KR20070103400A - 펩타이드 중간체 단편을 사용하여 펩타이드 ｔ-20을합성하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 T-20 펩타이드 및 펩타이드 중간체의 고상 합성 방법, 특히 탁월한 순도와 수율을 갖는 생성물을 제조하기 위하여 낮은 로딩 계수로 T-20 펩타이드 중간체를 합성함을 포함하는 방법에 관한 것이다.
T-20 펩타이드, 고상 합성, 용액상 합성, 중간체 펩타이드 단편.
Description
본 발명은 고상 및 용액상 공정을 이용하여 T-20 펩타이드를 제조하는 방법 및 이들 방법에 사용될 수 있는 T-20 중간체 펩타이드 단편에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 고상 방법을 이용하여 합성된 단편 2개를 사용하여 T-20 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
펩타이드 합성을 위한 다수의 방법이 문헌에 기재되어 있다[예컨대, 미국 특허 제 6,015,881 호; 머글러(Mergler) 등 (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008; 머글러 등 (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; 캠버(Kamber) 등(편집), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; 리니커(Riniker) 등 (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; 로이드-윌리암스(Lloyd-Williams) 등 (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; 및 앤더슨(Andersson) 등 (2000) Biopolymers 55:227-250 참조]. 다양한 합성방법은 합성이 일어나는 상의 물리적 상태, 즉 액상 또는 고상에 의해 구별된다.
고상 펩타이드 합성(SPPS)에서는, 아미노산 또는 펩타이드 기를 고체 지지체 수지에 결합시킨다. 이어, 목적하는 펩타이드 물질이 형성될 때까지 연속적인 아미노산 또는 펩타이드 기를 지지체-결합된 펩타이드에 부착시킨다. 이어 지지체-결합된 펩타이드를 전형적으로 지지제로부터 절단시키며 추가의 가공 및/또는 정제 처리시킨다. 일부 경우, 고상 합성은 성숙한 펩타이드 생성물을 얻으며; 다른 경우 지지체로부터 절단된 펩타이드(즉, "펩타이드 중간체 단편")를 더 크고 성숙한 펩타이드 생성물의 제조에 사용한다.
고상 공정으로부터 생성된 펩타이드 중간체 단편을 액상 합성 공정(이후 "용액상 합성"이라 칭함)에서 함께 커플링(coupled)시킬 수 있다. 용액상 합성은 고상에 의한 유용한 성숙 펩타이드의 합성이 불가능하거나 실용적이지 않을 때 특히 유용할 수 있다. 예컨대, 고상 합성에서는, 더 긴 펩타이드가 고체 지지체에 여전히 부착된 상태에서 불규칙한 형태를 취할 수 있는 바, 최종 생성물에서 활성의 부분 또는 완전 상실을 초래할 수 있다. 또한 펩타이드 쇄가 지지체 수지 상에서 더 길어짐에 따라서, 커플링 및 탈보호(deprotection)와 같은 공정 단계의 효능이 손상될 수 있다. 이것은 다시 활성화 가능한 아미노산, 공동 시약 및 용매와 같은 출발물질에서의 손실 증가 이외에 상기 문제들을 보상하기 위해 더 긴 가공 시간을 초래할 수 있다. 이들 문제는 펩타이드의 길이가 증가함에 따라서 증가할 수 있으므로 고상 과정만을 이용하여 합성된 30개보다 긴 아미노산 길이의 성숙 펩타이드를 찾기란 비교적 흔하지 않다.
용액상 커플링에서, 2개의 펩타이드 중간체 단편, 또는 1개의 펩타이드 중간 체 단편 및 1개의 반응성 아미노산은 적합한 용매 중에서 통상 커플링 반응의 효능 및 질을 증진시키는 부가적인 시약의 존재하에 커플링된다. 펩타이드 중간체 단편은 반응적으로 배열되어서 1개 단편의 N-말단이 나머지 1개 단편의 C-말단에 커플링되거나 또는 그 역으로 된다. 또한 고상 합성 동안 존재하는 측쇄 보호기는 용액상 커플링 동안 통상 단편 상에 보유되므로 단편의 말단 기의 특이적 반응성을 보장한다. 이들 측쇄 보호기는 전형적으로 성숙 펩타이드가 형성될 때까지 제거되지 않는다.
아주 큰 펩타이드를 합성하는 경우, 3개 또는 4개 또는 그 이상의 펩타이드 중간체 단편을 사용하여 복수의 용액상 커플링 단계를 실시하는 것은 흔하지 않다. 복수의 펩타이드 중간체 단편을 사용할 때 용액상 반응에서 말단 대 말단 커플링 반응의 일반적 개념은 이론적으로는 간단하지만, 실제로 이것은 아주 드문 경우이다. 불순물 및 펩타이드 수율과 같은 다양한 인자가 전체-길이 펩타이드의 품질과 수율에 상당한 영향을 줄 수 있다. 따라서, 하이브리드 방안(hybrid scheme)을 이용한 펩타이드 합성은 흔히 매우 어려우며, 또 많은 경우 실제 합성을 실시할 때까지 어떤 문제가 합성 방안에 있을지 예상하기 어렵다.
어떤 경우에는, 용액상 합성은 고상 합성 후 펩타이드 중간체 단편의 순도 결핍에 의해 영향을 받을 수 있다. 이와 관련하여, 용액상 공정에서 단편을 커플링하기 전에 펩타이드 중간체 단편을 정제 단계에서 처리하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 정제는 다시 펩타이드 중간체 단편의 수율 감소 및 그에 따른 최종 펩타이드 생성물의 수율 감소를 초래할 수 있다.
또한 성숙 펩타이드의 수율은 성숙 펩타이드를 합성하는데 필요한 용액상 단계의 수에 반비례한다. 일부 경우, 성숙 펩타이드를 생성하는데 있어서 펩타이드 중간체 생성물을 이용하는 3개, 4개 또는 그 이상의 용액상 단계가 필요할 수 있다. 부가적인 용액상 커플링 단계 각각은 전체-길이 펩타이드 생성물의 감소를 초래할 수 있다. 따라서, 전체 수율을 향상시키기 위하여, 커플링에 관여하는 단계의 수를 최소화하는 것이 일반적으로 바람직하다.
전체 합성 방안에서 하나 이상의 단계에서의 적은 향상이 성숙 펩타이드 제조에서의 상당한 향상에 달할 수 있다. 이러한 향상은 전체적인 시간 및 시약의 절감을 초래할 수 있고 또 최종 생성물의 순도와 수율을 상당히 향상시킬 수 있다.
하이브리드 합성에서 향상의 중요성에 대한 논의는 이들 과정을 이용하여 제조된 어떤 종류의 펩타이드에도 적용될 수 있지만, 치료적으로 유용하고 또 상업적 의료 용도에 맞는 규모로 제조되는 펩타이드와 관련하여 특히 중요하다. 소분자 약제의 합성은 비교적 저렴할 수 있지만, 대조적으로 치료 펩타이드와 같은 대형 생분자(biomolecular) 약제의 합성 비용은 아주 고가일 수 있다. 다른 인자 이외에 시약 비용, 합성 시간으로 인하여, 이들 대형 생분자 약제의 합성 공정에서의 아주 작은 개선이라도 이러한 약제를 경제적으로 용이하게 생산할 수 있는지의 여부에 대하여 중요한 영향을 줄 수 있다. 많은 경우에 있어서 대형 생분자 약제 유형에 대한 적합한 치료 대안이 거의 존재하지 않는 사실에 의해 지지되는 바와 같이, 대형 생분자 약제에 대한 이들 고가의 제조 비용으로 인하여 상기와 같은 개선이 필요한 것이다.
이러한 것은 레트로바이러스 감염에 의해 유발된 면역결핍 질환의 치료에 사용된 치료 펩타이드의 경우에서 분명히 확인된다. 항레트로바이러스 활성을 갖는 펩타이드는 바이러스 입자가 숙주 면역 세포와 융합하는 것을 방지함을 비롯한 상이한 방식으로 작용할 수 있다. 많은 경우에서 전통적으로 사용된 항바이러스제는 돌연변이에 의한 바이러스 내성으로 인하여 이들 질환 치료에 효과가 없어지므로 신규의 효과적인 치료 펩타이드에 대한 필요성이 크다.
면역결핍 질환 치료에 유용한 치료 펩타이드의 유망한 한 종류는 융합 억제제이다. 이들 유형의 치료 펩타이드는 바이러스 역가(titer)를 감소시킬 수 있고 또 면역결핍 질환을 갖는 환자의 삶의 질을 현저히 향상시킬 수 있다. 예컨대, 합성 36-아미노산 펩타이드인 퓨제온(FUZEON; 등록상표) 펩타이드(엔푸비르타이드 또는 T-20으로 공지됨), 하이브리드 펩타이드 T-1249, 및 이들 펩타이드의 유도체 및 대응물은 인간의 면역결핍 바이러스(HIV) 및 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 치료에서 융합 억제제로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 퓨제온(등록상표) 펩타이드 및 그의 유도체는 HIV에 감염된 사람에서 지속적이고 강력한 활성을 나타내는 HIV의 최초의 억제제이다. 킬비(Kilby) 등의 문헌[(1998) Nat Med 4:1302] 및 킬비 등의 문헌[(2002) AIDS Res Hum Retroviruses 18:685].
T-20 및 T-1249 펩타이드와 같은 융합 억제제는 CD4+ 숙주 세포의 막과 바이러스의 융합에 관련된 HIV 유형 1(HIV-1)의 당단백질 41 엔빌로프(envelope) 영역에 결합한다. 와일드(Wild) 등의 문헌[(1993) AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1051]. 융합 억제제는 세포 밖에 존재하며 HIV-1이 세포에 들어가기 전에 HIV-1 을 차단한다. 퓨제온(등록상표) 펩타이드 및 그의 유도체는 시험관내에서 HIV-1을 강력하게 또 선택적으로 억제함으로써 약물 상호작용, 부작용 및 세포 독성을 최소화한다.
이러한 문제점 이외에, 펩타이드의 대규모 생산에 있어서 생성물 회수 및 생성물 순도뿐만 아니라 시약 취급, 저장 및 폐기에 관련된 문제는 펩타이드 합성 방안의 용이성에 상당한 영향을 줄 수 있다. 따라서, 상업적으로 관심이 있는 펩타이드 물질을 향상된 수율로 다량으로 효율적으로 생산할 수 있는 펩타이드 합성 방법이 계속 요청되고 있다. 펩타이드의 고상 합성 후 지지체 수지로부터 절단된 펩타이드의 회수는 향상이 필요한 합성의 일면이다.
본 발명은 고상 및 용액상 ("하이브리드") 방법을 이용하여 합성되는 T-20 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 방법은 고상 화학을 이용하여 2개의 상이한 T-20 펩타이드 중간체 단편(서열 번호: 2 및 서열 번호: 3 또는 이들의 대응물)을 합성시킴을 포함한다. 본 발명의 요지에 따르면, 고상 합성 후 이들 특정 T-20 중간체 서열은 특히 용액상 커플링 단계에 적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 펩타이드 중간체 단편의 형성을 초래하는 고상 단계는 이들 중간체 단편의 수율과 순도를 현저하게 향상시키기 위하여 독창적으로 변형될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 향상된 수율 및 순도는 용액상 커플링 단계까지 미쳐서 전체 합성 공정을 향상시킨다.
본원에 기재된 본 발명의 방법 및 펩타이드 중간체 단편은 다양한 방법으로 T-20 합성 공정을 보다 효과적으로 만들기 때문에 특히 유리하다. 특히, T-20 펩타이드 중간체 생성물 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3의 형성을 초래하는 고상 합성 단계는 표준 고상 수법에서 전통적으로 사용되는 것보다 낮은 로딩 계수(loading factor)로 지지체에 커플링된 제 1 아미노산을 갖는 지지체 수지를 이용한다. 바람직하게는, 이러한 낮은 로딩 계수를 사용하여, 전형적이지 않게 긴 고상 합성된 단편인 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3 T-20 펩타이드 중간체 생성물을 향상된 수율 및 향상된 순도로 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
향상된 순도 및 수율은 용액상 커플링 단계의 조건을 상당히 개선시키므로, T-20의 전체적 합성에서 향상을 초래한다.
지금까지, 가장 성공적인 T-20 합성 방법은, 고상 합성에 의해 3개 또는 3개보다 많은 펩타이드 중간체 단편을 제조하고, 이들 중간체 단편을 용액상 커플링 반응에 사용하여 최종 T-20 성숙 생성물을 제조하는 용액상 커플링을 이용하였다. 중간체의 고상 합성의 더 높은 품질에 관하여는 3개(또는 그 이상) 단편 방법이 유리할 수 있지만, 3개(또는 그 이상) 단편 방법은 2개 단편 방법과 비교하여 더 많은 단리 및 정제 단계를 포함하고 또 이들 부가적 단계는 일반적으로 가공 시간을 증가시키며 그에 따라 합성 반응의 전체 수율을 감소시키는 단점이 있다.
본 발명은 고상 합성을 통하여 제조된 2개 펩타이드 중간체 단편을 이용하기 때문에, 1개의 분명한 이점은 가공 시간이 감소되고 또 가공 단계의 제거가 물질 및 시약의 보다 효과적인 사용을 초래할 수 있는 점이다. 그러나, 2개 단편 방법에 관한 가능한 단점은 고상 합성에 의한 더 긴 중간체 단편의 합성이 복잡해지고 또 흔히 심각한 순도 및/또는 회수 문제를 초래할 수 있는 점이다. 그럼에도 불구하고, 상술한 바와 같이, 본 발명은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3을 기본으로 한 서열을 갖는 중간체 펩타이드 단편을 선택한 다음 낮은 수지 로딩 계수를 이용하는 고상 합성에 의해 이들 단편을 합성하는 방법이 상기 중간체 단편을 양호한 수율 및 순도로 성공적으로 생산시킬 수 있음을 입증한다. 이러한 성공은 조합된 고상 및 용액상 방법을 이용하는 종래의 펩타이드 합성법에 비추어 훨씬 현저한 것이다.
따라서, 일부 요지에서, 본 발명은 (a) 글루타민(Q)인 잔기에 커플링된 제 1 아미노산을 갖는 고상 합성 지지체 수지를 제공하는 단계; (b) 후속 아미노산을 커플링된 지지체 상의 제 1 아미노산에 커플링시켜 서열 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-[지지체]를 제공하는 단계; (c) 절단 반응으로 지지체로부터 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2) 펩타이드 중간체를 제거한 다음, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 1)의 전부 또는 일부를 갖는 펩타이드를 합성하기 위해 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2) 펩타이드 중간체를 사용하는 단계를 포함하는, T-20 펩타이드를 합성하기 위한 펩타이드 중간체 단편을 제조하는 방법을 제공하며, 이 때 상기 글루타민은 0.5 이하의 로딩 계수로 커플링되며, 바람직하게는 글루타민은 0.2 내지 0.5 범위의 로딩 계수로 커플링된다.
다른 요지에서, 본 발명은 (a) 트립토판(W)인 잔기에 커플링된 제 1 아미노산을 갖는 고상 합성 지지체 수지를 제공하는 단계; (b) 후속 아미노산을 커플링된 지지체 상의 제 1 아미노산에 커플링시켜 서열 EKNEQELLELDKWASLWNW-[지지체]를 제공하는 단계; (c) 절단 반응으로 지지체로부터 EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3) 펩타이드 중간체를 제거한 다음, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 1)의 전부 또는 일부를 갖는 펩타이드를 합성하기 위해 EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3) 펩타이드 중간체를 사용하는 단계를 포함하는, T-20 펩타이드를 합성하기 위한 펩타이드 중간체 단편을 제조하는 방법을 제공하며, 이 때 상기 트립토판은 0.5 이하의 로딩 계수로 커플링되며, 바람직하게는 트립토판은 0.2 내지 0.5 범위의 로딩 계수로 커플링된다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 (a) 서열 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2) 및 EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3)를 갖는 펩타이드 중간체 단편을 제공하는 단계; (b) 용액상에서, EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3) 펩타이드를 페닐알라닌아마이드 잔기와 반응시켜 서열 EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 4)를 제공하는 단계; 및 (c) 용액상에서, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2) 펩타이드를 EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 4) 펩타이드와 반응시켜 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 1) 펩타이드를 제공하는 단계를 포함하는, T-20 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하며, 이 때 상기 펩타이드 중간체 단편은 0.5 이하의 로딩 계수, 바람직하게는 0.2 내지 0.5 범위의 로딩 계수를 이용하여 고체 지지체 상에서 합성된다.
다른 요지에서, 커플링 단계에서 제 1 아미노산은 지지체 상에 0.5 미만의 로딩 계수로 존재한다. 다른 요지에서, 커플링 단계에서, 제 1 아미노산은 0.2 내지 0.45 범위, 또는 0.25 내지 0.40 범위의 로딩 계수로 지지체 상에 존재한다.
다른 요지에서, 고상 합성은 아미노산을 인접 펩타이드 쇄에 1 내지 1.5당량의 양으로 커플링시킴으로써 실시된다.
다른 요지에서, 본 발명은 서열 EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3)를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 서열 번호: 3은 0.5 이하의 로딩 계수를 이용하여 고상 합성에 의해 합성될 수 있다.
이하에 기재되는 본 발명의 실시양태는 본 발명을 빠짐없이 기재하거나 이하의 상세한 설명에 개시되는 형태로 한정하려는 것은 아니다. 오히려, 이하의 실시양태는 당업자들이 본 발명의 원리 및 실행을 숙지하고 이해할 수 있도록 선택적으로 기재한 것이다.
본원에서 사용된 용어는 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 첨부한 청구범위를 비롯한 명세서 전체에서, 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 해석되지 않는 한 그의 복수 형태도 포함한다. 따라서, 예컨대 "하나의 아미노산 잔기"는 1개 이상의 아미노산 잔기를 지칭하며, 당업자에게 공지된 그의 대응물을 포함한다. 본 발명에서, 특정 용어가 자주 사용되며, 그 의미는 본원에 기재되어 있다. 다르게 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 용어는 당해 분야의 당업자들이 숙지하고 있는 것과 동일한 의미이다. 일부 용어는 나중에 명세서에 더욱 자세하게 설명될 것이다.
본 발명은 T-20(엔푸비르타이드로도 공지됨) 및 T-20 대응물의 합성을 개선하는 방법, 및 특히 T-20 펩타이드 중간체 단편의 고상 합성에 관련된 합성 요지를 개선하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 2개의 고상 합성된 펩타이드 단편만을 사용하여 T-20 펩타이드 및 그의 대응물을 제조하는데 유용하다. 본 발명은 일반적으로 T-20 합성에 관련되지만, 본 발명의 가르침은 또한 다른 펩타이드, 특히 고상 및 용액상 방법의 조합을 이용하여 합성된 펩타이드의 합성에도 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 불순물, 특히 피로글루타메이트 불순물과 관련된 펩타이드 중간체 단편의 합성에도 적용될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 T-20 펩타이드의 스케일-업(scaled-up) 합성 요지의 개선에 특히 적합하다. 스케일-업 과정은 분배에 유용한 양의 펩타이드를 제공하기 위해 전형적으로 실시된다. 예컨대 스케일-업 과정에서 펩타이드의 양은 뱃치(batch)당 500g 이상 또는 1kg 이상, 더욱 전형적으로 뱃치당 수십kg 내지 수백kg 이상일 수 있다. 대규모 합성과 같은 스케일-업 합성 과정에서는 하나 이상의 대형 반응 용기가 사용될 수 있다. 이들 용기는 100 내지 500kg 이상의 양으로 펩타이드를 생산할 수 있는 크기로 합성 공정의 다양한 단계를 위한 수지, 용매, 아미노산 및 화학물질과 같은 다량의 시약을 수용할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 펩타이드 합성, 특히 스케일-업 과정을 개선하는데 특히 적합하다. 바람직한 실시양태로서, 본 발명의 방법은 공정(합성) 시간의 감축, 생성물 수율의 향상, 생성물 순도의 향상 및 필요한 시약 및 출발물질의 감량과 같은 개선점을 제공할 수 있다.
T-20은 HIV-1LAI 단리물로부터 얻은 막투과(transmembrane) 단백질 gp41의 아미노산 잔기 638 내지 673에 상응하는 펩타이드이다. T-20(서열 번호: 1) 펩타이드의 서열은 다음에 나타낸다:
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (서열 번호: 1)
T-20은 HIV-1 감염을 치료하기 위해 사용되는 항-레트로바이러스 약제이다. T-20은 막 융합에 필요한 형태 변화를 차단함으로써 HIV-1 바이러스 입자와 숙주 세포의 융합을 차단하는 작용을 한다. 이러한 유형의 활성을 갖는 펩타이드를 본원에서는 T-20 활성을 갖는다고 한다.
T-20 합성은 전형적으로 특정 펩타이드 단편의 기를 합성 및 조합하여 엔푸비르타이드 생성물을 수득하기 위하여 고상 및 액상 과정을 이용한다[브레이(Bray, B.L.), Nature Rev., 2:587-593 (2003)]. 본 발명은 엔푸비르타이드 펩타이드 중간체 및 전체-길이 엔푸비르타이드 생성물의 개선된 합성 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 또한 엔푸비르타이드 활성을 갖는 펩타이드 및 엔푸비르타이드 활성을 갖는 펩타이드를 제조하기 위해 사용되는 펩타이드 중간체의 합성도 포함한다. 엔푸비르타이드 활성을 갖는 펩타이드는 미국 특허 제 5,464,933 호, 제 5,656,480 호 및 PCT 특허 공개 WO 96/19495 호에 기재되어 있다.
본 발명은 전체-길이 T-20 대응물 및 T-20 펩타이드 중간체 대응물을 비롯한 T-20 대응물의 합성에도 적용할 수 있다. 본원에 사용되는 "T-20 대응물"은 T-20 또는 T-20 중간체 단편으로부터 유도된 화합물을 지칭한다. 펩타이드 대응물은 펩타이드 유사체, 펩타이드 유도체, 융합 화합물 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 따라서, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3의 서열을 갖는 T-20 펩타이드 중간체 단편을 지칭할 때, 이들의 대응물은 예컨대 각각 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3의 펩타이드 유사체, 펩타이드 유도체, 융합 화합물을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 펩타이드 유사체는 일반적으로 다른 펩타이드 또는 펩타이드 대응물에 비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 역전(inversion) 및/또는 부가와 같은 변형된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 지칭한다. 치환은 바람직하게는 보존적(conservative) 또는 고도로 보존적일 수 있다. 보존적 치환은 일반적으로 동일한 순(net) 전하를 가지며 또 일반적으로 동일한 크기 및 형태를 갖는 다른 아미노산에 의해 아미노산을 치환하는 것을 지칭한다. 예컨대, 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 측쇄에서 전체 탄소 및 헤테로원자 수가 약 4개 이하로 상이할 때 거의 동일한 크기를 갖는다. 이들은 측쇄에서 분지 갯수가 약 1개 또는 2개 이하로 상이할 때 거의 동일한 형태를 갖는다. 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐 기를 갖는 아미노산은 대략 동일한 크기 및 형태를 갖는 것으로 간주된다. 이하에 수록한 것은 아미노산의 5개 군이다. 한 화합물 중의 1개 아미노산을 동일 군의 다른 아미노산으로 치환하면 일반적으로 보존적 치환을 초래한다.
군 I: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌 및 C1-C4 지방족 또는 C1-C4 하이드록실 치환된 지방족 측쇄(직쇄 또는 일 분지된)를 갖는 비-천연 산출 아미노산.
군 II: 글루탐산, 아스파르트산 및 카복실산 치환된 C1-C4 지방족 측쇄(분지되지 않거나 1개의 분지점)를 갖는 비-천연 산출 아미노산.
군 III: 리신, 오르니틴, 아르기닌 및 아민 또는 구아니디노 치환된 C1-C4 지방족 측쇄(분지되지 않거나 1개의 분지점)를 갖는 비-천연 산출 아미노산.
군 IV: 글루타민, 아스파라긴 및 아마이드 치환된 C1-C4 지방족 측쇄(분지되지 않거나 1개의 분지점)를 갖는 비-천연 산출 아미노산.
군 V: 페닐알라닌, 페닐글리신, 티로신 및 트립토판.
"고도로 보존적인 치환"은 아미노산을 측쇄에 동일한 작용기를 갖고 거의 동일한 크기 및 형태를 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 이들의 측쇄에서 전체 탄소 및 헤테로원자의 수가 2개 이하의 차이를 나타낼 때 거의 동일한 크기를 갖는다. 이들은 측쇄에서 동일한 분지 수를 가질 때 거의 동일한 형태를 갖는다. 고도로 보존적인 치환의 예는 류신 대신 발린, 세린 대신 트레오닌, 글루탐산 대신 아스파르트산 및 페닐알라닌 대신 페닐글리신을 포함한다.
펩타이드 유도체는 일반적으로 펩타이드, 펩타이드 유사체, 또는 측기, 알파 탄소원자, 말단 아미노 기 및/또는 말단 카복실산 기의 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 다른 펩타이드 대응물을 지칭한다. 예를 들어, 화학적 변형은 화학 잔기 부가, 새로운 결합의 생성 및/또는 화학적 잔기의 제거를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 아미노산 측기에서의 변형은 리신 e-아미노 기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 카복실산 기의 알킬화, 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아마이드화(deamidation)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 말단 아미노기의 변형은 데스-아미노, N-저급 알킬, N-다이-저급 알킬, 및 N-아실(예컨대 -CO-저급 알킬) 변형을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 말단 카복시 기의 변형은 아마이드, 저급 알킬 아마이드, 다이알킬 아마이드, 및 저급 알킬 에스터 변형을 포함하며, 이들로 한정되지 않는다. 따라서, 부분적으로 또는 전체적으로 보호된 펩타이드는 펩타이드 유도체를 구성한다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, T-20 및 T-20 중간체 단편을 포함하는 이하의 펩타이드 세트를 참조한다.
본 발명의 방법에 기초하여 개요를 제공하기 위하여, T-20 펩타이드에 대한 전반적인 합성 방안은 다음과 같다. T-20(서열 번호: 1)은 T-20 펩타이드 중간체 단편 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2) 및 EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3)의 고상 합성을 포함하는 단계에 의해 제조한다. 이들 펩타이드를 본원에 기재된 방법을 이용하여 합성한 다음 고상 수지로부터 측쇄 보호된 형태로 절단한다. 페닐알라닌아마이드 잔기를 용액 중의 EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3) 펩타이드 중간체에 커플링시켜 EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 4)를 생성시킨다. EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 4)를 용액 중의 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2)에 커플링시켜 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 1)를 생성시킨다.
본 발명에 따라, 고상 합성 수법을 이용하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2)의 16개 아미노산 서열을 갖는 T-20의 제 1 펩타이드 단편(중간체 단편 1) 또는 그의 대응물을 제조한다. 고상 합성의 바람직한 방법에 관하여, 펩타이드의 C-말단 부분에 존재하는 아미노-말단 글루타민(Q) 잔기(즉, 서열 번호: 2의 잔기 번호 16)는 고상 수지에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이므로 고체 지지체 수지에 대하여 그의 위치 측면에서 단편의 알파 아미노산을 구성한다. 이러한 바람직한 방법에서 고상 합성은 아미노산 잔기를 아미노-말단으로부터 카복실 말단으로 연속적으로 부가하고, 이어 아미노산을 목적하는 서열에 상응하도록 부가함으로써 진행시킨다. 펩타이드 중간체 단편의 합성은 N-말단 잔기(예컨대 서열 번호: 2의 N-말단 티로신(Y))가 인접 펩타이드 쇄에 부가된 후 완료된다.
고상 합성 수법을 이용하여 또한, EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3)의 19개 아미노산 서열을 갖는 T-20의 제 2 펩타이드 단편(중간체 단편 2) 또는 그의 대응물을 제조한다. 고상 합성의 바람직한 방법에 관하여, 아미노-말단 트립토판(W) 잔기(즉, 서열 번호: 3의 잔기 번호 19, 또는 서열 번호: 1의 잔기 번호 35)는 고상 수지에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이므로 고체 지지체 수지에 대하여 그의 위치 측면에서 단편의 알파 아미노산을 구성한다. 바람직한 방법에서 고상 합성은 아미노산 잔기를 아미노-말단으로부터 카복실 말단으로 연속적으로 부가하고, 이어 아미노산을 목적하는 서열에 상응하도록 부가함으로써 진행시킨다. 펩타이드 중간체 단편의 합성은 N-말단 잔기(예컨대 서열 번호: 3의 N-말단 글루탐산(E))가 인접 펩타이드 쇄에 부가된 후 완료된다.
상기 중간체 단편 1 및 2 각각은 16개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 알 수 있다. 이들은 고상 합성과 관련하여 상당히 큰 펩타이드 단편이지만, 본 발명의 원리는 이러한 대형 단편 및 그에 따른 T-20이 고수율 및 고순도로 합성되도록 한다.
본 발명에 따라, 고상 수지 상에서 합성되는 펩타이드의 상대적 양을 적절하게 제어하는 것에 의해, 펩타이드 중간체 단편의 수율 및 순도에 관한 이로운 효과를 얻을 수 있음이 밝혀졌다. 합성되는 펩타이드의 상대적 양은 일정 양의 수지에 커플링된 알파 아미노산의 양을 지칭하는 로딩 계수에 의해 제어될 수 있으며, 전형적으로 고상 수지 1g당 알파 아미노산의 밀리몰로서 표시된다. 예컨대, 0.25의 로딩 계수는 고상 수지 100g에 실제로 커플링된 알파 아미노산 25밀리몰에 상응한다. 제 1 아미노산을 고상 수지에 커플링하는 반응은 완전히 효과적이지 않을 수 있으므로 커플링되는 실제 양은 100% 커플링 효율 및 출발 시약의 양에 기초하여 이론적인 양 미만일 수 있음을 알 수 있다. 커플링된 물질의 실제 양은 반응이 일어난 후 측정될 수 있다. 실제 커플링을 측정하기 위하여, 펩타이드를 수지로부터 절단할 수 있고 또 예컨대 기준물에 대한 HPLC 분석을 이용하여 분석할 수 있다. 커플링된 제 1 아미노산 잔기의 실제 양을 측정하는 방법은 본원에 기재된다.
본 발명에 따라, 비교적 긴 펩타이드 단편(서열 번호: 2 및 서열 번호: 3 서열의 펩타이드 중간체 단편과 같은)의 수율과 순도 및 그에 따른 T-20 펩타이드의 수율과 순도는 0.5 이하와 같은 비교적 낮은 로딩 계수에서 더 높아지는 경향이 있음이 밝혀졌다. 그러나, 로딩 계수가 예컨대 0.2 미만이면, 생성물 처리량이 감소될 수 있다. 이들 문제를 균형 잡기 위해, 단편 1 및 2 중의 적어도 하나, 바람직하게는 단편 1 및 2 모두에 관한 로딩 계수는 약 0.2 내지 약 0.50, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 0.45 범위, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 약 0.40 범위이다. 예컨대, 하나의 대표 실시 모드에서는 약 0.34의 로딩 계수를 이용하는 것이 적합할 수 있다.
이 요지를 설명하기 위하여, 다음의 고상 과정을 실시할 수 있다. 적합한 수지를 수득하고 적합한 용매 중에서 세척함으로써 준비한다. 이어, 활성가능하고 보호된 형태의 제 1 아미노산을 함유하는 용액을 세척된 수지에 부가한다. 목적하는 범위의 로딩 계수를 달성하기 위하여, 아미노산의 양 및/또는 농도 및/또는 HOBT와 같은 공동 시약의 존재 및 농도, 커플링 반응의 지속시간, 커플링 반응의 온도 등과 같은 다른 반응 인자를 선택할 수 있다.
Fmoc 화학을 이용한 고상 합성을 이용하여, 수지에 커플링된 T-20 중간체 단편(들)(서열 번호: 2 및 서열 번호: 3을 포함하는 펩타이드 중간체 단편과 같은)을 제조할 수 있다. 펩타이드 중간체 단편을 수지 상에서 합성한 후, 절단 시약을 사용하여 이를 절단하여 용액 중의 펩타이드 중간체 단편을 보호된 형태로 생성시킨다. 이 펩타이드 중간체 단편을 수지로부터 분리한다. 일부 경우, 용액상 커플링을 실시하기 전에 펩타이드 중간체 단편을 정제하기 위한 수단으로서 펩타이드 중간체 단편을 침전제와 접촉시킨다.
고상 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 T-20 최종 생성물의 제조에 사용될 수 있는 펩타이드 중간체 단편을 제조하기 위한 낮은 로딩 계수를 이용하는 고상 합성 방법의 이용을 고려한다.
예컨대 본원에 기재된 T-20 펩타이드 중간체 단편은 표준 FMOC 절차를 이용하는 SSPS 수법에 의해 합성할 수 있다. 예컨대 카핀(Carpin) 등의 문헌[(1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749]; 카핀 등의 문헌[(1972), J. Org. Chem. 37(22):3404-3409, "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", 찬 및 화이트 편집 (2000) Oxford University Press Oxford Eng.] 참조.
고상 펩타이드 합성의 실시에 적합한 임의의 유형의 지지체를 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태로서, 상기 지지체는 폴리아마이드, 폴리설파마이드, 치환된 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글라이콜, 페놀 수지, 폴리사카라이드, 또는 폴리스타이렌과 같은 하나 이상의 중합체, 공중합체 또는 중합체의 조합물로부터 제조될 수 있는 수지를 포함한다. 중합체 지지체는 펩타이드 합성에 사용되는 용매에 충분히 불용성이고 불활성인 임의의 고체일 수 있다. 고체 지지체는 전형적으로 합성 동안 성장하는 펩타이드가 커플링되고 또 목적하는 조건하에서 절단되어 지지체로부터 펩타이드를 방출할 수 있는 연결 잔기를 포함한다. 적합한 고체 지지체는 광-절단성, TFA-절단성, HF-절단성, 플루오라이드 이온-절단성, 환원-절단성, Pd(O)-절단성, 친핵-절단성 또는 라디칼-절단성인 연결기를 가질 수 있다. 바람직한 연결 잔기는 절단된 펩타이드가 실질적으로 전체적으로(globally) 보호되는 조건하에서 절단성이다.
바람직한 합성 방법의 일례로서, 펩타이드 중간체 단편은 트리틸 기를 포함하는 산 감수성 고체 지지체 상에서, 더욱 바람직하게는 펜던트형(pendent) 염소 기를 갖는 트리틸 기를 포함하는 수지, 예컨대 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지[발로스(Barlos) 등 (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946] 상에서 합성된다. 그 예는 트리틸 클로라이드 수지, 4-메틸트리틸 클로라이드 수지, 4-메톡시트리틸 클로라이드 수지, 4-아미노뷰탄-1-올 2-클로로트리틸 수지, 4-아미노메틸벤조일 2-클로로트리틸 수지, 3-아미노프로판-1-올 2-클로로트리틸 수지, 브로모아세트산 2-클로로트리틸 수지, 사이아노아세트산 2-클로로트리틸 수지, 4-사이아노벤조산 2-클로로트리틸 수지, 글리시놀 2-클로로트리틸 수지, 프로피온 2-클로로트리틸 수지, 에틸렌글라이콜 2-클로로트리틸 수지, N-Fmoc 하이드록실아민 2-클로로트리틸 수지, 하이드라진 2-클로로트리틸 수지를 포함한다. 일부 바람직한 고체 지지체는 다이비닐벤젠과 공중합되어 반응성 기가 고정되는 지지체 물질을 형성할 수 있는 폴리스타이렌을 포함한다.
펩타이드 물질은 전형적으로 비이드 표면 및 비이드 내부에서 수지 비이드에 부착된다. FMOC 및 측쇄 보호된 펩타이드는 예컨대 DCM 중의 묽은 TFA 또는 아세트산과 같은 약산성 시약을 사용하여 이 수지로부터 보호된 상태로 용이하게 절단된다.
고상 합성에 사용되는 다른 수지는 스타이렌 및 다이비닐벤젠과 4-하이드록시메틸페닐옥시메틸 고정 기[왕(Wang, S.S.) 1973, J. Am. Chem. Soc.]의 공중합체를 포함하는 "왕" 수지, 및 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시뷰티르산 수지[리히터(Richter) 등 (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706]를 포함한다. 왕, 2-클로로트리틸 클로라이드 및 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시 뷰티르산 수지는 예컨대 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 칼바이오켐-노바바이오켐 코포레이션(Calbiochem-Novabiochem Corp.)으로부터 구입할 수 있다.
제 1 커플링된 아미노산을 갖는 지지체를 제공하기 위하여, 수지를 예컨대 세척에 의해 준비한 다음 활성화되고 보호된 아미노산을 함유하는 용액과 함께 항온 처리할 수 있다. 수지에 커플링되는 제 1 아미노산 및 후속 아미노산은 전형적으로 N-말단 보호기, 측쇄 보호기(특정 아미노산에 따라) 및 수지로부터의 펜던트형 기와 반응성인 기, 또는 펜던트형 아미노산과 반응성인 기를 포함한다.
바람직한 요지에서, 제 1 아미노산은 카복시 말단에서 지지체에 부착되는 반면에, N-말단 및 측쇄 기는 필요한 경우 보호기에 의해 보호된다. 예시적 기재로서, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2) 펩타이드 중간체 단편의 고상 합성은 보호된 글루타민 잔기를 2-클로로트리틸클로라이드(2-CTC) 수지에 처음으로 로딩함으로써 카복시-말단에서부터 NH2-말단 방향으로 실시된다.
보호기의 성질 및 용도는 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 적합한 보호기는 이들이 부착되어 있는 원자 또는 잔기, 예컨대 산소 또는 질소가 가공 및 합성 동안 바람직하지 않은 반응에 참여하지 않게 방지하는데 도움을 줄 수 있는 임의의 종류의 기이다. 보호기는 측쇄 보호기 및 아미노- 또는 N-말단 보호기를 포함한다. 보호기는 카복실산, 티올 등의 반응 또는 결합을 방지할 수 있다.
측쇄 보호기는 측쇄의 일부가 펩타이드 합성, 가공 등의 단계에 사용되는 화학물질과 반응하지 않도록 돕는, 아미노산의 측쇄(즉, 아미노산 일반 화학식 H2N-C(R)(H)-COOH 중의 R 기)에 커플링된 화학적 잔기를 지칭한다. 측쇄 보호기의 선택은 다양한 인자, 예컨대 실시하는 합성의 유형, 펩타이드가 처리되는 가공, 및 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 따라서 달라질 수 있다. 측쇄 보호기의 성질은 또한 아미노산 자체의 성질에 따라 달라진다. 일반적으로, 측쇄 보호기는 고상 합성 동안 아미노 기를 탈보호하는 동안 제거되지 않도록 선택한다. 따라서, 아미노 보호기 및 측쇄 보호기는 전형적으로 동일하지 않다.
일부 경우, 및 고상 합성 및 기타 펩타이드 가공에서 사용된 시약의 종류에 따라서, 아미노산은 측쇄 보호기를 필요로 하지 않을 수 있다. 이러한 아미노산은 전형적으로 측쇄에 반응성 산소, 질소 또는 기타 반응성 잔기를 포함하지 않는다.
측쇄 보호기의 예는 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 3급-뷰틸, 트라이페닐메틸(트리틸), 테트라하이드로피란일, 벤질 에터(Bzl) 및 2,6-다이클로로벤질(DCB), t-뷰톡시카본일(BOC), 나이트로, p-톨루엔설폰일(Tos), 아다만틸옥시카본일, 잔틸(Xan), 벤질, 2,6-다이클로로벤질, 메틸, 에틸 및 t-뷰틸 에스터, 벤질옥시카본일(Z), 2-클로로벤질옥시카본일(2-Cl-Z), Tos, t-아밀옥시카본일(Aoc), 및 방향족 또는 지방족 우레탄-형 보호기; 또는 나이트로 베리트릴 옥시카본일(NVOC)과 같은 광불안정성(photolabile) 기; 및 트라이메틸실릴 옥시카본일(TEOC)과 같은 플루오라이드 불안정성 기를 포함한다.
바람직한 측쇄 보호기는 Tyr(Y), Thr(T), Ser(S) 및 Asp(D) 아미노산 잔기에 대한 t-Bu 기; His(H), Gln(Q) 및 Asn(N) 아미노산 잔기에 대한 trt 기; 및 Lys(K) 및 Trp(W) 아미노산 잔기에 대한 Boc 기를 포함한다.
예컨대, 표 1에 수록된 펩타이드 단편의 아미노산 잔기의 하나 이상의 측쇄는 t-뷰틸(t-Bu), 트리틸(trt) 및 t-뷰틸옥시카본일(Boc)과 같은 표준 보호기에 의해 보호될 수 있다. t-Bu 기는 아미노산 잔기 Tyr(Y), Thr(T), Ser(S) 및 Asp(D)에 대한 바람직한 측쇄 보호기이고; trt 기는 아미노산 잔기 His(H), Gln(Q) 및 Asn(N)에 대한 바람직한 측쇄 보호기이며; 또 Boc 기는 아미노산 잔기 Lys(K) 및 Trp(W)에 대한 바람직한 측쇄 보호기이다.
히스티딘을 포함하는 T-20 펩타이드 중간체 단편을 합성하는 동안, 히스티딘 잔기의 측쇄는 바람직하게는 트리틸(trt) 보호기에 의해 보호된다. 보호되지 않으면, 수지로부터 펩타이드 단편을 절단하기 위해 및/또는 합성하는 동안 Fmoc 또는 기타 N-말단 보호기를 절단하기 위해 사용된 산이 보호되지 않은 히스티딘 잔기와 불리하게 반응하여 펩타이드 단편의 열화를 초래할 것이다. 가능하게는, 히스티딘이 보호되지 않으면 더 이상의 다른 아미노산의 부착이 이루어질 수 없다. 연장된 절단 시간은 히스티딘으로부터 trt와 같은 보호기를 제거할 수 있고 또 전형적인 품질 규정을 만족하는 뱃치를 유발할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 각 펩타이드 단편의 모든 아스파라긴 잔기는 보호된다. 또한, 트립토판 잔기는 Boc 기에 의해 보호되는 것이 바람직하다.
아미노-말단 보호기는 아미노산의 알파 아미노 기에 커플링된 화학적 잔기를 포함한다. 전형적으로, 아미노-말단 보호기는 성장하는 펩타이드 쇄에 부가할 다음 아미노산을 부가하기 전에 탈보호 반응으로 제거하지만, 펩타이드가 지지체로부터 절단될 때 유지될 수 있다. 아미노 말단 보호기의 선택은 다양한 인자, 예컨대 실시할 합성의 유형 및 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 따라서 달라질 수 있다.
아미노-말단 보호기의 예는 (1) 아실-형 보호기, 예컨대 폼일, 아크릴릴(Acr), 벤조일(Bz) 및 아세틸(Ac); (2) 방향족 우레탄-형 보호기, 예컨대 벤질옥시카본일(Z) 및 치환된 Z, 예컨대 p-클로로벤질옥시카본일, p-나이트로벤질옥시카본일, p-브로모벤질옥시카본일, p-메톡시벤질옥시카본일; (3) 지방족 우레탄 보호기, 예컨대 t-뷰틸옥시카본일(BOC), 다이아이소프로필메톡시카본일, 아이소프로필옥시카본일, 에톡시카본일, 알릴옥시카본일; (4) 사이클로알킬 우레탄-형 보호기, 예컨대 9-플루오렌일-메틸옥시카본일(Fmoc), 사이클로펜틸옥시카본일, 아다만틸옥시카본일, 및 사이클로헥실옥시카본일; 및 (5) 티오우레탄-형 보호기, 예컨대 페닐티오카본일을 포함한다. 바람직한 보호기는 9-플루오렌일-메틸옥시카본일(Fmoc), 2-(4-바이페닐릴)-프로필(2)옥시카본일(Bpoc), 2-페닐프로필(2)-옥시카본일(Poc) 및 t-뷰틸옥시카본일(Boc)을 포함한다.
본 발명에 따라, 보호기는 전형적으로 고상 합성 전체에 걸쳐 및 용액상 커플링 반응에 또한 그 전체에 걸쳐 펩타이드 중간체 단편 상에 보유된다. (일반적으로 용액상 커플링 단계가 완료된 후, 탈보호 단계를 실시하여 하나 이상의 보호기를 펩타이드로부터 제거한다.)
서열 번호: 2 및 서열 번호: 3을 갖는 펩타이드 중간체 단편을 합성하기 위해 수지에 커플링될 수 있는 특정 보호기를 갖는 제 1 아미노산의 특정 예는 각각 FmocGln(OtBu)OH 및 FmocTrp(Boc)OH일 수 있다.
고상 합성하기 위한 수지를 준비하기 위하여, 수지를 용매 중에서 예비 세척할 수 있다. 예컨대, 2-CTC 수지와 같은 고상 수지를 펩타이드 챔버에 부가한 다음 적합한 용매에 의해 예비 세척한다. 세척은 수지에 커플링될 제 1 아미노산과 접촉시키기 위한 수지를 준비하기 위해 실시될 수 있다. 실제로, 예비 세척은 수지에 대한 제 1 아미노산의 커플링 효율을 증진시키기 위해 실시될 수 있다. 예비 세척 용매는 커플링 반응에 사용된 용매 유형(또는 용매의 혼합물)에 기초하여 선택될 수 있거나 또는 그 역으로 실시할 수 있다.
세척 및 후속 커플링 반응에 적합한 용매는 다이클로로메테인(DCM), 다이클로로에테인(DCE), 다이메틸폼아마이드(DMF), 메틸렌 클로라이드 뿐만 아니라 이들 시약의 혼합물을 포함한다. 다른 유용한 용매는 DMSO, 피리딘, 클로로폼, 다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, N-메틸피롤리돈 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 경우 커플링은 DMF와 DCM의 혼합물과 같은 이원 용매 계에서 실시할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 수지 상의 제 1 알파 아미노산의 로딩 계수를 약 0.2 내지 약 0.50 범위, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 0.45 범위, 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 약 0.40 범위로 조절하는 것이 바람직하다. 따라서, 표적 범위의 커플링 계수를 제공할 아미노산의 양을 갖는 용액을 제조한다. 이것은 특정 반응에 대한 커플링 효율이 얼마인지를 인식하여 결정한다. 예컨대, 약 0.34의 표적 로딩 계수를 갖는 것이 요구될 때 커플링 효능이 약 80%인 것이 알려지면, 수지 매 1g당 0.425밀리몰의 아미노산을 함유하는 커플링 용액이 사용되어야 한다(0.34/0.8).
커플링 반응은 커플링 반응을 증가 또는 향상시키는 하나 이상의 화합물의 존재하에서 실시할 수 있다. 반응속도를 증가시키고 또 부반응 속도를 감소시킬 수 있는 화합물은 예컨대 다이아이소프로필에틸아민(DIEA) 및 트라이에틸아민(TEA)과 같은 3급 염기 존재하에서, 보호된 아미노산을 활성화된 종으로 전환시킬 수 있는(예컨대 BOP, PyBOPO, HBTU 및 TBTU는 모두 HOBt 에스터를 생성함) 포스포늄 및 우로늄 염을 포함한다. 다른 시약은 보호 시약을 제공함으로써 라세미화 반응을 방지하는데 도움을 준다. 이들 시약은 부가된 보조 친핵체(예컨대 1-하이드록시-벤조트라이아졸(HOBt), 1-하이드록시아자벤조트라이아졸(HOAt) 또는 HOSu)를 갖는 카보다이이미드(예컨대 DCC 또는 WSCDI)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 시약은 TBTU이다. 아이소뷰틸 클로로폼에이트를 사용하고 부가된 보조적 친핵체를 사용하거나 사용하지 않는 혼합된 무수물 방법이 그와 관련된 낮은 라세미화로 인하여 아지드 방법과 마찬가지로 또한 이용된다. 이들 유형의 화합물은 카보다이이미드 매개 커플링의 속도를 증가시킬 뿐만 아니라 Asn 및 Gln 잔기의 탈수를 방지할 수 있다.
커플링 완료는 본원에 기재된 바와 같은 정성적인 닌하이드린 시험에 의해 모니터링할 수 있다. 커플링이 완료된 것으로 결정된 후, 커플링 반응 혼합물을 용매로 세척하고 또 펩타이드 물질의 후속 아미노산 잔기 각각에 대해 커플링 싸이클을 반복한다. 최종 커플링 싸이클 이후, 수지를 NMP와 같은 용매로 세척한 다음 DCM과 같은 불활성 제 2 용매로 세척한다.
다음 아미노산을 커플링하기 위하여, 전형적으로 N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 다이메틸폼아마이드(DMF) 같은 용매 중에서 20 내지 50%(중량 기준) 피페리딘을 포함하는 시약으로 처리함으로써 N-말단 보호기(예컨대 Fmoc 기)를 제거한다. Fmoc 보호기를 제거한 후, 잔존하는 피페리딘 및 Fmoc 부산물(예컨대, 다이벤조풀벤 및 그의 피페리딘 부가생성물)을 제거하기 위하여 전형적으로 수회의 세척을 실시한다.
제 1 아미노산을 목적하는 로딩 계수로 수지에 커플링하고 또 N-말단 보호기를 제거한 후, 후속 아미노산을 부가하여 펩타이드 중간체 단편을 제조할 수 있다. 후속 아미노산은 로딩 계수에 관련된 아미노산의 화학양론적 과량으로 이용될 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 특정 T-20 중간체 단편의 고상 합성은 이들 단편의 고상 합성에 사용될 아미노산(및 상응하는 시약)을 매우 과량으로 요구하지는 않음이 밝혀졌다. 일반적으로 커플링 단계에 사용되는 아미노산의 양은 수지 상의 제 1 아미노산의 로딩 계수에 대하여 적어도 당량 이상(1당량 이상)이다. 바람직하게는 커플링 단계에 사용되는 아미노산의 양은 1.3당량(0.3 과량) 이상, 가장 바람직하게는 약 1.5당량(0.5 과량)이다. 일부 경우, 예컨대 커플링 단계는 1 내지 1.5(1보다 크고 1.5 미만) 범위의 아미노산 당량을 사용한다.
이 과량의 아미노산(예컨대 약 1.5)이 커플링 반응을 완결시키기에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 이 과량은 반응이 탈보호 시약으로부터의 과량의 염기를 견딜 수 있게 도울 수 있다.
커플링, 세척, N-말단 보호기 제거 및 세척 단계는 목적하는 T-20 중간체 생성물이 형성될 때까지 반복할 수 있다.
고상 합성 후 및 수지로부터 T-20 중간체 펩타이드를 제거하기 위하여, 절단된 T-20 중간체 펩타이드가 여전히 충분한 측쇄 및 말단 보호 기를 보유하도록 하는 방식으로 절단 처리를 실시한다. 보호기를 제자리에 남기면, 절단하는 동안 또는 절단한 후 펩타이드 단편의 바람직하지 않은 커플링 또는 다른 바람직하지 않은 반응을 방지하는데 도움이 된다. FMOC 또는 유사한 화학을 사용하여 펩타이드를 합성하는 경우, 보호된 절단은 수지를 팽윤시킬 수 있고 절단 및 분리 과정에 유용한 아세트산 또는 DCM과 같은 용매 중의 묽은 TFA 등의 비교적 약산 시약을 사용함으로써 임의의 원하는 방식으로 달성할 수 있다. DCM 중의 0.5 내지 10중량%, 바람직하게는 1 내지 3중량%의 TFA를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,281,335 호 참조.
고상 수지로부터 펩타이드 중간체 단편을 절단하는 단계는 다음과 같은 예시적 방법을 따라 실시할 수 있다. 그러나, 수지로부터 펩타이드 중간체 단편을 효과적으로 절단하는 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 예컨대, 산성 절단 시약을 함유하는 약 5 내지 20, 바람직하게는 약 10부피의 용매를 용기에 부가한다. 그에 따라 수지 비이드가 시약에 침지된다. 액체 내용물이 적합한 온도에서 적합한 시간 동안 진탕됨에 따라서 절단 반응이 이루어진다. 진탕은 비이드가 응집되지 않도록 하는데 도움을 준다. 적합한 시간 및 온도 조건은 사용된 산 시약, 펩타이드의 성질, 수지의 성질 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적 지침으로서, 약 -15℃ 내지 약 5℃, 바람직하게는 약 -10℃ 내지 약 0℃에서 약 5분 내지 2시간, 바람직하게는 약 25분 내지 약 45분간 교반하는 것이 적합할 것이다. 절단 시간은 약 10분 내지 약 2시간일 수 있다. 대규모 생산의 경우, 바람직한 시간은 약 15 내지 50분 범위이다. 절단은 반응 동안 전형적으로 생길 수 있는 반응 발열을 수용하도록 이러한 냉각된 온도 범위에서 실시되는 것이 바람직하다. 또한 절단 반응의 저온은 trt 기와 같은 산 감수성 측쇄 보호기가 상기 단계에서 제거되지 않게 한다.
절단 처리 후에, 반응을 급랭시킨다. 이것은 예컨대 피리딘 등과 같은 적합한 염기를 용기에 부가하고 부가적인 5분 내지 2시간, 바람직하게는 약 20분 내지 약 40분간과 같이 추가의 시간 동안 계속 진탕 및 교반시킴으로써 달성된다. 염기 부가 및 지속적인 진탕은 용기 내용물의 온도 상승을 초래한다. 진탕 후, 용기 내용물은 약 0℃ 내지 약 15℃, 바람직하게는 약 5℃ 내지 약 10℃ 범위의 온도일 수 있다.
펩타이드 회수를 향상시키기 위해 수지를 팽윤 및 수축시키는 것과 같은 요소를 전체 합성 공정에 임의적으로 혼입시킬 수 있다.
예컨대, 절단 후, 지지체를 임의적으로 1회 이상 팽윤성 시약으로 세척하여 절단된 펩타이드를 세척액(들) 내로 추출하고, 상기 세척액(들)을 수집하여 이들 세척액으로부터 펩타이드를 회수한다. 예컨대, DCM 중의 묽은 TFA를 사용하여 2-CTC 수지로부터 펩타이드를 절단하는 것은 팽윤 처리의 전부 또는 일부를 구성할 수 있다. 절단 후, 및 팽윤 처리 완료 후, 지지체를 1회 이상 임의적으로 수축 세척하여 부가량의 펩타이드를 이러한 수축 세척액으로부터 회수할 뿐만 아니라, 1회 이상의 후속하는 임의적 팽윤 세척액으로부터 부가적인 펩타이드를 회수하는 능력을 향상시킨다. 이어 부가적 팽윤 처리를 구성하는 후속하는 임의적 팽윤 세척(들)을 수축 처리가 완료된 후 실시할 수 있다.
DCM과 같은 팽윤성 용매는 절단 시약의 성분으로 사용될 수 있기 때문에, 절단 처리는 상당량의 절단된 펩타이드가 액체 내로 추출되는 제 1 팽윤 처리를 구성할 수 있다. DCM 중의 TFA에 의해 팽윤되면, 비이드 부피는 절단 처리 개시시에 최대로 되는 경향이 있다. 상기 비이드는 여전히 팽윤되지만, 이들의 부피는 펩타이드가 액체 내로 추출되어 들어감에 따라서 감소될 것이다.
급랭 후, 용기 내용물을 비워 내고 수거하여, 세척액 내로 추출된 펩타이드를 회수한다. 펩타이드 물질을 함유하는 액체 혼합물이 필터를 통하여 액체에 의해 운반되어 용기 밖으로 나가게 하도록 압력을 가할 수 있다. 용기에 남아있는 비이드는 여전히 잔류 DCM을 함유할 것이며 또 여전히 어느 정도는 팽윤될 것이다. 상당량의 잔류 펩타이드는 또한 비이드에 유지되는 경향이 있으므로 수축성 및 팽윤성 처리는 잔류 펩타이드의 상당 부분을 회수하는 것을 돕는다.
선택적으로, 보통 약간의 농축이 이루어진 후를 제외하고 증류 등을 통하여 농축시키기 전에, 수집된 절단 시약을 세척하는 것이 바람직할 수 있다. 절단 후 물로 세척하는 것은 펩타이드 품질 및 약간의 수율을 향상시키는데 유용한 것으로 믿어진다. 예컨대, 절단 시약에서 TFA 및 기타 성분과의 접촉 시간 증가는 His 6에서의 트리틸 제거(detritylation) 및/또는 펩타이드의 에스터화에 의해 펩타이드 품질을 손상시킬 수 있다. 물에 의한 세척은 잔류 TFA 및 그의 부산물 제거에 유용한 것으로 믿어진다. 물에 의한 세척/추출 처리 후, 액체 혼합물을 증류 장치로 전달하여 예컨대 DCM 등을 제거함으로써 혼합물을 더 농축시킬 수 있다.
절단 혼합물을 용기로부터 비워 내고 펩타이드 회수를 위해 수집한 후, 용기 내용물을 1회 이상 부가적으로 팽윤 세척 처리시켜 부가적 펩타이드를 추출하여 회수할 수 있다. 이들 부가적 팽윤 세척은 용기를 세척하고 또 잔류하는 절단 시약과 부산물을 제거하는 것을 돕는다. 이러한 성분은 수축 처리를 실시하기 전에 제거되어서 수축성 액체가 이들과 반응하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 예컨대, 에탄올이 TFA와 반응할 수 있기 때문에, 에탄올을 함유하는 수축성 액체를 부가하기 전에 용기로부터 TFA를 제거하는 것이 바람직하다. 전형적인 팽윤 세척 처리는 약 2분 내지 2시간, 바람직하게는 약 10분 내지 약 50분간의 시간 동안 진탕시키면서 실시할 수 있다. 세척을 실시한 후, 용기로부터 세척액을 제거한 다음 증류 용기에 다른 팽윤 세척액과 함께 부가할 수 있다. 임의적으로, 증류 포트에 부가되기 전에, 이들 부가적 팽윤 세척액은 불순물을 제거하기 위하여 물 추출 처리시킬 수 있다.
일부 경우, 예컨대 결정화에 의해 순도를 향상시키는 단계를 실시함으로써 펩타이드 중간체 단편을 용액상 커플링을 위해 준비할 수 있다. 하나 이상의 T-20 펩타이드 중간체 단편을 IPA와 DCM의 혼합물, 또는 IPA와 물의 혼합물과 같은 IPA를 함유하는 용액으로 처리하여 펩타이드 중간체 단편을 결정화시킬 수 있다.
고상 합성, 수지로부터 절단, 및 펩타이드 중간체의 임의의 세척 또는 정제 후, 서열 EKNEQELLELDKWASLWNW(서열 번호: 3)를 갖는 펩타이드 중간체 단편을 페닐알라닌아마이드(F-NH2) 잔기와 반응시켜 서열 EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 4)를 갖는 펩타이드 중간체 단편을 생성시킨다. 이 용액상 반응은 본원에 기재된 바와 같은 적합한 용액상 반응 용액 중에서 실시할 수 있다. 이러한 펩타이드 중간체 생성물을 비용매, 예컨대 물에서 침전시키고 세척하여 순도를 향상시킬 수 있다.
T-20 측쇄-보호된 펩타이드 중간체 단편 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ(서열 번호: 2) 및 EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 4)를 용액 중에서 함께 커플링시켜 서열 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(서열 번호: 1)를 갖는 전체-길이 T-20 펩타이드를 생성시킨다. 이들 펩타이드 중간체 단편은 EKNEQELLELDKWASLWNWF 펩타이드 중간체 단편의 N-말단이 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ 펩타이드 단편의 C-말단에 커플링되도록 화학적으로 배열된다.
바람직하게는, 상기 펩타이드는 HPLC 프로파일(profile)에 기초하여 80% 이상, 보다 바람직하게는 82.5%, 가장 바람직하게는 85% 이상의 순도로 커플링 반응에 공급된다. 본 발명의 방법에 따르면, 낮은 로딩 계수를 이용하는 고상 합성은 더 높은 순도를 갖는 T-20 중간체 펩타이드 단편을 제조하기 위한 중요한 요지이다.
펩타이드 커플링 반응은 예컨대 문헌[New Trends in Peptide Coupling Reagents; 알베리치오(Albericio, Fernando); 친칠라(Chinchilla, Rafeal); 도즈워쓰(Dodsworth, David J.); 및 나제라(Najera, Armen); Organic Preparation and Procedures International (2003), 33(3), 203-303]에 개략적으로 개시되어 있다.
펩타이드 중간체 단편의 커플링은 동일 반응계 내의 커플링 시약, 예컨대 BOP, o-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), HATU, 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 수용성 카보다이이미드(WSCDI) 또는 o-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU)를 사용하여 실시할 수 있다. 다른 커플링 수법은 하이드록시석신이미드(HOSu) 및 p-나이트로페놀(HONp) 에스터와 같은 미리 형성된 활성 에스터; 미리 형성된 대칭적 무수물; N-카복시 무수물(NCAs); 또는 아실 플루오라이드 뿐만 아니라 아실 클로라이드와 같은 산 할라이드를 사용한다.
적합한 커플링 용매를 커플링 반응에 사용할 수 있다. 사용되는 커플링 용매(들)는 형성되는 펩타이드 결합의 라세미화 정도; 펩타이드 및/또는 펩타이드 단편의 용해도; 및 커플링 반응 속도에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있다.
일부 실시양태에서, 커플링 반응은 수혼화성 용매(들)를 포함한다. 수혼화성 용매의 예는 예컨대 DMSO, 피리딘, 클로로폼, 다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, N-메틸피롤리딘온, 다이메틸폼아마이드, 다이옥세인 또는 그의 혼합물을 포함한다.
다른 실시양태에서, 커플링 반응은 비-수혼화성 용매를 포함한다. 비-수혼화성 용매의 예는 염화메틸렌이다. 이들 실시양태에서, 비-수혼화성 용매는 바람직하게는 탈보호 반응과 양립성이며; 예컨대 비-수혼화성 용매가 사용되면, 바람직하게는 탈보호 반응에 나쁜 영향을 주지 않는다.
펩타이드 중간체 단편을 커플링시켜 T-20 펩타이드를 생성시킨 후, 상기 생성물을 탈보호시켜 측쇄 보호기를 제거할 수 있다.
전체적인 탈보호에 의한 측쇄 보호기의 제거는 전형적으로 측쇄 보호기를 절단하기 위한 산분해제(acidolytic agent)를 포함하는 탈보호 용액을 이용한다. 전체적인 탈보호를 위해 흔히 사용되는 산분해 시약은 순수한(neat) 트라이플루오로아세트산(TFA), HCl, BF3Et2O 또는 Me3SiBr과 같은 루이스산, 액체 플루오르화수소산(HF), 브롬화수소산(HBr), 트라이플루오로메테인 황산, 및 이들의 조합물을 포함한다. 탈보호 용액은 또한 하나 이상의 적합한 양이온 소거제(scavenger), 예컨대 다이티오트레이톨, 아니솔, p-크레솔, 에테인다이티올 또는 다이메틸 설파이드를 포함한다. 탈보호 용액은 또한 물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 탈보호 조성물에 존재하는 시약의 양은 "중량부" 또는 "부피부"와 같은 "부"의 분자로 표시되며 분모는 조성물의 전체 부이다. 예컨대, TFA:H2O:DTT를 90:5:5(중량/중량/중량)로 함유하는 탈보호 용액은 90/100중량부의 TFA, 5/100중량부의 H2O 및 5/100중량부의 DTT를 갖는다.
일부 실시양태에서, 탈보호 반응은 탈보호 조성물중 산분해제, 바람직하게는 TFA의 양이 90/100중량부보다 클 때 실시될 수 있다. 다른 바람직한 탈보호 조성물은 93/100중량부 이상 또는 93/100중량부 내지 95/100중량부 범위의 양의 산분해제를 포함한다.
T-20 펩타이드가 탈보호된 후, 및 최종 형태일 때, 임의적으로 상기 펩타이드 뱃치는 전체 합성 방안에서 상기 단계에 존재할 수 있는 응집된 펩타이드를 해응집(deaggregated) 처리할 수 있다.
펩타이드 샘플을 수성 염기에 용해시킨 다음 수성 혼합물을 산성화시켜 하나 이상의 염 및 보조 용매의 존재하에서 펩타이드를 침전시킴으로써 해응집을 실시할 수 있다. 바람직하게는, 염 및 보조 용매는 둘 다 해응집 용액에 존재한다. 해응집은 비교적 낮은 온도에서 펩타이드를 비교적 신속하게 침전시키는 것에 의해(적어도 산성화의 첫 단계에서 알칼리성 매질의 pH를 6 내지 7.5 범위로 감소시키며, 그후 최종 목적하는 pH, 예컨대 3 내지 6으로의 산성화는 더욱 천천히 실시할 수 있음) 실시할 수 있다.
해응집의 경우, 수성의 완충된 알칼리성 용액은 일반적으로 물, 하나 이상의 염, 및 목적하는 용해 pH를 제공하기에 충분한 양의 하나 이상의 염기를 포함하는 성분으로부터 유도된다. 수성의 완충된 알칼리성 용액을 구성하는 T-20 펩타이드 및 다양한 성분은 임의의 순서대로 조합될 수 있다. 실제의 한 모드에서는, 상기 용액을 그의 구성 성분으로부터 제조한 다음 펩타이드를 이미 제조된 용액에 부가한다. 다른 모드에서는, 펩타이드를 염을 포함하는 수용액에 부가할 수 있는데, 이때 용액은 용해가 일어나기에는 너무 낮은 pH를 갖는다. 이어 염기를 상기 혼합물에 부가하여 pH를 용해가 이루어지는 값으로 상승시킨다. 다른 실시양태에서는, 용해 전, 도중 및/또는 후에 염을 용액에 부가할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드가 이하에 추가로 기재되는 바와 같이 침전되도록 하는 방식으로 pH가 저하되기 전에 염을 용액 내로 혼입한다.
용액 중의 펩타이드의 농도는 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있다. 일반적인 지침으로서, 용액 중의 T-20 펩타이드 농도는 약 3g/L 내지 약 6g/L 범위일 수 있다.
하나 이상의 다양한 염기가 상기 용액에 혼입되어 목적하는 pH를 제공할 수 있다. 적합한 염기의 대표예는 NaOH와 같은 수산화물 염기 및 중탄산나트륨 또는 중탄산 칼륨 또는 탄산나트륨 또는 탄산칼륨과 같은 중탄산염 및 탄산염 염기를 포함한다. 수산화나트륨이 바람직하고, 특히 0.5N 내지 1N NaOH가 바람직하다. 염기는 pH를 펩타이드가 적정한 시간 내에 용액에 용해되는 목적하는 값으로 조절하기 위해 사용된다. 다수의 펩타이드의 경우, 이것은 약 8 내지 약 11 범위의 용해 pH에 상응한다.
용액의 염 성분(들)은 침전되는 펩타이드의 용해 특징을 향상시킨다. 특히, 염이 적절한 농도로 존재할 때 보다 낮은 pH의 수용액에서 용이하게 용해되는 가용성 펩타이드가 더욱 일정하게 제조된다.
본 발명을 실시함에 있어서 다양한 염이 유용할 수 있다. 그 예는 탄산나트륨, 아세트산나트륨, 탄산암모늄, 아세트산암모늄, 중탄산나트륨, 중탄산암모늄, 이들의 나트륨 및 칼륨 버젼(version), 이들의 조합물 등을 포함한다. 아세트산암모늄이 가장 바람직하다.
용액 중의 염의 농도는 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있다. 1 내지 200mM에 상응하는 염은 적합한 염 농도 범위의 일례이다. 구체적인 실시 모드에서는, 약 5mM 내지 약 50mM, 보다 바람직하게는 약 10mM의 염, 특히 아세트산암모늄이 적합한 것으로 밝혀졌다.
용해 온도(들)는 일반적으로 펩타이드가 용해되는 수용액의 온도(들)를 지칭한다. 용해는 임의의 적합한 온도에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, 약 10℃ 내지 약 30℃ 범위, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 25℃ 범위, 더욱 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 20℃ 범위의 하나 이상의 온도에서 유지되는 용액에 펩타이드를 용해시키는 것이 바람직할 것이다.
보조 용매는 바람직하게는 보조 용매 존재하에서 펩타이드의 후속 침전이 발생되도록 용액에 혼입된다. 보조 용매는 용해 전, 도중 및/또는 후에 부가될 수 있지만, 바람직하게는 펩타이드의 용해 직후에 부가된다. 보조 용매는 용해 pH에서 펩타이드가 가용성인 하나 이상의 부가적 용매를 지칭한다. 바람직하게는, 펩타이드가 펩타이드의 측정된 분자량 대 펩타이드의 이론적 분자량의 비가 약 2:1 내지 약 1:1 범위이기에 충분히 해응집될 때 펩타이드는 또한 25℃ 및 생리적 pH에서 보조 용매에 가용성이다. 보조 용매의 예는 아세토나이트릴, 메탄올, 이들의 조합물 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 용액이 약 2 내지 50부피%, 바람직하게는 약 5 내지 약 30부피%, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 20부피%의 보조 용매를 함유하기에 충분한 양의 보조 용매를 용액에 부가한다.
용해 후 및 바람직하게는 보조 용매를 부가한 후, 필요한 경우 펩타이드의 추가적인 해응집을 더 용이하게 하기 위해 부가적 염기를 부가함에 의해 용액의 pH를 추가로 증가시킬 수 있다. 이어 용액을 바람직하게는 즉시 여과한다. 0.2마이크론 필터를 통한 압력 여과가 적합할 것이다. 여액을 임의적으로 진공하에서 탈기시키며, 그후 해응집 공정을 완료하기 위하여 추가의 공정을 실시하기 전에 상기 용액을 적합한 시간 동안 숙성(aged)시킬 수 있다. 일반적으로 펩타이드가 상승한 pH에서 존재하는 전체 시간(단지 숙성 시간만이 아니라 여과 시간, 탈기 시간 등을 포함함)이 약 5분 내지 약 6시간, 보다 바람직하게는 약 30분 내지 약 2시간이도록 숙성시킨다. 숙성 후, 용액을 임의적으로 다시 여과할 수 있다.
숙성 후, 펩타이드를 침전시키는데 효과적인 조건하에서 용액의 pH를 감소(예컨대 산성화)시킨다. 일반적인 지침으로서, 약 3 내지 약 6, 바람직하게는 4 내지 약 6 범위의 최종 pH가 적합할 수 있다.
용액의 pH는 바람직하게는 하나 이상의 산을 용액에 부가함으로써 감소될 수 있다. 산의 예는 HCl, 황산, 아세트산, 옥살산, 이들의 조합물 등을 포함한다. 아세트산이 바람직하다. 예컨대, 5% 또는 10% 아세트산 수용액이 적합한 것으로 밝혀졌다.
일부 실시 모드에서는, 산을 비교적 신속하게 부가하여 pH를 중간 pH까지 저하시키면 탁월한 용해 특성을 갖는 펩타이드 생성물을 얻을 수 있다. 산의 이러한 초기의 비교적 신속한 부가 후, 두번째로 산을 비교적 낮은 속도로 부가하여 용액의 pH를 최종의 목적하는 pH로 낮춘다. 적합한 중간 pH 값은 약 6 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.5 범위일 수 있다. 바람직하게는, pH를 초기에 신속하게 저하시키는 것은 약 1시간 미만, 바람직하게는 30분 이하, 더욱 바람직하게는 15분 이하의 시간 동안 실시한다.
예컨대, 하나의 적합한 실시 모드는 pH 11에서 먼저 T-20 용액의 pH를 저하시킴을 포함한다. 충분한 양의 산을 비교적 신속하게 10분간에 걸쳐 부가하여 pH를 약 6.0의 중간 값까지 저하시킨다. 이어 산을 10 내지 20분간에 걸쳐 더욱 서서히 부가하여 pH를 5.3 내지 5.5로 저하시킨다.
산을 부가하는 동안 상기 혼합물을 잘 혼합하여 펩타이드의 침전을 유발한다. 일반적 지침으로서, 혼합물의 발포를 피하기 위해 충분히 안전한 한계를 두면서 가능한 한 격렬하게 산을 부가하면서 혼합물을 진탕시키는 것이 바람직하다.
펩타이드의 침전을 유발하는 산의 부가는 임의의 적합한 온도의 용액을 사용하여 실시할 수 있다. 지침으로서, 10℃ 내지 30℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃, 가장 바람직하게는 16℃ 내지 18℃ 범위의 온도에서 침전을 실시하는 것이 적합할 것이다.
침전 후, 펩타이드를 바람직하게 단리하고 다른 성분과 조합하기 전에 건조시키고, 동결건조, 포장, 저장, 추가 가공 및/또는 다른 처리를 수행할 수 있다. 임의의 적합한 방식으로 이를 달성할 수 있다. 한 적합한 방법에 따라, 펩타이드를 여과에 의해 수집하고, 충분한 물로 세척하여 최종 염 함량을 적합한 수준으로 감소시킨 다음 건조시킨다.
펩타이드가 여과하기에 부적절한 형태로 침전되면(예컨대 침전물이 "젤과 같은" 형태이면), 상기 침전물을 바람직하게 진탕하면서 숙성 공정에서 처리하여, 펩타이드 입자를 응집시켜 입자를 "경화"시킬 수 있다.
바람직한 실시 모드에서, 상기 숙성-경화 처리는 펩타이드를 냉각/가열/냉각 처리 도중에 진탕에 의해 숙성시키는 것을 포함한다. 이것은 펩타이드 3차 구조에 과도한 손상없이 펩타이드의 여과 특성을 향상시킨다. 특정 실시 모드에서, 상기 처리는 수성 혼합물 중의 입자를 주위 온도 미만, 바람직하게는 0℃ 내지 약 20℃, 바람직하게는 10℃ 내지 20℃, 더욱 바람직하게는 약 16℃의 제 1 온도에서 5분 내지 48시간, 바람직하게는 30분 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 30분 내지 2시간 동안 숙성시킴을 포함한다. 진탕은 바람직하게는 입자가 숙성되는 동안 잘 분산되도록 하기 위해 이용된다.
이어, 혼합물의 온도를 약 2℃ 내지 약 30℃, 바람직하게는 약 5℃ 내지 약 15℃씩 증가시켜 중간 정도의 승온으로 높이며, 이때 승온으로의 전이는 약 1분 내지 약 48시간, 바람직하게는 5분 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 20분 내지 2시간 동안에 걸쳐 진탕시킴으로써 이루어진다. 바람직하게는, 새로운 중간 정도의 승온은 여전히 주위 온도 이하이다. 특정 실시 모드에서, 약 1시간 동안 온도를 16℃에서 21℃로 승온시키는 것이 적합한 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는 상기 전이 동안 계속 진탕시킨다. 상기 혼합물을 승온에서 5분 내지 8시간, 바람직하게는 20분 내지 4시간, 더욱 바람직하게는 약 3시간 동안 진탕시키면서 숙성시킨다.
상기 숙성 단계 후, 혼합물의 온도를 약 2℃ 내지 약 30℃, 바람직하게는 약 5℃ 내지 약 15℃씩 중간 정도의 더 차가운 온도로 감소시키며, 이때 더 차가운 온도로의 전이는 바람직하게는 약 1분 내지 약 48시간, 바람직하게는 5분 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 20분 내지 4시간의 기간에 걸쳐 진탕시킴으로써 이루어진다. 바람직하게는, 상기 새로운 중간 정도의 더 차가운 온도는 약 3℃ 내지 약 18℃ 범위, 보다 바람직하게는 약 10℃이다. 특정 실시 모드에서, 약 2시간 동안 온도를 21℃에서 10℃로 냉각시키는 것이 적합한 것으로 밝혀졌다. 상기 혼합물을 더 차가운 온도에서 약 5분 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 약 6시간의 기간 동안 더 숙성시킨다.
상기 숙성 처리는 여액으로부터의 펩타이드 입자의 여과 및 분리가 펩타이드의 2차 구조의 과도한 변화없이 더욱 용이하게 실시되는 점에서 침전 입자의 여과 특징을 향상시킨다.
따라서, 이 숙성 후, 침전물을 여과하고, 바람직하게는 압력 여과한다(1psig N2). 여과 케이크를 약 3℃ 내지 약 20℃, 바람직하게는 5℃ 내지 약 15℃, 더욱 바람직하게는 약 10℃의 온도로 예비냉각시킨 물로 1회 이상 세척할 수 있다. 이것은 케이크의 염 함량을 저하시키는데 도움이 된다. 적합한 온도에서 적합한 시간 동안, 예컨대 1분 내지 48시간, 바람직하게는 5분 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 약 6시간동안 케이크를 통해 질소를 통과시키는 것에 의해 여과 케이크를 부분적으로 또는 완전히 건조시킬 수 있다. 대략 주위 온도의 질소를 사용하는 것이 편리하고 적합하다. 건조를 용이하게 하도록 상기 케이크를 주기적으로 혼합할 수 있다. 건조는 임의적으로 별개의 건조 장치에서 종결될 수 있다. 이러한 임의적인 건조는 바람직하게는 진공하에, 예컨대 30mmHg 미만에서, 펩타이드를 분해하지 않는 적절한 온도, 예컨대 약 30℃ 미만, 바람직하게는 약 28℃ 미만의 온도에서 실시된다.
이하의 예시적 실시예를 참조하여 본 발명의 원리를 더욱 자세하게 설명한다.
이하의 실시예에서, 하기 표준 시약 및 명명법을 채용한다:
클로라닐 시험: 클로라닐 시험 용액은 톨루엔중 클로라닐의 포화 용액 1방울을 약 1mL의 아세톤에 부가함으로써 제조하였다. NMP 세척액은 세척액 1방울을 클로라닐 시험 용액에 부가함으로써 시험하였다. 청색 또는 보라색은 2급 아민의 존재에 대한 양성 표시이며, 이는 Fmoc 탈보호된 부산물 및/또는 잔류 피페리딘이 여전히 존재함을 나타낸다.
닌하이드린(카이저) 시험: 닌하이드린 정성 시험에서는, 수지의 2 내지 20mg 샘플을 빼내고 이것을 NMP로 세척한 다음 DCM 또는 메탄올로 세척하였다. 에탄올 중 페놀의 76% 용액 3방울, 피리딘중 KCN의 0.2mM 용액 6방울 및 에탄올중 닌하이드린의 0.28M 용액 3방울을 상기 샘플에 부가하고 이 샘플을 약 100℃의 가열 블록에 약 5분간 두었다. 샘플을 제거하고 에탄올/물 용액(9:1)으로 즉시 희석시켰다. 청색 또는 보라색은 유리 아민의 존재에 대한 양성 표시이며, 커플링 반응이 완결되지 않았음을 나타낸다. 1시간의 커플링 반응 후에 양성 닌하이드린 시험이 관찰되면, 커플링 반응을 추가로 1시간동안 지속시켰다. 3시간의 커플링 반응 후에 양 성 닌하이드린 시험이 발생되면, 용기를 비우고, 약 1당량의 활성화된 아미노산 및 시약을 사용하여 커플링 반응을 반복하였다.
실시예
1
T-20 중간체 단편
Ac
-
AA
(1-16)
OH
(서열 번호: 2)의 고상 합성
Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-ILe-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-O-2-CTC 수지[단편 Ac-AA(1-16)O-2-CTC-수지]를 생성하기 위한 고상 합성을 실시하였다.
Fmoc-Gln(OtBu)-O-2-CTC 수지(20.0g)를 240mL의 DCM과 함께 고상 합성 반응기에 장입하였다. 이 혼합물을 25℃에서 30분간 교반하였다. 챔버를 비워 내고 수지 상(resin bed)을 120mL의 NMP로 3회 세척하였다. (모든 세척에 있어서 사용된 액체의 양은 세척 1회당 액체의 양이다.)
NMP중 5% 피페리딘 120mL를 상기 반응기에 장입한 다음 30±2℃에서 30분간 교반하였다. 이 반응기를 비워 낸 다음 NMP중 5% 피페리딘 100mL를 장입하였다. 이 혼합물을 30±3℃에서 30분간 교반한 다음 반응기를 비워 내었다. 이 혼합물을 120mL NMP로 3회 세척하였다. 닌하이드린 정성 시험에 의한 피페리딘 수준 측정을 위해 마지막 세척액의 샘플을 채취하고; 피페리딘 수준이 3500ppm 이상이면, 4회째 세척을 수행하였다.
잔기 #15에서 잔기 #1까지 실시된 커플링 순서는 다음과 같다:
Q→Q→N→Q→S→E→E→I→L→S→H→I→L→S→T→Y
커플링은 1.5당량의 적합한 아미노산, 1.5당량의 HOBt 수화물, 및 90mL의 NMP를 부가하여 실시하였다. 내용물을 교반하여 고형분을 용해시킨 다음 1.7당량의 DIEA를 부가하였다. 용액이 균질화된 후, 얼음 욕에서 0 내지 5℃로 15분간 냉각시켰다. 이어, 54mL NMP중 HBTU 1.5당량의 용액을 상기 냉각된 아미노산 용액에 부가한 다음 48mL의 DCM을 부가하였다. 활성화된 아미노산 용액을 상기 수지를 함유하는 반응기에 부가하였다. 상기 혼합물을 30±3℃에서 3시간 동안 교반하였다. 카이저 시험에 의해 반응의 종결을 시험하기 위하여 수지 비이드의 샘플을 채취하였다. 반응이 종결된 후, 반응기를 비워 내고 수지 상을 120mL NMP로 세척하였다.
탈보호 및 적합한 아미노산을 사용한 커플링 단계를 순차적으로 실시하여 Ac-AA(1-16)O-2-CTC-수지를 생성하였다.
이어, 120mL NMP중 아세트산 무수물 5당량의 용액을 제조하였다. 5당량의 DIEA를 상기 용액에 부가하였다. 상기 반응기에 아세트산 무수물 용액을 부가하고 그 혼합물을 30±3℃에서 1 내지 3시간 동안 교반하였다. 카이저 시험에 의해 반응 종결을 시험하기 위해 수지 비이드의 샘플을 채취하였다.
실시예
2
고상 수지로부터의
Ac
-
AA
(1-16)
OH
(서열 번호: 2)의 절단 및 정제
실시예 1에서 제조된 CTC 수지로부터의 인접 Ac-AA(1-16)OH 펩타이드의 절단을 실시하였다.
수지로부터 펩타이드를 절단하기 위하여, 펩타이드-커플링된 수지(실시예 1에서와 같이 제조)를 100mL NMP로 3회 세척한 다음 200mL DCM으로 5회 세척하였다. 마지막 NMP 세척하는 동안, 반응기를 -5℃로 냉각하였다.
이어, 4mL 트라이플루오로아세트산 및 196mL DCM의 용액을 제조하고 -10℃로 냉각시킨 다음 반응기에 부가하고 0±5℃에서 30분간 교반하였다. 이어, 1.2당량의 피리딘(4.8mL)을 부가하고 그 수지를 5℃로 승온시키며 절단 용액을 여과하면서 100mL의 물에 부가하였다. 수지를 100mL DCM으로 세척하고 DCM/물과 조합하였다. DCM/물을 15분간 교반한 다음 층을 분리하고 DCM을 100mL 물로 세척하였다. 두번째 물 세척액이 DCM 층으로부터 분리된 후, 약 200mL 증류물이 수집될 때까지 DCM을 감압하에서 스트립핑(stripping)시켰다. 100mL 물을 DCM에 부가하였다.
수지를 DCM으로 2회 세척하고 또 세척액을 DCM/물 혼합물과 조합하였다. 상기 혼합물을 30분간 교반한 다음 층을 분리하였다. 물 층을 다시 100mL DCM으로 역추출하였다. 모든 DCM 세척액을 조합하였다.
DCM/단편 용액을 감압하에서 약 80mL 용액이 잔류할 때까지 스트립핑시켰다. DCM 용액을 4개 분량으로 375mL 헵테인에 부가하였다. DCM/단편 용액의 각각의 부가후, 상기 혼합물을 약 40mL 증류물이 수집될 때까지 스트립핑시켰다. DMC 용액 전부가 전달된 후, 80mL의 부가적 헵테인과 함께 용기를 헹구기 위해 사용되는 20g의 DMC 용액을 다시 부가하였다. 헵테인/DCM 슬러리를 여과하고 24mL 헵테인으로 세척하였다. 세척이 완료된 후, 단편을 진공하에서 건조시켰다.
실시예
3
FmocTrp
(
Boc
)-
로딩된
2-
CTC
수지의 제조
5L 펩타이드 반응기를 질소로 퍼지시킨 다음 200g의 2-CTC 수지와 2L의 DCM을 장입하였다. 수지-DCM 혼합물을 25±2℃에서 30분간 교반하였다. 한편, 51.8g Fmoc-Trp(Boc)OH, 1.4L DMF, 200mL DCM 및 26.66g DIEA를 2L 플라스크에 장입하였다. 플라스크 내용물을 주위 온도에서 교반하여 고형분을 용해시켰다.
DCM을 반응기로부터 빼낸 후, Fmoc-Trp(Boc)OH를 함유하는 혼합물을 수지와 함께 반응기에 장입하고 질소하에 25±2℃에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후 반응기를 비워 내었다.
수지 상의 활성 부위는 혼합물 DIEA:MeOH(200:1800mL)에 의해 말단-캡핑(end-capped)하였다. 이 혼합물을 25±2℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상을 비워 내고, 2L DMF로 1회, 1L DMF로 1회 및 2L DCM으로 4회 세척하였다. 마지막 2L DCM 세척액은 음의 UV 시험을 나타내었다.
수지를 2L N-메틸-피롤리돈(NMP)을 사용하여 3회 세척한 다음 28±2℃에서 30분간 교반하면서 NMP중 20% 피페리딘 2.75L로 처리하였다. 이 반응기를 비워 내고 피페리딘 처리 단계를 반복하였다. 상을 비워 내고 3L NMP로 5회 세척한 다음 3 L DMF로 5회 세척하였다. 1.5L IPA를 사용하여 3회 세척함으로써 수지로부터 팽윤을 제거하였다. 수지를 40±2℃에서 일정 중량까지 진공 건조시켜 220.06g의 로딩된 수지를 얻었다.
수지로부터 아미노산을 절단하고 기준물에 대하여 분석함으로써 정량적 HPLC 분석을 실시하였다. 상기 물질의 HPLC 분석은 0.37밀리몰/g의 수지의 로딩을 나타내었다.
칼럼: 베타베이직(Betabasic)-18, 150 x 4.6mm, 3㎛ 입자 크기, 150Å 기공 크기.
유량: 1.25mL/분
검출: 260nM에서 UV
이동상: A: 물중 10nM TEAP B: 아세토나이트릴
체류 시간: 약 13분.
실시예
4
T-20 중간체 단편
Fmoc
-
AA
(17-35)(서열 번호: 2)의 고상 합성
Fmoc-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-O-2-CTC 수지[단편 Fmoc-AA(17-35)O-2-CTC 수지]를 생성하기 위한 고상 합성을 실시하였다.
고상 반응 챔버에서 H-Trp(Boc)-O-2-CTC 수지(10.15g; 실시예 3에서 제조됨) 및 122mL DCM을 조합하였다. 이 혼합물을 30±3℃에서 30분간 교반하였다. 반응기를 비워 내고 수지 상을 61mL NMP로 3회 세척하였다. (모든 세척의 경우, 사용된 액체의 양은 세척 1회당 액체의 양이다.)
잔기 #34에서부터 잔기 #18까지(성숙 T-20 서열의 아미노산 번호를 나타냄) 실시된 커플링의 순서는 다음과 같다:
W→N→W→L→S→A→W→K→D→L→E→L→L→E→Q→E→N→K→E
(잔기 #34) 이어, 7.24g Fmoc-Asn(Trt)OH, 1.86g HOBT 일수화물, 1.79g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에서 조합하고 그 내용물을 주위 온도에서 교반하여 고형분을 용해시키고 그 용액을 10℃로 냉각시켰다.
이어, 별개의 플라스크에서 4.58g HBTU 및 15mL NMP를 조합하고 주위온도에서 교반하여 고형분을 용해시키고 10℃로 냉각시켰다. 냉각된 HBTU 용액을 Fmoc- Asn(Trt)OH 용액에 부가하고 이 용액을 SPPS 반응기에 장입하였다. 플라스크를 13mL DCM으로 세척하고 세척액을 SPPS 반응기에 장입하였다. 이 혼합물을 30±3℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 종결에 대해 시험하기 위하여 수지 비이드의 샘플을 채취하였다(카이저 시험). 반응이 완료되면, 반응기를 비워 내고 수지 상을 120mL NMP로 4회 세척하였다.
이어, NMP 중의 20% 피페리딘 61mL를 반응기에 장입하고 30±3℃에서 30분간 교반하였다. 반응기를 비워 내고 NMP 중의 20% 피페리딘 61mL를 반응기에 부가하였다. 이 혼합물을 30±3℃에서 30분간 교반하고 반응기를 비워내었다. 수지 상을 61mL NMP로 5회 세척하였다. 닌하이드린 정성 시험에 의해 피페리딘 수준을 시험하기 위하여 마지막 세척액의 샘플을 채취하였다.
(잔기 #33) 이어, 6.39g Fmoc-Trp(Boc)OH, 1.87g HOBT 일수화물, 1.82g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에서 나타낸 바와 같이 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.60g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 내용물을 용해시키고, 냉각시키고, 수지와 혼합하고, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 수지 상이 61mL NMP로 6회 세척되는 것을 제외하고는 제 1 단계에 지시된 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고, 세척하고 시험하였다.
(잔기 #32) 이어, 4.27g Fmoc-Leu-OH, 1.86g HOBT 일수화물, 1.83g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물 을 용해시키고 또 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.60g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #31) 이어, 4.65g Fmoc-Ser(tBu)-OH, 1.86g HOBT 일수화물, 1.81g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.60g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #30) 이어, 4.00g Fmoc-Ala-OH, 1.87g HOBT 일수화물, 1.78g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.59g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #29) 이어, 6.39g Fmoc-Trp(Boc)-OH, 1.86g HOBT 일수화물, 1.78g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.59g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #28) 이어, 5.71g Fmoc-Lys(Boc)-OH, 1.86g HOBT 일수화물, 1.81g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.58g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 수지 상을 61mL NMP로 6회 세척한 것을 제외하고는 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #27) 이어, 4.98g Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 1.92g HOBT 일수화물, 1.78g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.58g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #26) 이어, 4.27g Fmoc-Leu-OH, 1.86g HOBT 일수화물, 1.80g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.59g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #25) 이어, 5.15g Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 1.88g HOBT 일수화물, 1.80g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.58g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #24) 이어, 4.28g Fmoc-Leu-OH, 1.88g HOBT 일수화물, 1.77g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.59g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하 였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #23) 이어, 4.27g Fmoc-Leu-OH, 1.88g HOBT 일수화물, 1.77g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.60g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 수지 상을 61mL NMP로 6회 세척한 것을 제외하고는 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #22) 이어, 5.16g Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 1.88g HOBT 일수화물, 1.76g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 4.59g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고 세척하고 시험하였다.
(잔기 #21) 이어, 8.38g Fmoc-Gln(trt)-OH, 2.13g HOBT 일수화물, 2.01g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 5.22g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 카이저 시험은 불완전 반응을 나타내었다. 반응기를 비워 내고 시약의 50% 를 사용하여 1.5시간 동안 재커플링 반응을 실시함으로써 재커플링 반응을 실시하였다. 커플링 반응이 완료되면, 반응기를 비워 내고 수지 상을 120mL NMP를 사용하여 4회 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고, 세척하고 시험하였다.
(잔기 #20) 이어, 5.84g Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.15g HOBT 일수화물, 2.05g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 5.21g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고, 세척하고 시험하였다.
(잔기 #19) 이어, 8.44g Fmoc-Asn(Trt)-OH, 2.18g HOBT 일수화물, 2.09g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 5.36g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고, 세척하고 시험하였다.
(잔기 #18) 이어, 6.43g Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2.11g HOBT 일수화물, 2.09g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 5.20g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 반응기를 비워 내고 수지를 101.5mL NMP로 3회 세척하였다. 커플링 반응이 완료되면, 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 수지를 피페리딘 용액으로 처리하고, 세척하고 시험하였다.
(잔기 #17) 이어, 3.18g Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 1.28g HOBT 일수화물, 1.11g DIEA 및 25.1mL NMP를 플라스크에 장입하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이 그 내용물을 용해시키고 냉각시켰다.
별개의 플라스크에서 2.38g HBTU 및 15mL NMP를 조합하였다. 제 1 단계에 나타낸 바와 같이, 그 내용물을 용해, 냉각, 수지와 혼합, 커플링, 시험 및 세척하였다. 수지 상을 120mL DCM으로 5회 세척하고 또 120mL 아이소프로판올로 4회 세척하였다. 수지를 40±2℃에서 진공 건조시켜 20.77g을 수득하였다.
실시예
5
고상 수지로부터의
Fmoc
-
AA
(17-35)(서열 번호: 3)의 절단 및 정제
실시예 4에서 제조된 CTC 수지로부터 인접 Fmoc-AA(17-35)OH 펩타이드의 절단을 실시하였다.
수지로부터 펩타이드를 절단하기 위하여, 20.76g의 펩타이드-커플링된 수지를 반응기에서 208mL DCM과 조합하였다. 수지 및 DCM을 주위 온도에서 약 5분간 교반하였다. 반응기를 비워 내고 137mL DCM을 사용하여 DCM 세척을 2회 더 실시하였다. (모든 세척의 경우에서 사용된 액체의 양은 세척 1회당 액체의 양이다.) 반응기를 -10±5℃로 냉각하였다.
이어, 2.81g 트라이플루오로아세트산 및 201mL DCM의 용액을 제조하고 0±5℃로 냉각시켰다.
냉각된 TFA 용액을 반응기에 장입하고 슬러리를 0±5℃에서 30분간 교반하였다. 이어, 2.81g 피리딘을 상기 반응기에 부가하고 0±5℃에서 5분간 더 교반하였다. 반응기를 비워 내고 수지 상을 137mL DCM으로 주위 온도에서 7회 세척하였다. 모아진 DCM 세척액을 137mL DCM으로 세척하고 DCM을 진공 증류제거하여 건조시켰다. 잔류물을 35mL DCM에 용해시켰다. 이어, 137mL 아이소프로판올을 부가한 다음 진공하에서 약 75mL 부피까지 농축시키고, 10℃로 냉각시키고 또 100mL 물을 부가하였다. 슬러리를 0℃로 냉각시키고 또 1시간 동안 숙성시켰다. 생성물을 여과하고 5℃의 물 25mL로 세척하였다. 그 생성물을 40±2℃에서 진공 건조시켜 12.9g(69.1%)의 생성물을 수득하였다.
실시예
6
H-
AA
(17-36)
NH
2
(서열 번호: 4)
의 용액상
합성
T-20 중간체 단편 H-AA(17-36)NH2는 PheNH2를 Fmoc-AA(17-35)OH에 용액상커 플링함으로써 제조하였다.
Fmoc-AA(17-35)OH(12.0g, 2.83밀리몰, 1.0당량), PheNH2·HCl(0.74g, 3.68밀리몰, 1.3당량), 6-클로로 HOBT(0.96g, 5.66밀리몰, 2.0당량)를 DMF(100mL, 8.3부피)에 용해시켰다. 이 용액을 -10℃로 냉각시키고 또 DMF(5mL, 3.6부피) 중의 DIEA(1.4mL, 7.92밀리몰, 2.8당량)를 부가하였다. TBTU(1.2g, 3.68밀리몰, 1.3당량)를 한꺼번에 부가한 다음 DMF(15mL)로 헹구었다. 반응 혼합물을 -10℃에서 하룻밤동안 교반하고 주위 온도로 승온시켰다. 4시간 동안 더 교반을 계속하였다. 반응의 완료는 HPLC 분석에 의해 모니터링하며, 이는 0.4% 출발 Fmoc-AA(17-35)OH가 잔존함을 보여주었다. 피페리딘(1.23mL, 14.43밀리몰, 5.1당량)을 부가하고 그 용액을 30℃에서 3시간 동안 교반하였다. Fmoc 제거의 완료는 HPLC 분석에 의해 모니터링하며, 1% 미만의 Fmoc-AA(17-36)NH2를 나타내었다. 물(100mL, 8.3부피)을 부가하여 생성물을 침전시켰다. 고체를 흡입 여과에 의해 수집하고 물로 세척하였다. 주위 온도에서 하룻밤동안 건조시켜 11.85g(101%, % AN HPLC)을 수득하였다.
H-AA(17-36)NH2(11.85g)를 1:EtOH:물(200mL, 17부피)에 현탁시켰다. 슬러리를 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 흡입 여과 및 일정 중량으로의 건조는 80.0%(AN HPLC)의 순도를 갖는 11.6g(상기 두 단계에 대해 98.9%의 수율)을 제공하였다.
HPLC 조건:
칼럼: 졸박스-ACE, 3㎛, C18, 3.0 x 100mm
검출기: UV@220nm
유량: 0.6mL/분
이동상: A: 0.10% TFA/물/40% IPA B: 0.07% TFA/아세토나이트릴/40% IPA
구배: 0분 70% B, 8분 80% B, 15 내지 16분 90% B, 16.1 내지 20분 70% B
체류 시간: 적합하게는 8분
실시예
7
Ac
-
AA
(1-36)
NH
2
(서열 번호: 1)
의 용액상
합성
Ac-AA(1-16)OH를 H-AA(17-36)NH2와 용액상 커플링시켜 단편 Ac-AA(1-36)NH2 (서열 번호: 1)를 수득함에 의해 T-20 최종 생성물을 제조하였다.
H-AA(17-36)NH2(1당량), Ac-AA(1-16)OH(1당량) 및 6-클로로 HOBT(1.5당량)를 20부피의 DMF에 30분간 용해시켰다. 이 용액을 0±5℃로 냉각시키고 또 DIEA(1.85당량)에 이어 HBTU(1.2당량)를 부가하였다. 0℃에서 하룻밤동안 교반한 후, 물(50mL)을 적가하였다. 생성된 슬러리를 주위 온도에서 3 내지 4시간 동안 교반하고 그 생성물을 흡입 여과에 의해 단리하였다. 생성물을 진공 오븐에서 45℃에서 하룻밤동안 건조시켰다.
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Improved Synthesis Using Peptide Intermediate Fragments II
<130> Case 22972
<150> US 60/640711
<151> 2004-12-30
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 1
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1 5 10 15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30
Trp Asn Trp Phe
35
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 2
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1 5 10 15
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
1 5 10 15
Trp Asn Trp
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 4
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
1 5 10 15
Trp Asn Trp
Claims (16)
- (a) 화학식 Z-Q-[SUP]의 고상 합성 지지체 수지를 제공하는 단계;(b) Z-Q-[SUP]에 아미노산을 커플링시켜 Z-YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP]를 제공하는 단계;(c) Z-YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP]를 처리하여 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH(서열 번호: 2) 절단 생성물을 제공하는 단계; 및(d) Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH(서열 번호: 2)를 사용하여 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)의 전부 또는 일부를 포함하는 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는, 서열 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)를 갖는 펩타이드 또는 그의 대응물의 합성을 위한 펩타이드 중간체 단편의 제조 방법으로서,여기서, [SUP]는 지지체 수지이고, Q는 글루타민 잔기이고, Z는 NH2-말단 보호 기이며, Z-Q는 [SUP] 상에 0.5 이하의 로딩 계수로 존재하는, 방법.
- 제 1 항에 있어서,단계 (a)에서 [SUP]가 트리틸기를 포함하는, 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,단계 (a)에서 [SUP]가 클로로-트리틸기를 포함하는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,Z가 Fmoc 기인 방법.
- 제 1 항에 있어서,단계 (a)에서 Z-Q가 [SUP] 상에 0.5 미만의 로딩 계수로 존재하는, 방법.
- 제 5 항에 있어서,단계 (a)에서 Z-Q가 [SUP] 상에 0.2 내지 0.5의 로딩 계수로 존재하는, 방법.
- 제 1 항에 있어서,단계 (b)에서 아미노산을 Z-Q-[SUP]에 1 내지 1.5당량의 양으로 커플링시키는, 방법.
- 제 1 항에 있어서,단계 (d)에서 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH(서열 번호: 2)를 서열 H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 4)를 갖는 펩타이드와 반응시켜, 서열 Ac- YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)를 갖는 펩타이드를 제공하는, 방법.
- 제 8 항에 있어서,Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH(서열 번호: 3)를 페닐알라닌아마이드와 반응시킴으로써 H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 4)를 생성시키는, 방법.
- (a) 화학식 Z-W-[SUP]의 고상 합성 지지체 수지를 제공하는 단계;(b) Z-W-[SUP]에 아미노산을 커플링시켜 Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-[SUP]를 제공하는 단계;(c) Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-[SUP]를 처리하여 Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH(서열 번호: 3) 절단 생성물을 제공하는 단계; 및(d) Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH(서열 번호: 3)를 사용하여 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)의 전부 또는 일부를 포함하는 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는, 서열 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)를 갖는 펩타이드 또는 그의 대응물의 합성을 위한 펩타이드 중간체 단편의 제조 방법으로서,여기서, [SUP]는 지지체 수지이고, W는 트립토판 잔기이고, Z는 NH2-말단 보호 기이며, Z-W는 [SUP] 상에 0.5 이하의 로딩 계수로 존재하는, 방법.
- 제 10 항에 있어서,단계 (d)에서 Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH(서열 번호: 3)를 페닐알라닌아마이드와 반응시켜 H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 4)를 생성시키는, 방법.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 4)를 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH(서열 번호: 2)와 반응시켜 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)를 제공하는, 방법.
- (a) 서열 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-ON(서열 번호: 2) 및 Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH(서열 번호: 3)의 펩타이드 중간체 단편을 제공하는 단계;(b) 용액층에서, Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH(서열 번호: 3)를 페닐알라닌아마이드 잔기와 반응시켜 서열 H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 4)를 제공하는 단계; 및(c) 용액층에서, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH(서열 번호: 2)를 H- EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 4)와 반응시켜 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)를 제공하는 단계를 포함하는, 서열 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 번호: 1)를 갖는 펩타이드 또는 그의 대응물의 합성을 위한 펩타이드 중간체 단편의 제조 방법으로서,고체 지지체 상에서 0.5 이하의 로딩 계수를 이용하여 펩타이드 중간체 단편을 합성하는 방법.
- 제 13 항에 있어서,상기 단계 (a)에서, 펩타이드 중간체 단편이 고체 지지체 상에서 0.5 미만의 로딩 계수를 이용하여 합성된 방법.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,단계 (a)에서 0.2 내지 0.5의 로딩 계수를 이용하여 고체 지지체 상에서 펩타이드 중간체 단편을 합성하는 방법.
- 제 13 항에 있어서,단계 (b)에서 지지체에 커플링된 아미노산을 1 내지 1.5당량으로 사용하여 고체 지지체 상에서 펩타이드 중간체 단편을 합성하는 방법.
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