MX2007007917A

MX2007007917A - Sintesis del peptido t-20 utilizando fragmentos peptidicos intermediarios.

Info

Publication number: MX2007007917A
Application number: MX2007007917A
Authority: MX
Inventors: Yeun-Kwei Han; David A Johnston; N Khatri Hiralal
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2007-08-14
Also published as: KR101243013B1; DE602005017188D1; EP1833843A1; CN101133077A; CA2592438A1; CA2592438C; EP1833843B1; JP2008526698A; IL184080A0; CN101133077B; WO2006069728A1; IL184080A; ATE445636T1; US20060276624A1; JP4886702B2; KR20070103400A; ES2332418T3

Abstract

Se describen los metodos para la sintesis en fase solida de los peptidos T-20 e intermediarios peptidicos, en particular los metodos que involucran la sintesis de los intermediarios de peptidos T-20 a factores de baja carga para producir producto que tienen excelente pureza y rendimiento.

Description

SÍNTESIS DEL PEPTIDO T-20 UTILIZANDO FRAGMENTOS PEPTIDICOS INTERMEDIARIOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos para preparar los péptidos T-20 utilizando procesos en fase sólida y en fase de adición, además de los fragmentos peptídicos intermediarios T-20 que pueden ser utilizados en estos métodos. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación de péptidos T-20 utilizando dos fragmentos que son sintetizados utilizando un procedimiento en fase sólida. Muchos métodos para la síntesis de péptidos son descritos en la literatura por ejemplo, ver la Patente de los Estados Unidos No. 6,015,881; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; Lloyd- illiams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; y Andersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250. Los diversos métodos de síntesis son distinguidos por el estado físico de la fase en la cual tiene lugar la síntesis, a saber, la fase líquida o la fase sólida. En la síntesis peptídica en la fase sólida (SPPS) , un grupo aminoácido o péptido es enlazado a una resina de REF.: 183399 soporte sólido. Luego, los aminoácidos o grupos peptídicos sucesivos son acoplados al péptido enlazado al soporte hasta que el material peptídico de interés es formado. El péptido enlazado al soporte es luego típicamente escindido del soporte y sometido a procesamiento y/o purificación adicionales. En algunos casos, la síntesis en fase sólida produce un producto peptídico maduro, en otros casos el péptido escindido del soporte (por ejemplo, un "fragmento intermediario peptídico") es utilizado en la preparación de un producto peptídico más grande. Los fragmentos intermediarios peptídicos generados a partir de los procesos en fase sólida pueden ser acoplados entre sí en un proceso sintético en fase líquida (de aquí en adelante denominada "síntesis en fase de solución"). La síntesis en fase de solución puede ser particularmente útil en casos donde la síntesis de un péptido maduro útil mediante fase sólida es ya sea imposible o no práctica. Por ejemplo, en la síntesis en fase sólida, los péptidos más grandes eventualmente pueden adoptar una conformación irregular mientras que todavía están acoplados al soporte sólido, dando como resultado en consecuencia la pérdida parcial o completa de la actividad en el producto final. También, conforme la cadena peptídica se vuelve más larga sobre la resina de soporte, la eficiencia de los pasos del proceso tales como el acoplamiento y la desprotección pueden ser comprometidos.

Esto, a su vez puede dar como resultado tiempos de procesamiento más prolongados para compensar estos problemas, además de las pérdidas claves mayores en los materiales iniciales, tales como los aminoácidos activables, los co-reactivos y los solventes. Estos problemas pueden incrementarse conforme se incrementa la longitud del péptido y por lo tanto, es relativamente no común encontrar péptidos maduros de más de 30 aminoácidos de longitud sintetizados utilizando únicamente un procedimiento en fase sólida. En el acoplamiento en fase de solución, dos fragmentos intermediarios peptídicos, o un fragmento intermediario peptídico y un aminoácido reactivo, son acoplados en un solvente apropiado, y usualmente en presencia de reactivos adicionales que promueven la eficiencia y la calidad de la reacción de acoplamiento. Los fragmentos intermediarios peptídicos son acomodados reactivamente de modo que el extremo N de un fragmento se lleva a enlazar al extremo C del otro fragmento, o viceversa. Además, los grupos protectores de cadena lateral , que están presentes durante la síntesis en fase sólida, son comúnmente conservados sobre los fragmentos durante el acoplamiento en fase de solución para asegurar la reactividad específica de los extremos terminales de los fragmentos . Estos grupos protectores de cadena lateral son típicamente no eliminados hasta que ha sido formado un péptido maduro.

Para la síntesis de péptidos muy grandes, no es común que sean realizados múltiples pasos de acoplamiento en fase de solución utilizando tres o cuatro o más fragmentos intermediarios peptídicos . Mientras que el concepto general de reacciones de acoplamiento de extremo a extremo en las reacciones en fase de solución es en general teóricamente directo cuando se utilizan fragmentos intermediarios peptídicos múltiples, en la práctica éste es raramente el caso. Diversos factores, tales como impurezas y el rendimiento del péptido, pueden tener un efecto significativo sobre la calidad y rendimiento de un péptido de longitud completa. Por lo tanto, la síntesis peptídica utilizando esquemas híbridos es a menudo retadora, y en muchos casos es difícil de predecir qué problemas van a ser inherentes en un esquema de síntesis hasta que se realiza la síntesis efectiva . En algunos casos, la síntesis en fase de solución puede ser afectada por una falta de pureza de los fragmentos intermediarios peptídicos después de la síntesis en fase sólida. A este respecto, puede ser necesario someter los fragmentos de intermediarios peptídicos a un paso de purificación antes del acoplamiento de los fragmentos en un proceso en fase de solución. La purificación a su vez, puede provocar una reducción en el rendimiento del fragmento intermediario peptídico, y en consecuencia, el producto peptídico final . También, el rendimiento del péptido maduro es inversamente proporcional al número de pasos en fase de solución que son requeridos para sintetizar el péptido maduro. En algunos casos, pueden ser requeridos tres, cuatro o más de cuatro pasos en fase de solución utilizando los productos intermediarios peptídicos, para generar un péptido maduro. Cada paso de acoplamiento en fase de solución adicional, puede dar como resultado un retorno disminuido del producto peptídico de longitud completa. Por lo tanto, para mejorar el rendimiento completo es deseable en general reducir al mínimo los pasos que están involucrados en el acoplamiento . Mejoramientos modestos en uno o más pasos en el esquema sintético general pueden presentar mejoramientos significativos en la preparación del péptido maduro. Tales mejoramientos pueden prestarse a un ahorro general grande en tiempos reactivos, y puede también mejorar significativamente la pureza y rendimiento del producto final . Mientras que la discusión de la importancia de los mejoramientos en la síntesis híbrida es aplicable a cualquier clase de péptido producido utilizando estos procedimientos, es de importancia particular en el contexto de los péptidos, que éstos sean terapéuticamente útiles y que sean fabricados en una escala para el uso médico comercial. Mientras que la síntesis de productos farmacéuticos de molécula pequeña puede ser relativamente barata, el costo de la síntesis de productos farmacéuticos biomoleculares más grandes, tales como péptidos terapéuticos, en comparación puede ser bastamente superior. Debido al costo de los reactivos, al tiempo de síntesis, además de otros factores, mejoramientos muy pequeños en el proceso de síntesis de estos productos farmacéuticos biomoleculares más grandes pueden tener un impacto significativo sobre si es incluso económicamente factible de producir tal producto farmacéutico. Tales mejoramientos son necesarios debido a éstos altos costos de producción para productos farmacéuticos biomoleculares más grandes como es apoyado por el hecho de que, en muchos casos, existen pocas, si es que las hay, alternativas terapéuticas adecuadas para estos tipos de productos farmacéuticos biomoleculares más grandes. Esto es claramente observado en el caso de los péptidos terapéuticos que son utilizados para el tratamiento de enfermedad de inmunodeficiencia provocadas por infección retroviral. Los péptidos que tienen actividad anti-retroviral pueden actuar de diferentes maneras, incluyendo mediante la prevención de la fusión de la partícula viral con la célula inmune del hospedero. Existe una gran necesidad para péptidos terapéuticos nuevos y efectivos, debido a que, en muchos casos, los anti-virales tradicionalmente utilizados se vuelven no efectivos para el tratamiento de estas enfermedades por la resistencia viral debido a la mutación. Una clase promisoria de péptidos terapéuticos útiles para combatir las enfermedades de inmunodeficiencia, son los inhibidores de la fusión. Estos tipos de péptidos terapéuticos pueden reducir el título viral, y mejorar significativamente la calidad de vida en pacientes que tienen enfermedades de inmunodeficiencia. Por ejemplo, el péptido FUZEON® (también conocido como enfuvirtide o T-20) , es un péptido de 36 aminoácidos, sintético, el péptido híbrido T-1249 y derivados y contrapartes de estos péptidos, han probado ser benéficos como inhibidores de la fusión en el tratamiento del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) . El péptido FUZEON® y sus derivados son los primeros inhibidores del HIV que demuestran ser consistentes, de potente actividad en personas infectadas con el HIV. Kilby et al. (1998) Nat Med 4:1302 y Kilby et al. (2002) AIDS Res Hum Retroviruses 18:685. Los inhibidores de la fusión tales como los péptidos T-20 y T-1249 se enlazan a una región de la envoltura de glucoproteína 41 de HIV tipo 1 (HIV-1) que está involucrada en la fusión del virus con la membrana de la célula hospedera CD4+. ild et al. (1993) AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1051. Los inhibidores de la fusión permanecen fuera de la célula y bloquean el HIV-1, antes de HIV-1 entre a la célula. El péptido FUZEON® y sus derivados reducen al mínimo las interacciones con el fármaco, los efectos laterales y la citotoxicidad al inhibir potentemente y de manera selectiva HIV-1 in vi tro . Además de estos problemas, intereses relacionados a la recuperación del producto y a la pureza del producto para la producción a gran escala de los péptidos, así como el manejo, almacenamiento y desecho de los reactivos, pueden impactar en gran medida la factibilidad del esquema de síntesis del péptido. De este modo, existe una necesidad continua para procesos de síntesis de péptidos capaces de producir de manera eficiente materiales peptídicos de interés comercial en cantidades de lotes grandes con rendimientos mejorados. La recuperación del péptido escindido a partir de una resina de soporte después de la síntesis en fase sólida del péptido es un aspecto de la síntesis en la cual es necesario un mejoramiento. La presente invención se refiere a la preparación de péptidos T-20 que son sintetizados utilizando un procedimiento en fase sólida y en fase de solución ("híbridos"). En general, el procedimiento incluye la síntesis de dos diferentes fragmentos intermediarios del péptido T-20 (SEQ ID No. : 2 y SEQ ID No. : 3 o contrapartes de los mismos) utilizando la química de fase sólida. De acuerdo a algunos aspectos de la invención, se ha encontrado que después de la síntesis en fase sólida, estas secuencias intermediarias de T-20 específicas se prestan a sí mismas particularmente bien a los pasos de acoplamiento en fase de solución. Además, se ha encontrado que los pasos en fase sólida que conducen a la formación de estos fragmentos intermediarios peptídicos pueden ser inventivamente modificados para mejorar significativamente el rendimiento y la pureza de estos fragmentos intermediarios. Este rendimiento y pureza mejorados son llevados a cabo en los pasos de acoplamiento en fase de solución, con lo cual se mejora el proceso sintético completo. Los métodos de la invención y los fragmentos intermediarios peptídicos descritos en la presente son particularmente ventajosos, especialmente debido a que esto hace al proceso de síntesis de T-20 más eficiente en un número de formas. En particular, los pasos de síntesis en fase sólida que conducen a la formación de los productos intermediarios del péptido T-20, SEQ ID No. : 2 ó SEQ ID No . : 3, utilizan una resina de soporte que tiene un primer aminoácido acoplado al soporte en un factor de carga que es menor que lo que es tradicionalmente utilizado en las técnicas estándares de fase sólida. Favorablemente, se ha encontrado que utilizando este factor de carga más bajo, los productos intermediarios del péptido T-20, SEQ ID No.: 2 o SEQ ID No.: 3, que son fragmentos sintetizados en fase sólida, atípicamente largos, pueden ser producidos con pureza mejorada y rendimiento mejorado. La pureza y rendimiento mejorados, mejoran significativamente las condiciones para los pasos de acoplamiento en fase de solución, dando como resultado por ende un mejoramiento para la síntesis completa de T-20. Hasta ahora, los procedimientos más exitosos para la síntesis de T-20 han utilizado el acoplamiento en fase de solución, en donde tres o más de tres fragmentos intermediarios peptídicos son preparados mediante síntesis en fase sólida. Estos fragmentos intermediarios son luego utilizados en reacciones de acoplamiento en fase de solución para preparar el producto maduro T-20 final. Aunque una ventaja de un procedimiento de tres (o más) fragmentos puede ser considerado con respecto a una mayor calidad de síntesis en fase sólida de los intermediarios, un inconveniente es que el procedimiento de tres fragmentos (o más) involucra más pasos de aislamiento y purificación en comparación a un procedimiento de dos fragmentos, y estos pasos adicionales incrementan en general el tiempo de procesamiento y pueden subsecuentemente reducir el rendimiento completo de la reacción de síntesis. Debido a que la presente invención utiliza únicamente dos fragmentos intermediarios peptídicos preparados por medio de la síntesis en fase sólida, una ventaja clara es que los tiempos de procesamiento son reducidos y la eliminación de los pasos de procesamiento puede dar como resultado un uso más eficiente de los materiales y reactivos. No obstante, una desventaja potencial con un procedimiento de dos fragmentos es que la síntesis de fragmentos intermediarios más largos por síntesis en fase sólida puede ser complicada y a menudo conducir a problemas serios de pureza y/o recuperación. A pesar de esto, como se estableció, la presente invención demuestra que el método de elegir los fragmentos peptídicos intermediarios que tienen una secuencia basada en la SEQ ID No. : 2 o la SEQ ID No.: 3 y luego sintetizar estos fragmentos mediante síntesis en fase sólida utilizando un factor de baja carga de resina, permite exitosamente que sean producidos fragmentos intermediaros con buen rendimiento y pureza. Tal logro es más bien remarcable en vista de los procedimientos convencionales para la síntesis de péptidos utilizando procedimientos en fase sólida y en fase de solución combinados. Por lo tanto, en algunos aspectos, la invención proporciona un método para preparar un fragmento intermediario peptídico para la síntesis de un péptido T-20, que incluye los pasos de (a) proporcionar una resina de soporte de síntesis en fase sólida que tiene un primer aminoácido acoplado al residuo que es glutamina (Q) , en donde la glutamina es acoplada a un factor de carga de 0.5 o menos; preferentemente la glutamina es acoplada a un factor de carga de entre 0.2 y 0.5; (b) el acoplamiento subsecuente de los aminoácidos al primer aminoácido sobre el soporte acoplado, para proporcionar la siguiente secuencia: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ- [Soporte] ; (c) retirar el intermediario peptídico Ac- YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No : 2) del soporte en una reacción de escisión, y luego utilizar el intermediario peptídico Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No: 2) para la síntesis de un péptido que tiene toda o una porción de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK ASL NWF SEQ ID No : 1) . En otros aspectos, la invención proporciona la preparación de un fragmento intermediario peptídico para la síntesis del péptido T-20, que incluye los pasos de (a) proporcionar una resina de soporte de síntesis en fase sólida, que tiene un primer aminoácidos acoplado al residuo que es triptofano ( ) , en donde el triptofano es acoplado a un factor de carga de 0.5 o menos, preferentemente el triptofano es acoplado a un factor de carga entre 0.2 y 0.5; (b) el acoplamiento subsecuente de los aminoácidos al primer aminoácido sobre el soporte acoplado, para proporcionar la siguiente secuencia EKNEQELLELDK ASL N - [Soporte] ; (c) retirar el intermediario peptídico EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No: 3) del soporte en una reacción de escisión; y luego utilizar el intermediario peptídico EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No: 3) para la síntesis de un péptido que tiene toda o una porción de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO : 1) . Lo más preferentemente, la invención proporciona un método para preparar un péptido T-20 que incluye los pasos de (a) proporcionar fragmentos intermediarios peptídicos que tienen las secuencias Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No: 2) y EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No : 3), en donde los fragmentos intermediarios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando un factor de carga de 0.5 o menos, utilizando preferentemente un factor de carga entre 0.2 y 0.5; (b) en fase de solución, haciendo reaccionar el péptido EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No : 3) con un residuo de fenilalaninamida para proporcionar la secuencia EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No : 4); y (c) una fase en solución, haciendo reaccionar el péptido Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No: 2) con el péptido EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No: 4) para proporcionar el péptido Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No : 1) . En otros aspectos, en el paso de acoplamiento el primer aminoácido está presente sobre el soporte a un factor de carga de menos de 0.5. En otros aspectos, en el paso de acoplamiento, el primer aminoácido está presente sobre el soporte a un factor de carga en el intervalo de 0.2-0.45, o un factor de carga en el intervalo de 0.25-0.40. En otros aspectos más, la síntesis en fase sólida es llevada a cabo mediante el acoplamiento de los aminoácidos a la cadena peptídica naciente en una cantidad entre 1 y 1.5 equivalentes. En otros aspectos, la invención proporciona un polipéptido que tiene la secuencia Ac -EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No: ). SEQ ID No: 3 que puede ser sintetizado mediante síntesis en fase sólida utilizando un factor de carga de 0.5 o menor. Las modalidades de la presente invención descritas más adelante, no están destinadas a ser exhaustivas o a limitar la invención a las formas precisas descritas en la siguiente descripción detallada. Más bien, las modalidades son elegidas y descritas de modo que otras personas expertas en la técnica puedan apreciar y entender los principios y prácticas de la presente invención. La terminología utilizada en la presente no está destinada a limitar el alcance de la invención. A todo lo largo del texto, incluyendo las reivindicaciones anexas, las forma singular "un" , "uno" "una" y "el" , "la" incluyen la referencia plural a no ser que el contexto lo dicte claramente de otro modo. De este modo, por ejemplo, una referencia a "un residuo de aminoácido" es una referencia a uno o más residuos de aminoácidos e incluye equivalentes de los mismos conocidos por aquellos expertos en la técnica. En esta invención, ciertos términos son utilizados frecuentemente, los significados de los cuales son proporcionados en la presente. A no ser que se definan de otro modo, los términos utilizados aquí tienen el mismo significado que el que es comúnmente entendido por una persona de experiencia ordinaria en el campo de la tecnología. Algunos términos pueden ser también explicados con mayor detalle posteriormente en la especificación. La presente invención está dirigida a los métodos para mejorar la síntesis de T-20 (también conocido como enfuvirtide) y las contrapartes de T-20 y en particular para mejorar los aspectos de la síntesis con relación a la síntesis en fase sólida de los fragmentos peptídicos del péptido T-20. La metodología de la presente invención es útil para elaborar el péptido T-20 y contrapartes del mismo, utilizando únicamente los fragmentos peptídicos sintetizados en fase sólida. Mientras que la invención está en general dirigida a la síntesis de T-20, las enseñanzas de la invención en la presente, pueden ser también aplicables a la síntesis de otros péptidos, particularmente aquellos que son sintetizados utilizando una combinación de procedimiento en fase sólida y en fase de solución. La invención es también aplicable a la síntesis de los fragmentos intermediarios peptídicos asociados con impurezas, particularmente impurezas de piroglutamato. Los métodos descritos en la presente, son particularmente adecuados para mejorar los aspectos de la síntesis a gran escala de los péptidos T-20. Los procedimientos de elevación de escala son típicamente realizados para proporcionar una cantidad del péptido útil para la distribución. Por ejemplo, la cantidad de péptido en un procedimiento a gran escala puede ser de 500 kg o 1 kg por lote o más, o más típicamente decenas de kg a cientos de kg por lote o más. En los procedimientos sintéticos de elevación de escala tales como la síntesis a gran escala pueden ser utilizados uno o más recipientes de reacción grandes. Estos pueden acomodar cantidades de reactivos tales como resinas, solventes o aminoácidos y productos químicos para diversos pasos en el proceso de síntesis, en un tamaño que permite la producción de péptidos en cantidades, por ejemplo, en el intervalo de 100-500 kilogramos o más. Los métodos descritos en la presente son particularmente adecuados para mejorar aspectos de la síntesis del péptido, particularmente para procedimientos a gran escala. En modalidades preferidas, los métodos de la invención pueden proporcionar mejoramientos tales como la reducción en el tiempo de procesamiento (síntesis) , mejoramientos en el rendimiento de los productos, mejoramientos en la pureza de los productos y reducción en la cantidad de reactivos y materiales iniciales requeridos. T-20 es un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos 638 y 673 de la proteína transmembranal gp41 proveniente del aislado HIV-1IAI y tiene una secuencia de 36 aminoácidos. La secuencia del péptido T-20 (SEQ ID No.: 1) es mostrada en seguida: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO : 1) T-20 es un fármaco anti-retroviral utilizado para el tratamiento de la infección por HIV-1. T-20 funciona para bloquear la fusión de la partícula viral del HIV-1 con células hospederas mediante el bloqueo de los cambios conformacionales requeridos para la fusión de la membrana. Los péptidos que tienen ese tipo de actividad son denominados en la presente como poseedores de actividad de T-20. La síntesis de T-20 utiliza típicamente procedimientos en fase sólida y líquida para sintetizar y combinar grupos de fragmentos peptídicos específicos para producir el producto enfuvirtide (Bray, B.L., Nature Rev., 2:587-593 (2003)). La presente invención proporciona los métodos para la síntesis mejorada de los intermediarios peptídicos de enfuvirtide y los productos de enfuvirtide de longitud completa. Los métodos de la invención también incluyen la síntesis de péptidos que tienen actividad de enfuvirtide e intermediarios peptídicos utilizados para prepara péptidos que tienen actividad de enfuvirtide. Los péptidos que tienen actividad de enfuvirtide son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. Nos. 5,464,933 y 5,656,480, y Publicación del PCT No. WO 96/19495. La invención es también aplicable a la síntesis de contraparte de T-20 incluyendo contrapartes de T-20 de longitud completa, y contrapartes de intermediarios peptídicos de T-20. Como se utiliza en la presente, una "contraparte de T-20" se refiere a un compuesto derivado de T-20 o un fragmento intermediario de T-20. Las contrapartes peptídicas incluyen pero no están limitadas a, análogos de péptidos, derivados de péptidos, compuestos de fusión y similares. Por lo tanto, cuando se hace referencia a los fragmentos intermediarios del péptido T-20 que tienen las secuencias SEQ ID No. : 2 y SEQ ID No. : 3, sus contrapartes incluyen, por ejemplo, análogos de péptidos, derivados de péptidos, compuestos de fusión de la SEQ ID No. : 2 y de la SEQ ID No.: 3, respectivamente. Como se utiliza en la presente, un análogo de péptido se refiere en general a un péptido que tiene una secuencia modificada de aminoácidos tal como mediante una o más sustituciones, supresiones, inversiones y/o adiciones de aminoácidos con relación a otro péptido o contraparte peptídica. Las sustituciones pueden ser preferentemente conservadoras o altamente conservadoras. Una sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro más que tiene en general la misma carga electrónica neta y en general el mismo tamaño y forma. Por ejemplo, los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticas o alifáticas sustituidas, tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de átomos de carbono y heteroátomos en sus cadenas laterales, difiere por no más de aproximadamente cuatro. Estos son aproximadamente de la misma forma cuando el número de ramificaciones en sus cadenas laterales difiere por no más de aproximadamente uno o dos. Los aminoácidos con grupos fenilo y fenilo sustituido en sus cadenas laterales, son considerados como poseedores de aproximadamente el mismo tamaño y forma. Listados más adelante están cinco grupos de aminoácidos, que reemplazan un aminoácido en un compuesto con otro aminoácido proveniente de los mismos grupos que en general da como resultado una suspensión conservadora. Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales alifáticas sustituidas con alifático de 1 a 4 átomos de carbono o hidroxilo de 1 a 4 átomos de carbono (lineales ramificadas o mono ramificadas) . Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales alifáticas de 1 a 4 átomos de carbono sustituida con ácido carboxílico (no ramificadas o con un punto de ramificación) . Grupo III: lisina, ornitina, arginina y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales alifáticas de 1 a 4 átomos de carbono sustituidas con amino o guanidino (no ramificadas o con un punto de ramificación) . Grupo IV : glutamina , asparagina y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales alifáticas de 1 a 4 átomos de carbono sustituidas con amina (no ramificadas o con un punto de ramificación) . Grupo V: fenilalanina, fenilglicina , tirosina y triptofano . Una "sustitución altamente conservadora" es el reemplazo de un aminoácido con otro más que tiene el mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y forma. Los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticas o alifáticas sustituidas, tienen casi el mismo tamaño cuando el número total de carbonos y heteroátomos en sus cadenas laterales difiere por no más de dos. Estos tienen casi la misma forma cuando tienen el mismo número de ramificaciones en sus cadenas laterales. Los ejemplos de sustituciones altamente conservadoras incluyen valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico por ácido glutámico y fenilglicina por fenilalanina.

Un derivado peptídico se refiere en general a un péptido, un análogo de péptido u otra contraparte peptídica que tiene modificación química de uno o más de sus grupos laterales, átomos de carbono alfa, grupos amino terminales, y/o grupos carboxilo terminales. A manera de ejemplo, una modificación química incluye, pero no está limitada a, la adición de porciones químicas, la porción de nuevos enlaces y/o la eliminación de porciones químicas. Las modificaciones en los grupos laterales de aminoácidos incluyen, sin limitación, la acilación de los grupos e-amino de la lisina, la N-alquilación de la arginina, histidina y lisina, la alquilación de los grupos ácidos carboxílico, glutámico o aspártico, y la desamidación de la glutamina o la asparagina. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones des-amino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo (por ejemplo, -CO-alquilo inferior) . Las modificaciones del grupo carboxilo terminal incluyen, sin limitación la amida, la alquilamida inferior, dialquilamida y modificaciones de éster de alquilo inferior. De este modo, los péptidos parcial o completamente protegidos constituyen derivados peptídicos .

Tabla 1 Para proporcionar un panorama general, con base en los métodos de la invención, el esquema sintético general para el péptido T-20 es como sigue. T-20 (SEQ ID No.: 1) es preparado mediante los pasos que incluyen las síntesis en fase sólida de los fragmentos intermediarios del péptido T-20 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID No: 2) y EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No: 3). Estos péptidos son sintetizados utilizando los métodos descritos en la presente y son luego escindidos de la resina de fase sólida en forma protegida en la cadena lateral. Un residuo de fenilalaninamida es luego acoplado al intermediario peptídico EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No: 3) en solución para producir EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No: 4). EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No: 4) es luego acoplado a Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No: 2) en solución para producir Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No: 1) .

De acuerdo a la presente invención, las técnicas de síntesis en fases sólidas son utilizadas para preparar un primer fragmento peptídico de T-20 (fragmento intermediario 1) que tiene la secuencia de 16 aminoácidos de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No : 2) o una contraparte del mismo. Para referencia con respecto a un método preferido de síntesis de fase sólida, el residuo glutamina amino- terminal (Q) (por ejemplo, el residuo número 16 de la SEQ ID No. : 2) que está presente sobre la porción C-terminal del péptido, es el primer residuo de aminoácido que es acoplado a la resina de fase sólida y de este modo constituye el aminoácido alfa del fragmento en términos de su posición con respecto a la resina de soporte sólido. En este método preferido, la síntesis en fase sólida procede por lo tanto al agregar consecutivamente residuos de aminoácidos desde el extremo amino hacia el extremo carboxilo, agregando secuencialmente aminoácidos de una manera correspondiente a la secuencia deseada. La síntesis del fragmento intermediario peptídico es completa después de que el residuo N-terminal (por ejemplo, la tirosina N-terminal (Y) de la SEQ ID No.: 2) ha sido agregado a la cadena peptídica naciente. Las técnicas de síntesis en fase sólidas son también utilizadas para preparar un segundo fragmento peptídico de T-20 (fragmento intermediario 2) tiene la secuencia de 19 aminoácidos de EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No: 3) o una contraparte de la misma. Para referencia con respecto a un método preferido de síntesis en fase sólida, el residuo de triptofano (W) amino-terminal (por ejemplo, el residuo número 19 de la SEQ ID No. : 3 o el residuo número 35 de la SEQ ID No.: 1) es el primer residuo de aminoácido que es acoplado a la resina de fase sólida y constituye de este modo, el aminoácido alfa de fragmento en términos de su posición con respecto a la resina de soporte sólida. En este método preferido, la síntesis en fase sólida, también procede al agregar consecutivamente residuos de aminoácidos desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo, agregando secuencialmente aminoácidos de una manera correspondiente a la secuencia deseada. La síntesis del fragmento intermediario peptídico es completada después de que el residuo N-terminal (por ejemplo, la lisina N-terminal (K) (Y) de la SEQ ID No.: 3) ha sido agregada a la cadena peptídica naciente . Se nota también que cada uno de los fragmentos intermediarios 1 y 2 incluyen los residuos de al menos 16 aminoácidos. Estos son fragmentos peptídicos más bien grandes en el contexto de la síntesis en fase sólida, incluso los principios de la presente invención permiten que tales fragmentos grandes y el T-20 resultantes sean sintetizados con alto rendimiento y alta pureza. De acuerdo a la invención, se ha descubierto que al controlar apropiadamente la cantidad relativa de péptidos sintetizados sobre la resina de fase sólida, pueden ser obtenidos efectos ventajosos con respecto al rendimiento y a la pureza de los fragmentos intermediarios peptídicos. La cantidad relativa del péptido sintetizado puede ser controlada por el factor de carga, que se refiere a la cantidad del aminoácido alfa acoplado a una cantidad de resina, típicamente expresada como milimoles de aminoácido alfa por gramo de resina de fase sólida. Por ejemplo, un factor de carga de 0.25 correspondería a 25 mmol de aminoácido alfa que es efectivamente acoplado a 100 g de la resina de fase sólida. Se entiende que la reacción que acopla el primer aminoácido a la resina de fase sólida puede no ser completamente eficiente, y por lo tanto la cantidad efectiva que es acoplada puede ser menor que una cantidad teórica basada en 100% de eficacia de acoplamiento y las cantidades de los reactivos iniciales. La cantidad efectiva del material acoplado puede ser determinada después de que ha tenido lugar la reacción. Con el fin de determinar el acoplamiento efectivo, el péptido puede ser escindido de la resina y evaluado mediante el uso, por ejemplo, mediante análisis de HPLC versus un estándar. Los métodos para determinar la cantidad efectiva del primer residuo de aminoácido acoplado, son descritos en la presente. De acuerdo a la invención, se ha encontrado que el rendimiento y la pureza de un fragmento peptídico relativamente largo (tales como los fragmentos intermediarios peptídicos de las secuencias SEQ ID No. : 2 y SEQ ID No. : 3) y por lo tanto el rendimiento y la pureza de péptido T-20 resultante, tiende a ser más alta a factores de carga relativamente más bajos, tales como 0.5 o menos. No obstante, si el factor de carga es, por ejemplo, menor de 0.2, entonces el rendimiento del producto puede ser acortado. Balanceando estos problemas, el factor de carga con respecto al menos a uno de los fragmentos 1 y 2, preferentemente ambos fragmentos 1 y 2 está entre aproximadamente 0.2 y aproximadamente 0.50, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 0.2 a 0.45, y más preferentemente en el intervalo de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.40. Por ejemplo, en una modalidad representativa de la práctica, sería adecuado el uso de un factor de carga de aproximadamente 0.34. Para ilustrar este aspecto, puede ser realizado el siguiente procedimiento en fase sólida. Una resina adecuada es obtenida y preparada mediante el lavado en un solvente apropiado. En seguida, una solución que contiene el primer aminoácido en forma activable y protegida es agregada a la resina lavada. Para lograr un factor de carga, dentro de un intervalo deseado, la cantidad y/o concentración del aminoácido y/o otros factores de reacción, tales como la presencia y la concentración de los co-reactivos tales como HOBT, la duración de la reacción de acoplamiento, la temperatura de la reacción de acoplamiento y así sucesivamente, pueden ser elegidos. La síntesis en fase sólida utilizando la química de Fmoc puede ser utilizada para preparar uno o varios fragmentos intermediarios de T-20 (tales como los fragmentos intermediarios peptídicos que incluyen la SEQ ID No. : 2 y la SEQ ID No. : 3) acoplados a una resina. Después de que el fragmento intermediario peptídico es sintetizado sobre la resina, éste es escindido utilizando un reactivo de escisión para generar un fragmento intermediario peptídico en solución, que está en una forma protegida. El fragmento intermediario peptídico es luego separado de la resina. En algunos casos, el fragmento intermediario peptídico es puesto en contacto con un agente de precipitación como una medida para purificar el fragmento intermediario peptídico antes de realizar el acoplamiento en fase de solución. Los métodos para la síntesis de los péptidos utilizando un procedimiento en fase sólida son bien conocidos en la técnica. En consecuencia, la invención contempla el uso de cualquier procedimiento sintético de fase sólida, utilizando un factor de carga baja para preparar fragmentos intermediarios peptídicos que puedan ser utilizados en la preparación de un producto final T-20.

Por ejemplo, los fragmentos intermediarios del péptido T-20 descritos en la presente, pueden ser sintetizados mediante técnicas SSPS utilizando protocolos Fmoc estándares. Ver por ejemplo, Carpin et al. (1970), J. Am. Chem. Soc. 92 (19) : 5748-5749 ; Carpin et al. (1972), J. Org. Chem. 37 (22) : 3404-3409, "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis," Weng C. Chan y Peter D. White Eds. (2000) Oxford University Press Oxford Eng. Cualquier tipo de soporte adecuado en la práctica de la síntesis peptídica de fase sólida puede ser utilizada. En modalidades preferidas, el soporte comprende una resina que puede ser elaborada a partir de uno o más polímeros, copolímeros o combinaciones de polímeros, tales como poliamida, polisulfamida, polietilenos sustituidos, polietilenglicol, resinas fenólicas, polisacáridos o poliestireno. El soporte polimérico puede también ser cualquier sólido que sea suficientemente insoluble e inerte para los solventes utilizados en la síntesis peptídica. El soporte sólido incluye típicamente una porción de enlace a la cual se acopla el péptido en crecimiento durante la síntesis, y que puede ser escindido bajo condiciones deseadas para liberar el péptido a partir del soporte. Los soportes sólidos adecuados pueden tener ligadores que son foto-escindibles, escindibles por TFA, escindibles por HF, escindibles por iones fluoruro, escindibles reductivamente ; escindibles por Pd(0); escindibles nucleofílicamente o escindibles por radicales. Las porciones de enlace preferidas son escindibles bajo condiciones tales que el péptido escindido es todavía sustancialmente globalmente protegido. En un método preferido de síntesis, los fragmentos intermediarios peptídicos sintetizados sobre un soporte sólido sensible que incluye grupos tritilo y más preferentemente sobre una resina que incluye grupos tritilo, que tiene grupos cloro, por ejemplo una resina de cloruro de 2-clorotritilo (2-CTC) (Barios et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30) ¡3943-3946) . Los ejemplos también incluyen la resina de cloruro de tritilo, la resina de cloruro de 4-metiltritilo, la resina de cloruro de 4-metoxitritilo, la resina 4 -aminobutan-l-ol-2-clorotritilo, la resina de 4-aminometilbenzoil-2 -clorotritilo, la resina de 3 -aminopropan-1-ol-clorotritilo, la resina de ácido bromoacético y 2-clorotritilo, la resina de ácido cianoacético y 2-clorotritilo, la resina de ácido 4 -cianobenzoico y 2-clorotritilo, la resina de glicinol y 2-clorotritilo, la resina propiónica de 2-clorotritilo, la resina de etilenglicol de 2-clorotritilo, la resina de N-Fmoc-hidroxilamina-2-clorotritilo, la resina de hidrazina-2-clorotritilo . Algunos soportes sólidos preferidos incluyen poliestireno, los cuales pueden ser copolimerizados con divinilbenceno, para formar el material de soporte al cual se anclan los grupos reactivos. El material peptídico es típicamente acoplado a las esferas de resina en las superficies de las esferas dentro de los interiores de las esferas. El péptido protegido con FMOC y en la cadena lateral es fácilmente escindido en un estado protegido a partir de esta resina utilizando reactivos ácidos suaves tales como TFA diluido en DCM o ácido acético. Otras resinas que son utilizadas en la síntesis de fase sólida incluyen resinas "Wang", que comprenden un copolímero de estireno y divinilbenceno con grupos de anclaje 4-hidroximetilfeniloximetilo (Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc), y la resina del ácido 4-hidroximetil-3 -metoxifenoxibutírico (Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35 (27) : 4705-4706) . Las resinas de Wang, de cloruro de 2-clorotritilo, y del ácido 4-hidroximetil-3 -metoxifenoxibutírico pueden ser adquiridas por ejemplo de Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, California. Con el fin de proporcionar un soporte que tenga un primer aminoácido acoplado, la resina puede ser preparada, por ejemplo, lavando y luego incubando con una solución que contiene un aminoácido protegido, activado. El primer aminoácido y los aminoácidos subsecuentes que son acoplados incluyen típicamente un grupo protector N-terminal, un grupo protector de cadena lateral (dependiendo del aminoácido específico) y un grupo que es reactivo con un grupo sobresaliente de la resina, o un grupo que es reactivo con el aminoácido sobresaliente. En aspectos preferidos, el primer aminoácido es acoplado al soporte en el extremo carboxilo, mientras que el extremo N y los grupos de cadena lateral están protegidos, como sea apropiado, por grupos protectores. Como una descripción ejemplar, la síntesis en fase sólida del fragmento intermediario peptídico Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No: 2) es llevado desde el extremo carboxilo hacia la dirección NH2-terminal mediante la carga de un residuo protegido de glutamina, sobre una resina de cloruro de 2-clorotritilo (2-CTC) . La naturaleza y el uso de los grupos protectores es bien conocido en la técnica. En general, un grupo protector adecuado es cualquier clase de grupo que pueda ayudar a prevenir que el átomo o porción al cual se enlaza, por ejemplo, el oxígeno o el nitrógeno, participe en reacciones no deseadas durante el procesamiento y síntesis. Los grupos protectores incluyen grupos protectores de cadena lateral, y grupos protectores amino y N-terminales. Los grupos protectores pueden también prevenir la reacción o enlace de los ácidos carboxílicos, los tioles y similares. Un grupo protector de cadena lateral se refiere a una porción química acoplada a la cadena lateral (por ejemplo, grupo R en la fórmula de aminoácidos general H2N-C(R) (H) -COOH) de un aminoácido que ayuda a prevenir que una porción de la cadena lateral reaccione con productos químicos utilizados en pasos de síntesis peptídica, procesamiento, etc. La elección de un grupo protector de cadena lateral puede depender de varios factores, por ejemplo, el tipo de síntesis realizada, el procesamiento al cual será sometido el péptido, y el producto intermediario deseado o el producto final . La naturaleza del grupo protector de cadena lateral depende también de la naturaleza del aminoácido mismo. En general un grupo protector de cadena lateral es elegido, el cual no se ha eliminado durante la desprotección en los grupos -amino durante la síntesis en fase sólida. Por lo tanto, el grupo protector -amino y el grupo protector de cadena lateral típicamente no son los mismos. En algunos casos, y dependiendo del tipo de reactivos utilizados en las síntesis en fase sólida y otro procesamiento de péptidos, un aminoácido puede no requerir la presencia de un grupo protector de cadena lateral . Tales aminoácidos no incluyen típicamente un oxígeno reactivo, nitrógeno u otra porción reactiva en la cadena lateral. Los ejemplos de grupos protectores de cadena lateral incluyen acetilo (Ac) , benzoilo (Bz) , ter-butilo, trifenilmetilo (tritilo) , tetrahidropiranilo, éter bencílico (Bzl) y 2, 6-diclorobencilo (DCB) , t-butoxicarbonilo (BOC), nitro, p-toluensulfonilo (Tos) , adamantiloxicarbonilo, xantilo (Xan) , bencilo, 2 , 6-diclorobencilo, metilo, etilo y éster t-butílico, benciloxicarbonilo (Z) , 2-clorobenciloxicarbonilo (2-C1-Z) , Tos, t-amiloxicarbonilo (Aoc) , y grupos protectores tipo uretano aromáticos o alifáticos, Los grupos fotolábiles tales como nitro-veritril-oxicarbonilo (NVOC) ; y grupos lábiles al fluoruro tales como trimetilsilil-oxicarbonilo (TEOC) . Los grupos protectores de cadena lateral preferidos incluyen el grupo t-Bu para los residuos de aminoácidos Tyr (Y) , Thr (T) , Ser (S) y Asp (D) ; el grupo trt para los residuos de aminoácidos His (H) , Gln (Q) y Asn (N) ; y el grupo Boc para los residuos de aminoácidos Lys (K) y Trp (W) . Por ejemplo, una o más de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos de los fragmentos peptídicos listados en la Tabla 1, pueden ser protegidos con grupos protectores estándares tales como t-butilo (t-Bu) , tritilo (trt) y t-butiloxicarbonilo (Boc) . El grupo t-Bu es el grupo protector de cadena lateral preferido para los residuos de aminoácidos Tyr (Y) , Thr (T) , Ser (S) y Asp (D) ; el grupo trt es el grupo protector de cadena lateral preferido para los residuos de aminoácidos His (H) , Gln (Q) y Asn (N) ; y el grupo Boc es el grupo protector de cadena lateral preferido para los residuos de aminoácidos Lys (K) y Trp (W) . Durante la síntesis de los fragmentos intermediarios del péptido de T-20 que incluyen histidina, la cadena lateral del residuo de histidma deseablemente está protegida, preferentemente con un grupo protector tritilo (trt) . Si éste no está protegido, el ácido utilizado para escindir el fragmento peptídico de la resina y/o para escindir FMOC u otros grupos protectores N-termmales durante la síntesis, podría reaccionar de manera dañina con un residuo de histidma no protegido, provocando la degradación del fragmento peptídico. Muy posiblemente, ningún enlace adicional de otro aminoácido podría ocurrir si la histid a no es protegida. El tiempo de escisión prolongado puede también eliminar un grupo protector tal como trt de la hist dma, y puede provocar que un lote satisfaga especificaciones de calidad típicas. Preferentemente, todos los residuos de asparag a de cada fragmento peptídico de la invención están protegidos Además, se prefiere que el residuo de triptofano esté protegido con un grupo Boc. Un grupo protector ammo-terminal incluye una porción química acoplada al grupo alfa-ammo de un aminoácido. Típicamente, el grupo protector arrimo-terminal es eliminado en una reacción antes de la adición del siguiente aminoácido que va a ser agregado a la cadena peptídica en crecimiento, pero puede ser mantenido cuando el péptido es escindido del soporte. La elección de un grupo protector amino-terminal puede depender de diversos factores, por ejemplo, el tipo de síntesis realizada y el producto intermediario deseado o el producto final . Los ejemplos de grupos protectores amino-terminales incluyen (1) grupos protectores tipo acilo, tales como formilo, acrililo (Acr), benzoilo (Bz) y acetilo (Ac) ; (2) grupos protectores tipo uretano aromático, tales como benciloxicarbonilo (Z) y Z sustituido, tales como p-clorobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo; (3) grupos protectores de uretano alifático, tales como t-butiloxicarbonilo (BOC) , diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores tipo uretano cicloalquílico, tales como 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc) , ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, y ciclohexiloxicarbonilo; y (5) grupos protectores tipo tiouretano, tal como feniltiocarbonilo. Los grupos protectores preferidos incluyen 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), 2- (4-bifenilil) -propil (2) oxicarbonilo (Bpoc) , 2-fenilpropil (2 ) -oxicarbonilo (Poc) y t-butiloxicarbonilo (Boc) . De acuerdo a la invención, los grupos protectores son típicamente retenidos en los fragmentos intermediarios peptídicos a todo lo largo de la síntesis en fase sólida y también dentro y a todo lo largo de la reacción de acoplamiento en fase de solución. (En general, después de que se completa un paso de acoplamiento en fase de solución, es realizado un paso de desprotección para eliminar uno o más grupos protectores del péptido. Los ejemplos específicos de los primeros aminoácidos que tienen grupos protectores específicos que pueden ser acoplados a la resina para la síntesis de los fragmentos intermediarios peptídicos que tienen la SEQ ID No.: 2 y la SEQ ID No.: 3, pueden ser FmocGlu (OtBu) OH y FmocTrp (Boc) OH, respectivamente. Con el fin de preparar una resina para la síntesis en fase sólida, la resina puede ser pre-lavada en un solvente. Por ejemplo, una resina en fase sólida tal como una resina 2 -CTC es agregada a una cámara peptídica y pre-lavada con un solvente adecuado. El lavado puede ser realizado para preparar la resina para el contacto con el primer aminoácido que va a ser acoplado a la resina. En esencia, un prelavado puede ser realizado para promover el acoplamiento eficiente del primer aminoácido a la resina. El solvente de prelavado puede ser elegido con base en el tipo de solvente (o mezcla de solventes) que se utilice en la reacción de acoplamiento o viceversa. Los solventes que son adecuados para el lavado y también la reacción de acoplamiento subsiguiente incluyen diclorometano (DCM) , dicloroetano (DCE) , dimetilformamida (DMF), cloruro de metileno, y similares, así como mezclas de estos reactivos. Otros solventes útiles incluyen DMSO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona, y mezclas de los mismos. En algunos casos, el acoplamiento puede ser realizado en un sistema de solvente binario, tal como una mezcla de DMF y DCM. Como se describe en la presente, se desea controlar el factor de carga del primer aminoácido alfa sobre la resina para estar en el intervalo de 0.2 a aproximadamente 0.50, preferentemente aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.45, y más preferentemente aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.40. Por lo tanto, es preparada una solución que tiene una cantidad de aminoácido que proporcionará un factor de acoplamiento en el intervalo objetivo. Esto puede ser determinado conociendo en general que la eficiencia de acoplamiento es para una reacción particular. Por ejemplo, cuando se desea tener un factor de carga objetivo de aproximadamente 0.34, y si se sabe que la eficiencia de acoplamiento es de aproximadamente 80%, entonces la solución de acoplamiento que contiene 0.425 mmol del aminoácido por cada gramo de resina debe ser utilizada (0.34/0.8). La reacción de acoplamiento puede ser realizada en presencia de uno o más compuestos que aumentan o mejoran la reacción de acoplamiento. Los compuestos que pueden incrementar la proporción o velocidad de reacción y reducen la velocidad de las reacciones colaterales, incluyen las sales de fosfonio y uronio que pueden, en presencia de una base terciaria, por ejemplo, diisopropiletilamina (DIEA) y trietilamina (TEA) , convertir los aminoácidos protegidos a especies activadas (por ejemplo, BOP, PyBOPO, HBTU, y TBTU todos generan esteres de HOBt) . Otros reactivos ayudan a prever la racemización al proporcionar un reactivo protector. Estos reactivos incluyen carbodiimidas (por ejemplo, DCC o WSCDI) con un nucleófilo auxiliar agregado (por ejemplo, 1-hidroxi -benzotriazol (HOBt) , 1-hidroxi-azabenzotriazol (HOAt) , o HOSu) . Otro reactivo que puede ser utilizado es TBTU. El método de anhídrido mixto, utilizando cloroformiato de isobutilo, con o sin un nucleófilo auxiliar agregado, es también utilizado, como lo es el método de la azida, debido a la baja racemización asociada con éste. Estos tipos de compuestos pueden también incrementar la velocidad o proporción de acoplamientos mediados por carbodiimida así como prevenir la deshidratación de los residuos de Asn y Gln. La terminación del acoplamiento puede ser monitorizada con una prueba de ninhidrina cualitativa como se describe en la presente. Después de que se determina que el acoplamiento está completo, la mezcla de reacción de acoplamiento es lavada con un solvente, y el ciclo de acoplamiento es repetido para cada uno de los residuos de aminoácidos subsiguientes del material peptídico. Después del ciclo de acoplamiento final, la resina es lavada con un solvente tal como NMP, y luego lavada con un segundo solvente inerte tal como DCM. Con el fin de acoplar el siguiente aminoácido, la eliminación del grupo protector N-terminal (por ejemplo, un grupo Fmoc) es típicamente lograda mediante tratamiento con un reactivo que incluye 20-50% (en una base en peso) de piperidina en un solvente, tal como N-metilpirrolidona (NMP) o dimetilformamida (DMF) . Después de la eliminación del grupo protector de Fmoc, varios lavados son típicamente realizados para eliminar la piperidina residual y los subproductos de Fmoc (tales como el dibenzofulveno y su aducto de piperidina) . Después de que ha sido acoplado el primer aminoácido a la resina a un factor de carga deseado, y el grupo protector N-terminal ha sido removido, pueden ser agregados los aminoácidos subsiguientes para preparar los fragmentos intermediarios peptídicos. Los aminoácidos subsiguientes pueden ser utilizados a un exceso estequiométrico de aminoácidos, en relación al factor de carga. No obstante, se ha encontrado que la síntesis en fase sólida de los fragmentos intermediarios de T-20 específicos descritos en la presente, no requiere un gran exceso de aminoácidos (y reactivos correspondientes) para ser utilizados en la síntesis de fase sólida de estos fragmentos. En general, la cantidad de aminoácidos utilizados en el paso de acoplamiento es al menos equivalente al factor de carga del primer aminoácido sobre la resina (1 equivalente o más) . Preferentemente, la cantidad de aminoácidos utilizados en el paso de acoplamiento es 1.3 equivalentes (exceso de 0.3) o más, y más preferentemente aproximadamente 1.5 equivalentes (exceso de 0.5) . En algunos casos, por ejemplo, el paso de acoplamiento utiliza una cantidad equivalente de aminoácidos en el intervalo de 1 y 1.5 (mayor de 1 y menor de 1.5) . Se ha encontrado que este exceso de aminoácidos (por ejemplo aproximadamente 1.5) es suficiente para que la reacción de acoplamiento vaya hasta la terminación. Este exceso puede también ayudar a que la reacción tolere el exceso de base proveniente del reactivo de desprotección. Los pasos de acoplamiento, lavado, desprotección del grupo de protección N-terminal y lavado, pueden ser repetidos hasta que se forme el producto intermediario de T-20 deseado. Después de la síntesis en fase sólida, y con el fin de eliminar los péptidos intermediarios de T-20 de la resina, es llevado a cabo un tratamiento de escisión de una manera tal que los péptidos intermediarios de T-20 escindidos todavía tendrán suficientes grupos de cadena lateral y extremos. Dejar los grupos protectores en el sitio ayuda a prevenir el acoplamiento indeseable u otras reacciones indeseables de los fragmentos peptídicos durante o después de la escisión. En el caso cuando se utiliza FMOC o un producto químico similar, para sintetizar el péptido, la escisión protegida puede ser lograda de cualquier manera deseada, tal como mediante el uso de un reactivo de ácido relativamente débil tal como el ácido acético o TFA diluido en un solvente tal como DCM, el cual puede también hinchar la resina, siendo útil para el proceso de escisión y de separación. El uso de 0.5 y 10 por ciento en peso, preferentemente 1 a 3 por ciento en peso de TFA en DCM es preferido. Ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,281,335. Los pasos de escisión del fragmento intermediario peptídico a partir de la resina en fase sólida pueden proceder a lo largo de las líneas del proceso ejemplar como sigue. No obstante, cualquier proceso adecuado que rompa efectivamente el fragmento intermediario peptídico de la resina, puede ser utilizado. Por ejemplo, aproximadamente 5 a 20, preferentemente aproximadamente volúmenes de un solvente que contiene un reactivo de escisión ácido es agregado al recipiente. Las esferas de resina son sumergidas en el reactivo como una consecuencia. La reacción de escisión ocurre conforme los contenidos líquidos son agitados a una temperatura adecuada por un periodo de tiempo adecuado. La agitación ayuda a prevenir que las esferas se aglomeren.

Las condiciones adecuadas de tiempo y de temperatura dependerán de factores tales como el reactivo ácido que se utilice, la naturaleza del péptido, la naturaleza de la resina y similares. Como lineamientos generales, podría ser adecuada la agitación de aproximadamente -15°C hasta aproximadamente 5 C, preferentemente de aproximadamente -10°C hasta aproximadamente 0°C por aproximadamente 5 minutos hasta dos horas, preferentemente aproximadamente 25 minutos a aproximadamente 45 minutos. El tiempo de escisión puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente dos horas. Para la producción a gran escala, un tiempo preferido es en el intervalo de aproximadamente 15 a 50 minutos. La escisión es llevada a cabo de manera deseable en tal intervalo de temperatura fría para acomodar una exoterma de reacción que puede ocurrir típicamente durante la reacción. Además, una menor temperatura de la reacción de escisión previene que los grupos protectores de cadena lateral, sensibles al ácido, tales como los grupos trt, sean eliminados en esta etapa. Al final del tratamiento de escisión la reacción es apagada. Esto puede ser logrado, por ejemplo, mediante la adición de una base adecuada, tal como piridina o similar, al recipiente, y continuando la agitación por un periodo adicional tal como por 5 minutos a 2 horas adicionales, preferentemente aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos. La adición de la base y la agitación continua provoca que la temperatura de los contenidos de recipiente se incremente. Al final de la agitación, los contenidos del recipiente pueden estar a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 0°C a aproximadamente 15 °C, preferentemente aproximadamente 5°C a aproximadamente 10 °C. Los factores tales como el hinchamiento y el encogimiento de la resina, con el fin de mejorar los aspectos de la recuperación del péptido pueden ser opcionalmente incorporados en el proceso de síntesis general. Por ejemplo, después de la escisión el soporte puede ser opcionalmente lavado una o más veces con un reactivo de hinchamiento para extraer el péptido escindido hacia el o los lavados resultantes, y el o los lavados son recolectados para permitir la recuperación del péptido desde esos lavados. Por ejemplo, la escisión de un péptido desde una resina 2 -CTC utilizando TFA diluido en DCM, constituiría adicionalmente todo o una porción del tratamiento de hinchamiento. Después de la escisión y después de que se completa el tratamiento de hinchamiento, el soporte puede ser sometido a uno o más lavados de encogimiento opcionales que permiten que sean recuperadas cantidades adicionales de péptido de tales lavados de encogimiento, así como el mejoramiento de la habilidad para recuperar el péptido adicional de uno o más lavados de hinchamiento opcionales, subsiguientes. El o los lavados de hinchamiento opcionales, subsiguientes, que constituyen un tratamiento de hinchamiento adicional, pueden ser llevados a cabo después de que se completa el tratamiento de encogimiento. Debido a que puede ser utilizado un solvente de hinchamiento tal como DCM como un constituyente en el reactivo de escisión, el tratamiento de escisión puede también constituir un primer tratamiento de hinchamiento en el cual una cantidad significativa del péptido escindido será extraída hacia el líquido. Cuando se hinche con TFA en DCM, el volumen de las esferas tenderá a ser más grande al inicio de tratamiento de escisión. Las -esferas serán todavía hinchadas, pero su volumen disminuye, conforme es extraído el péptido hacia el líquido. Después del apagado, los contenidos de recipiente son vaciados y recolectados para recuperar el péptido extraído en el lavado. Puede ser utilizada presión para forzar la mezcla del líquido que contiene el material peptídico llevado por el líquido a través del filtro y fuera del recipiente. Las esferas que permanecen en el recipiente contendrán todavía DCM residual y serán todavía hinchadas en cierto grado. Una cantidad significativa del péptido residual también tiende a ser retenida en las esferas, y los tratamientos subsecuentes de encogimiento e hinchamiento ayudan a recuperar porciones significativas del péptido residual . Como una opción, puede ser deseable lavar el reactivo de escisión recolectado, con agua antes de la concentración vía la destilación o similar, usualmente después de que ha sido lograda cierta concentración. Se cree que el lavado con agua después de la escisión es útil para aumentar la calidad del péptido y, por lo tanto, en cierto grado el rendimiento. Por ejemplo el tiempo de contacto incrementado con el TFA y otros ingredientes en el reactivo de escisión puede deteriorar la calidad del péptido tal como mediante destritilación en His 6 y/o esterificación del péptido. Se cree que el lavado con agua es de auxilio en la eliminación del TFA residual y sus subproductos. Después del lavado con agua/tratamiento de extracción, la mezcla líquida puede ser transferida a un aparato de destilación, donde la mezcla es concentrada adicionalmente mediante eliminación, por ejemplo, del DCM o similar. Después de que se vacía la mezcla de escisión del recipiente y se recolecta para la recuperación del péptido, los contenidos del recipiente pueden ser sometidos a uno o más lavados de hinchamiento adicionales, en los cuales el péptido adicional puede ser extraído y luego recuperado. Estos lavados de hinchamiento adicionales también ayudan a lavar el recipiente y eliminar los reactivos de escisión residuales y los subproductos. Tales ingredientes son deseablemente removidos antes de proceder con un tratamiento de encogimiento de modo que el líquido de encogimiento no reaccionará con ellos. Por ejemplo, es deseable remover el TFA del recipiente antes de agregar un líquido de encogimiento que contiene etanol, ya que el etanol puede reaccionar con el TFA. Un tratamiento de lavado de hinchamiento típico puede ocurrir con agitación por un periodo de tiempo de aproximadamente 2 minutos a 2 horas, preferentemente de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 50 minutos. Después de que se realiza el lavado, el lavado es removido del recipiente y luego puede ser agregado al recipiente de destilación con los otros lavados de hinchamiento. Opcionalmente, antes de ser agregado al recipiente de destilación, estos lavados de hinchamiento adicionales si los hay, pueden ser sometidos a un tratamiento de extracción con agua para eliminar las impurezas . En algunos aspectos, los fragmentos peptídicos intermediarios pueden ser preparados para el acoplamiento en fase de solución mediante la realización del paso para aumentar su pureza, por ejemplo, mediante cristalización. Uno o más fragmentos intermediarios peptídicos de T-20 pueden ser tratados con una solución que contiene IPA, tal como una mezcla de IPA y DCM, o IPA y agua, para cristalizar los fragmentos intermediarios peptídicos.

Después de la síntesis en fase sólida, la escisión desde la resina, y cualquier lavado o purificación del intermediario peptídico, el fragmento intermediario peptídico que tiene la secuencia EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID No: 3) se hace reaccionar con un residuo de fenilalaninamida (F-NH ) , para producir un fragmento intermediario peptídico que tiene la secuencia EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No : 4) . Esta reacción en fase de solución puede ser realizada en una solución adecuada en fase de solución, como se describe en la presente. Este producto intermediario peptídico puede ser precipitado en un no solvente, por ejemplo, agua y lavado para mejorar la pureza. Los fragmentos intermediarios peptídicos protegidos en la cadena lateral de T-20 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID No: 2) y EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID 10 No: 4) son acoplados conjuntamente en solución para formar un péptido T-20 de longitud completa que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID No: 1). Estos fragmentos intermediarios peptídicos son acomodados químicamente, en donde el extremo N del fragmento intermediario peptídico EKNEQELLELDKWASLWNWF es acoplado al extremo C del fragmento peptídico Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ. Preferentemente, los péptidos son suministrados a la reacción de acoplamiento a un nivel de pureza de 80% o mayor, o más preferentemente 82.5% y más preferentemente 85% o mayor, con base en un perfil de HPLC. De acuerdo a los métodos de la invención, la síntesis en fase sólida utilizando un bajo factor de carga, es un aspecto significativo para la preparación de los fragmentos peptídicos intermediarios de T-20 que tienen un más alto nivel de pureza. Las reacciones de acoplamiento de péptido son realizadas en, por ejemplo, New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal ; Dodsworth, David J. ; y Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203- 25 303. El acoplamiento de los fragmentos intermediarios peptídicos puede ser llevado a cabo utilizando reactivos de acoplamiento in situ, por ejemplo, BOP, hexafluorofosfato de o- (benzotriazol-1-il) -N,N,N7N' -tetrametiluronio (HBTU), HATU, diciclohexilcarbodiimida (DCC) , carbodiimida soluble en agua (WSCDI) , o tetrafluoroborato de o- (benzotriazol-1-il) -N,N,N7N' -tetrametiluronio (TBTU). Otras técnicas de acoplamiento utilizan esteres activos preformados tales como los esteres de hidroxisuccinimida (HOSu) y de p-nitrofenol (HONp) ; anhídridos simétricos preformados; N-carboxíanhídridos (NCAs) ; o haluros de ácido tales como fluoruro de acilo, así como cloruro de acilo. Un solvente de acoplamiento adecuado puede ser utilizado en la reacción de acoplamiento. Se entiende que el o los solventes de acoplamiento utilizados pueden afectar el grado de racemización del enlace peptídico formado; la solubilidad del péptido y/o los fragmentos peptídicos; y la velocidad de reacción de acoplamiento. En algunas modalidades la reacción de acoplamiento incluye uno o varios solventes miscibles en agua. los ejemplos de solventes miscibles en agua incluyen, por ejemplo, DMSO, piridina, cloroformo, dioxano tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona, dimetilformamida, dioxano o mezclas de los mismos. En otras modalidades, la reacción de acoplamiento incluye un solvente no miscible en agua. Un solvente no miscible en agua ejemplar es el cloruro de metileno. En estas modalidades, el solvente no miscible en agua es preferentemente compatible con la reacción de desprotección; por ejemplo, si se utiliza un solvente no miscible en agua preferentemente éste no afecta de manera adversa la reacción de desprotección. Después de que han sido acoplados los fragmentos intermediarios peptídicos para producir un péptido T-20, el producto puede ser sometido a un paso de desprotección para eliminar los grupos protectores de cadena lateral. La eliminación de los grupos protectores de cadena lateral mediante desprotección global utiliza típicamente una solución de desprotección que incluye un agente acidolítico para escindir los grupos protectores de cadena lateral. Los reactivos acidolíticos comúnmente utilizados para la desprotección global incluyen ácido trifluoroacético puro (TFA), HCl, ácidos de Lewis tales como BF3Et20 o Me3SiBr, ácido fluorhídrico líquido (HF) , bromuro de hidrógeno (HBr) , ácido trifluorometansulfúrico y combinaciones de los mismos. La solución de desprotección también incluye uno o más depuradores de cationes adecuados, por ejemplo, ditiotreitol, anisol, p-cresol, etanoditiol o sulfuro de dimetilo. La solución de desprotección puede también incluir agua. Como se utiliza en la presente, las cantidades de reactivos presentes en la composición de desprotección son típicamente expresados en una proporción, en donde la cantidad de un componente individual es expresada como un numerador en "partes", tal como "partes en peso" o "partes en volumen" y el denominador son las partes totales en la composición. Por ejemplo, la solución de desprotección que contiene TFA:H20:DTT en una proporción de 90:5:5 (peso/peso/peso) tiene TFA a 90/100 partes en peso, H20 a 5/100 partes en peso, y DTT a 5/100 partes en peso. En algunas modalidades, la reacción de desprotección puede ser realizada en donde la cantidad del agente acidolítico, preferentemente TFA, en la composición de desprotección es mayor de 90 a 100/partes en peso. Otras composiciones de desprotección preferidas incluyen una cantidad de agente acidolítico en una cantidad de 93/100 partes en peso o mayor, o en una cantidad en el intervalo de 93/100 partes en peso a 95/100 partes en peso. Después de que el péptido T-20 ha sido desprotegido, y está en una forma final, opcionalmente el lote del péptido puede ser sometido a un procedimiento que desagrega el péptido agregado que pueda estar presente en esta etapa en el esquema sintético general . La desagregación puede ser realizada mediante la disolución de muestras peptídicas en base acuosa y luego acidificando la mezcla acuosa para precipitar el péptido en presencia de al menos uno de una sal, un co-solvente. Preferentemente, una sal y un co-solvente están presentes en la solución de desagregación. La desagregación puede ser llevada a cabo mediante precipitación del péptido de manera relativamente rápida (al menos en una primera etapa de acidificación en la cual el pH del medio alcalino es reducido a pH en el intervalo de 6 a 7.5, después de lo cual puede ocurrir más lentamente la acidificación hasta un pH final deseado por ejemplo de 3 a 6) a temperatura relativamente baj a . Para la desagregación, la solución acuosa, amortiguada, alcalina es en general derivada de ingredientes que comprenden agua, al menos una sal y una cantidad suficiente de al menos una base para proporcionar el pH de disolución deseado. El péptido T-20 y diversos ingredientes que constituyen la solución acuosa, amortiguada, alcalina pueden ser combinados en cualquier orden. En un modo de práctica, la solución es preparada a partir de sus ingredientes constituyentes y luego el péptido es agregado a la solución ya preparada. En otro modo de práctica, el péptido puede ser agregado a una solución acuosa que comprende la sal, en donde la solución tiene un pH que es demasiado bajo para que ocurra la disolución. Es luego agregada una base a esta mezcla con el fin de elevar el pH hasta un valor en el cual ocurrirá la disolución. Como otra alternativa más, la sal puede ser agregada a la solución antes de, durante y/o después de la disolución. En general, no obstante, la sal es incorporada en una solución antes de que el pH sea disminuido de una manera para provocar que el péptido precipite como se describe más adelante. La concentración del péptido en la solución puede variar en un amplio intervalo. Como lineamientos generales, la concentración del péptido T-20 en la solución puede estar en el intervalo de aproximadamente 3 g/litro hasta aproximadamente 6 g /litro. Pueden ser incorporadas una variedad de una o más bases en la solución para proporcionar el pH deseado. Los ejemplos representativos de bases adecuadas incluyen bases de hidróxido tales como NaOH y bases de bicarbonato y carbonato, tales como bicarbonato de sodio o de potasio o carbonato de sodio o de potasio. El hidróxido de sodio es preferido, especialmente 0.5 N a 1 N de hidróxido de sodio. La base es utilizada para ajustar el pH hasta un valor deseado en el cual el péptido se disolverá en la solución en una cantidad de tiempo razonable. Para muchos péptidos esto corresponde a una disolución del pH en el intervalo de aproximadamente 8 a aproximadamente 11. El o los constituyentes salinos de la solución mejoran las características de disolución del péptido precipitado resultante. Específicamente, un péptido soluble que se disuelve fácilmente en solución acuosa a menor pH es preparado más consistentemente cuando una sal está presente a una concentración apropiada. Podría ser útil una variedad de sales en la práctica de la presente invención. Los ejemplos incluyen carbonato de sodio, acetato de sodio, carbonato de amonio, acetato de amonio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de amonio, las versiones de sodio y potasio de éstos, combinaciones de éstos y similares. El acetato de amonio es el más preferido. La concentración de la sal en la solución puede variar en un amplio intervalo. El uso de 1 a 200 mM equivalentes de la sal es un ejemplo de un intervalo de concentración salina que podría ser adecuado. En un modo específico de práctica, ha sido encontrado como adecuado el uso de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, más preferentemente aproximadamente 10 mM de equivalentes de sal, especialmente acetato de amonio. La o las temperaturas de disolución se refieren en general a la o a las temperaturas de la solución acuosa en la cual se disuelve el péptido. La disolución puede ocurrir a cualquier temperatura adecuada. En general, la disolución del péptido en una solución mantenida a una o más temperaturas en un intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 30°C, preferentemente aproximadamente 10°C a aproximadamente 25°C, más preferentemente aproximadamente 15°C a aproximadamente 20°C podría ser preferible. Un co-solvente es preferentemente incorporado en la solución, de modo que la precipitación subsiguiente de péptido ocurre en presencia del co-solvente. El co-solvente puede ser agregado a la solución antes de, durante y/o después de la disolución, pero preferentemente es agregado prontamente después de la disolución del péptido. El co-solvente se refiere a uno o más solventes adicionales en los cuales el péptido es soluble al pH de disolución. Preferentemente, el péptido es también soluble en el co-solvente a 25°C y pH fisiológico, cuando el péptido es suficientemente desagregado de modo que la proporción del peso molecular medido del péptido al peso molecular teórico del péptido está en el intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:1. Los ejemplos de co-solventes incluyen acetonitrilo, metanol, combinaciones de éstos, y similares. En modalidades preferidas de la invención, es agregada una cantidad suficiente de co-solvente a la solución, tal que la solución contiene de aproximadamente 2 a 50 por ciento en volumen, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 por ciento en volumen, y más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento en volumen del co-solvente. Después de la disolución, y de manera deseable después de la adición del co-solvente, el pH de la solución es opcionalmente incrementado por la adición de base adicional, con el fin de facilitar la desagregación posterior del péptido, si se desea. La solución es luego de manera deseable prontamente filtrada. La filtración a presión a través de un filtro a 0.2 micrómetros sería adecuada. El filtrado es opcionalmente desgasificado a vacío, después de lo cual la solución puede ser madurada por un periodo de tiempo adecuado antes del procesamiento adicional, con el fin de completar el proceso de desagregación. En general, la maduración de modo que el tiempo total de ese péptido está al pH elevado (incluyendo no solo el tiempo de maduración, sino el tiempo de filtración, el tiempo de desgasificación, etc.) está en el intervalo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 6 horas, más preferentemente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas. Después de la maduración, la solución puede ser opcionalmente nuevamente filtrada. Después de la maduración, el pH de la solución es reducido, por ejemplo, acidificado, bajo condiciones efectivas para provocar que el péptido se precipite. Como lineamientos generales, un pH final en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6, preferentemente 4 a aproximadamente 6 podría ser adecuado. El pH de la solución es disminuido preferentemente por la adición de uno o más ácidos a la solución. Los ejemplos de ácidos incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido oxálico, combinaciones de éstos y similares. El ácido acético es preferido. Por ejemplo, una solución acuosa al 5% o 10% de ácido acético ha sido encontrada como adecuada. En algunas modalidades de práctica, el producto peptídico con excelentes propiedades de disolución puede todavía ser obtenido si es agregado ácido de manera relativamente rápida para disminuir el pH únicamente hasta un pH intermedio. Después de esta adición relativamente rápida del ácido, el ácido es agregado a una segunda velocidad relativamente más lenta para disminuir el pH de la solución hasta el pH final deseado. Los valores de pH intermedios adecuados podrían estar en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, más preferentemente de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.5. De manera deseable, la disminución rápida inicial del pH ocurre en un periodo de tiempo de aproximadamente una hora, 30 minutos o menos, más preferentemente 15 minutos o menos. Por ejemplo, un modo adecuado de práctica involucra la disminución del pH hasta una solución de T-20 inicialmente a un pH de 11. Una cantidad suficiente de ácido es agregada de manera relativamente rápida en un periodo de 10 minutos para disminuir el pH hasta un valor intermedio de aproximadamente 6.0. Luego, es agregado ácido más lentamente en 10 a 20 minutos para disminuir el pH a 5.3-5.5. La mezcla es deseablemente mezclada bien durante el curso de la adición del ácido para provocar la precipitación del péptido. Como lineamientos generales, se prefiere agitar la mezcla mientras que se agrega el ácido tan vigorosamente como sea práctico, mientras que se deja un margen de seguridad suficiente para evitar la formación de espuma en la mezcla. La adición de ácido para provocar la precipitación del péptido puede ser llevada a cabo con la solución a cualquier temperatura adecuada. Como lineamientos, llevar a cabo la precipitación a una temperatura en el intervalo de 10°C a 30°C, preferentemente 15°C a 25°C, lo más preferentemente 16°C a 18°C, sería adecuado. Después de la precipitación, el péptido es deseablemente aislado y secado antes de ser combinado con otros ingredientes, liofilizado, empaquetado, almacenado, adicionalmente procesado y/o de otro modo manejado. Esto puede ser logrado de cualquier manera adecuada. De acuerdo a un procedimiento adecuado, el péptido es recolectado vía la filtración, lavado con agua ampliamente para reducir el contenido de sal final hasta un nivel adecuado, y luego secado. Si el precipitado peptídico está en una forma no adecuada para la filtración (por ejemplo si el precipitado está en "forma de gel") el precipitado puede ser sometido a un proceso de maduración con agitación deseable en el cual las partículas peptídicas son aglomeradas para "endurecer" las partículas. En una modalidad preferida de práctica, este tratamiento de endurecimiento por maduración involucra la maduración del péptido con agitación en el curso de un tratamiento de enfriamiento/calentamiento/enfriamiento. Esto mejora las características de filtración del péptido sin daño indebido de la estructura terciaria del péptido. En una modalidad específica de práctica, el tratamiento involucró la maduración de las partículas en mezcla acuosa por 5 minutos a 48 horas, preferentemente 30 minutos a 8 horas, más preferentemente 30 minutos a 2 horas a una primera temperatura por debajo de la temperatura ambiente, que preferentemente está en el intervalo de más de 0°C hasta aproximadamente 20°C, preferentemente 10°C hasta aproximadamente 20°C, más preferentemente aproximadamente 16°C. La agitación es utilizada de manera deseable para asegurar que las partículas estén bien dispersas durante la maduración. Enseguida, la temperatura de la mezcla es incrementada por aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 30°C, preferentemente aproximadamente 5°C a aproximadamente 15°C a una temperatura moderadamente más caliente, en donde la transición de la temperatura más caliente ocurre con agitación en un periodo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 48 horas, preferentemente 5 minutos a 8 horas, más preferentemente 20 minutos a 2 horas. Preferentemente, la nueva temperatura moderadamente más caliente está todavía a la temperatura ambiente o menor. En una modalidad específica de práctica, el incremento de la temperatura desde 16°C hasta 21°C en aproximadamente una hora, fue encontrado como adecuado. La agitación continua de manera deseable durante esta transición. La mezcla es luego madurada a la temperatura más caliente por un periodo de 5 minutos a 8 horas, preferentemente 20 minutos a 4 horas, más preferentemente a aproximadamente 3 horas con agitación.

Después de este paso de maduración, la temperatura de la mezcla es disminuida por aproximadamente 2°C a aproximadamente 30°C, preferentemente aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 15 °C a una temperatura moderadamente más fría, en donde la transición de la temperatura más fría ocurre preferentemente con agitación en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 48 horas, preferentemente 5 minutos a 8 horas, más preferentemente 20 minutos a 4 horas. Preferentemente, la nueva temperatura moderadamente más fría está en el intervalo por arriba de aproximadamente 3°C hasta aproximadamente 18 °C, más preferentemente aproximadamente 10 °C. En un modo específico de práctica, se encontró que es adecuada la disminución de la temperatura desde 21°C hasta 10°C en aproximadamente 2 horas. La mezcla es luego adicionalmente madurada a una temperatura más fría preferentemente por un periodo de aproximadamente 5 minutos a 48 horas, más preferentemente aproximadamente 6 horas . Este tratamiento de maduración mejora las características de filtración de las partículas precipitadas ya que la filtración y la separación de las partículas peptídicas a partir del filtrado, ocurre más fácilmente sin cambio indebido de la estructura secundaria del péptido. De este modo, después de la maduración, el precipitado es filtrado, preferentemente filtrado a presión tal como con 0.0703 kg/cm2 (1 psig) de N2. La torta de filtro puede ser lavada una o más veces con agua deseablemente pre-enfriada, tal como a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 3°C hasta aproximadamente 20 °C, preferentemente4 5°C hasta aproximadamente 15°C, más preferentemente aproximadamente 10°C. Esto ayuda a disminuir el contenido de sal de la torta. Esta torta de filtro puede ser parcial o completamente secada, tal como mediante el paso de nitrógeno a través de la torta con nitrógeno a una temperatura adecuada, por un periodo de tiempo adecuado, tal como un minuto a 48 horas, preferentemente 5 minutos a 8 horas, más preferentemente aproximadamente 6 horas. El uso de nitrógeno que está aproximadamente a la temperatura ambiente, es conveniente y adecuado. La torta puede ser periódicamente mezclada para facilitar el secado. El secado puede ser completado opcionalmente en un aparato de secado separado. Tal secado opcional ocurre preferentemente a vacío, por ejemplo a menos de 30 mm Hg, a una temperatura moderada para no degradar el péptido, por ejemplo a una temperatura menor de aproximadamente 30°C, preferentemente menor de aproximadamente 28°C. Los principios de la presente invención serán ahora adicionalmente ilustrados con respecto a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplos Para los siguientes ejemplos, son adoptados los siguientes reactivos estándares y nomenclaturas: Prueba de cloranilo: La solución de prueba de cloranilo fue preparada mediante la adición de una gota de una solución saturada de cloranilo en tolueno a aproximadamente 1 ml de acetona. Los lavados de NMP fueron probados mediante la adición de una gota de lavado a la solución de prueba de cloranilo. Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de la amina secundaria, indicando que los subproductos desprotegidos de Fmoc y/o la piperidina residual, están todavía presentes. Prueba de ninhidrina (Keiser) : En la prueba de ninhidrina cualitativa, fue retirada una muestra de 2 a 20 mg de la resina y se lavó con NMP y subsecuentemente con DCM o metanol. Tres gotas de una solución a 76% de fenol en etanol, seis gotas de una solución de KCN 0.2 mM en piridina, y tres gotas de una solución 0.28 M de ninhidrina en etanol, se agregaron a la muestra, y la muestra fue colocada en un bloque de calentamiento aproximadamente a 100 °C por aproximadamente 5 minutos. La muestra fue retirada e inmediatamente diluida con una solución de etanol/agua (9:1) . Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de aminas libres, incluyendo que la reacción de acoplamiento no está todavía completa. Si fue observada una prueba de ninhidrina positiva después de una hora de reacción de acoplamiento, la reacción de acoplamiento fue continuada por una hora adicional. Si una prueba de ninhidrina positiva ocurrió después de 3 horas de reacción de acoplamiento, el recipiente fue drenado, y el acoplamiento fue repetido utilizando aproximadamente un equivalente de aminoácido activado y reactivos.

Ejemplo 1 Síntesis en Fase sólida del Fragmento intermediario Ac-AA(1- 16)0H de T-20 (SEQ ID NO:2) Fue realizada la síntesis en fase sólida para generar Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu- Ile-His-Ser-Leu- Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-O-2-CTC Resina [Fragmento Ac-AA (1-16) 0-2 -CTC-Resina] . Fmoc-Gln(OtBu) -0-2-CTC resina (20.0 g) se cargó a un reactor de síntesis en fase sólida junto con 240 ml of DCM. La mezcla se agitó por 30 minutos a 25°C. La cámara se drenó y el lecho de la resina se lavó tres veces con 120 ml de NMP. (Para todos los lavados la cantidad de líquido utilizado es la cantidad de líquido por lavado.) Al reactor se cargaron 120 ml de piperidina al 5% en NMP que fue luego agitada a 30±2°C por 30 minutos. El reactor se drenó y luego cargado con 100 ml de piperidina al 5% en NMP. La mezcla se agitó por 30 minutos a 30+3 °C y el reactor se drenó. La mezcla se lavó luego tres veces con 120 ml NMP. El último lavado se muestreó luego para los niveles de piperidina mediante la prueba cualitativa de ninhidrina; se realizó un cuarto lavado de modo que los niveles de piperidina estuvieron a 3500 ppm o superiores. El orden del acoplamiento procedió del residuo #15 al residuo #1: Q?Q?N?Q?S?E?E?I?L?S-H?I?L?S?T?Y . El acoplamiento se realizó mediante la adición de 1.5 equivalentes del aminoácido apropiado, 1.5 equivalentes de HOBt hidratado, y 90 ml de NMP. Los contenidos fueron agitados para disolver los sólidos y luego se agregaron 1.7 equivalentes de DIEA. Después de que la solución estuvo homogénea ésta fue enfriada a 0-5°C en un baño de hielo en 15 minutos. Enseguida, se agregó una solución de 1.5 equivalentes de HBTU en 54 ml de NMP a la solución de amino ácido enfriada, seguida por 48 ml de DCM. La solución de aminoácidos activada fue luego agregada al reactor que contenía la resina. La mezcla se agitó a 30+3 °C por 3 horas. Las esferas de resina fueron luego muestreadas para la terminación de la, reacción por una Prueba de Keiser. Después de que se completó la reacción, el reactor se drenó y el lecho de la resina lavado con 120 ml NMP. Los pasos de desprotección y acoplamiento utilizando el aminoácido apropiado fueron secuencialmente realizados para generar Ac-AA (1-16) O-2-CTC-Resina .

Enseguida, se preparó una solución de 5 equivalentes de anhídrido acético en 120 ml NMP. Se agregaron 5 equivalentes de DIEA a la solución. La solución de anhídrido acético fue agregada al reactor y la mezcla fue luego agitada a 30+3°C por 1-3 horas. Las esferas de resina fueron luego muestreadas para la terminación de la reacción por la Prueba de Keiser.

Ej emplo 2 Escisión y purificación de Ac-AA(l-lß) OH a partir de la resina en fase sólida Fue realizada la escisión del péptido Ac-AA (1-16) OH naciente a partir de la resina CTC, como se preparó en el Ejemplo 2. Con el fin de escindir el péptido de la resina, la resina acoplada al péptido (como se preparó en el Ejemplo 1) lavada tres veces con 100 ml de NMP, fue seguida por cinco lavados con 200 ml de DCM. Para el último lavado con NMP, el reactor fue enfriada a -5°C. Enseguida, se agregó una solución de 4 ml de ácido trifluoroacético y 196 ml de DCM, y se enfrió a -10°C, y se agregó al reactor y se agitó por 30 minutos a 0±5°C. Enseguida, se agregaron 1.2 equivalentes de piridina (4.8 ml) y la resina se calentó a 5°C y la solución de escisión fue agregada a 100 ml de agua con filtración. La resina se lavó con 100 ml de DCM que se combinó con DCM/agua. El DCM/agua fue agitado por 15 minutos, las capas se separaron, y el DCM fue lavado con 100 ml de agua. Después de que el segundo lavado con agua había sido separado de la capa de DCM, el DCM fue depurado bajo presión reducida hasta que aproximadamente 200 ml de destilado habían sido recolectados. Se agregaron luego 100 ml de agua al DCM. La resina fue lavada dos veces con DCM y los lavados se combinaron con la mezcla de DCM/agua. La mezcla fue agitada con 30 minutos y las capas se separaron. La capa acuosa fue luego nuevamente extraída con 100 ml de DCM. Todos los lavados con DCM fueron combinados . La solución de DCM/fragmento fue depurada bajo presión reducida hasta que permanecieron aproximadamente 80 ml de la solución. La solución de DCM fue agregada en cuatro porciones a 375 ml de heptano. Después de cada adición de la solución de DCM/fragmento, la mezcla fue depurada hasta que se recolectaron aproximadamente 40 ml del destilado. Después de toda la solución de DCM había sido transferida, se agregaron nuevamente 80 ml de heptano adiconal junto con 20 g de DCM, utilizados para enjuagar el recipiente. La suspensión de heptano/DCM fue filtrada y lavada con 24 ml de heptano. Después de que completó el lavado, el fragmento fue secado a vacío.

Ej emplo 3 Preparación de FmocTrp (Boc) -cargado 2-Resina CTC Un reactor de péptido de 5 litros fue purgado con nitrógeno y luego se cargó con 200 g de resina 2 -CTC y 2 litros de DCM. La mezcla de resina-DCM fue agitada a 25±2°C por 30 minutos. Mientras tanto, se cargaron a un matraz de 2 litros 51.8 g Fmoc-Trp (Boc) OH, 1.4 L DMF, 200 ml DCM, y 26.66 g de DIEA. Los contenidos del matraz fueron agitados a temperatura ambiente para disolver los sólidos. Después de que se drenó el DCM del reactor, la mezcla que contenía Fmoc-Trp (Boc) OH fue cargada al reactor con la resina, y se agitó por 2 horas bajo atmósfera de nitrógeno a 25±2°C. Después de 2 horas el reactor fue drenado . Los sitios activos sobre la resina fueron encasquetados en el extremo con una mezcla de DIEA:MeOH (200:1800 ml). Esta mezcla fue luego agitada a 25±2°C por una hora. El lecho fue drenado, lavado una vez con 2 litros de DMF una vez con 1 litro de DMF y cuatro veces con 2 litros de DCM. El último lavado con 2 litros de DCM demostró una prueba de UV negativa . La resina fue luego lavada tres veces con 2 litros de N-metil-pirrolidona (NMP) y luego se trató con 2.75 litros de piperidina al 20% en NMP, con agitación a 28±2°C por 30 minutos. El reactor fue luego drenado y se repitió el paso de tratamiento con piperidina. El lecho fue drenado y lavado cinco veces con 3 litros de NMP, y luego cinco veces con 3 litros de DMF. La resina fue des-hinchada mediante lavado con 3 porciones de 1.5 litros de IPA. La resina fue secada a vacío hasta un peso constante a 40±2°C para dar 220.06 g de la resina cargada. El análisis de HPLC cuantitativo fue realizado mediante la escisión del aminoácido de la resina, y la evaluación versus un estándar. El ensayo de HPLC del material mostró una carga de la resina a 0.37 mmol/g.

Columna : Betabasic-18 , 150 x 4.6 mm, tamaño de partícula 3 µm, tamaño de poro 150 Á Velocidad de flujo: 1.25 ml/ml Detección: UV a 260 nM Fase móvil : A: 10 nM TEAP en agua B: acetonitrilo Tiempo de retención: aproximadamente 13 minutos.

Ejemplo 4 Síntesis en Fase Sólida del Fragmento intermediario F oc- AA(17-35) (SEQ ID NO:2) de T-20 La síntesis en fase sólida para generar Fmoc-Glu- Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu- Leu-As -Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-O-2-CTC Resina [Fragmento Fmoc-AA(17-35) 0-2-Resina CTC] fue realizada. El H-Trp (Boc) -0-2-resina CTC (10.15 g; como se preparó en el Ejemplo 3) y 122 ml de DCM se combinaron en una cámara de reacción en fase sólida. La mezcla fue agitada por 30 minutos a 30±3°C. El reactor fue luego drenado, el lecho de resina fue lavado tres veces con 61 ml de NMP. (Para todos los lavados la cantidad de líquido utilizado es la cantidad de líquido por lavado.) El orden del acoplamiento procedió desde el residuo #34 hasta el residuo #18 (con referencia la numeración de aminoácidos de la secuencia T-20 madura) : W-?N?W-?L?S?A?W?K? D?L?E?L-?L?E?Q?E?N?K?E) . (Residuo #34) Enseguida, se combinaron 7.24 g de Fmoc-Asn(Trt) OH, 1.86 g de HOBT monohidratado, 1.79 g de DIEA y 25.1 ml de NMP en un matraz, y los contenidos se agitaron a temperatura ambiente para disolver los sólidos, y la solución se enfrió luego a 10°C. Enseguida, en un matraz separado se combinaron 4.58 g de HBTU y 15 ml de NMP, se agitaron a temperatura ambiente para disolver los sólidos, y se enfriaron a 10°C. La solución enfriada de HBTU fue agregada a la solución de Fmoc-Asn(Trt)OH y esta solución se cargó al reactor SPPS . El matraz se lavó con 13 ml de DCM y el lavado se cargó al Reactor SPPS . La mezcla se agitó luego a 30±3°C por 3 horas. Las esferas de resina fueron luego muestreadas para la terminación de la reacción (Prueba de Keiser) . Una vez que se completó la reacción, el reactor se drenó y el lecho de la resina se lavó cuatro veces con 120 ml de NMP. Enseguida, se cargaron 61 ml de piperidina al 20% en NMP al reactor y se agitaron a 30±3°C por 30 minutos. El reactor se drenó y se agregaron al reactor 61 ml de piperidina al 20% en NMP. La mezcla se agitó luego a 30+3 °C por 30 minutos y el reactor se drenó. El lecho de la resina se lavó luego cinco veces con 61 ml de NMP. El último lavado fue muestreado para los niveles de piperidina mediante la prueba de ninhidrina cualitativa. (Residuo #33) Enseguida, se cargaron a un matraz 6.39 g de Fmoc-Trp (Boc) OH, 1.87 g de HOBT monohidratado, 1.82 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.60 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso con la excepción de que el lecho de la resina se lavó seis veces con 61 ml de NMP.

(Residuo #32) Enseguida, se cargaron a un matraz 4.27 g de Fmoc-Leu-OH, 1.86 g de HOBT monohidratado, 1.83 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.60 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #31) Enseguida, se cargaron a un matraz 4.65 g de Fmoc-Ser (tBu) -OH, 1.86 g de HOBT monohidratado, 1.81 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.60 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #30) Enseguida, se cargaron a un matraz 4.00 g de Fmoc-Ala-OH, 1.87 g de HOBT monohidratado, 1.78 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.59 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #29) Enseguida, se cargaron a un matraz 6.39 g de Fmoc-Trp (Boc) -OH, 1.86 g de HOBT monohidratado, 1.78 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.59 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #28) Enseguida, se cargaron a un matraz 5.71 g de Fmoc-Lys (Boc) -OH, 1.86 g de HOBT monohidratado, 1.81 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.58 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso con la excepción de que el lecho de la resina se lavó seis veces con 61 ml de NMP. (Residuo #27) Enseguida, se cargaron a un matraz 4.98 g de Fmoc-Trp (OtBu) -OH, 1.92 g de HOBT monohidratado, 1.78 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.58 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #26) Enseguida, se cargaron a un matraz 4.27 g de Fmoc-Leu-OH, 1.86 g de HOBT monohidratado, 1.80 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.59 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #25) Enseguida, se cargaron a un matraz 5.15 g de Fmoc-Glu(OtBu) -OH, 1.88 g de HOBT monohidratado, 1.80 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.58 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #24) Enseguida, se cargaron a un matraz 4.28 g de Fmoc-Leu-OH, 1.88 g de HOBT monohidratado, 1.77 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.59 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso.

(Residuo #23) Enseguida, se cargaron a un matraz 4.29 g de Fmoc-Leu-OH, 1.88 g de HOBT monohidratado, 1.77 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.60 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso con la excepción de que el lecho de la resina se lavó seis veces con 61 ml de NMP. (Residuo #22) Enseguida, se cargaron a un matraz 5.16 g de Fmoc-Glu (OtBu) -OH, 1.88 g de HOBT monohidratado, 1.76 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 4.59 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #21) Enseguida, se cargaron a un matraz 8.38 g de Fmoc-Gln (trt) -OH, 2.13 g de HOBT monohidratado, 2.01 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 5.22 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. La Prueba de Keiser mostró una reacción incompleta. El re-acoplamiento se realizó mediante el drenado del reactor, y el re-acoplamiento utilizando el 50% de los reactivos por 1.5 horas. Una vez que se completó la reacción, el reactor se drenó y el lecho de la resina lavado cuatro veces con 120 ml de NMP. Una vez que se completó la reacción de acoplamiento, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #20) Enseguida, se cargaron a un matraz 5.84 g de Fmoc-Glu (OtBu) -OH, 2.15 g de HOBT monohidratado, 2.05 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 5.21 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso.

(Residuo #19) Enseguida, se cargaron a un matraz 8.44 g de Fmoc-Asn (Trt) -OH, 2.18 g de HOBT monohidratado, 2.09 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 5.36 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron, y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, se lavó y se probó como se indica en el primer paso. (Residuo #18) Enseguida, se cargaron a un matraz 6.43 g de Fmoc-Lys (Boc) -OH, 2.11 g de HOBT monohidratado, 2.09 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 5.20 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron y se lavaron como se indica en el primer paso. Una vez que se completó la reacción, el reactor se drenó y la resina lavada tres veces con 101.5 ml de NMP. Una vez que la reacción de acoplamiento se completó, la resina fue tratada con la solución de piperidina, lavada, y probada como se indica en el primer paso. (Residuo #17) Enseguida, se cargaron a un matraz 3.18 g de Fmoc-Glu (OtBu) -OH, 1.28 g de HOBT monohidratado, 1.11 g de DIEA y 25.1 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron y se enfriaron como se indica en el primer paso. En un matraz separado se combinaron 2.38 g de HBTU y 15 ml de NMP. Los contenidos se disolvieron, se enfriaron, se mezclaron con la resina, se acoplaron, se probaron y se lavaron como se indica en el primer paso. El lecho de la resina se lavó luego cinco veces con 120 ml de DCM y cuatro veces con 120 ml de isopropanol. La resina se secó a vacío a 40+2 °C y tuvo un rendimiento de 20.77 g.

Ejemplo 5 Escisión y purificación de Fmoc-AA(17-35) (SEQ ID NO: 3) a partir de la resina en fase sólida La escisión del péptido Fmoc-AA(17-35) a partir de la resina CTC, como se preparó en el Ejemplo 4, fue realizada . Con el fin de escindir el péptido de la resina, 20.76 g de la resina acoplada al péptido se combinaron con 208 ml de DCM en el reactor. La resina y DCM fueron agitados a temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos . El reactor fue luego drenado y el lavado con DCM fue repetido dos veces más con 137 ml de DCM. (Para todos los lavados la cantidad de líquido utilizado es la cantidad de líquido por lavado.) El reactor fue luego enfriado a -10+5°C.

Enseguida, se preparó una solución de 2.81 g de ácido trifluoroacético y 201 ml de DCM y se enfrió a 0+5°C. La solución de TFA enfriada fue luego cargada al reactor y la suspensión fue agitada por 30 minutos a 0+5°C. Enseguida, se agregaron 2.81 g de piridina al reactor, y se agitaron por 15 minutos adicionales a 0±5°C. El reactor fue luego drenado y el lecho de la resina lavado siete veces con 137 ml de DCM a temperatura ambiente. Los lavados combinados de DCM fueron lavados con 137 ml de agua y el DCM fue destilado a vacío hasta sequedad. El residuo se disolvió luego en 35 ml de DCM. Enseguida, se agregaron 137 ml de isopropanol, seguido por la concentración a vacío hasta aproximadamente un volumen de 75 ml , enfriando a 10 °C y luego se agregaron 100 ml de agua. La suspensión se enfrió luego a 0°C y se maduró por 1 hora. El producto se filtró y se lavó con 25 ml de agua a 5°C. El producto se secó a vacío a 40±2°C rendimiento 12.9 g (69.1%) de producto.

Ejemplo 6 Síntesis en fase de solución de H-AA (17-36) H2 (SEQ ID N0:4) Se preparó un fragmento intermediario H-AA (17-36)NH2 de T-20 mediante el acoplamiento en fase de solución de PheNH2 a Fmoc-AA(17-35) OH.

Fmoc-AA(17-35) OH (12.0 g, 2.83 mmol, 1.0 eq . ) , PheNH2.HCl (0.74 g, 3.68 mmol, 1.3 eq.), 6-cloro-HOBT (0.96 g, 5.66 mmol, 2.0 eq . ) se disolvieron en DMF (100 ml , 8.3 vol.) . La solución se enfrió a -10°C y se agregó DIEA (1.4 ml, 7.92 mmol, 2.8 eq.) en DMF (5 ml , 3.6 vol.). Se agregó TBTU (1.2 g, 3.68 mmol, 1.3 eq.) en una porción seguido por un enjuague con 15 ml de DMF. La mezcla de reacción se agitó a -10°C toda la noche y se calentó a temperatura ambiente. La agitación continuó por 4 horas adicionales . La terminación de la reacción fue monitorizada mediante análisis de HPLC que mostró 0.4% de Fmoc-AA (17-35 ) OH inicial, remanente. Se agregó piperidina (1.23 ml , 14.43 mmol, 5.1 eq.) y la solución se agitó a 30°C por 3 horas. La terminación de la eliminación de Fmoc fue monitorizada mediante análisis de HPLC que mostró <1% de Fmoc-AA ( 17 - 36 ) NH2. Se agregó agua (100 ml , 8.3 vol.) para precipitar el producto. El sólido se recolectó mediante filtración por succión, y se lavó con agua. El secado toda la noche a temperatura ambiente proporcionó 11.85 g de (101%, % AN HPLC) . H-AA(17-36)NH2 (11.85 g) se suspendió en 1: EtOH:agua (200 ml , 17 vol.) . La suspensión se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. La filtración por succión y el secado, hasta un peso constante proporcionó 11.6 g (98.9% de rendimientos para ambos pasos) con una pureza de 80.0% (AN HPLC).

Condiciones de HPLC: Columna: Zorbax-ACE, 3µm, C18, 3.0 x 100 mm Detector: UV a 220 nm Velocidad de flujo: 0.6 ml/minutos Fase móvil: A=O.10% TFA/Agua/40% IPA B=0.07% de TFA/acetonitrilo/40% IPA Gradiente: 0 minutos 70% B, 8 minutos 80% B, 15-16 min 90% B, 16.1-20 min 70% B Tiempo de retención: aproximadamente 8 minutos Ejemplo 7 Síntesis en fase de solución de Ac-AA ( 1-36 ) NH2 (SEQ ID NO:l) Se prepara un producto final de T-20 mediante el acoplamiento en fase de solución de Ac-AA ( I - 16) OH con H-AA(17-36)NH2 para producir el fragmento Ac-AA ( 1 -36 ) NH2 (SEQ ID NO: 1) . H-AA(17-36)NH2 (1 eq.), Ac-AA ( 1 - 16 ) OH (1 eq.), y 6-cloro-HOBT (1.5 eq.) se disuelven en 20 volúmenes de DMF por 30 minutos. La solución se enfría a 0 +5°C y se agrega DIEA (1.85 eq . ) seguido por HBTU (1.2 eq.) . Después de agitar toda la noche a 0°C, se agregan gota a gota 50 ml de agua. La suspensión resultante se agita a temperatura ambiente por 3-4 horas y el producto se aisla mediante filtración por succión. El producto se seca toda la noche en un horno a vacío a 45°C.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, sé reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN WF-NH2 (SEQ ID NO: 1), caracterizado porque comprende los pasos de: (a) proporcionar una resina de soporte de síntesis en fase sólida de la fórmula: Z-Q- [SUP] , en donde [SUP] es la resina de soporte, Q es un residuo de glutamina, y Z es el grupo protector del extremo NH2 , y en donde Z-Q está presente sobre [SUP] a un factor de carga de 0.5 o menos ; (b) el acoplamiento de los aminoácidos a Z-Q- [SUP] para proporcionar Z-YTSLIHSLIEESQNQQ- [SUP] ; (c) el tratamiento de Z-YTSLIHSLIEESQNQQ- [SUP] para proporcionar un producto de escisión Ac- YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO : 2 ) ; y (d) el uso de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO : 2 ) para la síntesis de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE KNEQELLELDKWASLWNWF- NH2 (SEQ ID NO:l) . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (a) [SUP] comprende grupos tritilo. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el paso (a) [SUP] comprende grupos cloro-tritilo. 4. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque Z es un grupo Fmoc . 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en el paso (a) , Z-Q está presente sobre [SUP] a un factor de carga menor de 0.5. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque en el paso (a), Z-Q está presente sobre [SUP] a un factor de carga entre 0.2 y 0.5. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en el paso (b) , los aminoácidos son acoplados a Z-Q- [SUP] en una cantidad entre 1 y 1.5 equivalentes . 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque, en el paso (d) , Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO: 2) se hace reaccionar con un péptido que tiene la secuencia H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO : 4 ) ; para proporcionar el péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO:l) . 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 4) es formado mediante la reacción de Z- EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO : 3 ) con fenilalaninamida . 10. Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN WF-NH2 (SEQ ID NO:l), caracterizado porque comprende los pasos de: (a) proporcionar una resina de soporte de síntesis en fase sólida de la fórmula: Z-W- [SUP] , en donde [SUP] es la resina de soporte, W es un residuo de triptofano, y Z es el grupo protector del extremo NH2, y en donde Z-W está presente sobre [SUP] a un factor de carga de 0.5 o menos; (b) el acoplamiento de los aminoácidos para Z-W- [SUP] para proporcionar Z-EKNEQELLELDKWASLWNW- [SUP] ; (c) el tratamiento de Z-EKNEQELLELDKWASLWNW- [SUP] para proporcionar a un producto de escisión Z- EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO: 3); y (d) el uso de Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO: 3) para la síntesis de Ac- YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 1) . 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque en el paso (d) , Z- EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO : 3 ) se hace reaccionar con fenilalaninamida para formar H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 4) . 12. El método de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque H- EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO : 4 ) se hace reaccionar con Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO: 2) para proporcionar Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO:l). 13. Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN WF-NH2 (SEQ ID NO:l), caracterizado porque comprende los pasos de: (a) la provisión de fragmentos intermediarios peptídicos de las secuencias Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID N0:2) y Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO : 3 ) , en donde los fragmentos intermediarios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando un factor de carga de 0.5 o menor; (b) en fase de solución se hace reaccionar con un residuo de fenilalaninamida de Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO: 3) para proporcionar la secuencia H- KNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO : 4 ) ; y (c) en fase de solución, se hace reaccionar el Ac- YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO: 2) con el H- EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO : 4 ) para proporcionar Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO : 1) . 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque en el paso (a), los fragmentos intermediarios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando un factor de carga de menos de 0.5. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque en el paso (a), los fragmentos intermediarios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando un factor de carga de entre 0.2 y 0.5. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque en el paso (b) , los fragmentos intermediarios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando aminoácidos que han sido acoplados a un soporte en una cantidad entre 1 y 1.5 equivalentes .