KR100650960B1 - 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 v8 단백질 분해 효소 - Google Patents
돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 v8 단백질 분해 효소 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 천연형 V8 단백질분해효소 단백질에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이 부위가 있고, 고농도의 요소 존재하에서도 효소 활성이 있는 돌연변이체 단백질분해효소들에 관한 것이다.
고농도의 요소 존재하에서도 효소 활성의 불활성화가 최소화되므로, 따라서 요소-함유 반응 시스템들에 보다 적은 양으로 효소를 첨가할 수 있으며 반응 시간의 단축도 가능하게 된다. 부수적인 이점으로서, 고농도의 요소 존재하에 단백질들을 분해시킬 수 있게 되는 결과, 종래 얻기 어려운 펩티드 단편들을 얻는 것이 가능하다.
Description
본 발명은 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성을 가지는 돌연변이형의 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소들 (이후 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소를 "천연형 V8 단백질분해효소"라고 부를 것임), 상기 효소 단백질을 코딩하는 유전자들, 상기 유전자를 포함하고 있는 발현 벡터들, 상기 발현 벡터로 형질전환시킨 재조합 세포들에 관한 것이며, 그리고 상기 효소들을 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 효소 단백질은 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건, 이를 테면 단백질 변성제의 존재시나 고온에서도, 알려진 천연형 V8 단백질분해효소보다 더 안정된 효소 활성을 갖는 돌연변이체 V8 단백질분해효소들이다.
천연형 V8 단백질분해효소는 에스. 아우레우스 V8 이 세포 배양액에서 분비하는 일종의 세린 단백질분해효소이다. l972년, 드라포 (G.R.Drapeau) 등이 에스. 아우레우스 V8 세포 배양액에서 글루탐산과 아스파르트산 사이의 C-말단 펩티드 결합을 특이적으로 쪼개는 세린 단백질분해효소인 그것을 분리·정제하였으며 [우마르 (Jean Houmard) 와 드라포 (Gabriel R. Drapeau) (1971 년), 미국국립과학원회보 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 제 69 권, 제 3506 - 3509 페이지], 1987 년에는 카로모나 (Cynthia Carmona) 등이 천연형 V8 단백질분해효소의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열을 보고하였다 [카로모나와 그레이 (Gregory L. Gray) (1987년), 핵산연구 (Nucleic Acid Res.) 제 15 권, 제 6757 페이지].
상기 효소는 336 개의 아미노산 잔기로 구성되어 있는 전구물질의 형태로 발현된 후, 68 개의 아미노산 잔기로 구성되어 있는 프리프로 서열 (prepro sequence) 이 제거되며 충분히 발달한 상태의 단백질이 분비된다. 상기 효소는 또한 C-말단 부위에 프롤린-아스파르트산-아스파라진의 반복성서열 (N-말단으로부터 아미노산 번호 제 221 번에서 제 256 번까지의 아미노산 서열) 도 있으나, 본 발명자들은 이 서열이 효소 활성에 필요한 것은 아님을 이미 발견한 바 있다 (일본 특허출원 제 94-296028 호).
효소로서의 천연형 V8 단백질분해효소에 대한 기능 분석은 아직도 불충분하나, 상기 효소는 글루탐산과 아스파르트산 사이의 C-말단 펩티드 결합을 특이적으로 쪼개는 것이기 때문에 단백질의 아미노산 서열을 결정하는데에 널리 사용되고 있다. 또한, 천연형 V8 단백질분해효소는 단백질 변성을 일으키는 단백질 변성제들 중의 하나인 요소의 존재하(2M 정도의 요소)에서도 그 기질에 어느 정도까지 작용하기 때문에, 재조합 기술에 의해 숙주에서 대량 발현된 목적 펩티드를 함유하는 불용성의 융합 단백질을 요소로 용해시킨 후 요소 존재하에서 상기 효소를 작용시켜 그 융합 단백질로부터 목적의 펩티드를 유리하는 방법들에서 사용된다.
본 발명자들은 상기한 방법을 사용하여 사람 칼시토닌을 유전자 재조합 기술에 의해 높은 수율로 생산하는 일에 성공하였다 (일본국 특허 공개 공보 제 93-328992 호). 또한, 이.콜리 (E. coli) 발현 시스템에서 사람 글루카곤을 융합 단백질의 형태로 발현시키는 경우에도, 그 융합 단백질로부터 사람 글루카곤을 쪼개기 위한 목적에서 천연형의 V8 단백질분해효소가 사용된다 [요시까와 가즈마사(kazumasa Yoshikawa) 등 (1991 년), 단백질화학저널 (Journal of Protein Chemistry) 제 11 권, 제 517 - 525 페이지].
따라서, 천연의 V8 단백질분해효소는 폭넓은 분야의 생화학적 연구 및 유전자 재조합에 의한 펩티드의 생산에 사용된다. 천연의 V8 단백질분해효소는 단백질 변성을 일으키는 것으로 알려져 있는 요소 (2M 정도의 요소)를 함유하는 효소 반응 혼합액에서도 어느 정도의 쪼갬 반응 (cleavage reaction)을 수행하기 때문에, 재조합 방법들에 의한 유용한 펩티드 등의 제조에 사용된다.
그러나, 천연의 V8 단백질분해효소의 성질들 외에도, 더 심한 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성이 있는 돌연변이체 V8 단백질분해효소를 제조·사용할 수 있었더라면, 그와 같은 환경 조건하에서 효소 활성이 상실되는 일은 최소화될 수 있었을 것이다. 이와 같은 성질을 가진 돌연변이체 V8 단백질분해효소의 사용은 (1) 단백질 변성제 존재하의 반응계에 보다 적은 양의 효소를 첨가할 수 있고, (2) 반응 시간을 단축시켜 주며, 그리고 (3) 고농도의 단백질 변성제의 존재 및 고온에서 단백질을 쪼갤 수 있으므로 종래 얻기 어려운 펩티드 단편들을 제공하는 이점을 제공해 줄 수 있으며, 이러한 이유들로 해서 연구 및 산업상 그와 같은 돌연변이체 V8 단백질분해효소가 매우 요망되어 왔다.
본 발명의 목적은 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성을 유지하는 돌연변이체 V8 단백질분해효소들을 얻는 것이며, 그리고 본 발명은 더 나아가 상기의 돌연변이체 효소 단백질을 코딩하는 유전자들, 상기 유전자를 함유하는 발현 벡터들, 상기 발현 벡터로 형질전환시킨 재조합 세포들, 그리고 상기의 효소 단백질의 제조 방법에 관한 것이기도 하다.
제 1 도는 (a) 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소 유전자의 구조와 그 유전자의 어닐링 부위들, 그리고 (b) 클로닝에 사용되는 PCR 프라이머들의 염기 서열을 나타낸 것이다.
제 2 도는 플라스미드 pG97S4DhCT[G]R6 과 플라스미드 pG97S4DhCT[G]R10 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 3 도는 플라스미드 pV8RPT(-) 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 4 도는 플라스미드 pV8RPT(-) 에 코딩되어 있는 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열 ID 번호 : 3)을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 야생형 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체의 서열 부분이며, 이중밑줄친 부분은 R6 링커의 아미노산 서열이다.
제 5 도는 (a) 클로닝에 사용되는 PCR 프라이머들의 뉴클레오티드 서열 (서열 ID 번호 : 4 및 5)과 (b) 플라스미드 pV8RPT(-) 의 구조 및 플라스미드상의 유전자들의 어닐링 부위를 나타낸 것이다.
제 6 도는 플라스미드 pV8RPT(-) 에 PCR 돌연변이를 도입하는 것을 예시한 것이다.
제 7 도는 5M 요소 존재시의 돌연변이체 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체들의 시간의 경과에 따른 반응성의 변화를 나타낸 것이다.
제 8 도는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체들에서의 돌연변이 부위를 확인한 결과를 수록한 것이다. 야생형 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체 유전자의 첫 번째 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 번호 제 1 번으로 표시된다. 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 의 N-말단은 아미노산 번호 제 1 번으로 표시된다.
제 9 도는 플라스미드 pV8RPT(-)158 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 10 도는 5M 요소 존재시의, 이중 또는 삼중 돌연변이를 가진 돌연변이체 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체들의 시간의 경과에 따른 반응성의 변화를 나타낸 것이다.
제 11 도는 플라스미드 pV8hCT[G] 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 12 도는 플라스미드 pV8D 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 13 도는 플라스미드 pV8D 에 코딩되어 있는 융합 단백질의 아미노산 서열(서열 ID 번호 : 9)을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D) 의 서열 부분이며, 이중밑줄친 부분들은 R6 링커들의 아미노산 서열이다. 화살표시들은 OmpT 단백질분해효소의 절단 부위를 나타낸다.
제 14 도는 플라스미드 pV8F 의 구성 과정을 나타낸 것이다. V8F 유전자는 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 를 코딩하는 유전자이다.
제 15 도는 플라스미드 pV8F 에 코딩되어 있는 융합 단백질의 아미노산 서열(서열 ID 번호 : 15)을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 의 서열 부분이며, 이중밑줄친 부분들은 R6 링커들의 아미노산 서열이다. 화살표시들은 OmpT 단백질분해효소의 절단 부위를 나타낸다.
제 16 도는 플라스미드 pV8Dl, pV8D5 및 pV8D8 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 17 도는 3M 요소 존재시의, 플라스미드 pV8Dl, pV8D5 및 pV8D8 에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체들 (V8D1, V8D5 및 V8D8)과 pV8D 에서 유도된 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D) 의 잔류 활성을 나타낸 것이다.
제 18 도는 플라스미드들 pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8 및 pV8Fl58 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 19 도는 5M 요소 존재시의, 플라스미드 pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8, 및 pV8F158에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들(V8F1, V8F5, V8F7, V8F8 및 V8F158)과 pV8F에서 유도된 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 의 시간의 경과에 따른 반응성의 변화를 나타낸 것이다.
제 20 도는 플라스미드 pV8F1, pV8F5 및 pV8F8에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체(V8F1, V8F5 및 V8F8) 및 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 의 0.1 % SDS 에 대한 안정성을 나타낸 것이다.
제 21 도는 플라스미드 pV8F1, pV8F5 및 pV8F8에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들 (V8F1, V8F5 및 V8F8) 과 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 의 50℃ 에서의 열 안정성을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 천연의 V8 단백질분해효소 유전자로부터 PCR 에 의해 얻어지는 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 유전자에 랜덤 돌연변이들을 유도하기 위해 PCR을 사용하고, 적당한 숙주를 선택하며, 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서 가장 안정된 효소 활성을 나타내는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체가 발현되는 유전자들을 얻고, 그 유전자들이 코딩하는 유전자 산물들 (단백질들) 을 제조하면 상기의 목적이 충분히 달성되고, 산업상의 관점에서 매우 유용한 방법임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서, "돌연변이체 V8 단백질분해효소" 는 천연의 V8 단백질분해효소의 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성을 가지는 효소 단백질을 가리키고, "야생형 V8 단백질분해효소 유도체" 는 천연의 V8 단백질분해효소에서 C-말단 부분을 결실시켜 만들어진 효소 단백질을 가리키며, "돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체" 는 야생형 V8 단백질분해효소 유도체에 돌연변이를 일으켜 만들어진 효소 단백질을 가리킨다.
서로 다른 C-말단 아미노산 서열을 가진 서로 다른 3 종류의 야생형 V8 단백질분해효소 유도체들이 만들어졌으며, 이것들은 (1) 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) (V8RPT(-) 로 약칭), (2) 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D 로 약칭) 및 (3) 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F로 약칭) 라고 불리운다. 또한, 야생형 V8 단백질분해효소 유도체들에 돌연변이를 도입함으로써 만들어지는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체들은 도입된 돌연변이를 나타내는 숫자를 덧붙이는 방법으로 ; 예를 들면, 돌연변이의 종류에 따라 유도체 이름의 끝에 "1", "5", "7", "8" 또는 "158"을 붙여서 표시한다 (예를 들면 V8RPT(-)1, V8D5, V8Fl58, 등).
천연의 V8 단백질분해효소의 변성이 촉진되는 환경 조건들은 공지되어 있고 단백질 변성제 또는 온도에 기인하여 단백질 구조가 변화하는 경우가 있으며, 본 명세서에서의 설명은 특히 단백질 변성제로서의 고농도의 요소에 대해 충분한 내성을 가지는 효소 단백질들을 예로 하여 단백질 변성제의 경우를 더욱 상세히 다룬 것이다.
상기한 바와 같이, 천연형 V8 단백질분해효소의 아미노산 서열 및 DNA 뉴클레오티드 서열은 이미 해명되었으나, 단백질의 3 차원 구조는 아직 완전히 이해되고 있지 않다. 따라서, 어떤 아미노산이 변화되어 고농도의 요소에 대한 내성을 부여하는 것인지는 완전히 알려져 있지 않다.
여기, 본 발명자들은 이 효소를 코딩하는 유전자에 랜덤 돌연변이를 일으켜서 요소 내성을 나타내는 효소의 돌연변이체 유전자를 분리하고, 그 돌연변이된 유전자를 발현 플라스미드에 삽입시키고, 그 재조합 플라스미드로 숙주 세포를 형질전화시켜 그 유전자를 발현시킨 다음, 천연의 V8 단백질분해효소를 불활성화시키는 5M 요소 존재하에서도 효소 활성을 나타낸 효소를 발현시키는 재조합체를 스크리닝하는 방법을 고안하였으며, 본 발명자들은 본 발명의 목적상 다음의 연구를 수행하였다.
먼저, 천연의 V8 단백질분해효소 유전자로부터 PCR 에 의해 얻어진 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자를 삽입하여 플라스미드 pV8RPT(-) 를 구성하였다. 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 는 천연의 V8 단백질분해효소의 C-말단 아미노산 48 개를 결실시킨 유도체이고, 플라스미드 pV8RPT(-) 는 이 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 와 이. 콜리 β-갈락토시데이즈 유도체 (β-ga197S4D)의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드이다.
다음, pV8RPT(-) 상의 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자에 대해 PCR 에 의한 랜덤 돌연변이 처리를 하여, 돌연변이된 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자의 푸울 (pool)을 제조하였다. 그 돌연변이된 유전자 푸울을 pV8RPT(-) 상의 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자로 치환하여 이. 콜리 JM101을 형질전환시키는 데 사용하였으며, 그리하여 다수의 재조합체를 얻었다. 그 재조합체들을 배양하였고, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (이하, IPTG)를 첨가하였으며, 융합 단백질의 유전자를 발현시켰다. 세포 배양액에 최종 농도 약 5M 이 되도록 요소를 첨가한 후, 상기 효소의 합성 기질인 Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드를 효소 반응에 사용하였다.
약 700 개의 재조합체 균주들을 스크린한 결과, 상기의 반응 조건하에서 효소 활성을 가졌던 4 개의 재조합체 균주 U1, U5, U7 및 U8을 얻었다. 5M 요소 존재하에서의 이들 돌연변이 균주들의 효소 활성을 천연의 V8 단백질분해효소와 비교하였을 때, 이들 모두는 천연의 V8 단백질분해효소보다 훨씬 더 높은 요소 내성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
또한 이들 재조합체들에서 플라스미드를 분리하여 돌연변이형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자들의 DNA 뉴클레오티드 서열을 결정하였으며, 그 결과, U1 균주에서 아미노산 위치 271번 리신이 아르기닌으로, U5 균주에서 아미노산 위치 195번의 아스파라진이 세린으로, U7 균주에서는 아미노산 위치 195번의 아스파라진이 세린으로, 아미노산 위치 271번의 리신이 아르기닌으로, 그리고 U8 균주에서는 아미노산 위치 168번의 아스파르트산이 글루탐산으로 바뀌는 치환 돌연변이가 발견되었다. 다시 말해, 3 종류의 서로 다른 아미노산 치환들이 얻어졌고, 그리고 U7 균주 유래의 유전자는 U1 균주 및 U5 균주의 아미노산 치환이 조합된 이중 돌연변이체임이 분명해지게 되었다.
본 발명자들은 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 가 요소 내성을 나타내기 위하여는 상기 아미노산 위치들에서 아미노산 돌연변이가 필요함을 처음으로 증명하였다. 이들 아미노산 위치들은 V8 단백질분해효소의 단백질 구조 유지의 관점에서 중요한 위치들인 것으로 추정되고 있다. 그러므로, 이들 위치들에서 다른 아미노산들을 도입하면 본 발명의 효소의 단백질 구조가 변화되며, 따라서 요소 내성이 충분히 높아지게 된다.
얻어진 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 중 이중 돌연변이가 있는 U7 균주 유래의 단백질이 가장 높은 요소 내성을 가졌으므로, 본 발명자들은 상기 3 종류의 돌연변이들을 조합하고, 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자에 도입하면, 각각의 개별 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 가 나타내는 것 이상으로 요소 내성이 더욱 증가될 것으로 예상하여, 삼중 돌연변이가 있는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체 유전자를 만들었으며, 그 융합 단백질을 발현시켜 요소 내성을 조사하였다. 그 결과, 삼중 돌연변이가 있는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 는 어떤 개별 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 보다도 더 높은 요소 내성을 분명히 보여 주었다.
본 발명자들은 다음으로 이 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체의 제조를 연구하였다. 각각, 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 와는 C-말단 아미노산 서열이 다른, 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체 또는 F 유도체를 불활성 봉입체 (封入體) 의 형태로서 먼저 발현시킨 다음에, 활성형의 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 또는 F 유도체를 얻는 방법으로 제조가 시도되었다. 이는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 의 경우 발현량이 적어, 생산의 관점상 불리하기 때문이었다. 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 및 F 유도체들의 제조에 사용된 야생형 V8 단백질분해효소 D 및 F 유도체들은, 각각, 천연의 V8 단백질분해효소의 C-말단의 아미노산 56 개 및 53 개가 빠져 있는 유도체들이다.
야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체와 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체를 발현시키는데 사용되는 플라스미드들 pV8D 와 pV8F 에 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 유전자를 삽입하였고, 세포배양하여, 이.콜리 β-갈락토시데이즈 유도체, 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체 또는 F 유도체 그리고 아미노글리코시드 3'-포스포트란스퍼레이즈 유도체 (tAPT) 로 구성되어 있는 불용성의 융합 단백질을 회수하였으며, 요소 존재하에서 내인성 이.콜리 ompT 단백질분해효소를 사용하여 그 융합 단백질을 절단하고, 그 융합 단백질로부터 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체 또는 F 유도체를 잘라내었다. 그리고 나서, 리폴딩 (refolding) 단계 및 정제 크로마토그라피 단계를 통하여 돌연변이 V8 단백질분해효소 D 유도체 또는 F 유도체를 정제하였으며, 이는 공업적 규모로 생산이 가능함을 보여주는 것이었다.
그 다음에는 각각의 정제된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체 또는 F 유도체를 사용하여, 각종의 단백질 변성을 촉진하는 환경 조건, 예를 들면 요소 존재하, SDS 존재하, 고온 등에서 그 야생형들과 비교 시험을 하였다. 그 결과, 돌연변이체들은 야생형들과 비교하여 요소 또는 SDS 존재하에서 불활성화 속도가 더 낮았으며, 이는 그와 같은 변성제에 대하여 내성을 나타낸 것임을 분명히 증명하였다.
3 중 돌연변이가 있는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체, 즉 V8Fl58이 5M 요소 존재하에서도 천연의 V8 단백질분해효소보다 더 안정된 효소 활성을 가지므로, 이 돌연변이체 단백질의 융합 단백질을 사용하여 펩티드 절단 실험을 수행하였다. 사용된 융합 단백질은 β-gal97S4DhCNP-22R5-3 이었으며, 보호성 펩티드 (β-gal97S4D) 와 사람 C-형 심방(心房) 나트륨뇨(尿)배설항진성 펩티드 (CNP-22) 가 링커 펩티드를 통하여 융합되어 있고, V8 단백질분해효소에 의해 CNP 가 방출되는 구조를 갖는 것이었다.
5M 요소의 존재하에 V8F158과 천연의 V8 단백질분해효소의 사람 C-형 심방 나트륨뇨배설항진성 펩티드에 대한 절단 효율을 조사한 결과, V8F158이 훨씬 더 높은 절단 효율로 융합 단백질을 쪼갤 수 있음이 최종적으로 밝혀졌다.
본 발명자들이 수행한 실시예들로부터, 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들 (V8F1, V8F5 및 V8F8) 은 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체들에 비하여 5M 요소 농도 및 0.1 % SDS 존재하의 효소 반응에서 변성제들에 대한 내성을 더 크게 나타내는 것이 분명하다. 그러나, 고온 (50℃) 에서의 효소 반응들을 비교하였을 때, 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F8 유도체 (V8F8) 는 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 보다 열 안정성이 더 낮았다.
요소 및 온도의 단백질 변성 조건의 차이에 따른 변성 조건하의 효소들의 저항성에 대하여는 서로 다른 결과들이 얻어졌는데, 그 결과들은 돌연변이 부위의 아미노산 잔기가 단백질의 고차 (高次) 구조의 유지에 중요하다는 것을 더욱 시사해주는 것으로 해석될 수 있다. 따라서, 본 발명분야에 익숙한 사람이라면 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F8 유도체 (V8F8) 의 돌연변이 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환할 경우 온도에 대한 저항성이 증가하리라는 것을 쉽게 추정할 수가 있기 때문에, 본 발명의 유용성은 전혀 감소되지 않는다.
본 발명자들은 단백질 변성을 촉진시키는 환경 조건하에 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체들, 야생형 V8 단백질분해효소들 그리고 천연의 V8 단백질분해효소의 효소 활성들을 비교하여 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체들의 유용성을 증명하였다. 본 발명자들이 얻은 결과로부터, 이들 돌연변이체들을 천연의 V8 단백질분해효소에 도입하면, 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도, 천연형과 동등하거나 혹은 보다 큰 효소 활성을 나타낼 수 있으리라는 것은 본 발명분야에 익숙한 사람이라면 쉽게 추정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 효소 단백질들은 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성을 나타내는 돌연변이체 V8 단백질분해효소들이며, 바람직하게는 이들 단백질분해효소들은 천연의 V8 단백질분해효소에 하나 이상의 돌연변이 부위가 있는 것을 특징으로 하는 것들이다.
더 구체적으로, 바람직한 구현예에는 돌연변이 부위가 천연의 V8 단백질분해효소의 N-말단으로부터 l68번 위치의 아스파르트산, 77 번째 위치의 아스파라진 및/또는 271번 위치의 리신이고, 돌연변이 부위가 하나, 둘 또는 셋일 수 있는 경우인 것을 특징으로 하는 단백질분해효소들이 있다.
가장 바람직한 구현예는 다음과 같다 :
(1) 돌연변이 부위가 하나인 경우로서, 천연의 V8 단백질분해효소의 N-말단으로부터 세었을 때, 돌연변이 부위가 168번 위치의 아스파르트산의 글루탐산으로의 치환, 195번 위치의 아스파라진의 세린으로의 치환 혹은 271번 위치의 리신의 아르기닌으로의 치환인 경우 ;
(2) 돌연변이 부위가 둘인 경우로서, 천연의 V8 단백질분해효소의 N-말단으로부터 세었을 때, 돌연변이 부위들이 168번 위치의 아스파르트산과 195번 위치의 아스파라진 (여기서, 바람직하게는 168번 위치의 아스파르트산이 글루탐산으로, 195번 위치의 아스파라진이 세린으로 치환된 것이 좋음), 168번 위치의 아스파르트산과 271번 위치의 리신 (여기서 바람직하게는 168번 위치의 아스파르트산이 글루탐산으로, 271번 위치의 리신이 아르기닌으로 치환된 것이 좋음), 혹은 195번 위치의 아스파라진과 271번 위치의 리신 (여기서 바람직하게는 195번 위치의 아스파라진이 세린으로, 271번 위치의 리신이 아르기닌으로 치환된 것이 좋음) 인 경우 ; 그리고
(3) 돌연변이 부위가 셋인 경우로서, 천연의 V8 단백질분해효소의 N-말단으로부터 세었을 때, 돌연변이 부위들이 168번 위치의 아스파르트산, 195번 위치의 아스파라진 그리고 271번 위치의 리신 (여기서 바람직하게는 168번 위치의 아스파르트산이 글루탐산으로, 195번 위치의 아스파라진이 세린으로 그리고 271번 위치의 리신이 아르기닌으로 치환된 것이 좋음) 인 경우.
상기의 돌연변이체 V8 단백질분해효소를 코딩하는 유전자의 제조 방법은 에스. 아우레우스에서 유전자를 분리하는 방법, 예를 들면, 보고된 천연의 V8 단백질분해효소 유전자 서열로부터 프라이머를 설계한 다음 에스. 아우레우스의 유전자 은행에서 그것을 분리하는 방법, 또는 본 발명자들이 사용한 PCR 법이 될 수 있다. 물론, 에스. 아우레우스의 알려진 천연의 V8 단백질분해효소 유전자 서열로부터 상기 유전자를 화학적으로 합성하는 것도 가능하다.
본 명세서에 있어서는, PCR 법으로 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 유전자들을 제조하였으나, 종래 알려진 돌연변이 방법 이를 테면, 생체내 (in vivo) 방법 (돌연변이유발제 처리, 자외선 또는 방사선 처리 등) 또는 각종의 시험관내(in vitro) 돌연변이법 중 하나를 써서 제조할 수도 있다. 또한 돌연변이체 균주들도 자연 돌연변이 선택법에 의한 본 발명의 방법에 따라 선택될 수도 있다.
단백질 변성을 촉진시키는 효소 반응 조건에 대하여는, 요소 또는 SDS 를 함유하는 반응 매질에서, 또는 고온에서 (예를 들면, 45℃ 이상), 또는 다른 단백질 변성제들 이를테면 구아니딘 히드로클로리드와 각종 계면활성제 등을 사용하여 효소 반응을 수행할 수 있다. 단백질 변성 효과를 갖는 효소 반응 조건에는 2M 내지 5M 요소, 0.01M 내지 6M 구아니딘 히드로클로리드, 0.01 % 내지 10 % SDS 및 45 ℃ 내지 65 ℃ 의 온도 등이 있다.
단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성을 가지는 본 발명에 따른 돌연변이체 V8 단백질분해효소의 유전자를 발현시키기 위하여 다음의 방법들을 사용할 수 있다. 본 명세서의 실시예들에서는 숙주 세포로서 이. 콜리 세포가 사용되었으나, 숙주 세포는 스타필로코키(Staphyococci), 살모넬라(Salmonella), 악티노미세테스(Actinomycetes), 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis) 등의 원핵 세포들이나 필라멘트성 박테리아, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등등의 진핵 세포들도 될 수 있다. 통상 사용되는 임의의 형질전환 기술에 의해서도 이들 숙주 세포들에 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유전자들을 도입시킬 수 있다.
형질전환에 사용되는 발현 플라스미드는 바람직하게는 숙주 세포에서 프로모터의 하류에 있는 유전자의 발현을 기능적으로 조절할 수 있는 프로모터를 가진 발현 플라스미드이고, 그에 의해 직접 발현법 또는 소위 융합 단백질 발현법을 수행할 수 있다. 또한, 벡터로서는 상동 유전자 재조합이 가능한 것을 사용하여, 적당한 숙주 세포의 염색체에 목적의 유전자를 삽입시켜 해당 단백질을 발현시키는 것도 가능하다. 또 다른 방법으로서는 해당 유전자를 삽입시키는 바이러스나 파아지를 사용하여 목적의 유전자의 발현을 위해 숙주 세포를 감염시키는 것도 가능하다.
단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성을 갖는 본 발명에 따른 돌연변이체 V8 단백질분해효소를 제조하는 방법으로서, 본 발명자들은 아주 효율성이 높은 제조 방법을 실시예에서 소개하였지만, 통상의 알려진 유전자 재조합 기술도 여기에 기술된 방법을 제한하는 일 없이 제조에 사용될 수도 있다.
위에서 기술된 발현 방법을 이용하는 가능한 제조 방법의 예에는
(1) 숙주 세포에서 목적의 성숙 단백질을 직접 발현시킨 후, 가용성 또는 불용성 형의 해당 단백질을 분리, 정제하여 제조하는 방법,
(2) 숙주 세포에서 목적의 단백질을 가용성 또는 불용성 형의 융합 단백질의 형태로 발현시키고, 프로세싱 효소에 의한 절단이 가능한 조건하에서 그 융합 단백질을 쪼갠 후, 목적의 단백질을 분리, 정제하여 제조하는 방법,
(3) 목적의 단백질의 세포외 분비 후, 해당 단백질을 분리, 정제하여 제조하는 방법, 그리고
(4) 숙주 세포의 주변세포질 (periplasm) 로부터 가용성 또는 불용성 형의 목적의 단백질을 분리, 정제하여 제조하는 방법 등이 있다. 물론, 직접 발현법이나 융합 단백질법에 의해 목적의 단백질을 발현시키는 경우, 불용성 단백질을 얻는 경우에는 적당한 리폴딩 단계를 거쳐서 분리 및 정제를 수행한다.
본 명세서의 실시예에서는, 본 발명의 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체의 정제를 위해 리폴딩 후 소수성 크로마토그라피를 이용하지만, 단백질 정제에 통상 사용되는 그 밖의 정제 방법들, 이를 테면 젤 여과법, 이온 크로마트그라피 등도 높은 순도를 제공해 줄 수 있다. 또한, 본 발명의 효소 단백질은 리폴딩 반응이 완료되면 활성화되어 함께 섞여 있는 단백질들을 분해시키므로, 그 결과 반응 완료 후에는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체가 주된 단백질 성분이 되며, 정제는 물론 매우 용이하게 달성된다.
실시예
이제 본 발명을 다음의 실시예로 더욱 충분히 설명하고자 한다.
실시예 1. 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자의 분리
PCR 법에 의해 야생형 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체 유전자를 분리하였다. 제 1 도 (b) 에 나타난 서열 (서열 ID 번호 : 1 및 2) 를 갖는 2 종류의 PCR 프라이머들을 설계하고 DNA 합성기 [모델 392, 어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems Co.) 의 제품] 를 사용, 합성하였다. 프라이머들 A 와 B 는 제 1 도(a) 에 나타난 V8 단백질분해효소 유전자의 부위들에 해당하며, 그것들은 자신들의 5' 말단에 각각 제한 핵산내부가수분해효소 XhoI 과 SalI 에 의해 인식되는 서열을 포함하고 있다.
자야스왈 (Jayaswal, R.K) 등 [세균학 저널 (J. Bacteriol) 제 172 권 : 제 5783 - 5788 페이지 (1990 년)] 의 방법에 따라 분리, 제조된 에스. 아우레우스 V8 (ATCC27733) 염색체들과 이것들의 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 1.0 μ M 의 프라이머, 1 ㎍의 염색체 DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL (pH 8.3), 1.5 μ M MgCl2, 0.01 % 젤라틴 및 200 μ M의 dNTP (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 의 혼합물) 를 함유하는 50 ㎕ 반응액에 2.5 단위의 TaqDNA 폴리머레이즈를 첨가하고, 94 ℃ · 1분, 72 ℃ · 2 분 그리고 55 ℃· 2분의 PCR 을 30 사이클로 수행하였다. 그 결과 프리프로 서열 및 C-말단 아미노산 48 개가 없는 야생형 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체 유전자가 얻어졌다.
다음에는 그 유전자를 아가로오즈 젤 전기 영동하고 SUPREP-2 [다까라 슈조사 (Takara Shuzo, KK.)] 를 사용하여 정제한 다음, 제한 효소 XhoI 및 SalI 으로 절단하여 XhoI 및 SalI 의 점착성 말단을 포함하는 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자 단편을 제조하였다.
실시예 2. 발현 벡터 pV8RPT(-) 의 구성 및 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 의 발현
이 실시예에 사용된 pG97S4DhCT[G]R6 [응용미생물 생물공학 (Appl. Microbiol, Biotechnol.) (1995 년) 제 42 권, 제 703 - 708 페이지] 은 이. 콜리 β-갈락토시데이즈 유도체와 사람 칼시토닌 전구체 (hCT[G]) 의 융합 단백질의 발현이 높은 플라스미드이며, 플라스미드 pBR322 와 플라스미드 pG97S4DhCT[G] 로부터 이 플라스미드를 구성하였다 (제 2 도).
플라스미드 pG97S4DhCT[G]를 함유하는 이.콜리 W3110 균주는 부다페스트 조약에 따라, 일본국 이바라끼껭 305 쓰꾸바시 히가시 1-◎메 1방 3고의 공업기술원 생명공학기술연구소에 에셔리키아 콜리 SBM323으로 1991년 8월 8일에 기탁되었으며, 수탁번호 FERM BP - 3503 을 부여받았다.
PCR에 의해 얻어진 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자를 발현시키기 위하여, pG97S4DhCT[G]R6을 XhoI 및 SalI 으로 처리하여, 사람 칼시토닌전구체 유전자 부분이 없는 DNA 단편(3.1 kb)을 아가로오즈 젤 전기영동으로 제조하였다. 이 DNA 단편과 앞서 미리 얻는, XhoI 및 SalI 점착성 말단을 함유하는 야생형 V8 단백질분해효소 유전자 단편을 T4 DNA 라이게이즈를 사용하여 연결시켰고, 그것으로 JM101(이 균주는 다까라 슈조사 등에서 구입가능함)을 형질전환시켜 pV8RPT(-)를 구성하였다(제 3 도). 제 4 도는 그 플라스미드에 의해 발현된,야생형 V8 단백질 분해효소 RPT(-) 유도체와 β-갈락토시데이즈 유도체의 융합 단백질 (β G97V8RPT(-))의 아미노산 서열(서열 ID번호 : 3)을 보여준다.
JM101/pV8RPT(-) 를 100 ml 의 LB 배지 (0.5 % 효모추출액, 1.0 % 트립톤, 0.5 % NaCl) 에서 37℃ 에서 OD 660 이 1.0 이 될때까지 배양한 후, IPTG 를 최종 농도가 2 mM 이 되도록 첨가하여 발현을 유도시켰다. 첨가 후 2 시간 동안 배양을 계속한 다음, 세포들을 원심분리에 의해 모았으며, OD 660 이 5 가 되도록 TE 완충액 (10 mM Tris - HCl (pH 8.0), 1mM EDTA) 에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 초음파 파쇄기 [Cellruptor : 도소 전기 (Toso Electric, KK.)] 로 파쇄한 다음, 5 분간 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하였으며 상청 (上淸) 분획물을 미정제 효소액으로 사용하였다.
V8 단백질분해효소의 활성 측정을 위해 합성 기질 [Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드 ; 베를링거 - 만하임 (Berlinger-Mannhein) 의 제품] 을 사용하였다. 20 ㎕ 의 10 mM Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드 용액 (DMSO 용액) 과 940 ㎕ 의 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충액을 혼합한 후, 미정제 효소액 40 ㎕ 를 첨가하고, 실온에서 5 분간의 반응 시 405 ㎚ 에서의 흡광도 증가를 측정하였다. 측정을 위해 히따찌 (Hitachi) 분광광도계 모델 U-3200 을 사용하였다.
그 결과, JM101/pV8RPT(-) 로부터 제조된 미정제 효소액에서 8 ㎍/ml 의 천연형 V8 단백질분해효소에 상당하는 활성을 확인하였으며, 따라서 β- 갈락토시데이즈 유도체와의 융합 단백질의 형태로, 그리고 프리프로 서열 및 C-말단 반복성 서열이 없는 상태로 활성을 나타냄을 증명하였다.
실시예 3. PCR 에 의한 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자의 돌연변이
요소에 대한 내성을 갖는 V8 단백질분해효소를 얻기 위하여 PCR 에 의해 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자를 돌연변이시켰다. 실시예 2 에서 얻어진 pV8RPT(-) (제 3 도) 는 C-말단의 48 개의 아미노산이 빠진 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) (V8RPT(-)) 와 이.콜리 β-갈락토시데이즈 유도체 (β-gal97S4D) 의 융합 단백질을 발현시키는 플라스미드이며, 세포내의 가용성 분획에 발현되는 융합 단백질 (이 융합 단백질을 이후 β G97V8RPT (-) 라고 부를 것임) 이 V8 단백질분해효소 활성을 갖는다.
상기한 플라스미드상의 β G97V8RPT(-) 유전자에 대하여 제 5 도 (a) 에 나타난 프라이머들 (서열 ID 번호 : 4 및 5) 을 사용하여 PCR 반응을 행하였다 (제 5 도 (b)). 1 μ mol 의 프라이머, 50 ng 의 pV8RPT(-), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 0.01 % 젤라틴, 10 % 디메틸술폭시드 (DMSO), 각각 1mM 의 dGTP, dCTP 및 dTTP 그리고 200 μ M 의 dATP 를 함유하는 50 ㎕ 의 반응액에 2.5 단위의 TaqDNA 폴리머레이즈를 첨가하였고, 94 ℃ · 1분, 72 ℃· 2분, 55 ℃ · 2분의 PCR 을 30 사이클로 수행하였다. 그 결과로 얻어지는 PCR 산물 (1 Kbp) 을 클로로포름 처리 및 에탄올 침전을 시킨 다음, 50 ㎕ 의 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA) 에 용해시켰다.
실시예 4. 요소 내성이 있는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체들 RPT(-)의 스크리닝 (1차 스크리닝)
실시예 3에서 얻어진 PCR 산물을 제한 효소 BglII 및 SalI 으로 절단하고, 돌연변이된 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 유전자를 포함하고 있는 0.8 Kbp 단편을 0.8 % 아가로오즈 젤 전기영동에 의해 분리한 후, 라이게이션 키트 (다까라 슈조의 제품) 를 써서 그것을 3.0 Kbp pV8RPT(-) 유래 BglII-SalI 단편과 연결시켰다 (제 6 도). 반응 종료후, 이. 콜리 JM101 [인 비트로젠 (In Vitrogen) 에서 구입가능, 카탈로그 번호 c660-00] 을 염화칼슘법으로 형질전환시키는 데 사용하였으며, 10 ㎍/ml 테트라시이클린-함유 LB 아가 배지 (1 % 트립톤, 0.5 % 효모추출액, 0.5 % NaCl, 1.5 % 아가) 에서 형질전환체를 얻었다. 제한 효소 반응, 아가로오즈 젤 전기 영동 및 형질전환은 모두 종래의 방법에 따라 수행되었다.
다음에는 5 mg/ml 글리세린 6 mg/ml Na2HPO4, 3 ㎎/ml KH2PO4, 0.5 ㎎/ml NaCl, 1.0 ㎎/ml NH4Cl, 2mM MgSO4· 7H2O, 0.1 mM CaCl2, 40 ㎍/ml 의 각 아미노산(20 종류), 1 ㎍/ml 염화티아민, 그리고 5 ㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 배지를 제조하여 (pH 7.4), 96-웰 배양 플레이트 [코닝사 (Corning Co.) 의 제품 번호 25860] 의 각각의 웰에 50 ㎕ 씩을 나누어 넣었다. 그 각각의 배지에 앞서 얻어진 형질전환체 균주 각각을 접종하여 37 ℃에서 배양하였다. 하룻밤의 정지 배양(static culturing) 후, 각각의 웰에 같은 조성의 신선한 배지 50 ㎕를 나누어 넣었고 37 ℃에서 3 시간 정지 배양을 계속하였다. 그후 50 mM IPTG 를 10 ㎕ 씩을 나누어 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 유전자 발현을 유도하였다.
그 다음에는, 10 ㎎/ml 의 라이소자임 (lysozyme) 수용액을 30 ㎕ 첨가하였고, 10 분간 방치 후, 0,1 % 트리톤 X - 100 과 5 mM EDTA (pH 8.0) 를 함유하는 용액 30 ㎕ 를 첨가하여 세균분해처리를 하였다.
이어서 10 M 요소를 함유하는 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 160 ㎕ 를 첨가하여 (최종 요소농도 4.85 M) 그 혼합물을 30 ℃에서 30 분간 방치한후, 20 mM Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드 (베를링거-만하임의 제품임) 를 함유하는 DMSO 용액 10 ㎕를 첨가하여 30 ℃ 에서 하룻밤 반응시켰다.
약 700 개의 형질전환체에 대하여 스크리닝을 행하였을 때, 효소 기질 Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드의 분해에 의해 생성되는 황색 발색의 정도가 가장 강한 4 개의 균주들이 얻어졌으며 U1, U5, U7 및 U8 이라는 이름으로 지정하였다.
실시예 5. 요소 내성이 있는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체들 RPT(-)의 스크리닝 (2차 스크리닝)
4 개의 균주들 (U1, U5, U7 및 U8) 을 10 ml 의 LB 배지 (0.5 % 효모 추출액, 1.0 % 트립톤, 0.5 % NaCl)을 OD660 이 1.0 이 될때까지 37 ℃ 에서 배양한 후, IPTG 를 최종농도 2 mM 이 되도록 첨가하였고, 2 시간 배양을 계속한 후, 세포들을 원심분리에 의한 방법으로 모았다.
그 다음에는 세포를 OD660 이 5 가 되도록 TE 완충액 (10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM EDTA) 에 현탁시켰고, 초음파 분쇄기 (Cellruptor : 도소 전기) 로 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 12,000 rpm 에서 5 시간 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하였으며, 상청 분획물을 미정제 효소액으로 사용하였다.
단백질분해효소 활성의 측정을 위해, 20 ㎕ 의 20 mM Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아릴리드 용액을 940 ㎕ 의 50 mM Tris - HCl (pH 8.0) 완충용액과 혼합하였고, 40 ㎕ 미정제 효소액을 첨가하였으며, 실온에서 5 분간의 반응 시 405 ㎚ 에서의 흡광도 증가를 히따찌 분광광도계 모델 U-3200 을 사용하여 측정하였다. 4 개의 균주 유래의 미정제 효소액들의 V8 단백질분해효소 활성을 측정한 후, 천연의 V8 단백질분해효소 (예를 들면, 엔도프로테이네이즈 Glu-C, 베를링거-만하임의 제품) 0.2 ㎍ 효소 활성에 상당하는 양의 각각의 미정제 효소액을 사용하여 요소 존재하에서 시간에 따른 반응성의 변화를 측정하였다. 실험은 5 M 요소 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.4 mM Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드 및 2 % DMSO 를 함유하는 반응액으로 수행하였고, 405 ㎚ 에서의 흡광도 증가를 바탕으로 시간에 따른 반응의 변화를 측정하였다 (히따찌 분광광도계 모델 U-3200). 그 결과들은 제 7 도에 나타나 있다.
제 7 도가 분명히 보여주는 바와 같이, 돌연변이 균주 U1, U5, U7 및 U8 (이후 각각을 β G97V8RPT(-)1, β G97V8RPT(-)5, β G97V8RPT(-)7 및 β G97V8RPT(-)8 이라 부름) 에 의해 생성된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체들 RPT(-) 의 융합 단백질은, 야생형의 β G97V8RPT(-)와의 대조적이게도, 요소에 대한 내성을 나타내면서 기질에 대한 분해 활성을 보여 주었다.
실시예 6. 돌연변이 부위의 확인과 조합 돌연변이를 가진 돌이변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 융합 단백질의 제조
돌연변이 균주, U1, U5, U7 및 U8 로부터 종래의 방법에 따라 플라스미드를 분리, 정제하였다. 이들 플라스미드들을 이후 pV8RPT(-)1, pV8RPT(-)5, pV8RPT(-)7 및 pV8RPT(-)8 이라고 부를 것이다.
다음에는 각 플라스미드상의 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 유전자의 DNA 뉴클레오티드 서열을 파마시아 (Pharmacia) 사 제품의 DNA 서열분석기 (A. L. F. DNA Sequencer)를 사용, 결정하였다. DNA 뉴클레오티드 서열의 결정은, 또한 파마시아사의 제품인, 오토리드 시퀀싱 키트 (AutoRead Sequencing Kit)를 사용, 플루오로-dUTP를 활용하는 형광표지법에 의해서 수행되었으며, 다음의 프라이머들을 사용하였다.
프라이머 A (뉴클레오티드 번호 1 에서 22 까지의 부분과 어닐링하는 센스 프라이머로서, 이때 뉴클레오티드 번호 1 은 제 4 도에 나타난 야생형 V8 단백질 분해효소 RPT(-) 유도체를 코딩하는 유전자의 첫 번째 염기임) ;
5'-ACCGCTCGAGGTTATATTACCAAATAACGAT-3'( 서열 ID 번호: 6)
프라이머 D1 (상기한 바와 같은 뉴클레오티드 번호 266 에서 294 까지의 부분과 어닐링하는 센스 프라이머) ;
5'-CAGGCGAAGGAGCGCTAGCAATAGTTAAA-3'( 서열 ID 번호: 7)
프라이머 D2 (상기한 바와 같은 뉴클레오티드 번호 266 에서 294까지의 부분과 어닐링하는 안티센스 프라이머) ;
5'-TTTAACTATTGCTAGCGCTCCTTCGCCTG-3'( 서열 ID 번호: 8)
제조사의 실험실용 안내서에 기술된 DNA 서열분석 절차를 그대로 따랐다. 그 결과 4 종류의 돌연변이체 균주에 의해 생성되는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) 에서 제 8 도에 나타낸 돌연변이들이 일어났음이 증명되었다. 특히 pV8RPT(-)7 상의 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체는 이중 돌연변이였으며, 이는 pV8RPT(-)1 및 pV8RPT(-)5 의 돌연변이의 조합인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 제 7 도에 나타나 있는 β G97V8RPT(-)7 이 β G97V8RPT(-)1 과 β G97V8RPT(-)5 에 비해 활성이 더 높았던 이유는 이중 돌연변이였기 때문인 것으로 결론지어졌다. 이는 돌연변이의 조합으로 요소-내성이 강한 효소를 만들수 있는 가능성을 보여준다.
이들 뒷받침하기 위해, 얻어진 3 종류의 돌연변이를 모두 가진 플라스미드 pV8RPT(-)158 을 구성하였다. 구성에는 V8 단백질분해효소 유전자상에 존재하는 제한 효소 부위들(DraI, EcoRI) 을 사용하여 제 9 도에 나타나 있는 절차를 따랐다. pV8RPT(-)7 의 0.4Kbp DraI-EcoRI 단편을 pV8RPT(-)8 의 것과 교환하여 pV8RPT(-)158 을 구성하였다.
이 플라스미드 유래의 삼중 돌연변이체 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-) (β G97V8RPT(-)158)를 가지고, 상기한 바의 절차에 따라, 5M 요소 존재하에 시간의 경과에 따른 반응성의 변화를 조사하였다 (제 10 도를 보라). 그 결과 β G97V8RPT(-)158 은 β G97V8RPT(-)7 에 비해 합성 기질의 분해 반응이 더욱 지연되는 것으로 증명되었으며, 이에 의해 3 개의 돌연변이는 누적하는 방식으로 요소 내성을 부여하는 것으로 이해되었다.
실시예 7. 발현 벡터 pV8D 의 구성
제 11 도 및 제 12 도에 나타낸 절차에 따라 불활성의 봉입체 형태의 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D) 를 발현하는 플라스미드 pV8D 를 구성하였다. 먼저, pV8RPT(-)로부터 BglII-SalI 단편 (3.0 kb)과 EcoRV-BglII 단편 (0.7 kb) 를 준비하였고, pG97S4DhCT[G]R10 으로부터 제조된 NarI - SalI 단편 (0.2 kb) 과 연결시켜 pV8hCT[G] 를 얻었다 (제 11 도). 플라스미드 pG97S4DhCT[G]R10 (응용미생물 생물공학 (1995년) 제 42 권, 제 703-708 페이지) 은 실시예 2 의 pG97S4DhCT[G]R6 와 똑같은 방식으로 플라스미드 pBR322 와 플라스미드 pG97S4DhCT[G] 로부터 구성될 수 있다.
다음에는, 얻어진 pV8hCT[G] 의 hCT[G] 부분 (0.1 kb BstE-SalI 단편) 을 pUC4K [비에이라 (Vieira, J.) 와 메싱 (Messing, J.) 유전자 제 19 권, 제 259 페이지 (1982년) ; 파마시아 바이오테크사의 제품 번호 27-4958-01 로서 쉽게 구입가능] 의 아미노글루코시드 3'-포스포트란스퍼레이즈 유전자 (APT) 부위를 포함하는 0.8 kb SmaI-SalI 단편으로 바꾸어 pV8D 를 구성하였다 (제 12 도). 제 13 도는 이 플라스미드에 의해 발현된 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D) 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열 ID 번호 : 9) 을 보여준다. 야생형 V8 단백질분해효소 D유도체는 천연형 단백질분해효소의 C-말단 아미노산 56 개가 빠져 있는 운도체이다.
융합 단백질을 천연의 V8 단백질분해효소의 N-말단으로부터 212번째 아미노산 (EcoRV 부위) 까지의 부분을 사용하여 제조하였다. 즉, 융합 단백질을 β-갈락토시데이즈 유도체와 아미노글루코시드 3'-포스포트란스퍼레이즈의 일부분(tAPT) 이 R6 링커들을 통해서, 각각, 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D)의 N-말단 부분과 C-말단 부분에서 융합되어 있는 구조를 가진다.
R6 링커는 다음의 아미노산 서열 :
을 가지며 서열중의 RR 사이의 펩티드 결합은 이.콜리의 ompT 단백질분해효소에 의해 절단되는 구조를 가진다.
실시예 8. 발현 벡터 pV8F 의 구성
야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 를 불활성의 봉입체로서 발현시키는 플라스미드는 상기의 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D) 보다도 V8 단백질분해효소 부분이 C-말단 끝에서 아미노산 3 개가 더 긴 유도체인 융합단백질을 발현하는 플라스미드이며, PCR 법과 유전자 클로닝에 의하여 다음의 방식으로 구성되었다.
먼저, 프라이머 IV (서열 ID 번호 : 11) ;
와 프라이머 V (서열 ID 번호 : 12) :
를 합성하였고, 주형 DNA 로서 실시예 2 에서 구성된 0.1 ㎍ 의 pV8RPT(-)를 사용하여 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 유전자 말단의 증폭 반응을 수행한 후, EcoRI 및 SacI 으로 절단하여 0.1 kb 유전자 단편을 제조하였다.
한편, 프라이머 VI (서열 ID 번호 : 13) :
과 프라이머 VII (서열 번호 ID 번호 : 14)
도 또한 합성하였으며 주형 DNA 로서 0.1 ㎍ 의 pV8D 를 사용하여 R6 링커 서열과 아미노글루코시드 3'-포스포트란스퍼레이즈 유전자 일부분의 중폭 반응을 한 후, EcoT22I 및 SacI 으로 절단하여 0.3 kb 유전자 단편을 제조하였다. PCR 은 실시예 1 에서와 똑같은 조건하에서 수행되었다.
상기한 바와 같이 얻어진 0.1 kb 및 0.3 kb 유전자 단편들을 pV8D 의 EcoRI-EcoT22I 단편(4.2 kb)과 연결시켜 pV8F 를 구성하였다 (제 14 도). 제 15 도는 이 플라스미드에 의해 발현된 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 융합 단백질의 아미노산 서열(서열 ID 번호 : 15) 을 보여준다. 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체는 천연형 단백질분해효소에서 C-말단 아미노산 53 개가 빠져 있는 유도체이다.
실시예 9. 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D (V8D) 및 F (V8F) 유도체들의 제조와 요소 내성의 확인
돌연변이체 V8 단백질분해효소 D (V8D) 및 F (V8F) 유도체들의 발현을 높이기 위한 시도에서 플라스미드 pV8D 및 pV8F 를 사용하였다.
(1) 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체
제 16 도에 나타낸 바와 같이, pV8RPT(-)1, pV8RPT(-)5, 및 pV8RPT(-)8 유래의 0.7 kbp BglII-EcoRI 단편들을 각각 3.9 kbp BglII-EcoRI 단편에 삽입시켜 pVD1, pV8D5 및 pV8D8 을 구성하였다.
발효조 [30L Kit Fermenter, 고마쓰가와 가꼬오 기까이 (Komatsugawa Chemical Instruments) 의 제품] 에서, 4 g/L K2HPO4, 4g/L KH2PO4, 2.7 g/L Na2HPO4, 0.2 g/L NH4Cl, 1.2 g/L (NH4)2SO4, 4 g/L 효모 추출물, 2 g/L MgSO4 · 7H2O, 40 ㎎/L CaCl2· 2H2O, 40 ㎎/L FeSO4· 7H2O, 10 ㎎/L MnSO4· nH2O, 10 ㎎/L AICl3· 6H2O, 4 ㎎/L CoCl2· 6H2O, 2 ㎎/L ZnSO4· 7H2O, 2 ㎎/L Na2MoO4· 2H2O, 1 ㎎/L CuCl2· 2H2O, 0.5 ㎎/L H3BO4 및 10 ㎎/L 테트라사이클린을 함유하는 배지 (20 L, pH 7.0) 에 37℃ 에서 글리세린을 연속적으로 첨가하면서 OD660이 10 이 될때까지 상기 플라스미드 각각을 갖는 JM101 을 배양한 후, IPTG 를 최종 농도 2 mM 가 되게 첨가하고 3 시간 배양을 계속하였다.
얻어진 진(truth) 배양배지를 만톤골린 (MantonGaullin) 균질기 (모델 15M - 8TBA, 만톤골린사) 로 600 kg/cm2 의 조건하에서 균질화하였고, 7000 rpm 에서 30 분간의 원심분리에 의해 침전 분획물을 회수하였다. 침전물의 OD660 이 100 에 이를 때까지 탈이온수를 첨가한 후, 15 ml 를 취하였고, 2.5 ml의 1M Tris-HCl (pH 8.0), 250 ㎕ 의 1M 디티오트레이톨 (DDT) 및 12 g 의 요소를 첨가하여 봉입체를 용해시킨 후, 탈이온수를 첨가하여 50 ml 를 제조하였으며 그 용액을 37 ℃ 에서 6 시간 보온 반응시켰다.
그후 0.4M (NH4)2SO4 를 함유하는 20 mM 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 7.5)으로 21 배 희석시킨 후, 그 용액을 아이스상에서 하룻밤 그대로 두었다. 이러한 리폴딩 과정으로 약 80 ㎍/ml 의 각 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체들 즉 pV8D1, pV8D5 및 pV8D8 유래의 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체들 V8D1, V8D5 및 V8D8 을 얻었다.
V8 단백질분해효소들 각각을 정제하기 위해, (NH4)2SO4를 첨가하여 최종농도 1.8M 이 되게 한 다음, 300 ml 혼합물을 부틸 도요퍼얼(Toyopearl) 650M (도소사의 제품)을 사용하여 정제하였다. 1.8M (NH4)2SO4를 함유하는 10mM 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 7.5) 으로 평형화시킨 Φ 16 ㎜×62 ㎜ 컬럼에 상기 샘플을 가하였고, (NH4)2SO4 농도 1.8M에서 0M 까지의 직선 농도 기울기로 정제를 수행하였다. 각 단백질분해효소들은 0.9M (NH4)2SO4 농도 부근에서 용출되었고, 대략 20 ㎎ 의 각각의 정제효소가 얻어졌다.
정제된 효소들의 활성은 실시예 3 에 기술된 방법으로 측정되었다.
정제된 V8D1, V8D5 및 V8D8을 사용하여 요소에 대한 내성을 재조사하였다. 3M 요소, 50 mM Tris-HCI (pH 8.0) 및 2 % DMSO를 함유하는 반응 혼합액 960 ㎕ 에 각각의 돌연변이체 효소 (V8D1, V8D5 그리고 V8D8) 40 ㎕ (농도 : 150 ㎍/ml) 를 가하였고. 그 혼합액을 30 ℃에서 30 분간 그대로 둔 후, 합성기질 (Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드)을 첨가하여 최종 농도가 0.4 mM 이 되게 하였으며, 효소 첨가 직후의 활성을 100 % 로 정의하여 각 효소의 잔류 합성 활성을 측정하였다. 대조군으로 pV8D 로부터 똑같은 절차를 거쳐 제조된 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D)를 사용하였다 그 결과, V8D1, V8D5 및 V8D8 은 V8D 보다 잔류 활성이 더 높았으며, 이는 돌연변이의 도입으로 요소에 대한 내성이 향상된 돌연변이체 V8 단백질 분해효소 D 유도체들이 만들어진다는 것을 증명하였다 (제 17 도).
(2) 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들
pV8F 에 도입된 돌연변이도 또한 조사하였다. 제 18 도에 나타난 절차에 따라, pV8RPT(-)1, pV8RPT(-)5, pV8RPT(-)7, pV8RPT(-)8, 및 pV8RPT(-)158 유래의 0.7 kbp BglII-EcoRI 단편을 pV8F 의 3.9 kbp BglII-EcoRI 단편에 삽입시켜 pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8, 및 pV8F158 을 구성하였다.
이들 플라스미드를 갖고 있는 JM101 균주들을 사용하여 각각의 돌연변이가 있는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들, 즉 pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8, 및 pV8F158 유래의 돌연변체 V8 단백질분해효소 F 유도체들 V8F1, V8F5, V8F7, V8F8 및 V8F158 을 상기한 방법에 따라 분리하였다.
역시 같은 절차에 따라 제조된, 정제된 V8F1, V8F5, V8F7, V8F8, V8F158, 그리고, 대조군으로 pV8F 유래의 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F)를 사용하여 요소에 대한 내성을 재시험하였다. 그 결과, 각 돌연변이체 효소들은 5M 요소존재하에서 우수한 요소 내성을 갖는 것으로 재확인되었으며, 따라서 요소에 대한내성이 우수한 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들을 만들 수 있음을 증명하였다
실시예 10. 소듐 도데실 술페이드 (0.1 %) 및 열 (50℃) 에 대한 V8F1, V8F5 및 V8F8 의 안정성 검토
실시예 9 에서 얻어진 V8F1, V8F5, V8F8을 사용하여 소듐 도데실 술페이트 (이하, SDS) 및 열에 대한 안정성에 대하여 검토를 행하였다. SDS 안정성의 경우, 0.1 % SDS, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 및 천연형 V8 단백질분해효소의 4.0㎍/ml 효소활성에 상당하는 양의 각 효소 (V8F1, V8F5, V8F8)을 함유한 용액을 30 ℃ 에서 보온반응시켰고, 일정시간마다 그로부터 900 ㎕를 취한 후, 4mM Z-Phe-Leu-Glu-4-니트로아닐리드 및 20% DMSO를 함유하는 용액 100 ㎕ 를 첨가하고, 잔류 활성을 측정하였다.
또, 50℃ 에서의 열 안정성에 대하여는, 50mM Tris-HCI (pH 8.0), 및 천연형 V8 단백질분해효소의 4.0㎍/ml 효소활성에 상당하는 양의 각 효소 (V8F1, V8F5, V8F8)을 함유한 용액을 50 ℃ 에서 보온반응시켰고, 일정시간마다 그로부터 900㎕를 취한 후, 아이스 상에서 냉각시켰으며 그들의 잔류 활성을 측정하였다.
제 20 도에 나타낸 바와 같이, 돌연변이체 효소인 V8F1, V8F5, V8F8 은 대조군으로 사용된 야생형에 비하여 불활성화 속도가 더 낮았고, 0.1% SDS 에 대한 안정성은 높았다. 이로써 3 종류의 요소 내성 돌연변이들 Lys147Arg (V8F1), Asn71Ser (V8F5) 및 Asp44Glu (V8F8) 의 도입은 SDS 에 의한 변성에 대해서도 유효한 것이 판명되었다. 또한, 50℃ 에서의 열에 의한 불활성화에 대하여는, V8F1 과 V8F5 가 야생형 V8F 에 비하여 불활성화 속도가 감소하고, Lys147Arg 및 Asn71Ser 의 돌연변이는 내열성도 부여하는 것이 명확해졌다 (제 21 도).
실시예 11. V8F158 에 의한 융합단백질의 절단
V8F158 (삼중 돌연변이형 V8 단백질분해효소 F 유도체) 를 사용하여, 요소 존재하에 단백질의 절단실험을 행하였다. 실험에는 pG97S4DhCNP-22R5-3 유래의 융합단백질을 기질로서 사용하였다. 이 융합단백질 (β-gal97S4DhCNP-22R5-3) 은 보호성 펩티드 (β-gal97S4D) 와 사람 C형 나트륨뇨배설항진성 펩티드 (hCNP) 가 링커를 통하여 융합되어 있고. V8 단백질분해효소에 의해 (hCNP) 가 방출되는 구조를 갖고 있다 (일본국 특허 공개 공보 제 93-328992 호).
5M 요소 존재하에 응합단백질로부터 hCNP를 절단하는 능력에 있어서는 천연형 V8 단백질분해효소와 V8F158을 가지고 비교하였다. pG97S4DhCNP-22R5-3 유래의 융합 단백질의 종류, 융합 펩티드의 발현, 발현 봉입체의 회수, V8 단백질분해효소의 반응조건, 융합단백질 및 방출된 hCNP 의 분석은 모두 일본국 특허 공개 공보 93-328992 호에 기재된 조건에 따랐다. 그러나, 반응시의 요소농도는 5M 로 조정하였으며, V8F158 은 천연형 V8 단백질분해효소로 환산하여 4㎍/ml 의 활성에 상당하는 양을 첨가하였다.
30 분의 반응 후, HPLC 의 피이크로부터 절단 효소 (절단된 융합단백질의 비율)을 계산하였고, 천연형 V8 단백질분해효소가 60% 인 것에 대해 V8F158 은 98% 였으며, 고농도의 요소존재하에서의 V8F158 의 유효성이 융합단백질의 절단반응에서도 증명되었다.
공지의 천연형 V8 단백질분해효소는 약 2M 요소를 함유하는 효소 탄응액에서도 어느 정도의 절단 반응을 여전히 수행하기 때문에 유전자 재조합법에 의한 유용한 펩티드 등의 제조에 널리 사용되고 있다 ; 그러나, 상기한 바와 같이, 본 발명의 효소들은 천연형의 효소 특성보다도 훨씬 더 큰 요소내성을 부여해 준다. 따라서, 본 발명에 따른 효소는 고농도의 요소 존재하에서도 효소 활성의 불활성화를최소화하는데 사용될 수 있으며, 따라서 요소-함유 반응계에 보다 적응 양으로 효소를 첨가할 수 있고 반응시간의 단축도 가능하게 된다. 부수적인 이점으로서 고농도의 요소 존재하에 단백질을 분해시킬수 있으므로 종래 얻기 어려운 펩티드 단편들을 얻는 것이 가능하다는 것이다.
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서열의 유형 : 아미노산
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분자의 유형 : 단백질
제 1 도는 (a) 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) V8 단백질분해효소 유전자의 구조와 그 유전자의 어닐링 (annealing) 부위들, 그리고 (b)클로닝에 사용되는 PCR 프라이머들의 염기 서열을 나타낸 것이다.
제 2 도는 플라스미드 pG97S4DhCT[G]R6과 플라스미드 pG97S4DhCT[G]R10 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 3 도는 플라스미드 pV8RPT(-) 의 구성 과정을 나타낸 것이다
제 4 도는 플라스미드 pV8RPT(-) 에 코딩되어 있는 융합 단백질의 아미노산서열 (서열 ID 번호 : 3)을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 야생형 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체의 서열 부분이며, 이중밑줄친 부분은 R6 링커(linker)의 아미노산 서열이다.
제 5 도는 (a) 클로닝에 사용되는 PCR 프라이머들의 뉴클레오티드 서열 (서열 ID 번호 : 4 및 5)과 (b) 플라스미드 pV8RPT(-) 의 구조 및 플라스미드상의 유전자들의 어닐링 부위를 나타낸 것이다.
제 6 도는 플라스미드 pV8RPT(-) 에 PCR 돌연변이를 도입하는 것을 예시한 것이다.
제 7 도는 5M 요소 존재시의 돌연변이체 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체들의 시간의 경과에 따른 반응성의 변화를 나타낸 것이다.
제 8 도는 돌연변이체 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체들에서의 돌연변이 부위를 확인한 결과를 수록한 것이다. 야생형 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체 유전자의 첫 번째 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 번호 제 1 번으로 표시된다. 야생형 V8 단백질분해효소 유도체 RPT(-)의 N-말단은 아미노산 번호 제 1 번으로 표시된다.
제 9 도는 플라스미드 pV8RPT(-)158 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 10 도는 5M 요소 존재시의, 이중 또는 삼중 돌연변이를 가진 돌연변이체 V8 단백질분해효소 RPT(-) 유도체들의 시간의 경과에 따른 반응성의 변화를 나타낸 것이다.
제 11 도는 플라스미드 pV8hCT[G] 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 12 도는 플라스미드 pV8D 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 13 도는 플라스미드 pV8D 에 코딩되어 있는 융합 단백질의 아미노산 서열(서열 ID 번호 : 9)을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D) 의 서열 부분이며, 이중밑줄친 부분들은 R6 링커들의 아미노산 서열이다. 화살표시들은 OmpT 단백질분해효소의 절단 부위를 나타낸다.
제 14 도는 플라스미드 pV8F 의 구성 과정을 나타낸 것이다. V8F 유전자는 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 를 코딩하는 유전자이다.
제 15 도는 플라스미드 pV8F에 코딩되어 있는 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열 ID 번호 : 15)을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 의 서열 부분이며, 이중밑줄친 부분들은 R6 링커들의 아미노산 서열이다. 화살표시들은 OmpT 단백질분해효소의 절단 부위를 나타낸다.
제 16 도는 플라스미드 pV8D1, pV8D5 및 pV8D8 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 l7 도는 3M 요소 존재시의, 플라스미드 pV8D1, pV8D5 및 pV8D8 에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 D 유도체들(V8D1, V8D5 및 V8D8) 과 pV8D 에서 유도된 야생형 V8 단백질분해효소 D 유도체 (V8D) 의 잔류 활성을 나타낸 것이다.
제 18 도는 플라스미드들 pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8 및 PV8F158 의 구성 과정을 나타낸 것이다.
제 19 도는 5M 요소 존재시의, 플라스미드 pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8, 및 pV8Fl58에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들(V8F1, V8F5, V8F7, V8F8 및 V8F158)과 pV8F에서 유도된 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 의 시간의 경과에 따른 반응성의 변화를 나타낸 것이다.
제 20 도는 플라스미드 pV8F1, pV8F5 및 pV8F8에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체(V8F1, V8F5 및 V8F8) 및 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체(V8F) 의 0.1 % SDS 에 대한 안정성을 나타낸 것이다.
제 21 도는 플라스미드 pV8F1, pV8F5 및 pV8F8에서 유도된 돌연변이체 V8 단백질분해효소 F 유도체들 (V8F1, V8F5 및 V8F8)과 야생형 V8 단백질분해효소 F 유도체 (V8F) 의 50℃ 에서의 열 안정성을 나타낸 것이다.
Claims (11)
- 서열 ID 번호 : 3 의 제 125 번 Val 에서 제 336 번 Asp 까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 168번 Asp, 195번 Asn 및 271번 Lys 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환되어 있는, 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) V8 단백질분해효소로서,168번 Asp 이 치환되는 경우 Glu 으로 치환되고, 195번 Asn 이 치환되는 경우 Ser 으로 치환되며, 271번 Lys 이 치환되는 경우 Arg 으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소.
- 제 1 항에 있어서, l68번 Asp, l95번 Asn 및 271번 Lys 중 하나가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 단백질분해효소.
- 제 1 항에 있어서, (a) 168번 Asp과 195번 Asn, (b) 168번 Asp과 271번 Lys, 또는 (c) 195번 Asn과 271번 Lys 이 다른 아미노산들로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 단백질분해효소.
- 제 1 항에 있어서, 168번 Asp, 195번 Asn 및 271번 Lys 의 모두가 다른 아미노산들로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 단백질분해효소.
- 서열 ID 번호 : 3 의 105번 Arg 내지 344번 Gln 의 아미노산 서열로 이루어지고, 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소.
- 서열 ID 번호 : 9 의 105번 Arg 내지 340번 Arg 의 아미노산 서열로 이루어지고, 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소.
- 서열 ID 번호: 15 의 제 105 번 Arg 내지 345 번 Arg 의 아미노산 서열로 이루어지고, 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소
- 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항의 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소를 코딩하는 유전자.
- 제 8 항의 유전자를 포함하고 있는 발현 벡터.
- 스타필로코키(Staphylococci), 살모넬라(Salmonella), 악티노미세테스 (Actinomycetes), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus Subtilis)로 이루어진 원핵세포 및 필라멘트성 박테리아, 효모, 곤충 세포 및 동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 진핵 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주세포를 제 9 항의 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 세포.
- 단백질 변성이 촉진되는 환경 조건하에서도 효소 활성을 가지는 돌연변이체 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 단백질분해효소의 생산 방법으로서, 제 10 항의 재조합 세포를 배양한 다음 그 배양 산물로부터 원하는 단백질분해효소 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
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