KR100263583B1 - 항균 펩타이드의 대량 제조방법 및 그에 유용한 플라즈미드 벡타 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항균 펩타이드의 대량 제조방법에 관한 것으로, 유전자 조작을 통하여 염기성의 항균 펩타이드(basic antimicrobial peptide)와 산성 펩타이드(acidic peptide)의 융합 유전자의 중합체를 제조하고, 그를 숙주 미생물에서 발현시킴으로써, 발현된 산성 펩타이드가 항균 펩타이드의 염기성을 중화시켜 항균 펩타이드의 항균력을 일시적으로 소거할 수 있어 숙주 미생믈의 사멸을 방지하여, 재조합 미생물로부터 항균 펩타이드를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

항균 펩타이드의 대량 제조방법 멎 그에 유용한 플라즈미드 벡타
본 발명은 항균 펩타이드의 대량 제조방법에 관한 젓이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전자 조작을 통하여 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)를 외래 펩타이드와의 융합 단백질 형태로 생산한 후, 외래 펩타이드를 제거하고 항균 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
항균 펩타이드는 열이나 알칼리 등에 의하여 항균활성이 거의 소실되지 않는 강한 물리·화학적 안정성을 가지고 있으며, 또한 미생물에 대한 내성이 문제시되고 있는 종래의 항생제들과는 다른 활성 기작(mechanism)에 의해 항균활성을 나타내므로, 내성을 유발할 가능성이 적다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 항균 펩타이드는 제약·식품 분야등에서의 산업적 응용 가능성이 매우 높다.
그러나, 전술한 항균 펩타이드의 산업적 이용에 가장 큰 장애요인은 지금까지의 방법으로는 이들을 값싸게 대량으로 제공할 수 없다는 점에 있다. 예를 들면, 화학합성으로 항균 펩타이드를 생산하는 경우에는 경제성이 낮고, 미생물을 이용한 유전공학적 기법으로 항균 펩타이드를 생산하는 경우에는 경제성은 있으나 발현된 항균 펩타이드가 숙주 미생물의 성장을 저해하여 펩타이드의 생산 수율이 매우 낮다는 문제점이 있었다. 이와 같은 숙주 미생물의 성장저해는 항균 펩타이드내에 양전하를 가진 염기성 아미노산 잔기들이 많다는 특성에 기인하여, 발현된 펩타이드와 DNA 또는 RNA와의 결합에 의한 DNA 븍제 및 단백질 생합성의 저해에 따른 것으로 알려져 있다.
본 발명은 미생물에서 항균 펩타이드를 대량 생산할 수 있는 플라즈미드를 제공한다.
본 발명은 항균 펩타이드의 발현이 숙주에 미치는 성장저해 효과를 극소화하여, 항균 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공한다.
도1a는 본 발명의 한 실시예에서 사용한 거머린 유전자 및 아미노산 서열이다.
도1b는 본 발명의 한 실시예에서 사용한 MIS 유전자 및 아미노산 서열이다.
도2a는 거머린(Guamerin)과 항균 펩타이드인 부포린 II(BuforinII)의 각 유전자를 재조합 중합효소 연쇄반응(PCR) 법에 의해 융합하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도2b는 MIS(magainin intervening segment)와 항균 펩타이드인 부포린II의 각 유전자를 PCR법에 의해 융합하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도3은 유전자 증폭 벡터(gene amplification vector)를 이용하여 융합 유전자의 중합체를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도4a는 항균 펩타이드 MSI-78의 유전자와 산성 펩타이드인 거머린(Guamerin) 유전자의 융합 유전자의 중합체를 제조하는데 이용되는 융합 유전자(유전자 I)를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도4b는 항균 펩타이드 MSI-78의 유전자와 산성 펩타이드인 거머린(Guamerin) 유전자의 융합 유전자의 중합체를 제조하는데 이용되는 융합 유전자(유전자 II)를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도5는 부포린II와, 거머린 또는 MIS와의 융합유전자의 중합체를 포함하는 재조합 대장균으로부터 단백질을 발현시키고, 세포를 파쇄하여 얻은 봉입체(inclusion body)를 SDS-PAGE한 곁과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도6은 거머린과 여러 항균 펩타이드와의 융합유전자를 포함하는 재조합 대장균으로부터 단백질을 발현시키고, 세포를 파쇄하여 얻은 봉입체(inclusion body)를 SDS-PAGE한 졀과를 나타내는 전기영동 사진이다.
본 발명은 산성 펩타이드와 염기성을 띠는 항균 펩타이드로 된 융합 유전자를 포함하는 플라즈미드에 관한 것이다.
본 발명의 플라즈미드는 유전자에 작동가능하도록 연결된 프로모터와 유전자로 이루어지며, 상기 유전자가 항균 펩타이드 유전자의 양전하를 중화시킬 수 있는 산성 펩타이드 유전자와 상기 항균 펩타이드 유전자로 이루어진다.
또한 본 발명은 산성 펩타이드 유전자와 염기성을 띠는 항균 펩타이드 유전자로 된 융합 유전자를 제조하고, 그를 숙주 미생물에서 발현시킨 다음, 융합펩타이드를 분리하여 산성 펩타이드를 제거함으로써 항균 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전자 조작을 통하여, 산성 펩타이드와 염기성인 항균 펩타이드로 된 융합 유전자를 제조하고 그것을 숙주 미생물에서 발현시킴으로써, 발현된 산성 펩타이드가 항균 펩타이드의 염기성을 중화시켜 항균펩타이드의 항균력을 일시적으로 소거함에 의해 숙주 미생물의 사멸을 방지하여 미생물 내에서의 중합체 생산을 대량으로 한 후에, 산성 펩타이드를 제거하고 항균펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 융합 유전자는 모노머 또는 중합체(multimer) 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
항균 펩타이드가 DNA 또는 RNA에 곁합하는 것을 방지할 수 있도록, 염기성 항균 펩타이드의 양전하를 중화시킬 산성 펩타이드를 고안한다. 산성 펩타이드는 항균 펩타이드의 양전하를 실질적으로 중화시킬 수 있는 것이 바람직하다. 산성 펩타이드의 길이는 한정되지 않으나, 발현하고자 하는 항균 펩타이드의 길이 및 양전하 분포를 고려하여 전하의 효과적인 중화에 적합하도록 항균 펩타이드의 길이와 같거나 그 이상의 길이인 것이 바람직하다. 또 산성 펩타이드는 최소 2개 이상의 시스테인 잔기수를 가지는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 시스테인 잔기는 발현 후에 이황화결합(disulfide bond)에 의한 2차 구조를 형성함으로써, 산성 펩타이드의 음전하와 항균 펩타이드의 양전하들 사이의 상호작용을 촉진하는 것으로 추측된다.
본 발명에 사용될 수 있는 산성 펩타이드는 인위적으로 디자인하거나 또는 자연계에 존재하는 산성 펩타이드들 중에서 선택할 수 있으며, 그것을 암호화하는 유전자를 합성하거나, 자연계로부터 분리하여 사용할 수 있다.
따라서 산성 펩타이드 유전자는 항균 펩타이드와의 융합을 용이하게 하기 위하여, 추후 융합 펩타이드로부터 항균 펩타이드만의 분리를 용이하게 하기 위하여, 또는 다양한 형태의 융합 펩타이드 유전자 중합체를 만들기 위하여, 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.
예를 들어 원하는 항균 펩타이드가 해독될 수 있도륵 항균 펩타이드와 인-프레임(in-frame) 연결될 수 있도록 산성 펩타이드 유전자를 합성 또는 변형시킬 수 있다. 또다른 예로, 항균 펩타이드가 융합 펩타이드 형태로 발현된 후 그 융합 펩타이드로부터 항균 펩타이드를 분리할 수 있는 효소 또는 화합물에 의해 절단되는 잔기를 암호화하는 유전자가 부가되도륵 산성 펩타이드 유전자를 합성, 변형시킬 수 있다.
예를 들어 산성 펩타이드 유전자는 산성 펩타이드를 암호화하는 유전자의 모노머, 또는 그것의 중합체(multimer) 중에서 항균 펩타이드의 중화에 가장 적당한 길이를 갖는 것을 선택하여 사용할 수 있다. 산성 펩타이드 유전자 중합체는 예를들어 유전자 증폭 시스템을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 두개의 마주 보는 클래스 IIS 제한효소 인식부위를 가지는 벡터의 상기 클래스 IIS 제한효소 인식 부위 사이에 산성 펩타이드 유전자를 삽입하여 산성 펩타이드 유전자를 증폭시킨 후 상기 벡터를 클래스 IIS 제한효소로 절단하여 산성 펩타이드 유전자를 포함하는 DNA 절편을 분리 정제하고, 분리된 DNA 절편을 자체접합시켜 중합체를 제조하고, 이들 여러가지 중합체를 위의 클래스 IIS 제한효소로 절단된 벡터에 클로닝하여, 산성 펩타이드 중합체들을 가진 벡터들을 제조할 수 있다(참조 : Lee, J.H. et al., Genetic analysis:Biomolecular Engineering 13;139-145(1996)).
본 발명에 사용될 수 있는 항균 펩타이드는 인위적으로 디자인하거나 자연계에 존재하는 항균 펩타이드들 중에서 선택할 수 있으며, 그것을 암호화하는 유전자를 합성하거나, 자연계로부터 분리하여 사용할 수 있다.
항균 펩타이드 유전자는 산성 펩타이드와의 융합을 용이하게 하기 위하여, 추후 융합 펩타이드로부터 항균 펩타이드만의 분리를 용이하게 하기 위하여, 또는 다양한 형태의 융합 펩타이드 유전자 중합체를 만들기 위하여, 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.
예를 들어 산성 펩타이드에 항균 펩타이드 유전자의 C말단이 직접(in-frame) 연결될 수 있도록 항균 펩타이드 유전자를 변형시킬 수 있다(항균 펩타이드 유전자 I).
또다른 예로, 항균 펩타이드 유전자의 N 말단에 상기 항균 펩타이드가 융합 펩타이드 형태로 발현된 후 그 융합 펩타이드로부터 항균 펩타이드를 분리할 수 있는 효소 또는 화합물에 의해 절단되는 잔기를 암호화하는 유전자가 부가되고, C말단에는 펩타이드 합성을 종결시키는 유전자가 부가되도록 항균 펩타이드 유전자를 변형시킬 수 있다(항균 펩타이드 유전자 II).
또다른 예로, 항균 펩타이드 유전자의 N말단 및 C말단에, 상기 항균 팹타이드가 융합 펩타이드 형태로 발현된 후 그 융합 펩타이드로부터 항균 펩타이드를 분리시킬 수 있는 효소 또는 화합물에 의해 절단되는 잔기, 예를 들어 CNBr에 의해 절단하고자는 하는 경우 메티오닌 기를 암호화하는 유전자가 부가되도록 항균 펩타이드 유전자를 변형시킬 수 있다(항균 펩타이드 유전자 III).
이와 같이 제조된 산성 펩타이드 유전자와 항균 펩타이드 유전자를 연결하여 융합 유전자를 제조하며, 앞에서 설명한 바에 따라, 산성 펩타이드 유전자 또는 항균펩타이드 유전자는 각각 모노머 또는 중합체일 수 있다.
융합유전자는 산성 펩타이드 유전자와 항균 펩타이드 유전자로 이루어지며, 항균 펩타이드 유전자가 인-프레임(in-frame)으로 연결되는 한, 산성 펩타이드 유전자와 항균 펩타이드 유전자는 직접 연곁되거나 또는 링커 등에 의해 간접적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 융합유전자는, 항균 펩타이드 유전자와 산성 펩타이드 유전자를 각 유전자의 단일가닥의 3'말단이 서로 상보적인 염기서열을 가지도록 변형시켜 두 유전자를 부분 이중결합에 의해 연결시키고, 이것을 주형으로 하고각 유전자의 단일가닥의 5'말단과 상보적인 염기서열을 프라이머로 사용하여 재조합 PCR(polymerase chain reaction) 방법에 의해 융합 유전자를 제조할 수 있다.
제조된 융합유전자 모노머로부터, 유전자증폭시스템(gene amplification system)을 이용하여 융합유전자 자체접합에 의해 융합유전자의 중합체를 제조할 수 있다.
융합 유전자의 중합체는 예를 들어 유전자 증폭 시스템을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 두개의 마주보는 클래스 IIS 제한효소 인식부위를 가지는 벡터의 상기 클래스 IIS 제한효소 인식부위 사이에 융합 유전자를 삽입하고 상기 벡터를 클래스 IIS 제한효소로 절단하여 융합 유전자를 포함하는 DNA 절편을 분리, 정제한 후 분리된 DNA 절편을 자체접합시켜 융합 유전자 중합체를 제조하고, 이 융합 유전자 중합체를 위의 클래스 IIS 제한효소로 절단된 벡터에 클로닝하여, 융합 유전자 중합체들을 가진 벡터들을 제조할 수 있다.
본 발명의 구체예에서 융합유전자 중합체의 한 예는, 항군 펩타이드 유전자 III을 포함하는 융합 유전자의 중합체이다.
본 발명의 구체예에서 융합유전자 중합체의 한 예는, 항균 펩타이드 유전자 I을 포함하는 융합 유전자의 모노머 또는 중합체의 3' 말단에 항균 펩타이드 유전자 II를 포함하는 융합 유전자가 연결된 중합체이다.
본 발명의 구체예에서 융합 유전자 중합체의 한 예는, 항균 펩타이드 유전자 III을 포함하는 융합 유전자의 모노머 또는 중합체의 3' 말단에 항균 펩타이드 유전자 II을 포함하는 융합 유전자가 연결된 중합체이다.
그런 다음, 융합 유전자 중합체를 적절한 발현벡터에 클로닝하여 미생물, 예를 들어 대장균내에서 발현시키고, 발현된 융합펩타이드 중합체를 순수분리한다. 분리된 융합펩타이드 중합체에, 항균 펩타이드의 양말단을 특이적으로 인지하여 분해할 수 있는 효소나 화학물질, 예를 들어 CNBr을 처리하여 산성 펩타이드를 제거함으로써 항균 펩타이드를 모노머 단위로 분리하고, 음이온 교환수지 크로마토그래피 등에 의하여 항균 펩타이드만을 수득한다. 이렇게 제조된 중합체를 발현시켜 얻은 융합 펩타이드 중합체를 효소나 화합물로 처리하는 경우, 특히 CNBr 처리에 의해 중합체의 C말단에 있는 항균 펩타이드를 자연형 모노머로 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 실시예에 예시된 특정의 항균 펩타이드, 산성 펩타이드 및 그들의 중합체 유전자는 단지 바람직한 구체적인 예들에 지나지 않는 것으로, 각종 염기성 항균 펩타이드의 대량 생산을 목적으로, 항균 펩타이드의 염기성 중화에 산성 펩타이드를 이용하는 발명은 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.
[실시예 1]
산성 펩타이드 아미노산 서열의 결정 및 그의 유전자의 제조
항균 펩타이드 부포린 II(Buforin II; TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK; Park, C.B. et al., (1996) Biochem Biophys. Res. Comm. 218, 408-413)을 발현시키기 위하여, 부포린 II의 길이 및 전하 분포를 고려하여, 부프린 II의 길이와 같거나 그 이상의 길이를 가지면서, 부포린 II의 양전하 수 및 분포와 비슷한 음전하 수 및 분포를 가지고, 많은 양의 시스테인 잔기를 갖고 있는 적합한 산성 펩타이드의 아미노산 서열을 탐색한 결과, 자연계에 존재하는 거머린(이하 편의상 'G'로 표기함. Jung, H.I. et al.(1995) J. Bio1. Chem. 270; 13879-13884) 또는 MIS(magainin intervening segment, 이하 편의상 'M'으로 표기함. Zasloff, M.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 5449-5453)를 산성 펩타이드로 채용하였다. 도1a 및 도1b(센서 서열만 표시)에 기재된 바와 같이, 이들 각각을 암호화하는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드 4종류를 합성하였다(1종의 산성 펩타이드마다 상호 상보적인 단일가닥의 올리고뉴클레오티드 2종류가 합성되며, 그의 5'말단은 5'CCCC/GGGG5' 이 되도륵 하였다). MIS에는 올리고뉴클레오티드 합성시에 MIS 염기서열의 5'말단과 3'말단에 각각 하나씩의 시스테인 코돈을 부가하였다.
상기에서 합성된 올리고뉴클레오티드들을 같은 몰비로 TE 완충액(pH 8.0)에 용해시키고, 70℃에서 10분간 가열하여 0℃에서 30분간 방치한 다음, 20% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 이중가닥 DNA를 분리, 정제하였다. 이렇게 정제된 이중가닥의 올리고머를 클래스 IIS 제한효소인 BbsI으로 절단된 pBBS1 벡터(참조: Lee, J.H. et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 13:139-145(1996))에 클로닝하여 pBBS1-G1(거머린) 또는 pBBS1-M1(MIS) 벡터를 제조하였다.
이렇게 제조된 벡터 pBBS1-G1또는 pBBS1-M1를 이용하여, 산성 펩타이드 유전자의 중합체(pBBS1-Gn 또는 pBBS1-Mn, n=1,2,3,...)를 제조할 수 있으므로, 항균 펩타이드의 중화에 가장 적당한 길이의 산성 펩타이드를 선택할 수 있다.
[실시예 2]
항균 펩타이드 유전자의 제조
항균 펩타이드를 융합 펩타이드 중합체로 발현시키고 분리·정제한 후에 활성이 있는 모노머로 제조하고자, 유전자의 발현 후 CNBr을 처리함에 의해 메티오닌잔기 바로 뒤의 펩타이드 결합이 절단되도록 하기 위하여 항균 펩타이드 부포린 II유전자의 양쪽 끝에 메티오닌 코돈을 부가하였다.
이와 같이 제조된 항균 펩타이드 부포린 II(이하 'B'로 표기함)을 암호화하는 이중가닥의 올리고머를 합성한 다음, 클래스 IIS 제한효소인 BbsI으로 절단된 pBBS1 벡터에 클로닝하여 pBBS1-B1벡터를 제조하였다. 이렇게 제조된 pBBS1-B1벡터에는 완전한 부포린 II의 유전자가 삽입되어 있고, 그 항균 뎁타이드 부포린 II유전자 전후로 메티오닌 코돈이 하나씩 부가되어 있다.
[실시예 3]
산성 펩타이드 유전자/항균 펩타이드 유전자의 융합유전자 및 그의 중합체 제조
실시예 1에서 제조된 산성 펩타이드 유전자와 실시예 2에서 제조된 항균 펩타이드 유전자를 융합시키기 위하여, 다음과 같이 PCR하였다(참조: 도2a 및 도2b). 산성 펩타이드 거머린의 5'말단과 3'말단에 해당하는 1쌍의 프라이머(프라이머 1:및 프라이머 2:를 이용하여 거머린 유전자를 PCR 증폭시키고, 항균 펩타이드 부포린 II의 5'말단과 3'말단에 해당하는 1쌍의 프라이머(프라이머 3:및 프라이머 4:를 이용하여 부포린 II 유전자를 PCR 증폭시켰다.
이렇게 증폭된 PCR 산물을 같은 몰비로 혼합한 후에 프라이머 1과 4를 이용하여 다시 PCR 증폭시켰다. 그 결과 얻어진 PCR 산물을 제한효소 BbsI으로 절단하고, 거머린과 부포린 II의 융합유전자를 포함하는 DNA 절편을 분리한 다음, 제한효소 BbsI으로 절단된 pBBS1 벡터에 클로닝하여, pBBS1-(GB)1벡터를 제조하였다(참조:도2a).
그런 다음, 유전자 증폭 시스템을 이용하여 융합유전자의 중합체 제조를 위하여, pBBS1-(GB)1벡터를 제한효소 BbsI으로 절단하여 융합유전자를 포함하는 DNA절편을 분리, 정제하였다. 분리된 DNA 절편을 자체 접합시켜 중합체를 제조하고, 이들 여러가지 중합체를 BbsI으로 절단된 pBBS1 벡터에 클로닝하여, 유전자 중합체들을 가진 벡터들을 제조하였으며, 이들을 각각 pBBS1-(GB)n(n=1,2,3,4...)으로 명명하였다(참조:도3).
한편, 거머린 대신에 MIS를 산성 펩타이드로 이용한다는 점을 제외하고는 상술한 방법과 동일하게 실험을 수행하여, pBBS1-(MB)1벡터(참조:도2b) 및 융합유전자의 중합체를 포함하는 벡터들 pBBS1-(MB)n(n=1,2,3,4...)을 제조하였다.
[실시예 4]
자연형의 항균 펩타이드 발현을 위한 융합유전자 및 그의 중합체 제조
실시예 3에서 제조된 중합체들로부터 최종적으로 얻어지는 항균 펩타이드는 C말단에 호모세린(homoserine) 잔기를 가진다. 호모세린 잔기를 포함하지 않는 자연형의 항균 펩타이드를 제조하기 위하여, 다음과 같이 일부 서열을 변형시킨 융합 유전자 및 그의 중합체를 제조하였다. 이때 산성 펩타이드로는 거머린을 사용하였고, 항균 펩타이드로는 MSI78(GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK-NH2)를 사용하였다.
이와 같은 목적을 만족시키기 위한 두 종류의 항균 펩타이드 유전자 I와 II(이하, 각각 'BI' 및 'BII'라 함)를 제조하였다. 즉, 항균 펩타이드 유전자 I은 그것이 암호화하고 있는 펩타이드의 N말단에 메티오닌 잔기가 없으며, C말단은 다음에 연결되는 산성 펩타이드와 인-프레임(in-frame) 연결될 수 있도록 제조되었다. 항균 펩타이드 유전자 II는 그가 암호화하고 있는 펩타이드의 N말단에 하나의 메티오닌 잔기가 있으며, C말단에는 C말단 아미노산 서열에서 펩타이드 합성이 종결되도록 제조되었다.
이렇게 제조된 항균 펩타이드 유전자 I, II를 각각 산성 펩타이드의 유전자들과 실시예 3과 동일한 방법으로 연결하여 융합유전자를 제조하고, 제한효소 BbsI으로 절단된 pBBS1 벡터에 클로닝하여, 각각 pBBS1-(GB)1벡터 및 pBBS1-(GBⅡ)1벡터를 제조하였다(참조:도4a 및 도4b).
전기 pBBS1-(GB I)1벡터로부터 융합유전자 GB I의 중합체를 유전자 증폭 시스템으로 제조하고, 그 중합체의 말단에 융합유전자 GB Ⅱ 모노머를 연결시켜, pBBS1-[(GB I)n(GB Ⅱ)](n=O,1,2,3,4...)로 명명되는 벡터를 제조한 다음, 이들 벡터중에서 최대의 발현을 나타내는 벡터를 선택하였다.
[실시예 5]
유전자 발현 및 항균 펩타이드의 제조
상기 실시예 3 및 4에서 제조된 벡터들에 있는 융합유전자의 중합체들을 대장균에서 발현시키기 위하여, 이들을 각각 BamHI/HindIII로 절단된 유전자 발현용 벡터 pET21c(Novagen, USA)에 클로닝하고, 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 융합 펩타이드 중합체들을 발현시켰다. 그런 다음, 배양물로부터 균체를 수확하고 세포를 파쇄하여 파쇄물을 SDS-PAGE하였다(참조:도5).
도5에서, 각 레인별로 로딩된 세포 파쇄물은 다음의 세포로부터 얻어진 것이다:
M레인은 분자량 크기 마커, 1레인:벡터를 포함하지 않은 대장균, 2레인:pET21c로 형질전환된 대장균, 3레인:pET21c-B1로 형질전환된 대장균, 4레인:pET21c-B2로 형질전환된 대장균, 5레인:pET21c-B4로 형질전환된 대장균, 6레인:pET21c-B6로 형질전환된 대장균, 7레인:pET21c-(GB)1로 형질전환된 대장균, 8레인:pET21c-(GB)2로 형질전환된 대장균, 9레인:pET21c-(GB)4로 형질전환된 대장균, 10레인:pET21c-(GB)6로 형질전환된 대장균, 11레인:pET21c-(MB)1로 형질전환된 대장균, 12레인:pET21c-(MB)2로 형질전환된 대장균, 13레인:pET21c-(MB)4로 형질전환된 대장균, 14레인:pET21c-(MB)6로 형질전환된 대장균.
도5에서 보듯이, 부포린 다량체(multimer)만의 발현에 비하여 산성 펩타이드인 거머린 또는 MIS를 융합시킨 경우에 이들의 다량체 발현이 크게 증가하였음을 알 수 있다.
상기에서 발현이 확인된 융합펩타이드 중합체를 포함하는 봉입체를 1N HCL과 6M 구아니디니움 클로라이드(guanidinium chloride) 용액에 현탁시키고, 1M CNBr을 처리한 다음, Sep-Pak을 이용한 역상농축으로 펩타이드를 농축하고, QAE-세파넥스(Sigma Chemical Co., USA) 음이온 교환수지 크로마토그래피를 통과시켜, 양전하를 갖는 항균 펩타이드만을 분리, 농축하였다. 분리된 항균 펩타이드는 역상 HPLC로 한번 더 정제하여 순수한 재조합 항균 펩타이드를 얻었다. 얻어진 재조합 항균 펩타이드의 항균활성을 확안한 결과, 재조합 항균 펩타이드는 자연형의 항균 펩타이드와 동일한 항균활성을 갗는 것으로 확인되었다.
[실시예 6]
산성 펩타이드로 거머린을 사용한 융합유전자 제조
도1a에 기재된 거머린의 유전자 서열을, C-말단은 BspHI로 절단하고 항균 펩타이드와 융합되었을 때 항균 펩타이드의 처음 아미노산 바로 앞에서 메티오닌이 생기도록 하여 융합 펩타이드 발현 후 CNBr로 절단하여 순수한 항균펩타이드만 분리될 수 있도록 설계하였다. 이를 위하여 N-말단 올리고뉴클레오티드에는 BamHI 과 NdeI 절단부위를 첨가하고, C-말단 올리고 뉴클레오티드에는 BamHI과 BspHI 절단부위가 첨가되도록 N-말단과 C-말단의 올리고 뉴클레오티드를 합성하였다. 합성된 각각의 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다.
새로이 합성한 N-말단과 C-말단 올리고뉴클레오티드와 도1의 거머린 유전자를 사용하여 PCR을 통해 새로운 거머린 유전자를 합성하였다.
융합 유전자를 위한 항균 펩타이드로는, Peptide Science, vol. 37, 105-122(1995)에 기재된 아래와 같은 9종의 펩타이드를 선택하였다. 각 펩타이드의 특성을 표 1에 나타낸다. 각 펩타이드 서열로부터 대장균의 코돈 유시지(codon usage)에 의거하여 DNA 염기서열을 유추하여 합성하여 이후의 실험에 이용하였다.
이와 같이 합성된 거머린 유전자와 항균펩타이드 유전자를 융합시켜 거머린-항균펩타이드 융합유전자를 제조하였다. 먼저, 새로이 합성된 거머린 유전자를 BspHI으로 절단하여, BspHI 또는 NcoI 절단부위와 상보적으로 결합할 수 있는 부위를 만들고, 실시예 6에서 합성된 항균펩타이드 유전자를 NcoI으로 절단하여, 거머린의 BspHI 절단부위와 융합하여 융합 유전자를 제조하였다.
[실시예 7]
실시예 6에서 합성된 융합유전자를 대장균에서 발현시키기 위하여, IPTG에 의해 발현이 유도되고 T7 프로모터에 의해 발현이 조절되는 pRSETC(Invitrogene사) 발현벡터를 사용하였다. 이 발현벡터를 BamHI과 EcoRI으로 절단한 후, 탈인산화시키고 여기에 실시예 6에서 합성된 각각의 거머린-항균펩타이드 융합유전자를 삽입하였다. CaCl2방법(Sambrook et al. Molecular cloning. A laboratory manual 2nd ed.(1989))으로 대장균(E. coli BL21(DE3)pLysS)을 형질전환시켰다.
형질전환된 대장균을 발현시키기 위하여 각 대장균 클로니를 37℃에서, 엠피실린을 포함하는 LB배지 5ml에 전 배양하고, 다음날 1% 배양액을 새로운 5ml LB배지에 접종하여 37℃에서 2시간동안 배양한 후 여기에 마지막 농도가 2%가 되도록 락토오스를 첨가하여 거머린-항균펩타이드 융합유전자의 발현을 37℃에서 4시간동안 유도하였다. 이 후 대장균을 회수하여 SDS-PAGE상에서 발현여부를 확인하였다. 그 결과를 도6에 나타낸다. 도6에서
본 발명에 따라 항균 펩타이드의 발현이 숙주에 미치는 성장저해 효과를 극소화할 수 있으므로, 펩타이드 항생물질의 종류에 관계엾이 재조합 미생물로부터 항균 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (6)

  1. (i) 항균 펩타이드의 양전하를 실질적으로 중화시킬 수 있으며 하나 이상의 S-S 결합을 가지는 산성 펩타이드의 유전자와 양전하를 띠는 항균 펩타이드의 유전자를 연결하여 융합유전자를 제조하는 공정; (ii) 융합유전자를 벡터에 클로닝하고, 그것을 미생물에 도입하여 발현시키는 공정; 및, (iii) 발현된 융합 펩타이드를 분리하여 상기 산성 펩타이드를 제거하고, 염기성의 항균 펩타이드를 수득하는 공정으로 이루어지는 항균 펩타이드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산성 펩타이드의 유전자는, 상기 융합 펩타이드로부터 항균 펩타이드를 분리할 수 있는 효소 또는 화합물에 의해 절단되는 잔기를 암호화하는 유전자가 부가된 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드의 유전자는 N말단에, 상기 융합 펩타이드로부터 항균 펩타이드를 분리할 수 있는 효소 또는 화합물에 의해 절단되는 잔기를 암호화하는 유전자가 부가된 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드 제조방법.
  4. (i) 항균 펩타이드의 양전하를 실질적으로 중화시킬 수 있으며 하나 이상의 S-S 결합을 가지는 산성 펩타이드의 유전자와 양전하를 띠는 항균 펩타이드의 유전자를 연결하여 융합유전자를 제조하는 공정; (ii) 상기 융합유전자의 중합체를 제조하는 공정; (iii) 상기 융합유전자 중합체를 벡터에 클로닝하고, 그것을 미생물에 도입하여 발현시키는 공정; 및, (iv) 발현된 융합 펩타이드를 분리하여 산성 펩타이드를 제거하고, 염기성의 항균 펩타이드를 수득하는 공정으로 이루어지는 항균 펩타이드의 제조방법.
  5. 유전자에 작동가능하도록 연결된 프로모터와 유전자로 이루어지며, 상기 유전자가 항균 펩타이드 유전자의 양전하를 중화시킬 수 있으며 하나 이상의 S-S결합을 가지는 산성 펩타이드 유전자와 항균 펩타이드 유전자로 이루어지는 DNA 플라즈미드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유전자가 항균 펩타이드 유전자의 양전하를 중화시킬수 있는 산성 펩타이드의 유전자와 항균 펩타이드 유전자로 이루어진 유전자의 중합체 형태인 DNA 플라즈미드.
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