JP4010560B2 - Ｈｉｖ複製を阻害する化合物 - Google Patents

Description

本発明は、国立アレルギー・感染症研究所からの承認番号R01-AI30411及びP30-AI28662のもとに政府援助により完成されたものである。政府は本発明に関し一定の権利を有する。
本出願は、同時に係属中の、1992年８月７日に出願されたC. Wild, T. Matthews及びD. Bolognesiの出願番号07/927,532号出願の一部継続出願であり、前記出願の開示はその全体において引用により本明細書の一部とする。
1. 序
本発明は、抗ウィルス活性を有するヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）タンパクフラグメントに係わり、特にＨＩＶ誘発細胞−細胞融合を阻害する、ＨＩＶトランスメンブラン糖タンパク（gp41）から誘導されたＨＩＶペプチドに関する。本発明はさらに、エンベロープ（を有する）ウイルス感染を阻害する方法、及び高次コイルペプチド相互作用を含む生化学的工程を変調する方法に係わる。
2. 発明の背景
有効なＨＩＶワクチンを開発しようとする試みにおいて多数のＨＩＶタンパクフラグメント、あるいはペプチドが同定されている。全体的には、B. Spalding, Biotechnology 10, 24 (1992，１月）を参照されたい。gp41タンパクの抗原エピトープについての特許出願の例としては、J. Rosen等のPCT出願WO 87/06005及びR. DuncanのEPO出願0 371 817号が挙げられる。これまで、抗ＨＩＶワクチンの開発は困難なものであった。
N. Qureshi et al., Aids 1990 4, 553-558は、インビトロでＴ細胞活性化を阻害するＨＩＶトランスメンブランタンパク（「gp41」と指称される）のセグメントを記載している。「CS3」と指称されるこのセグメントは、ヒト血清アルブミンと結合しフルオレセインで標識した場合、CD4+細胞系に特異的に結合し、抗ウィルス活性を有しているといわれている。CS3は、gp41タンパクのアミノ酸581〜597を含んでいる。
B. Kemp et al., EPO出願0 323 157号は、抗ウィルス活性を有するとされる、gp41タンパクのアミノ酸572〜591を含むフラグメントを記載している。
3. 発明の要約
本発明の第１の形態は、(a)アミノ末端からカルボキシ末端へ、NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ（配列番号１）の式を有するペプチドDP-107、及び（b）ペプチドDP-107（配列番号１）とヘテロダイマーを形成する、14〜60アミノ酸長のペプチド（以下、本明細書において「活性化合物」と呼ぶ場合がある）からなる群から選択されるペプチドである。
本発明の第２の形態は、ＨＩＶ誘発細胞融合を阻害する方法である。該方法は、(a)アミノ末端からカルボキシ末端へ、NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ（配列番号１）の式を有するペプチドDP-107、及び（b）ペプチドDP-107（配列番号１）とヘテロダイマーを形成する、14〜60アミノ酸長のペプチドからなる群から選択されるペプチドの有効な融合阻害量をＨＩＶ感染細胞に接触させることを含む。
本発明の第３の形態は、ＨＩＶの細胞に感染する能力を阻害する能力について化合物を試験する方法である。該方法は、(a)(i)アミノ末端からカルボキシ末端へ、NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ（配列番号１）の式を有するペプチドDP-107、及び（ii）ペプチドDP-107（配列番号１）とヘテロダイマーを形成する、14〜60アミノ酸長のペプチドからなる群から選択されるペプチドのマルチマーに試験化合物を接触させ、そして（b）試験化合物が前記マルチマーを崩壊させる（disrupt）か否かを検知することを含み、試験化合物のマルチマーを崩壊させる能力が、その試験化合物がＨＩＶの細胞感染を阻害できることを示すものである。
本発明の別の形態は、エンベロープを有するウィルスの感染を阻害する方法であって、未感染細胞を、高次コイル（coiled coil）ペプチド構造の形成に寄与できる有効量のペプチドと接触させ、エンベロープを有するウィルスが未感染細胞を感染するのを阻害するようにすることを含む。
上記及びその他の本発明の目的及び形態は、添付の図面及び以下に記載する明細書中において詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、研究した種々のペプチドの配列を示す。DP-107（配列番号１）、DP-121（配列番号２）及びDP-125（配列番号３）においては、ロイシンまたはイソロイシンの７個目の反復単位に下線を付した。DP-107、DP-121及びDP-125はNH₂末端でアセチル化されており、COOH末端でアミド化されている。DP-116（配列番号４）（CS3ペプチドと同一）はカルボキシ末端でアミド化されており、遊離アミン末端を有する。DP-31（配列番号５）は、アセチル化もアミド化もされていない。アミノ酸残基については、Human Retroviruses and AIDS (1991)に従って番号を付した。
図２は、DP-107(m)、DP-121(+)及びDP-116(1)の10mM溶液の０℃(A)及び37℃(B)におけるCDスペクトルを示す。CD信号(C)の温度依存性(T_m)の中間点の濃度依存性。T_mは、CD溶融曲線の第１誘導値の最大値に対応する。CDスペクトルは、pH7.0の10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウムバッファー中で得た。
図３は、ＨＩＶ-1_LAIによるAA5細胞感染のペプチドブロックについての試験を示す。約500 TCID₅₀ HIV-LAIを2×10⁴AA5細胞及び試験ペプチド（最終濃度を示した）に加え、最終容量100mlとした。細胞培養は、96ウェルマイクロタイタープレート中で、新鮮な培地を１日おきに加えることにより（但しさらにペプチドを加えることなく）８日間維持した。感染後第８日目に、感染の成功の証拠としての逆転写酵素活性について上清を試験した。
図４は、ペプチド及び可溶性CD4（sT4）の直接の殺ウィルス（virocidal）効果についての試験を示す。ＨＩＶ-1_LAIウィルスストックを２つの部分に分けた。１つの部分の試料（図中、ペレット化ウィルス＋として表した）を37℃で２時間、培地のみ、40mg/mlのDP-107、または10mg/mlのsT4で処理した。次にウィルスを5%蔗糖層を通してペレット化し、非結合阻害剤からウィルスを分離した。ウィルス含有ペレットを培地に分散し、連続的な希釈物をAA5細胞への感染性に関して試験した。ウィルスのもう一方の部分（ペレット化ウィルス−）の連続的な４倍希釈物を、40mg/mlのDP-107の不存在下または存在下においてインキュベートされたウィルスの各希釈物で細胞の感染について直接試験した。
図５は、一次ウィルス単離物を阻害する、ペプチド及び可溶性CD4の比較を示すものである。２つの一次単離物及びＨＩＶ-1_LAIの約25 TCID₁₀₀を試験ペプチドまたは5T4の示した最終濃度を含むPRA活性化ヒトPBMC（約1.5×10⁶/ml）に加えた。各処理条件について２つずつ試験を行い、細胞を10% FCS, 5% IL2を含むRPMI1640中で培養した。感染の４日後、同数の新鮮なPBMCを各ウェルに加えた。このステップにより、さらにウィルスが増殖し、最終的なRTアッセイにおけるノイズ対バックグラウンド比を増加させる。感染後８日目に上清を回収し、逆転写酵素活性の存在について試験した。
5. 発明の詳細な説明
本明細書における「ＨＩＶ」の用語はＨＩＶ-1を示すものであり、本明細書で使用したＨＩＶタンパク及びそのフラグメントにおけるアミノ酸の番号はHIV1_LAI単離物についてのものである。しかし、ＨＩＶウィルス感染及びDP-107のそのようなＨＩＶ感染に対する効果を、本明細書においてはモデルシステムとして使用し、それにおいては高次コイルを形成することができるペプチドの強力な抗ウィルス性質を記載するが、そのような高次コイルペプチドの性質は、エンベロープを有するウィルスの感染の広範なスペクトルを阻害する一般化されたメカニズムを表わすものと理解されなければならない。本発明の高次コイルペプチドを使用することによりその感染性が阻害され得るエンベロープを有するウィルスは、限定されるものではないが、その他のＨＩＶウィルス株、例えばＨＩＶ-2、並びにインフルエンザウィルス、シンシチウム呼吸器ウィルス、ヘルペスウィルスを含む。
DP-107ペプチド配列は、Gallaher et al., AIDS Res. and Human Retro. 5, 431 (1989) により予言されていた、トランスメンブランタンパク(TM)中に高度に保存されている領域をベースとするものであり、インフルエンザウィルス及びその他のレトロウィルスのようないくつかのフゾゲニック(fusogenic)ウィルスのTMタンパクにおいて、構造的アナローグとともに延長された両親媒性α−ヘリックスを形成する。その部位の機能は知られていないが、エンベロープを有する糖タンパクのマルチマー化に関連し得るものである。この部位は、「ロイシンジッパー」反復を含むことが示されている。E. Delwart et al., AIDS Res. and Human Retro. 6, 703 (1990) 参照。従って、高次コイルを形成できるDP-107のようなペプチドの使用は、このような高次コイルペプチド形成を含む多くの生化学的プロセスを妨害し、ブロックし、あるいは何らかの方法で変調させるのに役立ち得る。そのような生化学的プロセスは、限定するものではないが、転写因子(Abel and Maniatis, Nature 341:24)及び膜融合を含む生理学的プロセス(White, J.M., 1992, Science 258:1917-1924)を含み得る。
ペプチドDP-107の生物学的活性は予期されなかったものであり、そのメカニズムは直ちには明らかでない。本明細書において示した結果は、それが細胞遊離ビリオンに直接働いているものではないことを示している。Qureshi et al. (AIDS 4, 553 (1990))は、オーバーラップペプチドCS3（本明細書においてはDP-116）がアルブミンに結合した場合に感染を阻害したことを報告し、これは膜融合に必要とされる細胞表面上の第２のレセプターに対する結合により起こると提案した。これらの研究者はレセプターについての候補を44kDタンパクとして仮に同定した。そのようなメカニズムは、以下に記載する図４に示したDP-107の結果と一致するが、他の観察によれば、これらの２種のペプチドは全く異なるものであり、そのままで異なるメカニズムを通して機能し得るものであるかもしれないといえる。最も重要なことは、CS3ペプチドはアルブミンに結合した後にのみ活性であり、遊離の（非結合）DP-107ペプチドの顕著な抗ウィルス効果と対照的なことである。また、CS3ペプチドは低温及び高濃度においてもCDにより安定な２次構造の証拠を示さなかった。我々の実験は、安定な２次構造を確保する構造あるいは能力が生物学的活性に必要であることを示している。例えば、ヘリックスを破壊するプロリン置換を含むDP-107アナローグ(DP-121)、及び安定な溶液構造を示さなくなったあるいは示すことができないDP-107のいくつかの切断バージョン（示していない）は抗ウィルス活性を示さなかった。
上記したように、本発明の第１の形態は、(a)アミノ末端からカルボキシ末端へ、NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ（配列番号１）の式を有するペプチドDP-107、及び（b）ペプチドDP-107（配列番号１）とヘテロダイマーを形成する、14〜60アミノ酸長のペプチドからなる群から選択されるペプチドである。
一般に、該ペプチドは適当な任意の長さを有するものでよいが、好ましくは14〜60アミノ酸の長さ、より好ましくは16〜38アミノ酸の長さである。さらに、ペプチドに対して若干の変更を加えることは許容される。例えば、前記ペプチドはそのアミノ末端においてアセチル化されていてもよく、及び／またはそのカルボキシ末端においてアミド化されていてもよい。
本発明のペプチドは、マルチマー、特にダイマー及びテトラマーとして与えてられてもよい。そのような形態で供給される場合、マルチマーはモノマーを互いに共有結合で結合することにより安定化され得る。例えば、システイン残基をモノマーのいずれか（あるいは両方）の末端に付加し、マルチマーのモノマーをシステイン残基間のジスルフィド結合により互いに共有結合させることができる。反応は公知の方法により行うことができる。このような方法により、ダイマーの２つのモノマーは共有結合して共有結合により安定化されたダイマーを形成することができ、必要により、そのような共有結合により安定化されたダイマーの２つを互いに結合してテトラマーを形成することができる。また別の例においては、末端に位置するシステイン残基の間のジスルフィド結合を介して、テトラマーの４つ全部のメンバーを互いに共有結合することができる。
これらのペプチドのマルチマー形態のものを安定化させる別の方法としては、分子間アミド結合の形成を介してモノマー成分を互いに架橋することが挙げられる。この方法は、塩基性アミノ酸残基、即ちリジンのアミン部分と、酸性アミノ酸残基、即ちアスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシ部分との反応を含む。
所与のペプチドあるいはペプチド混合物のマルチマー化状態（ホモダイマーあるいはヘテロダイマー）を測定するためにはいくつかの方法が使用できる。最も直截な方法は、マルチマー複合体の見かけの分子量を測定し、これから結合しているモノマー成分の数を決定する（これはこの見かけの分子量をモノマーの分子量で割ることにより成し得る）ことを含むものである。分析的超遠心分離がこの目的に特に適した方法である。この方法の詳細は当業者に公知である。例えば、P. Graceffa et al., J. Biol. Chem. 263, 14196-14202 (1988)を参照されたいが、以下のように要約することができる。対象となる物質を、サンプルセル中に入れ、適当な検出装置を備えたモデルＥ超遠心分離器中で非常に急速に回転させる。実験の間に集められた情報とペプチドのアミノ酸組成を合わせることにより、マルチマー複合体の見かけ分子量を決定することができる。高速タンパク液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）もこの目的に使用できる。この方法は、クロマトグラフィーのタイプとして、何等かの一次標準（分析的超遠心分離により決定されたもの）を参照し直すことが最終的に必要である点で上記のものとは異なる。Pharmacia BiosystemsがSUPERDEX 75^TMカラムを供給しており、これにより自己結合ペプチドの種々のマルチマー形態の分離が可能である。これらの測定は変成していない（元のままの）条件下で行われ、適当な標準を参照すれば、ペプチド及びタンパクオリゴマー化状態を同定するのに使用できる。
当業者にはやはり明らかなように、上記の２種の方法のいずれかを使用するか、これらの方法の一方と組み合わせたCDを使用することにより、ヘテロダイマー化についての試験を行うことができる。簡単にいうと、この後者の方法は、既知の量のペプチドを同じペプチド（ホモダイマー化について）あるいは異なるペプチド（ヘテロダイマー化について）の既知の量を含む溶液に加え、この添加の関数としてCD信号を追跡することを使用する。ペプチドを添加するに従って信号の大きさが増加することは、添加した物質がマルチマー形成に参加していることを示している。ホモ対ヘテロダイマー化はこの同じ実験をFPLCあるいは超遠心分離を使用して行うことにより測定でき、これにより生じた系が単一（ヘテロ）あるいはマルチ（ホモ）成分のいずれであるかを決定できる。この同じ目的についての、第２の、そして特に好ましいアプローチは、この同じ試料についてCD溶融を実施することである。ヘテロダイマー化が生じた場合、ヘテロダイマーのT_mに対応する単一の転移が観察されることになる（このT_m値はおそらく混合物成分のいずれかのものについての値とは異なるであろう）。ホモダイマー化のみが起こった場合は、２つの転移（２つのTm）が観察されることになる。
やはり本明細書中に開示するように、ＨＩＶ誘発細胞融合を阻害する方法は、ＨＩＶ感染細胞に有効な融合阻害量の上記ペプチドを接触させることを含む。該方法は水性溶液中インビトロで、あるいはＨＩＶ感染についての細胞培養アッセイ（例えば、L. Kucera et al., Aids Research and Human Retroviruses 6, 491 (1990)に記載されたCEM-SS細胞単層プラークアッセイ）中、あるいはＨＩＶウィルスに感染した動物患者中においてインビボで実施することができる。該方法は、上記したようなそのマルチマー（特にダイマー）の形態の本発明のペプチドを使用して実施することができる。該方法をヒトまたは動物患者中で実施してＨＩＶ誘発細胞融合を防止することができ、この場合化合物は適当な薬理学的に許容できるキャリア（例えば、殺菌された、発熱物質を含まない生理食塩水溶液、あるいは殺菌された、発熱物質を含まないリン酸緩衝食塩水）と合わせて患者に適当な経路（即ち、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈注射）で投与することができる。治療的投与量は１日あたり約１〜10,000μg/kg患者体重、より特定的には１日あたり約10〜1,000μg/kg患者体重、最も特定的に好ましくは１日あたり約100μg/kg患者体重である。このように、本発明は、本明細書に記載した活性化合物を有効なＨＩＶ（あるいはより特定的にはＨＩＶ誘発細胞融合）撲滅量で投与することによる、ヒトまたは動物患者中のＨＩＶ（そして特にＨＩＶ誘発細胞融合）を撲滅する方法を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載した活性化合物の、そのような治療を必要としているヒトまたは動物患者中のＨＩＶ（あるいはより特定的にはＨＩＶ誘発細胞融合）を撲滅するための薬剤の製造における使用を提供する。
本発明のさらに別の形態は、合理的な薬剤設計に有用な、ＨＩＶの細胞に感染する能力を阻害する能力について化合物を試験する方法である。該方法は、(a)上記したペプチドのマルチマー（例えばダイマー、テトラマー）に試験化合物を接触させ、そして(b)試験化合物が前記マルチマーを崩壊させるかどうかを検出することを含み、試験化合物のマルチマーを崩壊させる能力が、その試験化合物がＨＩＶの細胞感染を阻害できることを示すものである。この方法は、合理的な薬物設計においてこれまで探査されたことのない部位に対する化合物を同定する能力において注目される。該方法は、試験化合物を該水溶液に加え、マルチマーを含む水性溶液中インビトロで便利に行うことができ、そしてマルチマー構造が崩壊されるかどうかを測定することによって実施することができる。マルチマー構造の分裂は上記したのと同じ方法により決定することができる。
本明細書に開示したアミノ酸配列は、左から右へ、アミノからカルボキシの方向に示されている。アミノ及びカルボキシ基は配列中には示していない。本明細書中アミノ酸は以下のような１文字コードまたは３文字コードで示した。
Ala; A = アラニン Leu; L = ロイシン
Arg; R = アルギニン Lys; K = リジン
Asn; N = アスパラギン Met; M = メチオニン
Asp; D = アスパラギン酸 Phe; F = フェニルアラニン
Cys; C = システイン Pro; P = プロリン
Gln; Q = グルタミン Ser; S = セリン
Glu; E = グルタミン酸 Thr; T = スレオニン
Gly; G = グリシン Trp; W = トリプトファン
His; H = ヒスチジン Tyr; Y = チロシン
Ile; I = イソロイシン Val; V = バリン
上記の略号は確立された用法によるものである。例えば、Hudson et al. に付与された米国特許第4,871,670のカラム３、20〜43行を参照されたい（出願人は具体的に、この特許及び本明細書で引用したその他の全ての特許引用文献を引用により本明細書の一部とすることを意図するものである）。
以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明を目的とするだけのものであって、本発明を限定するものと解してはならない。
６．実施例：ペプチド合成
ペプチドＤＰ−１０７（配列番号：１）、ＤＰ−１２１（配列番号：２）、ＤＰ−１２５（配列番号：３）、ＤＰ−１１６（配列番号：４）及びＤＰ−３１（配列番号：５）をファースト・モック（FAST MOC）（商標）化学品を用いてアプライド・バイオシステムズ・モデル４３１Ａペプチド合成装置で合成した。アミド化ペプチドをリンク（Rink）樹脂（アドバンスド・ケムテック（Advanced Chemtech））を用いて調製すると共にフリーのカルボキシ末端を含有するペプチドをワング（Wang）（ｐ−アルコキシ−ベンジル−アルコール）樹脂（バケム（Bachem））で合成した。最初の残基を適当な樹脂に高次にカップリングし、続く残基を一重にカップリングした。各カップリング工程後に無水酢酸でキャッピングした。ペプチドをＴＦＡ（１０ｍｌ）、H₂Ｏ（０.５ｍｌ）、チオアニソール（０.５ｍｌ）、エタンジチオール（０.２５ｍｌ）及び結晶フェノール（０.７５ｇ）で処理することによって樹脂から切り離した。精製は、逆相ＨＰＬＣにより行った。約５０ｍｇサンプルの粗製ペプチドをウォーターズ・デルタパック（DELTA PAK）（商標）Ｃ１８カラム（１９ｍｍ×３０ｃｍ，１５ｍ球）で直線濃度勾配のH₂Ｏ／アセトニトリル０.１％ＴＦＡを用いてクロマトグラフィーに付した。凍結乾燥したペプチドをデシケーターに保存し、そして約５ｍｇ／ｍｌのペプチド水溶液を作った。溶液で保存したペプチドは４℃で長期間安定で、生物活性への明らかな影響なしに繰り返し凍結及び解凍できた。
これら合成したペプチドのアミノ酸配列を図１に示す。ＤＰ−１０７は、ＨＩＶ−１ＴＭタンパク質の残基５５８〜５９５に対応する３８アミノ酸ペプチドである。Gallaherら（AIDS Res. and Human Retro. 5, 431 (1989))及びDelwartら（AIDS Res. and Human Reix-o. 6, 703 (1990)）は、この領域の一次配列はヘリックス第二構造を強く予測させるものであって“ロイシンジッパー”繰り返し単位を含有することも認めた。このペプチドのアミノ末端はアセチル化されかつそのカルボキシ末端はアミド化され、それら位置における非天然の荷電作用を少なくした。この研究で用いたＤＰ−１０７及びその他の各のペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製した。そして、それぞれについて精製ペプチドは分析ＨＰＬＣにより単一の対称ピークを示した。各ペプチドの一致性を電子スプレー式質量分析により確認し、次の結果を得た：ＤＰ−１０７：４５２６.７１（計算値４５２６.３１）；ＤＰ−１２１：４５１０.７５（計算値４５１０.２７）；ＤＰ−１１６：２０５７.３２（計算値２０５６.４４）；ＤＰ−１２５：４７４３.４６（計算値４７４３.５５）；ＤＰ−３１：２４７９.３５（計算値２４８０.９３）。
７．実施例：溶液中での第二構造の証拠
円二色性スペクトルを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７.０）緩衝液中、約１０ｍＭ濃度で、１ｃｍ光路長セルを用いて、ジョビン／イボン（Jobin/Yvon）自動円二色計マークＶ ＣＤ分光分析器で測定した。ペプチド濃度は、エドレホックス（Edlehoch's）法（Biochemistry 6, 1948 (1967)）を用いてＡ₂₈₀から決定した。
ＤＰ−１０７の紫外ＣＤ分析の纏めを図２に示す。これら結果は、生理的条件下でこのペプチドについてかなりの量の第二構造を示唆している。２２２及び２０８ｎｍにおける２つの極小値はαヘリックスの特徴であり、そして０℃における−３２，０００（図２Ａ）及び３７℃における−２７，０００（図２Ｂ）の平均モル楕円率（〔Ｑ〕₂₂₂）は、このペプチドがこれら温度で約１００％及び８５％折り畳まれていることを示しているY. Chenら，Biochemistry 13, 3350 (1974); Greenfield & Fasman, Biochemistry 8, 4108 (1969))。観察された構造の安定性は、図２Ｃに示した熱溶融データにより示されている。例えば、１０ｍＭ濃度のＤＰ−１０７では、溶融曲線の中点（Ｔｍ）は約７２℃であった。また、ＤＰ−１０７についてのＴｍがペプチド濃度の関数として変動することも図２Ｃで明らかである。この濃度依存性は、ロイシンジッパー型構造の特徴であり、自己会合による第二構造要素の安定性の指標である（E.0'sheaら，Science 243, 538 (1989)）。ダイマー及びテトラマーを生成するためのＤＰ−１０７の溶液中でのオリゴマー化も、沈降平衡研究により示唆される。併せて考慮すると、図２に示した結果は、ＤＰ−１０７に対応するｇｐ４１の領域が、エンベロープオリゴマー化にある役割を果たし得るロイシンジッパー様（高次コイル）モチーフを含有するという予測（W. Gallaherらの前記文献；E. Delwartらの前記文献）を支持する傾向にある。この型の構造は、特異的（そしてしばしば平行）な２つのαヘリックスの会合により生成するホモダイマーとして記載することができる。この相互作用は、それらヘリックスの疎水性面の整列により特徴付けられる。これら型の系に包含されるペプチドによって示される異常に安定な第二構造は、これらの高次相互作用によるものである。多次元核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルによるＤＰ−１０７の溶液構造の予備的分析は、ＮＥＯＳＹスペクトルにおいて多数の連続のＮＨ−ＮＨクロスピークを示しており、生理的条件下でこのペプチドがかなりのαヘリックス第二構造を示すというＣＤの証拠と一致している。
他の２種の合成ペプチドのＣＤスペクトルも図２に示している。これらのうち１つ（ＤＰ−１２１）は、５７８位のイソロイシンがプロリン残基で置換されているほかはＤＰ−１０７と同一である。もう１種のペプチド、つまりＤＰ−１１６は１７量体であり、ＤＰ−１０７のカルボキシ末端と重複している。このペプチドは、Qureshiら（AIDS 4, 553 (1990)）により記載されたペプチドであってアルブミンとカップリングすると抗ウィルス活性を示すと報告されているペプチドであるＣＳ３と同じアミノ酸及び保護基を含有するように合成されたものであった。これら２種のペプチドについて観察されたＣＤスペクトルは、いずれもがＤＰ−１０７について得られた結果とは直接対照的に３７℃でランダムコイルコンフォメーションで存在することを示している。この結論は、プロリン置換類縁体、つまりＤＰ−１２１について、プロリン残基がヘリックス形成を壊すだけでなく高次コイル構造を安定化すると考えられる疎水性相互作用をも崩壊させる傾向があるという点で、予想されたものであった。
８．実施例：逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ
Goffら（J. Virol. 38, 239 (1981)）及びWilleyら（J. Virol. 62, 139 (1988)）からの微小ＲＴアッセイを適用した。ウィルス／細胞培養物からの上澄み液をトリトン−Ｘ１００中で１％にした。１０ｍｌサンプルの上澄み液を９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート中の５０ｍｌのＲＴカクテルに添加し、これらサンプルを３７℃で９０分間インキュベートした。このカクテルは、７５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍｇ／ｍｌポリＡ（ファルマシアカタログNo.２７−４１１０−０１）、０.２５ユニット／ｍｌオリゴｄＴ（ファルマシアカタログNo.２７−７８５８−０１）、０.０５％ＮＰ40、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、０.５ｍＭ非放射性ｄＴＴＰ、及び１０ｍＣｉ／ｍｌ³²ｐ−ｄＴＴＰ（アマシャムカタログNo.ＰＢ.１０１６７）を含有した。インキュベーション時間経過後、４０ｍｌの反応混合液を、ＧＢ００３濾紙の１枚のシート上のシュレイハー（Schleicher）・アンド・シュエルミニホールド（Schuell Minifold）内に保持された２×ＳＳＣ緩衝液（０.３Ｍ ＮａＣｌ及び０.００３Ｍクエン酸ナトリウム）中で飽和されたシュレイハー・アンド・シュエルＮＡ４５メンブラン（又はＤＥ８１ペーパー）に適用した。このミニホールドの各ウェルを２００ｍｌの２×ＳＳＣで４回洗浄した。メンブランをミニホールドから取り出してパイレックス皿内で過剰の２×ＳＳＣでもう２回洗浄した。最後にこのメンブランの水分を吸収紙上で吸い取り、ワットマン＃３ペーパー上に載せ、サランラップで覆い、そしてフィルムに一晩露光させた。
９．実施例：ＨＩＶ−１ウィルス増殖
ＨＩＶ−１_LA1ウィルスをR. Gallo (M. Popovicら，Science 224, 497 (1984) を参照のこと）から得、そして１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養したＣＥＭ細胞内で増殖させた。この感染ＣＥＭ細胞からの上澄み液を０.２ｍｍフィルターに通し、その感染力価を、ウィルス複製を支援するＡＡ５細胞株を用いる微小感染力アッセイで見積もった。この目的のために、段階的に希釈した２５ｍｌのウィルスを９６ウェルマイクロタイタープレート中の２×１０⁵／ｍｌの７５ｍｌのＡＡ５細胞に添加した。各ウィルス希釈液を３重に試験した。新鮮な培地を１日置きに添加することによって細胞を８日間培養した。８日目に、感染後上澄み液サンプルを、上記の操作に従って上澄み液に放出されるＲＴ活性により明示されるウィルス複製について試験した。ＴＣＩＤ₅₀をリード（Reed）・アンド・ミュエンク（Muench）式に従って既知の方法に従って計算した。L. Reedら，Amer. J. Hygiene 27, 493 (1938) を参照のこと。この研究に用いたＨＩＶ−１_LA1ストックの力価は、ＡＡ５細胞株で測定して、約１×１０⁷ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌであった。２種の一次単離物が、ＩＬ２を含有するＲＰＭＩ１６４０中でのＰＨＡ−出芽（blasted）正常ドナーＰＢＭＣとの共存培養によって、２種の感染ドナーのＰＢＭＣから得られた。１種はブラジル（Brazil）（ＨＩＶ−１_Br3）からのものであり、そしてもう１つはトリニダッド（Trinidad）（ＨＩＶ−１_QZ2775）からのものであった。これら一次ウィルスストックの感染力価を、９６ウェルマイクロタイタープレート内での正常ヒトＰＨＡ出芽ＰＢＭＣ上への滴定によって、やはり感染がうまく行ったときの証拠として上澄み液に放出されるＲＴ活性を用いて評価した。これらのいずれの単離物の感染力価も、約１×１０³ＴＣＩＤ₁₀₀／ｍｌであると見積もられた。
１０．実施例：感染細胞誘発融合細胞形成のペプチド阻害
図１に示したペプチドの抗ウィルス活性の最初のスクリーニングは、未感染Ｍｏｌｔ４細胞と慢性感染（ＨＩＶ−１_IIIB）ＣＥＭ細胞との一晩共存培養によって誘発された融合細胞形成の遮断についてのものである。
約７×１０⁴Ｍｏｌｔ細胞をＨＩＶ−１_LA1ウィルスで慢性感染した１×１０⁴ＣＥＭ細胞と共に９６ウェルプレート（１／２面積クラスタープレート；コースター，ケンブリッジ，ＭＡ）内で１００ｍｌ培地の最終容量で既知の方法（T. Matthews）ら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 5424 (1987)）に従ってインキュベートした。ペプチド阻害物質を１０ｍｌの容量で添加してこれら細胞混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。その時点で、４０倍の倍率の顕微鏡検査によって多核巨細胞を見積もった。この倍率では、一視野内に全ウェルが見える。
かかる３実験の結果を表１に示す。これらの第１実験では、５０μｇ／ｍｌ〜１.５μｇ／ｍｌの段階的濃度のペプチドを細胞融合プロセスの遮断について試験した。ＤＰ−１０７が、６μｇ／ｍｌの濃度に至るまでに完全に防御したことが分かる。重複１７量体ペプチド、つまりＤＰ−１１６は、以前にQureshiら（AIDS 4, 553 (1990)）により記載されたＣＳ３に類似するものであるが、５０μｇ／ｍｌでも抗融合(fusogenic)活性の形跡を示さなかった。この観察結果は、ＣＳ３についてはアルブミンと複合化した後にしか抗ウィルス活性が見出されないという研究結果と一致している。重複している免疫優勢部位を表す第２ペプチドＤＰ−３１（M. Oldstoneら，J. Virol. 65, 1727 (1991) ; J. Wangら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 1659 (1986)）も阻害活性を示さなかった。

ＤＰ−１０７の阻害活性は、細胞障害又は細胞増殖抑制作用に関連していないようであった。というのは、他の研究において、５０μｇ／ｍｌ（試験した最高濃度）のＤＰ−１０７の存在下で新鮮なペプチドを毎日添加して３日間増殖させたＣＥＭ細胞が、コントロール培養物と同じ生活能力及び増殖速度を示したからである。我々は、ＤＰ−１０７が他の始原型単離物：ＨＩＶ−１_MN、ＨＩＶ−１_RF及びＨＩＶ−１_SF2により媒介される融合を遮断することも見いだした。
記載したＣＤスペクトルの濃度依存性は、ＤＰ−１０７の構造がペプチド自己会合によって安定化されることを示唆している。類似の研究において、O'Sheaら（Science 243, 538 (1989)）は、共有結合で結合したホモダイマーを形成するためのＧＣＮ４タンパク質（転写調節因子）中のロイシンジッパードメインのペプチドのジスルフィド架橋が、高次コイル構造を安定化したことを報告した。類似の理由に従って、我々は、ＤＰ−１０７による細胞融合遮断のための限界有効濃度が、部分的にペプチド自己会合の濃度依存性に関連しているかどうかを確認しようとした。この可能性を試験するために、我々は、精製後に空気酸化してホモダイマーを生じ得る“尾状物”を含有するシステインを有するＤＰ−１０７類縁体を合成した。得られたペプチド、つまりＤＰ−１２５は、非還元性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでＤＰ−１０７の約２倍の見掛け分子量を示した。これは、実に共有結合で結合したホモダイマーが生成したことを示唆するものである。融合細胞遮断アッセイ（表１の実験２及び３）において、この類縁体は、実際にＤＰ−１０７よりも効力があり、阻害に１／２〜１／４濃度を必要としただけであった。ＤＰ−１２５により示されたこの活性の増加は、これまでに行った全てのアッセイにおいて再現性があるので、ダイマー及びより高次のマルチマーが、このペプチドの生物活性型を実際に呈することを示唆している。また、ＤＰ−１２５のＣＤ測定により、親のＤＰ−１０７と類似の楕円率を生じることが分かった。併せて考慮すると、これら観察結果は、推定上のマルチマーの個々のペプチド成分は、平行で方向が逆というよりもむしろ方向が同じで平行に配置されていることを示している。
ＤＰ−１０７についてのＣＤ及びＮＭＲ研究で観察された溶液構造が生物活性に要求されるか否かに関して更なる知見を得るために、３７℃でのＣＤ実験でヘリックス関連シグナルを示さなかったプロリン含有類縁体（ＤＰ−１２１）を細胞融合アッセイにおける活性について試験した。それら結果は、表１に示すように阻害活性の徴候を示さなかった。このことは、その構造が生物活性に必要でないことを証明してはいないが、その可能性に沿うものである。同じように、細胞融合を遮断しなかったこれまでに試験した各ＤＰ−１０７ペプチド類縁体も、ＣＤ研究において安定な溶液構造の証拠を示していない。また、高次コイル構造（ＧＣＮ４−ｐｌ，R. Rutkowskiにより提供されたもの）を形成したペプチドも、如何なる生物活性も示さなかった。
１１．実施例：無細胞ウィルスによる感染のペプチド阻害
次に、これらペプチドを無細胞ウィルスによる感染の遮断について試験した。図３に示す結果は、ＡＡ５細胞のＨＩＶ_LA1感染の遮断力についてＤＰ−１０７、１２５及び１１６（ＣＳ３）ペプチドを比較した幾つかの実験の代表である。各レベルのペプチドを約５００ＴＣＩＤ₅₀のウィルス及び細胞と共に同じものを３重にインキュベートした。培養７日後に、無細胞上澄み液を感染がうまく行ったことの指標としてのＲＴ活性の存在について試験した。それら結果は図３に示されており、ＤＰ−１０７及びＤＰ−１２５試薬のいずれもが、上記の融合アッセイに記したのとほぼ同じ有効用量でデノボ感染プロセスを阻害したことを証明している。更には、阻害作用に要求される用量は、ジスルフィド架橋ＤＰ−１２５類縁体についてはより低く、そしてＤＰ−１１６については抗ウィルス作用の微かな徴候も認められなかった。
１２．実施例：一次単離物によるＰＢＭＣ感染のペプチド阻害
今や、抗ウィルス剤への感受性の相当な相違が、実験室適合始原型単離物とＰＢＭＣによってのみ継代接種された一次領域（primary field）単離物の間に存在することが明らかである。この問題は、可溶性ＣＤ４での研究においてHoとその共同研究者によって初めて光があてられた（E. Dearら，Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 6574 (1990)）。ｇｐ４１ペプチドが反応性において類似の不一致を示すか否かを試験するために、ＤＰ−１０７、ＤＰ−１２５（システイン類縁体）、及びｓＴ４（前の実験で用いたのと同じ試薬）を２種の一次ＨＩＶ−１単離物とＨＩＶ_LA1によるＰＢＭＣ感染の阻害について比較した。これら研究の結果（図５）は、それらペプチドが試験した一次単離物及び始原型単離物のいずれをも阻害することを示している。ｓＴ４の１回用量（１０ｍｇ／ｍｌ）だけを比較のために含めたが、２種の一次単離物と比較して、この試薬が細胞株適合ＨＩＶ−１_LA1ウィルスに対して実質的により活性であることが明らかである。
１３．実施例：ＤＰ−１０７類縁体の合成
ＤＰ−１０７の類縁体を上の実施例１に示すような既知の方法に従って合成した。かかる類縁体を以下の表２に示す。

１４．実施例：ＤＰ−１０７類縁体の活性
ここに記載した種々のＤＰ−１０７類縁体の活性を上の10.実施例に記載した融合細胞アッセイにより試験した。これらデータを以下の表３に示す。

１５．実施例：ＤＰ−１０７及びその類縁体の生物活性
上の実施例５に記載した融合アッセイ及び上の実施例６に記載した中和アッセイにおけるＤＰ−１０７及びその種々の類縁体の生物活性を以下の表４に纏めてある。融合細胞数の９０％低下をもたらすのに要求される化合物の量を“融合”と題した欄に示し；感染力の９０％低下をもたらすのに要求される化合物の量を“中和”と題した欄に示した。融合アッセイにおいて２０〜４０μｇ／ｍｌで活性な化合物がまあまあ活性であると考えられ；１０〜２０μｇ／ｍｌで活性な化合物が強力であると考えられ；そして１０μｇ／ｍｌ未満の量で活性な化合物が非常に強力であると考えられる。

以上の実施例は本発明の説明のために示したものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は以下の請求項によって規定されるものであり、それら請求項の均等物も該請求項に包含されるものである。

Claims (9)

1. 配列番号１に示したＤＰ−１０７アミノ酸配列を含む３８〜４４アミノ酸の長さの単離されたペプチド。
2. ペプチドのアミノ末端がアセチル化された、請求項１に記載のペプチド。
3. ペプチドのカルボキシ末端がアミド化された、請求項１に記載のペプチド。
4. 請求項１に記載のペプチドの単離されたダイマー。
5. ダイマーのモノマーが相互に共有結合で結合している、請求項４に記載のダイマー。
6. 細胞融合を阻害するように、有効な量の請求項１に記載のペプチドを含んでなるＨＩＶ誘発細胞融合を阻害するための医薬組成物。
7. ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項６に記載の医薬組成物。
8. ペプチドがダイマーとして存在する、請求項６に記載の医薬組成物。
9. ダイマーのモノマーが相互に共有結合で結合している、請求項８に記載の医薬組成物。

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