KR20050024730A - Ｔ―２０ 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합대장균의 고농도 세포 배양 방법 및 이로부터 생산된ｔ―２０ 펩타이드의 분리 및 정제 방법 - Google Patents

Ｔ―２０ 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합대장균의 고농도 세포 배양 방법 및 이로부터 생산된ｔ―２０ 펩타이드의 분리 및 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 고농도 세포 배양 방법 및 이로부터 생산된 T-20 펩타이드의 분리 및 정제 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균 배양배지의 pH를 적정 수준으로 유지하기 위하여 영양배지를 누적 첨가하는 유가식 배양기술을 이용하여 상기 대장균을 고농도로 배양하는 방법 및 상기 배양한 재조합 대장균으로부터 발현된 T-20 펩타이드를 아세톤 용매 처리하여 고순도로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
이와 같은 본 발명은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 대장균을 고농도로 제공할 수 있고, 따라서 산업상 이용가치가 있는 T-20 펩타이드를 보다 손쉽게 제공할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

Ｔ―２０ 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 고농도 세포 배양 방법 및 이로부터 생산된 Ｔ―２０ 펩타이드의 분리 및 정제 방법 {A method for cultivating recombinant E.coli containing T-20 peptide coding gene and a method for separating and purifying T-20 peptide therefrom}
본 발명은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 고농도 세포 배양 방법 및 이로부터 생산된 T-20 펩타이드의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균 배양배지의 pH를 적정 수준으로 유지하기 위하여 영양배지를 누적 첨가하는 유가식 배양기술을 이용하여 상기 대장균을 고농도로 배양하는 방법 및 상기 배양한 재조합 대장균으로부터 발현된 T0-20 펩타이드를 아세톤 용매 처리하여 고순도로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
T-20 펩타이드는 HIV-1 LA1 의 막투과 단백질인 gp41의 638 내지 673번 아미노산에 해당하는 펩타이드로서, CD-4+ 세포로의 HIV 감염을 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. T-20 펩타이드의 구조 및 기능은 미국특허 제 5,464,933호 및 제 5,656,480호 등을 통하여 이미 잘 알려져 있으며, 특히 T-20 펩타이드를 수득하기 위한 화학적 합성방법은 미국특허 제 6,015,881을 통하여 이미 공지된 바 있다.
전통적인 펩타이드의 화학적 합성방법은 동종업계의 모든 전문가들이 인정하는 바와 같이 매우 복잡하고 고가의 경비가 요구되는 공정이다. 특정 펩타이드는 20 종류의 아미노산이 일정한 성분과 배열로 구성된 것으로, 이를 화학적으로 합성하기 위해서는 목적하는 아미노산을 고형상 혹은 액상에서 목적하는 순서에 맞게 결합하고 정제하는 공정을 반복해야 한다. 즉, 고도로 정제된 아미노산이나 그 유도체를 원료로 해야 하며, 목적하는 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 수가 많아질수록 생산 공정이 복잡해지고 회수율이 떨어지며 생산단가가 기하급수적으로 높아지게 되는 것이다. 이에 따라, 산업적으로 유용한 펩타이드가 개발되었다고 하더라도 생산 공정의 복잡성과 경제성의 저하로 산업화의 어려움에 당면하게 된다.
국내특허 제 263583호, 미국특허 제 6,183,992호 및 국내특허 제 319529호에는 유용한 펩타이드를 유전자와 미생물을 이용한 생물학적 생산방법에 따라 생산하는 과정이 제시되어 있다.
유용한 펩타이드의 생물학적 생산방법은 화학적 생산방법에서 요구하는 고도로 정제된 아미노산이나 특정 펩타이드 단편을 원료로 하지 않고 자연계에 존재하는 상대적으로 저렴하고 환경 친화적인 배지 성분을 주원료로 하기 때문에 원료의 조달로 인한 제조원가에 대한 부담이 적으며 원료수급의 문제점을 야기하지 않는다는 장점이 있다. 또한 주공정인 미생물의 배양에 소요되는 시간이 짧으며(예를 들면, 대장균의 경우 72시간 이내), 목적하는 융합 펩타이드를 분리 및 정제하는 공정에 의해 높은 순도의 펩타이드를 큰 어려움 없이 획득할 수 있는 장점이 있다.
유용한 펩타이드의 생물학적 생산방법 중 미생물을 이용하여 생산하는 방법으로 회분식, 연속식, 유가식 등의 방법이 알려져 있다. 이들 방법을 서로 비교해 보면, 회분식 배양 방법은 연속식에 비하여 생산성이 낮은 단점이 있고, 반면 연속식 배양방법은 배양시간이 길기 때문에 균체가 오염될 가능성이 높고 설비 투자비가 고액인 단점이 있어서 산업적으로 이용하기가 어려운 단점이 있다.
이에 비해, 유가식 배양방법은 회분식 배양방법에 비해 생산성을 높일 수가 있고 연속식에 비해 쉽게 산업화시킬 수 있는 장점이 있어서 최근에는 이에 대한 연구 및 산업화 시도가 많이 이루어지고 있다.
한편, 미생물의 균체 자체를 최종 생산물로 획득하기 위한 발효공정에 있어서 균체의 함량을 증대시킬수록 유리하지만, 발효조에서의 균체의 함량을 최대한으로 증가시키는데는 일정한 한계가 있다. 즉, 이론적으로 일정 함량(70∼80%) 이상의 수분을 함유하고 있는 미생물의 균체로만 발효조를 채울 경우, 미생물의 종류에 따라 차이는 있지만 대략 240∼280g/??를 최대 한계로 보고 있다.
그러나 실제로 미생물을 배양하는 데에는 영양소가 적절히 공급되어야 하고 어느 정도의 균체량이 되면 물질 전달이 불가능하며 생육이 정지 상태가 되기 때문에 결국 배양가능한 농도는 그 이하가 된다.
이에, 최근에는 발효공정에 있어서 생산성을 증대시키기 위한 방법의 하나로 고농도 세포 배양 기술이 연구되고 있는 바, 고농도 세포 배양 기술은 일정 농도의 균체가 생육을 계속할 수 있도록 배양 조건을 최적화시키면서 최대의 균체를 얻는 기술이다. 이러한 고농도 세포 배양 방법은 특히 유용한 물질을 생산하는 균체를 대량 생산하는데 매우 유용한 것으로 그 이용가치가 매우 뛰어나다고 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 상업적으로 유용한 T-20 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하고 있어 T-20 펩타이드를 세포 내에서 발현할 수 있는 형질전환 재조합 대장균을 고농도로 세포 배양하는 한편 배양한 재조합 대장균 내에서 발현된 T-20 펩타이드를 고순도로 획득하기 위한 방법에 대하여 연구한 결과, 일정 농도의 재조합 대장균이 생육을 계속할 수 있도록 배양 조건을 최적화시키면서 촤대의 균체량을 획득할 수 있는 유가식 배양방법을 통한 고농도 세포 배양 기술 및 아세톤을 이용한 T-20 펩타이드의 분리 및 정제방법을 개발할 수 있었다.
즉, 유가식 배양방법을 이용함에 있어 공정상의 편의성이 뛰어난 pH-stat 기술을 활용하여 대장균의 배양 중 영양배지를 추가적으로 공급하고, 발효 용적당 일정 농도 이상에서도 세포의 생리적 활성도가 저해받지 않도록 온도, pH, 교반속도 등을 일정하게 유지하고, 용존 산소량이 제한받지 않도록 배양조건을 적절히 조절함으로써 T-20 펩타이드를 생산하는 재조합 대장균을 고농도로 배양할 수 있으며, 아울러 저렴한 용매인 아세톤을 이용하여 재조합 대장균 내에서 발현된 T-20 펩타이드를 고순도로 분리 및 정제할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르른 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 대장균의 고농도 세포 배양 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 대장균으로부터 T-20 펩타이드를 고순도로 분리 및 정제하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 대장균을 유가식 배양방법에 따라 고농도로 세포 배양하는 방법을 제공함을 특징으로 한다. 즉, 배양액의 pH를 적정 수준으로 유지하기 위하여 pH의 변화에 따라 영양배지를 누적 첨가시킴으로써 T-20 펩타이드를 생산하는 재조합 대장균을 고농도로 배양하고, 아울러 재조합 대장균의 배양 농도가 일정 수준에 도달하였을 때 락토오스를 첨가함으로써 재조합 대장균 세포내에서의 T-20 펩타이드의 발현을 유도하는 방법을 제공함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균으로부터 발현된 T-20 펩타이드를 용이하게 추출, 분리 및 정제하기 위한 용매로 케톤류 화합물, 보다 바람직하게는 아세톤을 사용하여 고순도의 T-20 펩타이드를 분리 및 정제하는 방법을 제공함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 T-20 펩타이드의 대량생산을 위하여 이용하는 재조합 대장균은 T-20 펩타이드를 코딩하는 유전자뿐만 아니라 락토오스 유도성 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 재조합 대장균은 T-20 펩타이드와 융합되어 발현되는 융합파트너(fusion partner)로서, 펩타이드 또는 단백질이 세포내 단백질 분해효소에 의해 분해되는 것을 방지하는 융합파트너를 코딩하는 유전자 또한 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 상기 T-20 펩타이드 코딩 유전자는 이미 공지된 유전자로서 NCBI의 GenBank 등 유전자 서열 데이터베이스에 등록된 유전자를 용이하게 선택하여 이용할 수 있다.
상기 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균은 본 발명 기술 분야의 당업자라면 적의 선정하여 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 E.coli BmG3 균주(KCCM 10506)를 이용하는 것이 좋지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균을 대량생산하기 위한 유가식 배양방법은 하기의,
(1) 초기 배양배지에 미네랄 용액을 가하고 pH를 6.8∼7.2 수준으로 조절한 배지에서 재조합 미생물을 회분식 배양하는 단계;
(2) 상기 재조합 대장균 배양액의 pH를 6.8∼7.2 수준으로 조절하면서 영양배지를 누적 첨가시키는 단계; 및
(3) 상기 재조합 대장균 배양액의 OD600에서의 흡광도가 30∼50일 때 락토오스를 첨가하여 더 배양하는 단계;
를 포함함을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 유가식 배양방법에 있어서 영양배지의 첨가 방식은 배양액의 pH의 변화에 따라 영양배지를 첨가하는 방법을 이용하였다. 즉, 본 발명에서는 고농도 세포 배양 기술을 응용한 유가식 배양 방법을 이용함에 있어 공정상의 편의성이 뛰어난 pH에 의한 첨가방식인 pH-stat 기술을 활용하는 한편, 발효 용적당 일정 농도 이상에서도 세포의 생리적 활성도가 저해받지 않도록 온도, pH, 교반속도 등을 일정하게 유지하고 용존산소량이 제한받지 않도록 배양 조건을 적절하게 조절하면서 배양하는 방법을 이용한 것에 그 특징이 있다.
상기에서 초기 배양배지에는 1ℓ배양을 기준으로 글루코스 15g, 황산암모늄 4g, 제일인산칼륨 3g, 제이인산칼륨 3g, 염화나트륨 1g, 구연산나트륨 2.3g, 티아민 5㎎, 황산마그네슘 0.45㎎, 가나마이신 50㎍/㎕및 소포제 0.2g 등의 영양성분이 포함될 수 있으나, 상기한 영양성분의 종류 및 사용량 등은 이에 한정하는 것은 아니다.
상기에서 미네랄 용액에는 용액 1ℓ에 대하여 염화칼슘 11.5g, 구연산철 7.3g, 염화망간 3.2g, 초산아연 1.68g, 염화구리 0.302g, 염화코발트 0.534g, 붕산 0.666g, 몰리브덴산나트륨 0.534g, 티아민 0.534g, 구연산나트륨 20g 및 2N의 염산 등이 포함될 수 있으나, 상기한 영양성분의 종류 및 사용량 등은 이에 한정하는 것은 아니다.
상기에서 영양배지는 상기 유가식 배양 (2)단계에서 1ℓ배양을 기준으로 제일인산칼륨 4g, 제이인산칼륨 2g, 티아민 5㎎, 황산암모늄 4g, 가나마이신 50㎍/㎕이 포함되어 있는 총 200㎖의 용액을 먼저 모두 투입하고, 글루코스 250g 및 황산마그네슘 4g을 포함하는 500㎖의 용액을 pH를 일정 수준으로 조절하기 위하여 투여하는 것으로 구성된다.
본 발명에서 목적하는 T-20 펩타이드의 대장균 세포내에서의 발현을 유도하기 위하여, T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균 배양액의 OD600에서의 흡광도가 약 30∼50일 때 발현 유도 물질인 락토오스를 더 첨가하여야 한다. 이때 락토오스의 첨가량은 총 배양액당 w/v6∼8%인 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균이 생산하는 T-20 펩타이드는 대장균으로부터 발현된 최종 산물 그 자체, T-20 펩타이드의 중간체를 모두 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 유가식 배양방법을 통하여 충분히 배양된 재조합 대장균에서 발현된 T-20 펩타이드를 효과적으로 추출, 분리 및 정제하기 위하여 C18 고압 크로마토그래피 또는 세파로스 수지를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 용매로는 케톤류 용매, 보다 바람직하게는 아세톤 또는 아세토나이트릴을 이용하는 것이 좋으며, 이때 아세톤 또는 아세톤나이트릴의 농도는 10∼60%로 사용하는 것이 좋다. 상기 용매로서의 아세톤은 저렴한 산업용 용매로써 경제적으로도 유리하며 추출효과가 뛰어난 장점이 있는데, 특히 본 발명 실시예 2의 방법에 따르면 개별 분순물 0.5% 이하, 총 2.0% 이하의 고순도로 정제가 가능하다.
아세톤을 이용하여 불용성 단백질을 추출하는 방법은 잘 알려진 사실이나, T-20 융합 펩타이드의 추출에서 사용된 예는 없으며, 더욱이 하기 실시예 2에서와 같이 아세톤을 사용하는 경우 정제 중간 단계를 줄일 수 있어 매우 효과적인 방법인 것이다. 즉, 분리된 대장균 세포를 아세톤 용매로 처리함으로써 세포의 파괴와 함께 목적하는 T-20 펩타이드를 융합 펩타이드의 형태로 용이하게 추출해낼 수 있는 것이다.
본 발명의 방법에 따라 아세톤에 의하여 추출, 분리 및 정제된 T-20 펩타이드 결합 융합단백질을 CNBr을 처리함으로써 융합파트너 부분을 절단할 수 있다. 그 다음 상용적으로 이용되는 컬럼용 수지를 적의 선정하여 이용함으로써 T-20 펩타이드를 순수하게 분리할 수 있다.
본 발명은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균 배양시 배양물의 pH를 적정 수준으로 조절하여 세포 생육 상태를 최적으로 유지하기 위하여 pH변화에 따라 영양배지를 누적 첨가시킴으로써 상기 대장균의 배양 농도, 즉 발효액 용적당 획득할 수 있는 형질전환 대장균의 건조중량(g/ℓ)을 발효물 1ℓ당 20∼30g까지, OD600에서의 흡광도로는 60까지 높일 수 있으며, 이에 따라 목적하는 T-20 펩타이드의 생산량을 더불어 증대시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 상기 대장균 세포 내에서 발현된 T-20 펩타이드를 저렴한 비용의 아세톤을 이용하여 추출 및 정제함으로써 고순도의 T-20 펩타이드를 단시간에 다량으로 효율적으로 획득할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이에 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1] T-20 펩타이드를 생산하는 형질전환 재조합 대장균의 유가식 배양방법에 의한 고농도 세포 배양
형질전환 재조합 대장균 E.coli BmG3(KCCM 10506)을 하기와 같은 유가식 배양을 위한 발효 공정 조건 하에서 배양하여 형질전환 T-20 펩타이드를 생산하였다. 총 5ℓ의 용량을 갖고 있으며 pH, 온도 및 기포 수준을 자동적으로 조절할 수 있는 발효조를 사용하여 대장균 배양물을 총 3ℓ의 액체용적으로 배양하고자 하였다.
이를 위하여, 1ℓ배양을 기준으로 글루코스 15g, 황산암모늄 4g, 제일인산칼륨 3g, 제이인산칼륨 3g, 염화나트륨 1g, 구연산나트륨 2.3g, 티아민 5㎎, 황산마그네슘 0.45㎎, 가나마이신 50㎍/㎕ 및 소포제 0.2g을 첨가하고 증류수를 가하여 제조한 배지를 멸균한 다음 형질전환 재조합 대장균 E.coli BmG3(KCCM 10506)을 배양액의 2%의 양으로 첨가하여 대장균 배양물 2.2ℓ를 준비하였다. 그 다음, 용액 1ℓ에 대해 염화칼슘 11.5g, 구연산철 7.3g, 염화망간 3.2g, 초산아연 1.68g, 염화구리 0.302g, 염화코발트 0.534g, 붕산 0.666g, 몰리브덴산나트륨 0.534g, 티아민 0.534g, 구연산나트륨 20g을 첨가하고 2N 염산을 가하여 준비한 미네랄 용액 10㎖를 첨가하고 초기 pH를 6.8로 조절한 다음 OD600에서의 흡광도가 10이 될 때까지 약 7시간 동안 회분식 배양하였다.
그 다음, 제일인산칼륨 4g, 제이인산칼륨 2g, 티아민 5㎎, 황산암모늄 4g, 가나마이신 50㎍/㎕을 증류수에 녹여 200㎖이 되도록 제조한 영양배지를 먼저 첨가하고, 글루코스 250g, 황산마그네슘 4g를 증류수에 녹여 500㎖이 되도록 준비한 용액을 배양액의 pH가 6.8∼7.2 수준으로 유지되도록 조절하면서 공급하였다. 이 때, 상기 준비한 미네랄 용액 10㎖를 더 첨가하였다.
상기 배양시 발효조 내 액체를 두 개의 임펠러가 달린 교반기를 사용하여 300~1,000rpm의 범위로 교반시키고, 통기 속도는 1분당 발효조 내에 있는 액체용적당 공기의 0.5∼3용적이 되도록 조절하였다. 발효조는 pH-stat법을 사용하여 암모니아수와 염산이 자동적으로 첨가될 수 있도록 하여 pH를 6.8 정도로 유지하였다. 이때, 암모니아수는 pH 조절기능뿐만 아니라 대장균의 성장을 위한 질소원으로도 사용되는 것이다.
상기와 같은 유가식 배양을 통해서 OD600에서의 흡광도가 40이 되면 배지 총량을 기준으로 하여 w/v6∼8%의 락토오스를 1ℓ가 되도록 녹인 후 첨가하여 10시간 동안 발현시켜 형질전환 펩타이드 T-20을 생산하였다. 이때, 발현은 37℃, 대기압 하에서 실시하였으며, pH 6.8∼7.2 수준이 되도록 발현시켰다.
상기 배양한 대장균 배양액을 원심분리하여 배양액으로부터 분리한 대장균을 증류수로 현탁한 후 다시 원심분리하는 방법으로 세척한 다음 60℃ 건조기에서 34시간동안 건조시키고 중량을 측정하였다.
그 결과로 시간의 경과에 따른 형질전환 대장균의 생장률을 흡광도 및 건조중량에 대하여 나타낸 생장곡선을 도 1에 나타내었다. 또한 T-20 펩타이드의 발현 유무를 확인하기 위하여, 발현 후 시간의 경과에 따라 샘플링한 샘플을 상기와 동일한 방법으로 세척한 후 pH 8.0 완충용액에 현탁하여 16.2% 트리신젤에서 전기영동하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 1에 따르면 성장 속도가 0.1hr-1 이하에서는 조단백 함량이 55% 이상, 핵산의 함량이 8% 이하의 값으로 나타났다. 발효 종료 후 건조중량은 23.3g으로 나타났다. 또한 발현된 T-20 펩타이드의 양은 젤 분석을 통해서 총 단백질의 20%인 것으로 확인되었으며 수율은 1g/ℓ로 확인되었다.
[실시예 2] T-20 펩타이드의 분리 및 정제
상기 실시예 1을 통하여 대장균으로부터 생산된 발현 펩타이드에서 순수 T-20 펩타이드를 분리 및 정제하였다.
먼저 유가식 배양방법으로 발현시킨 상기 형질전환 대장균 균체로부터 형질전환 펩타이드를 분리하기 위하여 100g(wet weight)의 균체를 400㎖이 되도록 증류수에 현탁한 후 교반하였다. 여기에 최종 반응액이 1ℓ가 되도록 아세톤을 총 반응 용액의 60%가 되게 처리한 후 잘 교반하였다. 상기 교반액을 원심분리하여 상등액을 취하고 -20℃에서 냉각된 아세톤을 상등액의 5배의 양으로 처리한 후 침전이 발생하면 다시 원심분리하여 침전물을 취한 후 건조시켰다.
상기 분리한 펩타이드로부터 퓨전파트너를 잘라주기 위해서 CNBr을 처리하였다. 70% 포름산 100㎖당 4g의 건조된 침전물을 녹인 후 2N이 되게 6N CNBr을 처리하고 24시간 반응시켰다. 반응종료 후 아세톤 침전으로 침전물을 회수하여 건조시켰다.
상기 건조된 침전물을 200mM 탄산나트륨 1㎖ 용액에 90㎎이 되게 녹이고 2N 염산을 사용하여 pH 8.0으로 보정하였다. 상기 액을 Sepharose Fast Flow가 충진된 컬럼에 흡착시킨 다음 염화나트륨이 포함된 완충용액을 0∼0.5M의 염농도 구배를 주어 2회 이상 세척하고, 0.4M 염화나트륨이 포함된 완충용액으로 T-20 펩타이드를 회수하고 상기와 동일한 방법으로 아세톤 침전하여 침전물을 건조시켰다.
상기 건조된 침전물을 C18이 충진된 고압 컬럼을 이용하여 불순물을 완전히 제거하고 같은 방법으로 아세톤 침전하여 침전물을 건조시켰다.
상기와 같은 정제 단계에 따른 침전물의 전기영동 결과를 도 3에 나타내었다.
최종적으로 획득된 건조물을 HPLC 분석한 결과를 도 4 및 하기 표 1에 나타내었다. 위와 같은 전처리를 거처 정제한 결과 이온피크를 제외한 고순도의 T-20 펩타이드를 얻을 수 있었으며, Q-Top MS/MS 분석한 결과 분자량이 4.45kDa으로 일치함을 확인하였다.
# RT (분) 면적 (mV*sec) 형태 폭 (초) 면적 (%)
1 20.565 12350.745 BB 56.300 99.144
2 21.305 106.586 BB 14.300 0.856
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 대장균을 고농도로 배양할 수 있는 방법과 이로부터 발현된 T-20 펩타이드를 고순도로 분리 및 정제할 수 있는 방법을 제공함으로써 산업상 이용가치가 높은 T-20 펩타이드를 보다 손쉽게 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 유가식 배양에 의한 T-20 펩타이드 생산을 위한 형질전환 재조합 대장균의 성장곡선 그래프이다.
도 2는 유가식 배양 중 발현 이후 시간대별 펩타이드 발현을 나타낸 전기영동 사진이다.
도 3은 정제 단계별 전기영동 사진이다.
도 4는 정제된 T-20 펩타이드를 HPLC로 분석한 그래프이다.

Claims (5)

  1. (1) T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균을 초기 배양배지에 미네랄 용액을 첨가한 pH 6.8∼7.2 수준의 배양배지에서 회분식 배양하는 단계;
    (2) 상기 재조합 대장균 배양액의 pH를 pH 6.8∼7.2 수준으로 조절하면서 영양배지를 누적 첨가시키는 단계; 및
    (3) 상기 재조합 대장균 배양액의 OD600에서의 흡광도가 30∼50일 때 락토오스를 첨가하여 더 배양하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 고농도 세포 배양 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균은 E.coli BmG3(KCCM 10506)임을 특징으로 하는 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 고농도 세포 배양 방법.
  3. 케톤류 화합물을 용매로 이용하는 C18 크로마토그래피 또는 세파로스 컬럼에 의하여 T-20 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합 대장균으로부터 T-20 펩타이드를 분리 및 정제하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 케톤류 화합물은 아세톤임을 특징으로 하는 T-20 펩타이드를 분리 및 정제하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 아세톤은 농도가 10∼60%인 것임을 특징으로 하는 T-20 펩타이드를 분리 및 정제하는 방법.
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