，以Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)→Gly→Glu(OtBu)→Leu→Tyr(tBu)→Ser(tBu)-Ser(ψMe，Me)→Val→Asp(OtBu)→Ser(tBu)→Thr(tBu)→Phe→Thr(tBu)→Frag.1的顺序)重复去除Fmoc基团和偶联反应循环。

对于1.6当量的GPA片段1(Fmoc-AA(7-10)-OH，Fmoc-Hi s(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH)的最后偶联，使用1.5当量HOBT·H₂O，1.5当量HBTU和3.38当量DIEA。将这一反应混合物搅拌16小时以达到完成。

将用于此实施例中的所有试剂的量列在下表中：

材料

A.A wt(g/Eq)

HOBT·H₂O(g/Eq)

DMF(mL)

DIEA(mL/Eq)

HBTUSol’n(mL/Eq)

DCM(mL)

偶联时间(分钟)

Fmoc-Lys(Boc)-OH

3.86/2.0

1.27/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Ala-OH.H2O

2.71/2.0

1.27/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Ala-OH.H2O

2.71/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Gln(trt)-OH

5.08/2.0

1.29/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Gly-OH

2.44/2.0

1.27/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Glu(OtBu)-OH

3.52/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Leu-OH

2.91/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Tyr(tBu)-OH

3.78/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe，Me)-OH

4.19/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Val-OH

2.82/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Asp(OtBu)-OH

3.38/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Ser(tBu)-OH

3.16/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Thr(tBu)-OH

3.26/2.0

1.29/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Phe-OH

3.21/2.0

1.29/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

Fmoc-Thr(tBu)-OH

3.27/2.0

1.28/2.0

33.5

3.2/4.5

16.3/2.0

17.8

240

片段1(Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH)

6.23/1.6

0.96/1.5

23.9

2.4/3.38

12.2/1.5

13.4

960

在完成固相合成后，用DMF(6X90mL)，DCM(7x90mL)，和异丙醇(3x90mL)洗涤树脂。随后将构建的树脂进行真空干燥并保持用来裂解。

实施例23

由构建的树脂裂解GPA中间体片段1+2Fmoc-AA(7-27)-OH：

将由实施例22构建的树脂(18.24g)在25℃于DCM(200mL)中溶胀30分钟。随后将混合物冷却至-5℃。排出DCM并用1％TFA/DCM(3x100mL)的冷溶液于0℃通过搅拌处理树脂三次，达30分钟。将裂解溶液收集在包含吡啶(相对于总TFA为1.4当量)的烧瓶中。当容器升温至25℃时，用DCM(100mL)洗涤树脂3次。合并所有的DCM溶液，浓缩并与水(100mL)混合。在减压下蒸馏得到的混合物以除去DCM(350-50托于25℃)。当去除DCM时片段由水中沉淀。过滤片段，用水洗涤并在真空下于30℃-35℃进行干燥。获得67.6％产率的GPA备选片段1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)，纯度为85.3％AN。

实施例24

GPA备选片段1+2，Fmoc-AA(7-27)-O-2CT树脂的固相合成：

Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)Ser(ψMe，Me pro)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-O-2CT

在罗氏肽合成仪上以20.0g Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂的规模重复Fmoc-AA(7-27)-O-2CT树脂的固相合成，负载因子为0.50mmol/g(393-53)。将树脂于25℃在DCM(200mL)中溶胀30分钟。排出DCM溶剂并用DMF(每次洗涤120mL)将树脂洗涤3次。

随后用DMF中的哌啶将溶胀和洗涤过的Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂去保护。通过用DMF(每次处理120mL)中的20％哌啶处理树脂两次达30分钟以除去Fmoc保护基来进行树脂的全部去保护作用。在第二次哌啶/DMF处理(30min)后，用DMF(每次洗涤120mL)洗涤树脂九次。

为了制备偶联溶液，称取2.0当量的氨基酸(或GPA片段1)和2.0当量的HOBT·H₂O，将其溶于DMF中，随后在0℃-5℃与DMF中的2.0当量HBTU溶液(0.503mmoles/mL)和4.5当量DIEA顺序合并。将得到的溶液加到反应容器中，随后用加入反应器中的DCM润洗烧瓶，将其与树脂于25℃一起搅拌4小时。取样进行开氏检验或HPLC分析以检查反应完成。在偶联反应完成后，排出偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(每次洗涤180mL)。随后对于片段中的残余氨基酸(即，以Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)→Gly→Glu(OtBu)Leu→Tyr(tBu)→Ser((tBu)Ser(ψMe，Me)→Val→Asp(OtBu)→Ser(tBu)→Thr(tBu)→Phe→Thr(tBu)→片段1的顺序)重复Fmoc基团去保护作用和偶联反应循环。

对于最后的偶联只使用1.5当量的片段1(Fmoc-AA(7-10)-OH)，HOBT·H₂O，HBTU，和3.38当量的DIEA。将此反应混合物搅拌16小时。

用于此实施例中的所有试剂量列在下表中：

材料

A.A wt(g/Eq)

HOBT·H₂O(g/Eq)

DMF(mL)

DIEA(mL/Eq)

HBTUSol’n(mL/Eq)

DCM(mL)

偶联时间(分钟)

Fmoc-Lys(Boc)-OH

9.38/2.0

3.07/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Ala-OH

6.60/2.0

3.09/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Ala-OH

6.63/2.0

3.07/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Gln(trt)-OH

12.22/2.0

3.07/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Gly-OH

5.97/2.0

3.05/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Glu(OtBu)-OH

8.53/2.0

3.05/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Leu-OH

7.06/2.0

3.06/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Tyr(tBu)-OH

9.22/2.0

3.06/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Ser(tBu)Ser(ψMe，Me)-OH

10.21/2.0

3.07/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Val-OH

6.79/2.0

3.08/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Asp(OtBu)-OH

8.23/2.0

3.07/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Ser(tBu)-OH

7.69/2.0

3.06/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Thr(tBu)-OH

7.97/2.0

3.06/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Phe-OH

7.76/2.0

3.06/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Fmoc-Thr(tBu)-OH

7.97/2.0

3.06/2.0

60.0

7.8/4.5

36.9/2.0

32.8

240

Frag.1(Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH)

14.21/1.5

2.30/1.5

45.0

5.9/4.0

27.6/1.7

25.3

960

在完成固相合成后，用DMF(4x120mL)和DCM(8x120mL)洗涤树脂。在用于裂解的制备中在最后DCM洗涤期间将混合物冷却至-5℃。

由构建的树脂裂解GPA中间体片段Fmoc-AA(7-27)-OH：

在来自上述的DCM中的构建树脂的反应器温度达到-5℃时，将DCM排干，并在0℃，将树脂用1％TFA/DCM(3X200mL)的冷溶液处理3次，达到30分钟，伴随搅拌。将裂解溶液收集在包含吡啶的烧瓶中(基于所用的总TFA1.4当量)。当将所述容器加温到25℃时，将树脂用DCM洗涤5次(每次200mL)。将所有的DCM溶液合并、浓缩并混合以水(200mL)和异丙醇(80mL)。将得到的混合物在减压下蒸馏从而去除DCM(350-50托，在25℃)。当将DCM去除时，片段沉淀出来。将所述片段过滤，洗涤，并在真空下，在30℃-35℃干燥。获得77.7％产率的GPA备选片段1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)，其纯度为86.4％AN。

GPA备选片段3’，H-AA(28-36)-NH ₂ 的液相合成：

H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH₂

实施例25

将备选片段3(Fmoc-AA(28-35)-OH，6.11g，4.42mmoles实施例20和精氨酰胺二盐酸盐(H-Arg(2HCl)-NH2，2.18g，8.84mmoles，2当量)溶解于DMF(42mL)中。向该溶液中，顺序加入HOBt·H₂O(0.67g，1当量)和HBTU(3.38g，2当量)在DMF(42mL)中的溶液，和DIEA(3.44mL，4当量)，以及15mL的DMF。将所述反应混合物在25℃搅动并通过HPLC监测。在搅拌21小时后，完成反应。接着，将哌啶(2.26g，6当量)添加到反应混合物中。在35℃搅拌1小时后，不完全去除Fmoc。加入另外的哌啶(2.33g，6.2当量)，并再继续搅拌1.75小时。将反应混合物用水(240mL)猝灭以形成白色固体。将吡啶盐酸盐(8.33g，16.3当量)加入沉淀的反应混合物中以中和哌啶。将白色固体过滤、用水(400mL)洗涤并部分干燥过夜。将湿滤饼与100mL MTBE/正庚烷(1∶1＝体积∶体积)再次成浆，过滤，用MTBE/正庚烷(1∶1＝体积∶体积；2X25mL)洗涤，并真空干燥以得到GPA备选片段3’H-AA(28-36)-NH2(6.22g，产率106.9％)。HPLC分析显示87％AN的纯度。

实施例26

将备选片段3(Fmoc-AA(28-35)-OH，6.12g，4.42mmoles实施例21和精氨酰胺二盐酸盐(H-Arg(2HCl)-NH2，2.19g，8.84mmoles，2当量)溶解于DMF(42mL)中。向该溶液中，顺序加入HOBt·H₂O(0.67g，1当量)和HBTU(3.38g，2当量)在DMF(42mL)中的溶液，和DIEA(3.44mL，4当量)，以及15mL的DMF。将所述反应物在25℃搅动并通过HPLC监测。将反应进行过夜(16.3小时)。接着，将哌啶(4.52g，12当量)添加到反应混合物中。在25℃搅拌35分钟后，完成Fmoc去除。将反应混合物用水(200mL)猝灭。将DCM(180mL)加入以提取沉淀的产物。将底部DCM层用水洗涤2次(2X100mL)并将其浓缩到50mL的体积。将该浓缩的DCM溶液逐份加入庚烷150mL中以沉淀所述产物。将DCM在真空下蒸馏。将MTBE 120mL加入沉淀的混合物中。将形成的白色固体过滤，用MTBE/正庚烷(1∶1＝体积∶体积；2x50mL)洗涤，并真空干燥以得到GPA备选片段3’H-AA(28-36)-NH2(6.54g，重量产率112.4％)。HPLC分析显示92.1％AN的纯度。

GPA粗制品的液相合成：

实施例27

将来自实施例23的GPA片段1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)(0.383g)和来自实施例24的片段3’(H-AA(28-36)-NH2)(0.203g)溶解在DMSO(2mL)和NMP(4mL)的溶液中并搅拌1小时。向该溶液中，加入HOBt水合物(0.040g)和HBTU(0.092g)。接着，将DIEA(0.080mL)加入反应混合物中。将反应物在室温下搅动，并通过HPLC监测。在搅拌68小时后，反应完成检查指示反应已经进行。将哌啶(0.1mL)加入反应混合物中。在搅拌16小时后，去除Fmoc。接着，通过加入水(40mL)来猝灭反应混合物。在搅拌30分钟后，将固体通过过滤分离，用水(20mL)洗涤，并干燥过夜。接着，将分离的固体在室温加入包含TFA(4mL)，DCM(1.5mL)，二硫苏糖醇(DTT)，(0.2g)和水(0.2mL)的溶液中。在6小时搅动后，将反应混合物通过加入冷(-20℃)MTBE(40mL)猝灭。将猝灭的反应混合物搅拌30分钟。过滤固体产物，用MTBE(2x10mL)洗涤，在室温干燥过夜。获得0.42g的GPA粗制品(28.2％wt/wt)，其纯度为49.5％AN(D-Glu-27差向异构体，7.9％)。

实施例28

将来自批次实施例23的GPA片段1+2(Fmoc-AA(7-27)-OH)(0.382g)和来自实施例25的片段3’(H-AA(28-36)-NH2)(0.202g)溶解在DMSO(2mL)和NMP(4mL)的溶液中，并搅拌0.5小时。向该溶液中，加入HOBt水合物(0.041g)和DEPBT(0.085g)。接着，将DIEA(0.080mL)加入反应混合物中。将反应物在室温搅拌，并通过HPLC监测。过夜反应完成检查指示反应完成。将哌啶(0.1mL)加入反应混合物中。在搅拌68小时后，去除Fmoc。接着，通过加入水(40mL)来猝灭反应混合物。在搅拌15分钟后，通过过滤分离固体，用水(20mL)洗涤并干燥过夜。接着，将分离的固体在室温加入包含TFA(4mL)，DCM(1.5mL)，DTT(0.2g)和水(0.2mL)的溶液中。在搅动6小时后，通过加入冷(-20℃)MTBE(40mL)来猝灭反应混合物。将猝灭的反应混合物搅拌30分钟。过滤固体产物，用MTBE(2x10mL)洗涤，并在室温干燥过夜。获得重量为0.43g的GPA粗制品(31.4％wt/wt)，其纯度为51.3％AN(D-Glu-27差向异构体，4.5％)

实施例29

步骤A.在HOBt，HBTU和DIEA存在下的THF中片段1+2与片段3’的偶联反应：

在10分钟内，在22℃-27℃内部温度，向具有37.5mL THF的100mL4颈烧瓶中以三份加入片段1+2(6.20g，2.32mmol)。向20mL圆底烧瓶中，加入HOBt水合物(309mg，1.98mmol)和HBTU(1223mg，3.16mmol)。加入10.0mL THF并将反应混合物在22℃-27℃内部温度搅拌10分钟。将该偶联试剂混悬液添加到肽溶液中，并将所述烧瓶用3.0mL THF润洗，将反应混合物搅拌10分钟。接着加入DIEA(0.582mL，3.31mmol)并搅拌10分钟。在1小时内，以3份加入片段3’(6.10g，2.72mmol)。将片段残留用10.0mL THF润洗。将反应混合物在25℃-27℃内部温度剧烈搅拌24小时。

步骤B.用哌啶去除FMOC-基团：

接着，加入哌啶(1.60mL，16.0mmol)，并将反应混合物在25℃-27℃内部温度剧烈搅拌6h。接着，将反应混合物转移到250mL圆底烧瓶中，并在42℃水浴温度/200-100mbar在真空中去除溶剂。

步骤C.与二氯甲烷的溶剂交换

接着，将残余物溶解在35.0mL二氯甲烷中，将其接着在42℃水浴温度/400-100mbar，在真空中去除。接着，将残余物溶解在30.0mL二氯甲烷中。

步骤D.用TFA/DTT/水完全去保护：

向1000mL双夹套烧瓶中，加入(5.75g，37.1mmol)DTT，5.75mL H₂O和(102.5mL，1220mmol)TFA，并将溶液冷却到15℃内部温度。接着，在10-15分钟内加入肽溶液，并用5.0mL二氯甲烷润洗添加漏斗。将明黄色反应溶液在14℃-16℃内部温度搅拌10.5h。

步骤E.在加入MTBE后沉淀肽：

接着，将反应混合物冷却到0℃内部温度并在10分钟内持续加入480mL MTBE(预先冷却到0-5℃)，使内部温度升高到22℃。接着，将混悬液在16℃-18℃内部温度搅拌2h，随后过滤。将仍旧潮湿的滤饼用300mL MTBE(3x100mL)洗涤3次。接着，润洗烧瓶，使滤饼成浆，并过滤。接着，在最后一次洗涤后，将滤饼吸干，并将残余物在38℃-42℃/20-30mbar干燥过夜。(化学产率：58-65％，测定：39-43％)。

在前述说明书、或随附的权利要求中，以它们的具体形式或在实施公开的功能或用于获得公开的结果的方法或过程的方式方面公开的特征，如果需要，可以单独地或以这些特征的任何组合以其多样化的形式用来实现本发明。

为了清楚和易于理解的目的，前述发明已经通过举例和实施例的方式详细进行了描述。本领域技术人员应该清楚可以在随附权利要求的范围内进行改变和改进。因此，要理解，前述说明书意欲举例说明而非限制。因此，本发明范围的确定不应该参考上述说明书，而应该参考随附的权利要求，以及被授予所述权利要求的等价物的全部范围确定。

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司

克里斯托夫·R·罗伯茨

韩渊奎

陈林

<120>使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成

<130>Case 24689

<150>US 61/007238

<151>2007-12-11

<160>32

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>37

<212>PRT

<213>人

<400>1

His Asp Glu Phe Glu Arg Hi s Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val

1 5 10 15

Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gl n Ala Ala Lys Gl u Phe Ile Ala Trp Leu

20 25 30

Val Lys Gly Arg Gly

35

<210>2

<211>31

<212>PRT

<213>人

<400>2

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210>3

<211>30

<212>PRT

<213>人

<400>3

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210>4

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..()

<223>Xaa是Aib

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..()

<223>Xaa是Aib

<400>4

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25 30

<210>5

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>由是固相树脂或-OH的B′取代

<400>5

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Tle Ala Trp Leu Val Lys Xaa

1 5 10

<210>6

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>6

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

1 5 10

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>由是固相树脂或-OH的B′取代

<400>7

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Gl u Gl y

1 5 10

<210>8

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(25)..(25)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>8

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25

<210>9

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>由是固相树脂或-OH的B′取代

<400>9

His Xaa Glu Xaa

1

<210>10

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..(29)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>10

His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25 30

<210>11

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..(29)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>11

His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25 30

<210>12

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是Aib

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..(29)

<223>Xaa是Aib

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>12

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25 30

<210>13

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(22)..(22)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(25)..(25)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(25)..(25)

<223>由是固相树脂或-OH的B′取代

<400>13

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Phe Tle Ala Trp Leu Val Lys Xaa

20 25

<210>14

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(25)..(25)

<223>Xaa是Aib

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(25)..(25)

<223>由是固相树脂或-OH的B′取代

<400>14

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa

20 25

<210>15

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(25)..(25)

<223>Xaa是Aib

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>15

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25

<210>16

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>由是固相树脂或-OH的B′取代

<400>16

Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa

1 5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>17

Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

1 5

<210>18

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>由是N端保护基或氢的Z取代

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(21)..(21)

<223>由是固相树脂或-OH的B′取代

<400>18

His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu

20

<210>19

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..(29)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>19

His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25 30

<210>20

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<400>20

His Xaa Glu Xaa

1

<210>21

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是Aib

<400>21

His Xaa Glu Gly

1

<210>22

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<400>22

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly

1 5 10

<210>23

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<400>23

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa

1 5 10

<210>24

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>Xaa是Aib

<400>24

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa

1 5 10

<210>25

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(25)..(25)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>25

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25

<210>26

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..(29)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>26

His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

20 25 30

<210>27

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<400>27

His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu

20

<210>28

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa是Aib

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基11-12)的氨基酸

<400>28

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu

20

<210>29

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是假脯氨酸二肽(残基7-8)的氨基酸

<400>29

Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<400>30

Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa

1 5

<210>31

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是Aib

<400>31

Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa

1 5

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa是非手性氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>酰胺化的精氨酸(精氨酰胺)

<400>32

Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg

1 5

Claims

1.一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.6)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.7)

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.14)：

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供包括氨基酸序列(SEQID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第七肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

B’是-OH；且

H和E的每个任选地包含侧链保护；且

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的促胰岛素肽，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

2.根据权利要求1所述的制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.6)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.7)

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第七肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

3.根据权利要求1或权利要求2的方法，所述方法还包括下述步骤：

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵X⁸，X¹⁰和X³⁵每个独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；并且

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.12)

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂。

5.一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第二肽片段，

其中：

Z是H-；

B’是固相树脂；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’，

其中：

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供这样的第七肽片段，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

6.根据权利要求5制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

b)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.5)

Z-QAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第二肽片段，

其中：

Z是H-；

B’是固相树脂；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)提供在溶液中的第三肽片段，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.7)

Z-TFTSDVX^17-18YLEG-B’

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

f)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

g)提供这样的第七肽片段，其包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

7.根据权利要求5或权利要求6的方法，所述方法还包括下述步骤：

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

j)使由步骤i)得到的促胰岛素肽与酸接触以对所述氨基酸侧链进行去保护，从而提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.11)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；且

8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.12)

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂。

9.一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.13)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段或其负体，

其中：

Z是N-端保护基；

B’是-OH；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第四肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；并且

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

10.根据权利要求9所述的制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.13)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段或其负体，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

c)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.8)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.9)

Z-HX⁸EX¹⁰-B’

的第四肽片段，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是-OH；并且

H和E的每个任选地包含侧链保护；并且

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

11.根据权利要求9或权利要求10的方法，所述方法还包括下述步骤：

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；并且

12.根据权利要求9-11中任一项的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.12)

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂。

13.氨基酸序列(SEQ.ID NO.14)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAib-B’

的肽，

其中：

Z选自H-和Fmoc-；

B’是-OH或固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

14.根据权利要求13的肽，其中假脯氨酸的二肽残基是假脯氨酸的Ser-Ser残基。

15.氨基酸序列(SEQ.ID NO.15)

Z-TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂

的肽，

其中：

Z选自H-和Fmoc-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

16.根据权利要求15的肽，其中假脯氨酸的二肽残基是假脯氨酸的Ser-Ser残基。

17.一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的第一肽片段，

其中：

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；

Z是N-端保护基；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

Z-FIAWLVKX³⁵-B’，

其中B’是-OH；

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第二肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；

d)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第三肽片段，

其中：

Z是H-；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

18.一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

其中B’是-OH。

19.根据权利要求17的方法，所述方法还包括下述步骤：

e)提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的第四肽片段，

其中：

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

Z是N-端保护基Fmoc-；

B’是固相树脂；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护；和

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

其中B’是-OH。

20.根据权利要求19的方法，所述方法还包括下述步骤：

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第五肽片段，

其中：

Z是N-端保护基；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

21.根据权利要求20的方法，所述方法还包括下述步骤：

h)去除所述N-端保护基以提供包括氨基酸序列(SEQ ID NO.10)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的第六肽片段，

其中：

Z是H-；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

22.根据权利要求21的方法，所述方法还包括下述步骤：

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R-NH₂

的去保护的促胰岛素肽，

其中：

Z是H-；并且

23.根据权利要求17-22中任一项的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.12)

HAibEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH₂。

24.氨基酸序列(SEQ.ID NO.18)

Z-HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKE-B’

的肽，

其中：

Z选自H-和Fmoc-；

B’是-OH或固相树脂；

X^17-18是假脯氨酸的二肽残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

25.根据权利要求24的肽，其中假脯氨酸的二肽残基是假脯氨酸的Ser-Ser残基。

26.具有氨基酸序列(SEQ ID NO.17)

Z-FIAWLVKX³⁵R-NH₂

的肽，

其中：

Z是N-端保护基Fmoc-；并且

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

27.根据权利要求26的肽，其中X³⁵是Aib。

28.具有氨基酸序列(SEQ ID NO.16)

Z-FIAWLVKX³⁵-B’

的肽，

其中：

B’是固相树脂或-OH；

Z是N-端保护基Fmoc-；并且

X³⁵是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且

所述序列的一个或多个残基任选地包含侧链保护。

29.根据权利要求28的肽，其中X³⁵是Aib。

30.如前文定义的制备促胰岛素肽的方法和所述肽。