JPH0947291A - 変異型スタフィロコッカス・アウレウスｖ８プロテアーゼ - Google Patents
変異型スタフィロコッカス・アウレウスｖ８プロテアーゼInfo
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- JPH0947291A JPH0947291A JP8160475A JP16047596A JPH0947291A JP H0947291 A JPH0947291 A JP H0947291A JP 8160475 A JP8160475 A JP 8160475A JP 16047596 A JP16047596 A JP 16047596A JP H0947291 A JPH0947291 A JP H0947291A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 天然型Ｖ８プロテアーゼと比較して、蛋白変
性をもたらす環境条件においても酵素活性を有する変異
型Ｖ８プロテアーゼを得ることを目的とする。 【解決手段】 天然型Ｖ８プロテアーゼ蛋白中に１つ以
上の変異部位を有し、高濃度の尿素存在下でも酵素活性
を有する変異型プロテアーゼを得る。 【効果】 高濃度の尿素存在下でも酵素活性の失活が抑
えられることにより、尿素存在下の反応系に加える酵素
量が少なくてすみ、また、反応時間の短縮が行なえる。
更には高濃度尿素存在下で蛋白切断が行なえることによ
り今まで得られなかったペプチド断片が得られる等の利
点がある。
性をもたらす環境条件においても酵素活性を有する変異
型Ｖ８プロテアーゼを得ることを目的とする。 【解決手段】 天然型Ｖ８プロテアーゼ蛋白中に１つ以
上の変異部位を有し、高濃度の尿素存在下でも酵素活性
を有する変異型プロテアーゼを得る。 【効果】 高濃度の尿素存在下でも酵素活性の失活が抑
えられることにより、尿素存在下の反応系に加える酵素
量が少なくてすみ、また、反応時間の短縮が行なえる。
更には高濃度尿素存在下で蛋白切断が行なえることによ
り今まで得られなかったペプチド断片が得られる等の利
点がある。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は蛋白変性をもたらす
環境条件下においても酵素活性を有する変異型スタフィ
ロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）Ｖ
８プロテアーゼ（以下、スタフィロコッカス・アウレウ
スＶ８プロテアーゼを天然型Ｖ８プロテアーゼと称す
る）、当該酵素蛋白をコードする遺伝子、当該遺伝子を
有する発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換
された組換え細胞及び当該酵素の製造方法に関する。
環境条件下においても酵素活性を有する変異型スタフィ
ロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）Ｖ
８プロテアーゼ（以下、スタフィロコッカス・アウレウ
スＶ８プロテアーゼを天然型Ｖ８プロテアーゼと称す
る）、当該酵素蛋白をコードする遺伝子、当該遺伝子を
有する発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換
された組換え細胞及び当該酵素の製造方法に関する。
【０００２】さらに詳細には、本発明に係る酵素蛋白
は、蛋白変性剤または温度等により蛋白変性をもたらす
環境条件下においても、従来知られている天然型Ｖ８プ
ロテアーゼと比較して、より安定に酵素活性を有する変
異型Ｖ８プロテアーゼに関する。
は、蛋白変性剤または温度等により蛋白変性をもたらす
環境条件下においても、従来知られている天然型Ｖ８プ
ロテアーゼと比較して、より安定に酵素活性を有する変
異型Ｖ８プロテアーゼに関する。
【０００３】
【従来の技術】天然型Ｖ８プロテアーゼはS. aureus Ｖ
８株が培地中に分泌するセリンプロテアーゼの一種であ
る。１９７２年にDrapeau, G. R. 等によりS. aureus
Ｖ８株の培地より、グルタミン酸及びアスパラギン酸の
Ｃ末端側のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロ
テアーゼの一種として単離精製され（Jean Houmard and
Gabriel R. Drapeau(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 69, 3506-3509), １９８７年にはCynthia Carmona
等によりＤＮＡ塩基配列が明らかになっている（Cynthi
a Carmona and Gregory L. Gray (1987) Nucleic. Aci
d. Res.15, 6757)。
８株が培地中に分泌するセリンプロテアーゼの一種であ
る。１９７２年にDrapeau, G. R. 等によりS. aureus
Ｖ８株の培地より、グルタミン酸及びアスパラギン酸の
Ｃ末端側のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロ
テアーゼの一種として単離精製され（Jean Houmard and
Gabriel R. Drapeau(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 69, 3506-3509), １９８７年にはCynthia Carmona
等によりＤＮＡ塩基配列が明らかになっている（Cynthi
a Carmona and Gregory L. Gray (1987) Nucleic. Aci
d. Res.15, 6757)。
【０００４】当該酵素は３３６個のアミノ酸残基からな
る前駆体として発現された後、Ｎ末端から６８個のアミ
ノ酸残基からなるプレプロ配列が除去されて成熟蛋白と
して分泌される。さらに当該酵素にはそのＣ末端領域
（Ｎ末端からのアミノ酸配列番号；２２１−２５６）に
プロリン−アスパラギン酸−アスパラギンのリピート
（繰り返し）配列が存在しているが、当該配列は酵素活
性には必要ないことを本発明者等は既に見いだしている
（特願平６−２９６０２８、ＥＰ７００９９５Ａ）。
る前駆体として発現された後、Ｎ末端から６８個のアミ
ノ酸残基からなるプレプロ配列が除去されて成熟蛋白と
して分泌される。さらに当該酵素にはそのＣ末端領域
（Ｎ末端からのアミノ酸配列番号；２２１−２５６）に
プロリン−アスパラギン酸−アスパラギンのリピート
（繰り返し）配列が存在しているが、当該配列は酵素活
性には必要ないことを本発明者等は既に見いだしている
（特願平６−２９６０２８、ＥＰ７００９９５Ａ）。
【０００５】天然型Ｖ８プロテアーゼは酵素としての機
能解析は不十分であるにも拘わらず、当該酵素はグルタ
ミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端側のペプチド結合を
特異的に切断することから蛋白のアミノ酸配列の決定に
汎用されている。また、天然型Ｖ８プロテアーゼは蛋白
の変性を起こさせるような蛋白変性剤の一つである尿素
の存在下（２Ｍ尿素程度）でも基質にある程度作用する
ことから、遺伝子組換え技術で宿主内に大量に発現させ
た目的ペプチドを含む不溶性融合蛋白を尿素で可溶化し
た後、尿素存在下に当該酵素を作用させて目的ペプチド
を融合蛋白から遊離させる工程にも使用されている。
能解析は不十分であるにも拘わらず、当該酵素はグルタ
ミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端側のペプチド結合を
特異的に切断することから蛋白のアミノ酸配列の決定に
汎用されている。また、天然型Ｖ８プロテアーゼは蛋白
の変性を起こさせるような蛋白変性剤の一つである尿素
の存在下（２Ｍ尿素程度）でも基質にある程度作用する
ことから、遺伝子組換え技術で宿主内に大量に発現させ
た目的ペプチドを含む不溶性融合蛋白を尿素で可溶化し
た後、尿素存在下に当該酵素を作用させて目的ペプチド
を融合蛋白から遊離させる工程にも使用されている。
【０００６】一方、本発明者等はヒトカルシトニンの遺
伝子組換え法による製造に関して、上記の方法を用いて
効率良くヒトカルシトニンを製造することに成功してい
る（特開平５−３２８９９２）。また、ヒトグルカゴン
を大腸菌発現系で融合蛋白として発現させた例において
も、天然型Ｖ８プロテアーゼが当該融合蛋白からヒトグ
ルカゴンの切り出しに使用されている（Kazumasa Yosik
awa et al. (1992) Journal of Protein Chemistry 11,
517-525) 。
伝子組換え法による製造に関して、上記の方法を用いて
効率良くヒトカルシトニンを製造することに成功してい
る（特開平５−３２８９９２）。また、ヒトグルカゴン
を大腸菌発現系で融合蛋白として発現させた例において
も、天然型Ｖ８プロテアーゼが当該融合蛋白からヒトグ
ルカゴンの切り出しに使用されている（Kazumasa Yosik
awa et al. (1992) Journal of Protein Chemistry 11,
517-525) 。
【０００７】以上のように、天然型Ｖ８プロテアーゼは
非常に多くの生化学的研究又は遺伝子組換えによるペプ
チドの製造に用いられている。天然型Ｖ８プロテアーゼ
は蛋白の変性を起こさせることで知られている尿素を含
む酵素反応液中（２Ｍ程度の尿素を含む）においてもあ
る程度の切断反応を行なうため、遺伝子組換え法による
有用ペプチド等の製造に用いられている。
非常に多くの生化学的研究又は遺伝子組換えによるペプ
チドの製造に用いられている。天然型Ｖ８プロテアーゼ
は蛋白の変性を起こさせることで知られている尿素を含
む酵素反応液中（２Ｍ程度の尿素を含む）においてもあ
る程度の切断反応を行なうため、遺伝子組換え法による
有用ペプチド等の製造に用いられている。
【０００８】しかし、この天然型Ｖ８プロテアーゼの当
該性質に加えて更に蛋白変性をもたらす環境条件下にお
いても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼを作製
し、用いることができれば、当該環境条件下においても
酵素活性の失活が抑えられることになる。従って、当該
性質を有する変異型Ｖ８プロテアーゼを用いることがで
きれば、（１）蛋白変性剤存在下の反応系に加える酵素
量が少なくてすむ、（２）または反応時間の短縮が行な
える、（３）更には高濃度の蛋白変性剤存在下や高温下
で蛋白切断が行なえることにより今まで得られなかった
ペプチド断片が得られる等の利点があげられるために、
研究上及び産業上、当該変異型Ｖ８プロテアーゼが非常
に望まれていた。
該性質に加えて更に蛋白変性をもたらす環境条件下にお
いても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼを作製
し、用いることができれば、当該環境条件下においても
酵素活性の失活が抑えられることになる。従って、当該
性質を有する変異型Ｖ８プロテアーゼを用いることがで
きれば、（１）蛋白変性剤存在下の反応系に加える酵素
量が少なくてすむ、（２）または反応時間の短縮が行な
える、（３）更には高濃度の蛋白変性剤存在下や高温下
で蛋白切断が行なえることにより今まで得られなかった
ペプチド断片が得られる等の利点があげられるために、
研究上及び産業上、当該変異型Ｖ８プロテアーゼが非常
に望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、蛋白変性を
もたらすような環境条件においても酵素活性を有する変
異型Ｖ８プロテアーゼを得ることを目的とし、更に本発
明は、当該酵素蛋白をコードする遺伝子、当該遺伝子を
有する発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換
された組換え細胞及び当該酵素蛋白の製造方法に関する
ものである。
もたらすような環境条件においても酵素活性を有する変
異型Ｖ８プロテアーゼを得ることを目的とし、更に本発
明は、当該酵素蛋白をコードする遺伝子、当該遺伝子を
有する発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換
された組換え細胞及び当該酵素蛋白の製造方法に関する
ものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、天然型Ｖ
８プロテアーゼ遺伝子からＰＣＲ法で取得した野性型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体遺伝子にＰＣＲ法でランダム変異
を起こさせ、適当な宿主を選択して、蛋白変性をもたら
すような環境条件下でもより安定に酵素活性を示す変異
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体を発現する遺伝子を取得し、
当該遺伝子によりコードされる遺伝子産物（蛋白質）が
上記に述べた目的を十分に達成し、産業上非常に有用で
あることを確認することにより本発明を完成した。
８プロテアーゼ遺伝子からＰＣＲ法で取得した野性型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体遺伝子にＰＣＲ法でランダム変異
を起こさせ、適当な宿主を選択して、蛋白変性をもたら
すような環境条件下でもより安定に酵素活性を示す変異
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体を発現する遺伝子を取得し、
当該遺伝子によりコードされる遺伝子産物（蛋白質）が
上記に述べた目的を十分に達成し、産業上非常に有用で
あることを確認することにより本発明を完成した。
【００１１】本明細書において、変異型Ｖ８プロテアー
ゼとは天然型Ｖ８プロテアーゼが蛋白変性をもたらすよ
うな環境条件においても酵素活性を有する酵素蛋白を意
味し、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体とは天然型Ｖ８プ
ロテアーゼから当該蛋白のＣ末端の一部分を欠失させた
酵素蛋白を意味し、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体とは
野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体に変異を起こさせた酵素
蛋白を意味する。なお、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
にはＣ末端アミノ酸配列の異なる３種類の野性型Ｖ８プ
ロテアーゼ誘導体が作製され、それらは各々（１） 野
性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）（略称、Ｖ８
ＲＰＴ（−））、（２）野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｄ（略称、Ｖ８Ｄ) 、（３）野性型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体Ｆ（略称、Ｖ８Ｆ）と記載する。また、これらの野
性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体に変異が導入された変異型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体については、各誘導体の末尾に
変異の種類を示す番号を記載することにより（例えば、
Ｖ８ＲＰＴ（−）１、Ｖ８Ｄ５、Ｖ８Ｆ１５８等）、導
入されている変異の種類を表わす。
ゼとは天然型Ｖ８プロテアーゼが蛋白変性をもたらすよ
うな環境条件においても酵素活性を有する酵素蛋白を意
味し、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体とは天然型Ｖ８プ
ロテアーゼから当該蛋白のＣ末端の一部分を欠失させた
酵素蛋白を意味し、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体とは
野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体に変異を起こさせた酵素
蛋白を意味する。なお、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
にはＣ末端アミノ酸配列の異なる３種類の野性型Ｖ８プ
ロテアーゼ誘導体が作製され、それらは各々（１） 野
性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）（略称、Ｖ８
ＲＰＴ（−））、（２）野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｄ（略称、Ｖ８Ｄ) 、（３）野性型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体Ｆ（略称、Ｖ８Ｆ）と記載する。また、これらの野
性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体に変異が導入された変異型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体については、各誘導体の末尾に
変異の種類を示す番号を記載することにより（例えば、
Ｖ８ＲＰＴ（−）１、Ｖ８Ｄ５、Ｖ８Ｆ１５８等）、導
入されている変異の種類を表わす。
【００１２】従来知られている天然型Ｖ８プロテアーゼ
が変性をもたらすような環境条件としては、蛋白変性剤
又は温度等により蛋白構造が変化する場合が挙げられる
が、本明細書においては蛋白変性剤による場合、特に蛋
白変性剤としての高濃度の尿素に対して十分な耐性を有
する酵素蛋白を例に挙げて詳細に説明する。前述のよう
に天然型Ｖ８プロテアーゼのアミノ酸配列とＤＮＡ塩基
配列は既に明らかになっているが、蛋白の高次構造は明
らかになっていない。従って、どのアミノ酸を変えれば
高濃度の尿素に対して耐性を有する性質が付加されるの
かは全く不明である。
が変性をもたらすような環境条件としては、蛋白変性剤
又は温度等により蛋白構造が変化する場合が挙げられる
が、本明細書においては蛋白変性剤による場合、特に蛋
白変性剤としての高濃度の尿素に対して十分な耐性を有
する酵素蛋白を例に挙げて詳細に説明する。前述のよう
に天然型Ｖ８プロテアーゼのアミノ酸配列とＤＮＡ塩基
配列は既に明らかになっているが、蛋白の高次構造は明
らかになっていない。従って、どのアミノ酸を変えれば
高濃度の尿素に対して耐性を有する性質が付加されるの
かは全く不明である。
【００１３】そこで本発明者等は尿素耐性を示す本酵素
の変異遺伝子を単離するには、本遺伝子をコードする遺
伝子にランダムに変異を起こさせ、変異を持った遺伝子
を発現プラスミドに組み込み、宿主細胞を組換えプラス
ミドで形質転換し、遺伝子発現を行なった後、天然型Ｖ
８プロテアーゼが失活する５Ｍ尿素存在下でも酵素活性
を示す酵素を発現する組換え体をスクリーニングする方
法が適切であろうと考え本発明に係る以下の研究を行な
った。
の変異遺伝子を単離するには、本遺伝子をコードする遺
伝子にランダムに変異を起こさせ、変異を持った遺伝子
を発現プラスミドに組み込み、宿主細胞を組換えプラス
ミドで形質転換し、遺伝子発現を行なった後、天然型Ｖ
８プロテアーゼが失活する５Ｍ尿素存在下でも酵素活性
を示す酵素を発現する組換え体をスクリーニングする方
法が適切であろうと考え本発明に係る以下の研究を行な
った。
【００１４】まず、天然型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子から
ＰＣＲ法で取得した野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰ
Ｔ（−）遺伝子を組み込んだプラスミドｐＶ８ＲＰＴ
（−）を作製した。なお野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
ＲＰＴ（−）とは天然型Ｖ８プロテアーゼのＣ末端の４
８アミノ酸を欠失した誘導体であり、プラスミドｐＶ８
ＲＰＴ（−）はこの野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰ
Ｔ（−）と大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体（β−ｇ
ａｌ９７Ｓ４Ｄ）との融合蛋白を発現するプラスミドで
ある。
ＰＣＲ法で取得した野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰ
Ｔ（−）遺伝子を組み込んだプラスミドｐＶ８ＲＰＴ
（−）を作製した。なお野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
ＲＰＴ（−）とは天然型Ｖ８プロテアーゼのＣ末端の４
８アミノ酸を欠失した誘導体であり、プラスミドｐＶ８
ＲＰＴ（−）はこの野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰ
Ｔ（−）と大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体（β−ｇ
ａｌ９７Ｓ４Ｄ）との融合蛋白を発現するプラスミドで
ある。
【００１５】次に、ｐＶ８ＲＰＴ（−）上の野生型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子に対しＰＣＲ法
によるランダム変異処理を行い、変異処理された野生型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子のプールを
調製した。この変異処理を受けた遺伝子プールをｐＶ８
ＲＰＴ（−）上の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子と置換し、大腸菌ＪＭ１０１に形質転換を
行ない、多数の組換え体を得た。これらの組換え体を培
養し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（以下ＩＰＴＧ）を添加し融合蛋白の遺伝子発現を行な
った。培養液に最終濃度が約５Ｍになるように尿素を添
加した後、本酵素の合成基質であるZ-Phe-Leu-Glu-4-ni
troanilideを用いて酵素反応を行なった。
プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子に対しＰＣＲ法
によるランダム変異処理を行い、変異処理された野生型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子のプールを
調製した。この変異処理を受けた遺伝子プールをｐＶ８
ＲＰＴ（−）上の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子と置換し、大腸菌ＪＭ１０１に形質転換を
行ない、多数の組換え体を得た。これらの組換え体を培
養し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（以下ＩＰＴＧ）を添加し融合蛋白の遺伝子発現を行な
った。培養液に最終濃度が約５Ｍになるように尿素を添
加した後、本酵素の合成基質であるZ-Phe-Leu-Glu-4-ni
troanilideを用いて酵素反応を行なった。
【００１６】約７００株の組換え体をスクリーングした
結果、上記の反応条件で酵素活性を有する４株の組換え
体Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８株が得られた。これらの変
異株を用い５Ｍ尿素存在下での酵素活性を天然型Ｖ８プ
ロテアーゼと比較したところ、いずれも天然型Ｖ８プロ
テアーゼよりはるかに高い尿素抵抗性を示した。
結果、上記の反応条件で酵素活性を有する４株の組換え
体Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８株が得られた。これらの変
異株を用い５Ｍ尿素存在下での酵素活性を天然型Ｖ８プ
ロテアーゼと比較したところ、いずれも天然型Ｖ８プロ
テアーゼよりはるかに高い尿素抵抗性を示した。
【００１７】更にこれらの組換え体よりプラスミドを単
離し、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝
子のＤＮＡ塩基配列を決定したところ、Ｕ１株では１４
７番目のアミノ酸のリジンがアルギニンに、Ｕ５株では
７１番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに、Ｕ７株
では７１番目のアミノ酸のアスパラギンがセリン及び１
４７番目のアミノ酸のリジンがアルギニンに、Ｕ８株で
は４４番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグルタミン酸
に置換される変異を起こしていた。すなわちアミノ酸置
換として３種類が得られ、とくにＵ７株由来のものはＵ
１株とＵ５株由来のアミノ酸置換を組み合わせた２重変
異であることが明らかとなった。
離し、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝
子のＤＮＡ塩基配列を決定したところ、Ｕ１株では１４
７番目のアミノ酸のリジンがアルギニンに、Ｕ５株では
７１番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに、Ｕ７株
では７１番目のアミノ酸のアスパラギンがセリン及び１
４７番目のアミノ酸のリジンがアルギニンに、Ｕ８株で
は４４番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグルタミン酸
に置換される変異を起こしていた。すなわちアミノ酸置
換として３種類が得られ、とくにＵ７株由来のものはＵ
１株とＵ５株由来のアミノ酸置換を組み合わせた２重変
異であることが明らかとなった。
【００１８】野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）が尿素耐性を示すには上記の位置のアミノ酸変異
が必要であることが本発明者等により始めて明らかにさ
れた。これらのアミノ酸の位置はＶ８プロテアーゼ蛋白
の構造を保つうえで重要な位置と考えられる。従って、
これらの位置に他のアミノ酸を導入することにより本発
明に係る酵素の蛋白構造が変化し、尿素耐性が上がるこ
とが十分に考えられる。
（−）が尿素耐性を示すには上記の位置のアミノ酸変異
が必要であることが本発明者等により始めて明らかにさ
れた。これらのアミノ酸の位置はＶ８プロテアーゼ蛋白
の構造を保つうえで重要な位置と考えられる。従って、
これらの位置に他のアミノ酸を導入することにより本発
明に係る酵素の蛋白構造が変化し、尿素耐性が上がるこ
とが十分に考えられる。
【００１９】得られた変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｒ
ＰＴ（−）において、２重変異を持つＵ７株由来のもの
が最も尿素耐性に優れていることから、本発明者等は、
上記の３種類の変異を組み合わせて野生型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子に導入すれば、個々の変
異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）が示す尿素耐
性より更に耐性が増すのではないかと考え、３重変異を
有する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝
子を作製し、その融合蛋白を発現させて尿素耐性を検討
した。その結果、３重変異を有する変異型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）は、個々の変異型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）より高い尿素耐性を示すことが
明らかになった。
ＰＴ（−）において、２重変異を持つＵ７株由来のもの
が最も尿素耐性に優れていることから、本発明者等は、
上記の３種類の変異を組み合わせて野生型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子に導入すれば、個々の変
異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）が示す尿素耐
性より更に耐性が増すのではないかと考え、３重変異を
有する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝
子を作製し、その融合蛋白を発現させて尿素耐性を検討
した。その結果、３重変異を有する変異型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）は、個々の変異型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）より高い尿素耐性を示すことが
明らかになった。
【００２０】次に、本発明者等は上記の変異型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体の生産について検討した。この際、変異
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）とはＣ末端のア
ミノ酸配列が異なる変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあ
るいは同Ｆを用い、まずそれらを不活性な封入体として
発現させ、その後、活性ある変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体Ｄあるいは同Ｆを得る方法による生産を試みた。こ
れは変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）では発
現量が低く生産には不利なことによる。なお変異型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体Ｄおよび同Ｆを作製するにあたり使
用した野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ及び同Ｆは、そ
れぞれ天然型Ｖ８プロテアーゼのＣ末端の５６アミノ酸
及び５３アミノ酸を欠く誘導体である。
テアーゼ誘導体の生産について検討した。この際、変異
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）とはＣ末端のア
ミノ酸配列が異なる変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあ
るいは同Ｆを用い、まずそれらを不活性な封入体として
発現させ、その後、活性ある変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体Ｄあるいは同Ｆを得る方法による生産を試みた。こ
れは変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）では発
現量が低く生産には不利なことによる。なお変異型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体Ｄおよび同Ｆを作製するにあたり使
用した野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ及び同Ｆは、そ
れぞれ天然型Ｖ８プロテアーゼのＣ末端の５６アミノ酸
及び５３アミノ酸を欠く誘導体である。
【００２１】野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ及び野生
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆを発現させるプラスミドで
あるｐＶ８Ｄ又はｐＶ８Ｆに変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体遺伝子を組み込み、培養後、大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ誘導体、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあるい
は同Ｆ、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフ
ェラーゼ誘導体 （ｔＡＰＴ）からなる不溶性の融合蛋
白を回収し、大腸菌の内因性ｏｍｐＴプロテアーゼによ
る融合蛋白の切断を尿素存在下に行い、変異型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体Ｄあるいは同Ｆを上記融合蛋白から切り
出した。その後、各種の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｄあるいは同Ｆをリフォールディング工程、精製クロマ
ト工程を経てを精製し工業スケールで生産が可能である
ことを示した。
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆを発現させるプラスミドで
あるｐＶ８Ｄ又はｐＶ８Ｆに変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体遺伝子を組み込み、培養後、大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ誘導体、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあるい
は同Ｆ、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフ
ェラーゼ誘導体 （ｔＡＰＴ）からなる不溶性の融合蛋
白を回収し、大腸菌の内因性ｏｍｐＴプロテアーゼによ
る融合蛋白の切断を尿素存在下に行い、変異型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体Ｄあるいは同Ｆを上記融合蛋白から切り
出した。その後、各種の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｄあるいは同Ｆをリフォールディング工程、精製クロマ
ト工程を経てを精製し工業スケールで生産が可能である
ことを示した。
【００２２】さらに精製した各種の変異型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体Ｄ又は同Ｆを用い、各種の蛋白変性をもたら
す環境条件下、例えば、尿素存在下、ＳＤＳ存在下及び
高温における条件下における野性型との比較検討を行っ
た。その結果、変異型は野性型に比べ尿素及びＳＤＳに
よる失活速度が減少し、これらの変性剤に対する耐性を
示すことが明らかになった。
ーゼ誘導体Ｄ又は同Ｆを用い、各種の蛋白変性をもたら
す環境条件下、例えば、尿素存在下、ＳＤＳ存在下及び
高温における条件下における野性型との比較検討を行っ
た。その結果、変異型は野性型に比べ尿素及びＳＤＳに
よる失活速度が減少し、これらの変性剤に対する耐性を
示すことが明らかになった。
【００２３】３重変異を持つ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体ＦであるＶ８Ｆ１５８は５Ｍ尿素存在下においても
天然型Ｖ８プロテアーゼより安定に酵素活性を有するこ
とから、融合蛋白からのペプチドの切断実験を行った。
融合蛋白としては保護ペプチド（β−ｇａｌ９７Ｓ４
Ｄ）とヒトＣ型心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ
−２２）がリンカーペプチドを介して融合され、Ｖ８プ
ロテアーゼによりＣＮＰが遊離される構造を有するβ−
ｇａｌ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３を用いた。
導体ＦであるＶ８Ｆ１５８は５Ｍ尿素存在下においても
天然型Ｖ８プロテアーゼより安定に酵素活性を有するこ
とから、融合蛋白からのペプチドの切断実験を行った。
融合蛋白としては保護ペプチド（β−ｇａｌ９７Ｓ４
Ｄ）とヒトＣ型心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ
−２２）がリンカーペプチドを介して融合され、Ｖ８プ
ロテアーゼによりＣＮＰが遊離される構造を有するβ−
ｇａｌ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３を用いた。
【００２４】５Ｍ尿素存在下にＶ８Ｆ１５８と天然型Ｖ
８プロテアーゼのヒトＣ型心房性ナトリウム利尿ペプチ
ド融合蛋白に対する切断効率を検討した結果、Ｖ８Ｆ１
５８の方が非常に高い切断効率で上記融合蛋白を切断で
きることを実証した。本発明者等の実施例から変異型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５およびＶ
８Ｆ８）は野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆに比べ、５
Ｍ尿素濃度及び０．１％ＳＤＳ存在下の酵素反応におい
て変性剤に対する耐性を示すことが明らかになった。し
かし、高温（５０℃）での酵素反応の比較においては変
異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ８（Ｖ８Ｆ８）は野性型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）に比べて熱安定性
が低くなっていた。
８プロテアーゼのヒトＣ型心房性ナトリウム利尿ペプチ
ド融合蛋白に対する切断効率を検討した結果、Ｖ８Ｆ１
５８の方が非常に高い切断効率で上記融合蛋白を切断で
きることを実証した。本発明者等の実施例から変異型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５およびＶ
８Ｆ８）は野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆに比べ、５
Ｍ尿素濃度及び０．１％ＳＤＳ存在下の酵素反応におい
て変性剤に対する耐性を示すことが明らかになった。し
かし、高温（５０℃）での酵素反応の比較においては変
異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ８（Ｖ８Ｆ８）は野性型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）に比べて熱安定性
が低くなっていた。
【００２５】尿素と高温という蛋白変性条件の違いによ
り、それら変性条件に対する酵素の抵抗性に異なる結果
が得られたが、変異部位のアミノ酸残基が当該蛋白の高
次構造を保つのに重要であることを改めて示唆する結果
であるといえる。従って、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導
体Ｆ８（Ｖ８Ｆ８）の変異位置のアミノ酸を他のアミノ
酸に置換すれば、温度に対する抵抗性があがると当業者
にとり容易に推測できると考えられることから、本発明
の有用性をそこなうものではない。
り、それら変性条件に対する酵素の抵抗性に異なる結果
が得られたが、変異部位のアミノ酸残基が当該蛋白の高
次構造を保つのに重要であることを改めて示唆する結果
であるといえる。従って、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導
体Ｆ８（Ｖ８Ｆ８）の変異位置のアミノ酸を他のアミノ
酸に置換すれば、温度に対する抵抗性があがると当業者
にとり容易に推測できると考えられることから、本発明
の有用性をそこなうものではない。
【００２６】本発明者等は、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体及び天然型Ｖ８プ
ロテアーゼについて、蛋白変性をもたらす環境条件下に
おける酵素活性を比較することで、変異型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体の有用性を証明した。本発明者等により得ら
れた結果から、これらの変異を天然型Ｖ８プロテアーゼ
に導入すれば蛋白変性をもたらす環境条件下においても
天然型と同等以上の酵素活性を有することは当業者に容
易に推測できることである。従って、本発明に係る酵素
蛋白は、蛋白変性もたらすような環境条件においても酵
素活性を示す変異型Ｖ８プロテアーゼであり、望ましく
は当該プロテアーゼが天然型Ｖ８プロテアーゼ中に少な
くとも１つ以上の変異部位を有することを特徴とするプ
ロテアーゼである。
導体、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体及び天然型Ｖ８プ
ロテアーゼについて、蛋白変性をもたらす環境条件下に
おける酵素活性を比較することで、変異型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体の有用性を証明した。本発明者等により得ら
れた結果から、これらの変異を天然型Ｖ８プロテアーゼ
に導入すれば蛋白変性をもたらす環境条件下においても
天然型と同等以上の酵素活性を有することは当業者に容
易に推測できることである。従って、本発明に係る酵素
蛋白は、蛋白変性もたらすような環境条件においても酵
素活性を示す変異型Ｖ８プロテアーゼであり、望ましく
は当該プロテアーゼが天然型Ｖ８プロテアーゼ中に少な
くとも１つ以上の変異部位を有することを特徴とするプ
ロテアーゼである。
【００２７】また、更に具体的に好ましい態様としては
変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４
番目のアスパラギン酸、７１番目のアスパラギン及び／
又は１４７番目のリジンの部位であることを特徴とする
プロテアーゼであり、この場合、変異部位を１箇所、２
箇所乃至３箇所有する場合等が挙げられる。
変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４
番目のアスパラギン酸、７１番目のアスパラギン及び／
又は１４７番目のリジンの部位であることを特徴とする
プロテアーゼであり、この場合、変異部位を１箇所、２
箇所乃至３箇所有する場合等が挙げられる。
【００２８】そして、最も好ましい態様としては、 （１）変異部位が１箇所である場合、当該変異部位が天
然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４番目のアスパ
ラギン酸がグルタミン酸に置換された場合、７１番目の
アスパラギンがセリンに置換された場合又は１４７番目
のリジンがアルギニンに置換された場合等が挙げられ、
然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４番目のアスパ
ラギン酸がグルタミン酸に置換された場合、７１番目の
アスパラギンがセリンに置換された場合又は１４７番目
のリジンがアルギニンに置換された場合等が挙げられ、
【００２９】（２）変異部位が２箇所である場合、当該
変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４
番目のアスパラギン酸及び７１番目のアスパラギンの部
位である場合（この場合、特に好ましのは４４番目のア
スパラギン酸がグルタミン酸に、及び７１番目のアスパ
ラギンがセリンに置換された場合が挙げられる）、４４
番目のアスパラギン酸及び１４７番目のリジンの部位で
ある場合（この場合、特に好ましのは４４番目のアスパ
ラギン酸がグルタミン酸に、及び１４７番目のリジンが
アルギニンに置換された場合が挙げられる）、又は７１
番目のアスパラギン及び１４７番目のリジンの部位であ
る場合（この場合、特に好ましのは７１番目のアスパラ
ギンがセリンに、及び１４７番目のリジンがアルギニン
に置換された場合）等が挙げられ、
変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４
番目のアスパラギン酸及び７１番目のアスパラギンの部
位である場合（この場合、特に好ましのは４４番目のア
スパラギン酸がグルタミン酸に、及び７１番目のアスパ
ラギンがセリンに置換された場合が挙げられる）、４４
番目のアスパラギン酸及び１４７番目のリジンの部位で
ある場合（この場合、特に好ましのは４４番目のアスパ
ラギン酸がグルタミン酸に、及び１４７番目のリジンが
アルギニンに置換された場合が挙げられる）、又は７１
番目のアスパラギン及び１４７番目のリジンの部位であ
る場合（この場合、特に好ましのは７１番目のアスパラ
ギンがセリンに、及び１４７番目のリジンがアルギニン
に置換された場合）等が挙げられ、
【００３０】（３）変異部位が３箇所である場合、当該
変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４
番目のアスパラギン酸、７１番目のアスパラギン及び１
４７番目のリジンの部位である場合（この場合、特に好
ましのは４４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、
７１番目のアスパラギンがセリンに、及び１４７番目の
リジンがアルギニンに置換された場合）等が挙げられ
る。
変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４
番目のアスパラギン酸、７１番目のアスパラギン及び１
４７番目のリジンの部位である場合（この場合、特に好
ましのは４４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、
７１番目のアスパラギンがセリンに、及び１４７番目の
リジンがアルギニンに置換された場合）等が挙げられ
る。
【００３１】上記の変異型Ｖ８プロテアーゼをコードす
る遺伝子の作製法としては、S. aureus から遺伝子を単
離する方法、例えば報告されている天然型Ｖ８プロテア
ーゼ遺伝子配列からプライマーをデザインし、S. aureu
s の遺伝子バンクから単離する方法、または本発明者等
が行ったＰＣＲ法などが挙げられる。さらに、明らかに
なっているS. aureus の天然型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子
配列から遺伝子を化学合成することも可能であることは
言うまでもない。
る遺伝子の作製法としては、S. aureus から遺伝子を単
離する方法、例えば報告されている天然型Ｖ８プロテア
ーゼ遺伝子配列からプライマーをデザインし、S. aureu
s の遺伝子バンクから単離する方法、または本発明者等
が行ったＰＣＲ法などが挙げられる。さらに、明らかに
なっているS. aureus の天然型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子
配列から遺伝子を化学合成することも可能であることは
言うまでもない。
【００３２】本明細書においてはＰＣＲ法で変異型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体遺伝子を作製したが、変異方法とし
ては従来から知られている方法、例えばin vivo 法（変
異誘発剤処理、紫外線及び放射線処理等）、種々のin v
itro変異法を用い変異遺伝子を作製することができる。
また、所謂自然突然変異選択法でも本発明に係る方法で
変異株を選択できる。
プロテアーゼ誘導体遺伝子を作製したが、変異方法とし
ては従来から知られている方法、例えばin vivo 法（変
異誘発剤処理、紫外線及び放射線処理等）、種々のin v
itro変異法を用い変異遺伝子を作製することができる。
また、所謂自然突然変異選択法でも本発明に係る方法で
変異株を選択できる。
【００３３】蛋白の変性をもたらす酵素反応条件として
は尿素、ＳＤＳを含む反応液及び高温（例えば４５℃以
上）での酵素反応が上げられる、その他の蛋白変性剤と
しては塩酸グアニジンや界面活性剤等が挙げられる。蛋
白変性作用を持つ酵素反応条件としては尿素の場合２〜
５Ｍ、塩酸グアニジンの場合０、０１〜６Ｍ、ＳＤＳの
場合０、０１〜１０％、温度の場合４５〜６５℃等が挙
げられる。
は尿素、ＳＤＳを含む反応液及び高温（例えば４５℃以
上）での酵素反応が上げられる、その他の蛋白変性剤と
しては塩酸グアニジンや界面活性剤等が挙げられる。蛋
白変性作用を持つ酵素反応条件としては尿素の場合２〜
５Ｍ、塩酸グアニジンの場合０、０１〜６Ｍ、ＳＤＳの
場合０、０１〜１０％、温度の場合４５〜６５℃等が挙
げられる。
【００３４】本発明に係る蛋白変性をもたらす環境条件
下においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼ
遺伝子の発現方法としては以下の方法が挙げられる。本
明細書の実施例においては大腸菌を宿主細胞として用い
たが、宿主細胞としては原核細胞においてはブドウ球
菌、サルモネラ菌、放線菌、枯草菌等を挙げることがで
き、また、真核細胞においては糸状菌、酵母、昆虫細
胞、動物細胞等の宿主細胞を挙げることができる。これ
らの宿主細胞に通常用いられている形質転換法により、
変異型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子を導入することができ
る。
下においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼ
遺伝子の発現方法としては以下の方法が挙げられる。本
明細書の実施例においては大腸菌を宿主細胞として用い
たが、宿主細胞としては原核細胞においてはブドウ球
菌、サルモネラ菌、放線菌、枯草菌等を挙げることがで
き、また、真核細胞においては糸状菌、酵母、昆虫細
胞、動物細胞等の宿主細胞を挙げることができる。これ
らの宿主細胞に通常用いられている形質転換法により、
変異型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子を導入することができ
る。
【００３５】形質転換に用いる発現プラスミドとして
は、その宿主細胞で機能的に下流の遺伝子発現をコント
ロールできるプロモーターを有し、直接発現法や所謂融
合蛋白発現法などを行える発現プラスミドが望ましい。
また、ベクターとして遺伝子相同組換えを行えるベクタ
ーを用い、適当な宿主細胞の染色体に当該遺伝子を組み
込み、当該蛋白を発現させることも可能である。さらに
は、当該遺伝子を組み込んだウイルスやファージを宿主
細胞に感染させ当該遺伝子を発現させる方法も可能であ
る。
は、その宿主細胞で機能的に下流の遺伝子発現をコント
ロールできるプロモーターを有し、直接発現法や所謂融
合蛋白発現法などを行える発現プラスミドが望ましい。
また、ベクターとして遺伝子相同組換えを行えるベクタ
ーを用い、適当な宿主細胞の染色体に当該遺伝子を組み
込み、当該蛋白を発現させることも可能である。さらに
は、当該遺伝子を組み込んだウイルスやファージを宿主
細胞に感染させ当該遺伝子を発現させる方法も可能であ
る。
【００３６】また、本発明に係る蛋白変性をもたらす環
境条件下においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテ
アーゼの製造方法に関して、本発明者等は非常に効率よ
い製造方法を実施例で示したが、この方法に限定される
だけでなく、既に知られている一般の遺伝子組換え技術
により製造することができる。
境条件下においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテ
アーゼの製造方法に関して、本発明者等は非常に効率よ
い製造方法を実施例で示したが、この方法に限定される
だけでなく、既に知られている一般の遺伝子組換え技術
により製造することができる。
【００３７】例えば、上述の発現方法を用いて（１）宿
主細胞内で当該蛋白のＮ末端から直接発現させ可溶性あ
るいは不溶性蛋白として分離精製する製造する方法
（２）宿主細胞内で融合蛋白として当該蛋白を可溶性あ
るいは不溶性融合蛋白として発現させ、プロセッシング
酵素が切断できる条件で融合蛋白を切断し、当該蛋白を
分離精製する製造方法、（３）宿主細胞外に当該蛋白を
分泌させ、当該蛋白を分離精製する製造方法、（４）宿
主菌のペリプラスムに可溶性及び不溶性の蛋白として当
該蛋白を分離精製する製造方法等が挙げられる。当該蛋
白を直接発現法及び融合蛋白法で発現させる場合、不溶
性蛋白になった場合には適当なリフォールディング工程
を経て分離精製し製造することは言うまでもない。
主細胞内で当該蛋白のＮ末端から直接発現させ可溶性あ
るいは不溶性蛋白として分離精製する製造する方法
（２）宿主細胞内で融合蛋白として当該蛋白を可溶性あ
るいは不溶性融合蛋白として発現させ、プロセッシング
酵素が切断できる条件で融合蛋白を切断し、当該蛋白を
分離精製する製造方法、（３）宿主細胞外に当該蛋白を
分泌させ、当該蛋白を分離精製する製造方法、（４）宿
主菌のペリプラスムに可溶性及び不溶性の蛋白として当
該蛋白を分離精製する製造方法等が挙げられる。当該蛋
白を直接発現法及び融合蛋白法で発現させる場合、不溶
性蛋白になった場合には適当なリフォールディング工程
を経て分離精製し製造することは言うまでもない。
【００３８】本明細書の実施例においては、本発明に係
る変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体の精製の為に、リフォ
ールディング後、疎水性クロマトグラフィーを用いてい
るが、他の精製方法でも、例えばゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー等の通常の蛋白の精製操作により高
純度に精製できる。更に、リフォールディング反応終了
時には当該酵素蛋白が活性化され夾雑蛋白を分解してい
まい、その結果、反応終了後の主要蛋白成分が変異型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体であることから、精製が非常に容
易であることは述べるまでもない。
る変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体の精製の為に、リフォ
ールディング後、疎水性クロマトグラフィーを用いてい
るが、他の精製方法でも、例えばゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー等の通常の蛋白の精製操作により高
純度に精製できる。更に、リフォールディング反応終了
時には当該酵素蛋白が活性化され夾雑蛋白を分解してい
まい、その結果、反応終了後の主要蛋白成分が変異型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体であることから、精製が非常に容
易であることは述べるまでもない。
【００３９】
【実施例】以下に実施例により本発明を詳細に説明す
る。実施例１ 野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）
遺伝子の単離 ＰＣＲ 法により野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子の単離を行った。図１（ｂ）に示す配列を
持つ２種のＰＣＲプライマーを設計し、ＤＮＡ合成機
（アプライド・バイオシステム社製３９２型）により合
成した。プライマーＡ及びＢは、図１（ａ）に示すＶ８
プロテアーゼ遺伝子領域に対応し、各々の５’側にはXh
o I あるいはSal I 制限酵素認識配列を設けている。
る。実施例１ 野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）
遺伝子の単離 ＰＣＲ 法により野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子の単離を行った。図１（ｂ）に示す配列を
持つ２種のＰＣＲプライマーを設計し、ＤＮＡ合成機
（アプライド・バイオシステム社製３９２型）により合
成した。プライマーＡ及びＢは、図１（ａ）に示すＶ８
プロテアーゼ遺伝子領域に対応し、各々の５’側にはXh
o I あるいはSal I 制限酵素認識配列を設けている。
【００４０】Jayaswal, R. K. ら（J. Bacteriol. 172:
5783-5788 (1990)）の方法により単離調製したS. aureu
s Ｖ８株（ATCC27733 ）の染色体とこれらのＰＣＲプラ
イマーを用いてＰＣＲを行った。1.0 μＭのプライマ
ー、１μｇの染色体ＤＮＡ、50mM KCl、10mM Tris-HCl,
pH8.3、1.5mM MgCl2 、0.01% ゼラチン、200 μＭのdN
TP（dATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物）を含む50μl の
反応液に2.5 ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添
加し、９４℃・１分、７２℃・２分、５５℃・２分のＰ
ＣＲを３０サイクル行った。その結果、プレプロ配列及
びＣ末端の４８アミノ酸を欠く野生型Ｖ８プロテアーゼ
誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子が得られた。
5783-5788 (1990)）の方法により単離調製したS. aureu
s Ｖ８株（ATCC27733 ）の染色体とこれらのＰＣＲプラ
イマーを用いてＰＣＲを行った。1.0 μＭのプライマ
ー、１μｇの染色体ＤＮＡ、50mM KCl、10mM Tris-HCl,
pH8.3、1.5mM MgCl2 、0.01% ゼラチン、200 μＭのdN
TP（dATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物）を含む50μl の
反応液に2.5 ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添
加し、９４℃・１分、７２℃・２分、５５℃・２分のＰ
ＣＲを３０サイクル行った。その結果、プレプロ配列及
びＣ末端の４８アミノ酸を欠く野生型Ｖ８プロテアーゼ
誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子が得られた。
【００４１】次に、これらの遺伝子を寒天ゲル電気泳動
し、SUPREP-2（宝酒造（株））を用いて精製した後、制
限酵素Xho I 及びSal I で切断し、Xho I 、Sal I の粘
着末端をもつ野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子断片を調製した。
し、SUPREP-2（宝酒造（株））を用いて精製した後、制
限酵素Xho I 及びSal I で切断し、Xho I 、Sal I の粘
着末端をもつ野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子断片を調製した。
【００４２】実施例２ 発現ベクターｐＶ８ＲＰＴ
（−） の作製及び野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰ
Ｔ（−）の発現 本実施例で用いるｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６（Ap
pl. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42, 703-708 ）
は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体とヒトカルシト
ニン前駆体（ｈＣＴ〔Ｇ〕）との融合蛋白質を高発現す
るプラスミドであり、当該プラスミドはプラスミドｐＢ
Ｒ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕より
作製することができる（図２）。
（−） の作製及び野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰ
Ｔ（−）の発現 本実施例で用いるｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６（Ap
pl. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42, 703-708 ）
は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体とヒトカルシト
ニン前駆体（ｈＣＴ〔Ｇ〕）との融合蛋白質を高発現す
るプラスミドであり、当該プラスミドはプラスミドｐＢ
Ｒ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕より
作製することができる（図２）。
【００４３】なお、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕を含有する大腸菌Ｗ３１１０株はブダペスト条約
に基づいて工業技術院生命工学技術研究所にEschericha
i coliSBM323 として１９９１年８月８日に寄託されて
おり、受託番号微工研条寄第３５０３号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３５０３）が付与されている。
〔Ｇ〕を含有する大腸菌Ｗ３１１０株はブダペスト条約
に基づいて工業技術院生命工学技術研究所にEschericha
i coliSBM323 として１９９１年８月８日に寄託されて
おり、受託番号微工研条寄第３５０３号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３５０３）が付与されている。
【００４４】ＰＣＲにより得られた野生型Ｖ８プロテア
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を発現させるため、ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６をXho I 及びSal I で処理
し、ヒトカルシトニン前駆体遺伝子部を欠いたＤＮＡ断
片（3.1kb ）を寒天ゲル電気泳動により調製した。この
ＤＮＡ 断片と先に得られたXho I 、Sal I の粘着末端
をもつ野生型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより連結し、ＪＭ１０１（本菌株は、例えば
Stratagene社等より入手できる）に形質転換を行い、ｐ
Ｖ８ＲＰＴ（−）を作製した（図３）。このプラスミド
より発現される野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）とβ−ガラクトシダーゼ誘導体との融合蛋白質
（βG97V8RPT(-) ) のアミノ酸配列を図４に示す。
ーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を発現させるため、ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６をXho I 及びSal I で処理
し、ヒトカルシトニン前駆体遺伝子部を欠いたＤＮＡ断
片（3.1kb ）を寒天ゲル電気泳動により調製した。この
ＤＮＡ 断片と先に得られたXho I 、Sal I の粘着末端
をもつ野生型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより連結し、ＪＭ１０１（本菌株は、例えば
Stratagene社等より入手できる）に形質転換を行い、ｐ
Ｖ８ＲＰＴ（−）を作製した（図３）。このプラスミド
より発現される野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）とβ−ガラクトシダーゼ誘導体との融合蛋白質
（βG97V8RPT(-) ) のアミノ酸配列を図４に示す。
【００４５】ＪＭ１０１／ｐＶ８ＲＰＴ（−）を１００
ｍｌのＬＢ培地（0.5 ％酵母エキス、1.0 ％トリプト
ン、0.5 ％NaCl）を用い３７℃でＯＤ６６０が１．０に
なるまで培養後、ＩＰＴＧを最終濃度が２ｍＭになるよ
うに添加し発現の誘導を行った。添加後さらに２時間培
養を継続した後、菌体を遠心分離により回収し、ＯＤ６
６０が５となるようにＴＥバッファー（10mM Tris-HCl
(pH8.0),1mM EDTA ）に懸濁した。当該懸濁液を超音波
破砕機（Cellruptor; 東湘電気（株））で破砕後、1200
0rpm、５分の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清
画分を粗酵素液として使用した。
ｍｌのＬＢ培地（0.5 ％酵母エキス、1.0 ％トリプト
ン、0.5 ％NaCl）を用い３７℃でＯＤ６６０が１．０に
なるまで培養後、ＩＰＴＧを最終濃度が２ｍＭになるよ
うに添加し発現の誘導を行った。添加後さらに２時間培
養を継続した後、菌体を遠心分離により回収し、ＯＤ６
６０が５となるようにＴＥバッファー（10mM Tris-HCl
(pH8.0),1mM EDTA ）に懸濁した。当該懸濁液を超音波
破砕機（Cellruptor; 東湘電気（株））で破砕後、1200
0rpm、５分の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清
画分を粗酵素液として使用した。
【００４６】Ｖ８プロテアーゼの活性測定には合成基質
（Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide；ベーリンガーマンハ
イム社製）を用いた。940 μl の100mM Tris-HCl（pH8.
0 ）緩衝液に20μl の10mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanil
ide 溶液（ＤＭＳＯ溶液）を混合後、40μl の粗酵素液
を添加し、室温５分間の反応による405nm の吸収増加を
測定した。測定には日立分光光度計U-3200を使用した。
（Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide；ベーリンガーマンハ
イム社製）を用いた。940 μl の100mM Tris-HCl（pH8.
0 ）緩衝液に20μl の10mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanil
ide 溶液（ＤＭＳＯ溶液）を混合後、40μl の粗酵素液
を添加し、室温５分間の反応による405nm の吸収増加を
測定した。測定には日立分光光度計U-3200を使用した。
【００４７】その結果、ＪＭ１０１／ｐＶ８ＲＰＴ
（−）においては、それらの菌体より調製した粗酵素液
には８μｇ／ｍｌの天然型Ｖ８プロテアーゼに相当する
活性が認められ、β−ガラクトシダーゼ誘導体との融合
蛋白質の形で、かつプレプロ配列及びＣ末端リピート配
列を欠いた状態で活性があることが判明した。
（−）においては、それらの菌体より調製した粗酵素液
には８μｇ／ｍｌの天然型Ｖ８プロテアーゼに相当する
活性が認められ、β−ガラクトシダーゼ誘導体との融合
蛋白質の形で、かつプレプロ配列及びＣ末端リピート配
列を欠いた状態で活性があることが判明した。
【００４８】実施例３ ＰＣＲによるＶ８プロテアーゼ
誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子の変異処理 尿素に対して耐性を持つＶ８プロテアーゼを得るため、
ＰＣＲにより野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子を変異処理した。実施例２で得られたｐＶ
８ＲＰＴ（−）（図３）は、Ｃ末端の４８アミノ酸が欠
失した野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体（Ｖ８ＲＰＴ
（−））を、大腸菌βーガラクトシダーゼ誘導体（β−
ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）との融合蛋白質として発現するプラ
スミドであり、菌体内の可溶性画分に発現した融合蛋白
質（以後、本融合蛋白質をβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）と
表記する）はＶ８プロテアーゼ活性を持つ。
誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子の変異処理 尿素に対して耐性を持つＶ８プロテアーゼを得るため、
ＰＣＲにより野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）遺伝子を変異処理した。実施例２で得られたｐＶ
８ＲＰＴ（−）（図３）は、Ｃ末端の４８アミノ酸が欠
失した野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体（Ｖ８ＲＰＴ
（−））を、大腸菌βーガラクトシダーゼ誘導体（β−
ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）との融合蛋白質として発現するプラ
スミドであり、菌体内の可溶性画分に発現した融合蛋白
質（以後、本融合蛋白質をβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）と
表記する）はＶ８プロテアーゼ活性を持つ。
【００４９】当該プラスミドのβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ
（−）遺伝子に対し、図５（ａ）に示すプライマーを用
いて、ＰＣＲを行った（図５（ｂ））。１μmol のプラ
イマー、50ngのｐＶ８ＲＰＴ（−）、50mM KCl、10mM T
ris-HCl (pH8.3) 、1.5mM MgCl2、0.01% ゼラチン、10%
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、各1mＭの dGTP,
dCTP, dTTP 、200 μＭ dATP を含む50μl の反応液に
２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加し、
９４℃・１分、７２℃・２分、５５℃・２分のＰＣＲを
３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物（１Ｋｂｐ）
はクロロホルム処理、エタノール沈殿処理の後、50μl
のＴＥバッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0),1mM EDTA
）に溶解した。
（−）遺伝子に対し、図５（ａ）に示すプライマーを用
いて、ＰＣＲを行った（図５（ｂ））。１μmol のプラ
イマー、50ngのｐＶ８ＲＰＴ（−）、50mM KCl、10mM T
ris-HCl (pH8.3) 、1.5mM MgCl2、0.01% ゼラチン、10%
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、各1mＭの dGTP,
dCTP, dTTP 、200 μＭ dATP を含む50μl の反応液に
２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加し、
９４℃・１分、７２℃・２分、５５℃・２分のＰＣＲを
３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物（１Ｋｂｐ）
はクロロホルム処理、エタノール沈殿処理の後、50μl
のＴＥバッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0),1mM EDTA
）に溶解した。
【００５０】実施例４ 尿素耐性をもつ変異型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）のスクリーニング（１次ス
クリーニング） 実施例３で得られたＰＣＲ産物を制限酵素Bgl II及びSa
l I で切断後、変異処理を受けた野生型Ｖ８プロテアー
ゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を含む0.8KbpのＤＮＡ断片
を0.8 ％アガロースゲル電気泳動の後単離し、これをラ
イゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて、ｐＶ
８ＲＰＴ（−）由来のBgl II-Sal I 3.0Kbp 断片と連結
した（図６）。反応終了後、塩化カルシウム法により大
腸菌ＪＭ１０１（本菌株はIn Vitrogen Catalog No. c6
60-00 より入手可）に形質転換し、10μg/mlのテトラサ
イクリンを含むＬＢ寒天培地（1 ％トリプトン、0.5 ％
酵母エキス、0.5 ％NaCl、1.5 ％寒天）で形質転換体を
取得した。なお、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳
動、形質転換の各操作は常法に従った。
テアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）のスクリーニング（１次ス
クリーニング） 実施例３で得られたＰＣＲ産物を制限酵素Bgl II及びSa
l I で切断後、変異処理を受けた野生型Ｖ８プロテアー
ゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を含む0.8KbpのＤＮＡ断片
を0.8 ％アガロースゲル電気泳動の後単離し、これをラ
イゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて、ｐＶ
８ＲＰＴ（−）由来のBgl II-Sal I 3.0Kbp 断片と連結
した（図６）。反応終了後、塩化カルシウム法により大
腸菌ＪＭ１０１（本菌株はIn Vitrogen Catalog No. c6
60-00 より入手可）に形質転換し、10μg/mlのテトラサ
イクリンを含むＬＢ寒天培地（1 ％トリプトン、0.5 ％
酵母エキス、0.5 ％NaCl、1.5 ％寒天）で形質転換体を
取得した。なお、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳
動、形質転換の各操作は常法に従った。
【００５１】次に、5 mg/ml グリセリン、6 mg/ml Na2H
PO4 、3 mg/ml KH2PO4、0.5 mg/mlNaCl、1.0mg/ml NH4C
l、2 mM MgSO4・7H2O、0.1mM CaCl2 , 40μg/mlの各ア
ミノ酸（２０種類）、1 μg/ml塩酸チアミン、5 μg/ml
テトラサイクリンを含む培地（pH 7.4）を調製し、９６
ウェル培養プレート（コーニング社製；製品番号25860
）に50μl ずつ分注した。この培地に先の形質転換体
を1 株ずつ接種し、３７℃で培養した。１晩静置培養
後、各ウェルに同組成の新鮮な培地を50μl 分注し、さ
らに３７℃で３時間静置培養した。その後、50mMのＩＰ
ＴＧ溶液を10μl 分注し、３７℃で１時間、遺伝子発現
を誘導した。
PO4 、3 mg/ml KH2PO4、0.5 mg/mlNaCl、1.0mg/ml NH4C
l、2 mM MgSO4・7H2O、0.1mM CaCl2 , 40μg/mlの各ア
ミノ酸（２０種類）、1 μg/ml塩酸チアミン、5 μg/ml
テトラサイクリンを含む培地（pH 7.4）を調製し、９６
ウェル培養プレート（コーニング社製；製品番号25860
）に50μl ずつ分注した。この培地に先の形質転換体
を1 株ずつ接種し、３７℃で培養した。１晩静置培養
後、各ウェルに同組成の新鮮な培地を50μl 分注し、さ
らに３７℃で３時間静置培養した。その後、50mMのＩＰ
ＴＧ溶液を10μl 分注し、３７℃で１時間、遺伝子発現
を誘導した。
【００５２】次に、10mg/ml のリゾチーム水溶液を30μ
l 添加し、１０分放置後、0.1 ％トリトンX-100, 5mM E
DTA (pH8.0) を含む溶液を30μl 添加し、溶菌処理を行
った。続いて、10M 尿素を含む0.1M Tris-HCl (pH8.0)
を160 μl 添加し（最終尿素濃度4.85M ）、３０℃で３
０分間放置後、10μl の20mMの Z-Phe-Leu-Glu-4-nitro
anilide （ベーリンガーマンハイム社製）を含むＤＭＳ
Ｏ溶液を添加し、３０℃で１晩反応させた。
l 添加し、１０分放置後、0.1 ％トリトンX-100, 5mM E
DTA (pH8.0) を含む溶液を30μl 添加し、溶菌処理を行
った。続いて、10M 尿素を含む0.1M Tris-HCl (pH8.0)
を160 μl 添加し（最終尿素濃度4.85M ）、３０℃で３
０分間放置後、10μl の20mMの Z-Phe-Leu-Glu-4-nitro
anilide （ベーリンガーマンハイム社製）を含むＤＭＳ
Ｏ溶液を添加し、３０℃で１晩反応させた。
【００５３】約７００個の形質転換体に対して上記のス
クリーニングを行ったところ、酵素基質である Z-Phe-L
eu-Glu-4-nitroanilide の分解より生ずる黄色の発色
が、他に比べ強いものが４株得られ、これらの名称をＵ
１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８とした。
クリーニングを行ったところ、酵素基質である Z-Phe-L
eu-Glu-4-nitroanilide の分解より生ずる黄色の発色
が、他に比べ強いものが４株得られ、これらの名称をＵ
１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８とした。
【００５４】実施例５ 尿素耐性をもつ変異型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体ＲＰＴ（−) のスクリーニング（２次ス
クリーニング） この４株（Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８）を10mlのＬＢ培
地（0.5 ％酵母エキス、1.0 ％トリプトン、0.5 ％NaC
l）でＯＤ６６０が１．０になるまで３７℃で培養後、
ＩＰＴＧを最終濃度が２mMになるように添加し、さらに
２時間培養を継続した後、菌体を遠心分離により回収し
た。
テアーゼ誘導体ＲＰＴ（−) のスクリーニング（２次ス
クリーニング） この４株（Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８）を10mlのＬＢ培
地（0.5 ％酵母エキス、1.0 ％トリプトン、0.5 ％NaC
l）でＯＤ６６０が１．０になるまで３７℃で培養後、
ＩＰＴＧを最終濃度が２mMになるように添加し、さらに
２時間培養を継続した後、菌体を遠心分離により回収し
た。
【００５５】次に、菌体をＯＤ６６０が５となるように
ＴＥバッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0),1mM EDTA ）
に懸濁し、超音波破砕機（Cellruptor; 東湘電気
（株））により菌体を破砕した。破砕液を12000rpm 、
５分の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清画分を
粗酵素液として用いた。
ＴＥバッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0),1mM EDTA ）
に懸濁し、超音波破砕機（Cellruptor; 東湘電気
（株））により菌体を破砕した。破砕液を12000rpm 、
５分の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清画分を
粗酵素液として用いた。
【００５６】プロテアーゼ活性の測定は940 μl の50mM
Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に20μl の20mM Z-Phe-Leu-Glu
-4-nitroanilide 溶液を混合後、40μl の粗酵素液を添
加し、室温５分間の反応による405nm の吸収増加を日立
分光光度計U-3200により測定した。４株由来の粗酵素液
についてＶ８プロテアーゼ活性を測定した後、次に天然
型Ｖ８プロテアーゼ（例えば、エンドプロテイナーゼGl
u-C ；ベーリンガーマンハイム社製）0.2 μg の酵素活
性に相当する粗酵素液を用いて、尿素存在下における反
応の経時変化を調べた。実験操作は、5M尿素、50mM Tri
s-HCl (pH8.0)、0.4mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilid
e、２％ＤＭＳＯを含む反応液１mlで行い、405nm の吸
収増加により反応の経時変化を測定した（日立分光光度
計U-3200使用）。図７にその結果を示す。
Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に20μl の20mM Z-Phe-Leu-Glu
-4-nitroanilide 溶液を混合後、40μl の粗酵素液を添
加し、室温５分間の反応による405nm の吸収増加を日立
分光光度計U-3200により測定した。４株由来の粗酵素液
についてＶ８プロテアーゼ活性を測定した後、次に天然
型Ｖ８プロテアーゼ（例えば、エンドプロテイナーゼGl
u-C ；ベーリンガーマンハイム社製）0.2 μg の酵素活
性に相当する粗酵素液を用いて、尿素存在下における反
応の経時変化を調べた。実験操作は、5M尿素、50mM Tri
s-HCl (pH8.0)、0.4mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilid
e、２％ＤＭＳＯを含む反応液１mlで行い、405nm の吸
収増加により反応の経時変化を測定した（日立分光光度
計U-3200使用）。図７にその結果を示す。
【００５７】図７より明らかなように、変異株Ｕ１、Ｕ
５、Ｕ７及びＵ８が生産する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体ＲＰＴ（−）の融合蛋白質（以後、各々βＧ９７Ｖ
８ＲＰＴ（−）１、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）５、βＧ
９７Ｖ８ＲＰＴ（−）７及びβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）
８と表記する）は野生型のβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）に
比べ基質の分解活性が持続し、尿素に対して耐性である
ことが示された。
５、Ｕ７及びＵ８が生産する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘
導体ＲＰＴ（−）の融合蛋白質（以後、各々βＧ９７Ｖ
８ＲＰＴ（−）１、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）５、βＧ
９７Ｖ８ＲＰＴ（−）７及びβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）
８と表記する）は野生型のβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）に
比べ基質の分解活性が持続し、尿素に対して耐性である
ことが示された。
【００５８】実施例６ 変異部位の同定及び組み合わせ
の変異を持つ変異型V ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）融合蛋白質の作製 変異株Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８より、常法に従い、プ
ラスミドを単離・精製した。これらのプラスミドを以
後、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８ＲＰＴ（−）５、ｐ
Ｖ８ＲＰＴ（−）７及びｐＶ８ＲＰＴ（−）８とする。
次に、各々のプラスミド上の変異型V ８プロテアーゼ誘
導体遺伝子のＤＮＡ塩基配列をPharmacia 製ＤＮＡシー
ケンサー（A.L.F. DNA Sequencer ）により決定した。
ＤＮＡ塩基配列の決定に際してはPharmacia 製 AutoRea
d Sequencing Kit を用い、フロオロｄＵＴＰを用いた
蛍光ラベル法により行ない、プライマーには以下に示す
ものを使用した。
の変異を持つ変異型V ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）融合蛋白質の作製 変異株Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８より、常法に従い、プ
ラスミドを単離・精製した。これらのプラスミドを以
後、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８ＲＰＴ（−）５、ｐ
Ｖ８ＲＰＴ（−）７及びｐＶ８ＲＰＴ（−）８とする。
次に、各々のプラスミド上の変異型V ８プロテアーゼ誘
導体遺伝子のＤＮＡ塩基配列をPharmacia 製ＤＮＡシー
ケンサー（A.L.F. DNA Sequencer ）により決定した。
ＤＮＡ塩基配列の決定に際してはPharmacia 製 AutoRea
d Sequencing Kit を用い、フロオロｄＵＴＰを用いた
蛍光ラベル法により行ない、プライマーには以下に示す
ものを使用した。
【００５９】プライマーＡ（図４に示された野生型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）をコードする遺伝子の
最初の塩基を番号１とした場合、番号１から２１の部位
とアニールするセンスプライマー）； 5′ACCGCTCGAGGT
TATATTACCAAATAACGAT 3′ プライマーＤ１（同様に番号２６６から２９４の部位と
アニールするセンスプライマー）； 5′CAGGCGAAGGAGCG
CTAGCAATAGTTAAA 3′ プライマーＤ２（同様に番号２６６から２９４の部位と
アニールするアンチセンスプライマー）； 5′TTTAACTA
TTGCTAGCGCTCCTTCGCCTG 3′
プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）をコードする遺伝子の
最初の塩基を番号１とした場合、番号１から２１の部位
とアニールするセンスプライマー）； 5′ACCGCTCGAGGT
TATATTACCAAATAACGAT 3′ プライマーＤ１（同様に番号２６６から２９４の部位と
アニールするセンスプライマー）； 5′CAGGCGAAGGAGCG
CTAGCAATAGTTAAA 3′ プライマーＤ２（同様に番号２６６から２９４の部位と
アニールするアンチセンスプライマー）； 5′TTTAACTA
TTGCTAGCGCTCCTTCGCCTG 3′
【００６０】ＤＮＡシーケンス操作はメーカーの手順書
に従った。その結果、４種の変異株が生産する変異型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）には図８に示す変異
が生じていることが判明した。特にｐＶ８ＲＰＴ（−）
７上の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体は２重変異であ
り、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１及びｐＶ８ＲＰＴ（−）５の
変異を合わせたものであることも判明した。従って、図
７において、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）７が、βＧ９７
Ｖ８ＲＰＴ（−）１やβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）５に比
べ高い活性示した理由は２重変異のためと考えられた。
これは変異を組み合わせることにより、さらに尿素に強
い酵素を作り出せる可能性を意味している。
に従った。その結果、４種の変異株が生産する変異型Ｖ
８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）には図８に示す変異
が生じていることが判明した。特にｐＶ８ＲＰＴ（−）
７上の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体は２重変異であ
り、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１及びｐＶ８ＲＰＴ（−）５の
変異を合わせたものであることも判明した。従って、図
７において、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）７が、βＧ９７
Ｖ８ＲＰＴ（−）１やβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）５に比
べ高い活性示した理由は２重変異のためと考えられた。
これは変異を組み合わせることにより、さらに尿素に強
い酵素を作り出せる可能性を意味している。
【００６１】このことを確かめるため、得られた３種類
の変異を全て持つｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８を作製し
た。作製にはＶ８プロテアーゼ遺伝子に存在する制限酵
素部位（Dra I 、EcoR I ）を利用し、図９に示す手順
により行った。ｐＶ８ＲＰＴ（−）７の0.4Kbp Dra I-
EcoR I 断片をｐＶ８ＲＰＴ（−）８のそれと交換する
ことによりｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８を作製した。
の変異を全て持つｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８を作製し
た。作製にはＶ８プロテアーゼ遺伝子に存在する制限酵
素部位（Dra I 、EcoR I ）を利用し、図９に示す手順
により行った。ｐＶ８ＲＰＴ（−）７の0.4Kbp Dra I-
EcoR I 断片をｐＶ８ＲＰＴ（−）８のそれと交換する
ことによりｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８を作製した。
【００６２】本プラスミド由来の３重変異型Ｖ８プロテ
アーゼ誘導体ＲＰＴ（−）（βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）
１５８）について先に示した手順により、５Ｍ尿素存在
下における反応の経時変化を調べた（図１０参照）。そ
の結果、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）１５８はβＧ９７Ｖ
８ＲＰＴ（−）７以上に合成基質の分解反応が持続する
ことが判明し、３つの変異は加算的に尿素耐性を付与す
ることが明らかとなった。
アーゼ誘導体ＲＰＴ（−）（βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）
１５８）について先に示した手順により、５Ｍ尿素存在
下における反応の経時変化を調べた（図１０参照）。そ
の結果、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）１５８はβＧ９７Ｖ
８ＲＰＴ（−）７以上に合成基質の分解反応が持続する
ことが判明し、３つの変異は加算的に尿素耐性を付与す
ることが明らかとなった。
【００６３】実施例７ 発現ベクターｐＶ８Ｄの作製 野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）を不活性な
封入体として発現させるプラスミドｐＶ８Ｄは図１１及
び図１２に示す手順で作製した。まず、ｐＶ８ＲＰＴ
（−）よりBgl II-Sal I断片（3.0kb ）及びEcoRV-Bgl
II断片（0.7kb ）を調製し、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ１０より調製したNar I-Sal I 断片（0.2kb ）
と連結させることによりｐＶ８ｈＣＴ〔Ｇ〕を得た（図
１１）。なお、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０(App
l. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42,703-708) は上
記実施例２のｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６と同様に
プラスミドｐＢＲ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４Ｄｈ
ＣＴ〔Ｇ〕より作成することができる（図２）。
封入体として発現させるプラスミドｐＶ８Ｄは図１１及
び図１２に示す手順で作製した。まず、ｐＶ８ＲＰＴ
（−）よりBgl II-Sal I断片（3.0kb ）及びEcoRV-Bgl
II断片（0.7kb ）を調製し、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ１０より調製したNar I-Sal I 断片（0.2kb ）
と連結させることによりｐＶ８ｈＣＴ〔Ｇ〕を得た（図
１１）。なお、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０(App
l. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42,703-708) は上
記実施例２のｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６と同様に
プラスミドｐＢＲ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４Ｄｈ
ＣＴ〔Ｇ〕より作成することができる（図２）。
【００６４】次に、得られたｐＶ８ｈＣＴ〔Ｇ〕のｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕部分（0.1kb BstE II-SalI 断片）をｐＵＣ４
Ｋ（Vieira, J. and Messing, J., Gene 19, 259 (198
2) ；ファルマシア バイオテク社より製品番号27-4958
-01として容易に入手できる）のアミノグルコシド３’
−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＰＴ）領域を含
む0.8kb SmaI-Sal I断片と入れ換えｐＶ８Ｄを作製した
（図１２）。当該プラスミドより発現される野生型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の融合蛋白質のアミノ
酸配列を図１３に示す。野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｄは天然型プロテアーゼのＣ末端の５６アミノ酸を欠い
た誘導体である。
Ｔ〔Ｇ〕部分（0.1kb BstE II-SalI 断片）をｐＵＣ４
Ｋ（Vieira, J. and Messing, J., Gene 19, 259 (198
2) ；ファルマシア バイオテク社より製品番号27-4958
-01として容易に入手できる）のアミノグルコシド３’
−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＰＴ）領域を含
む0.8kb SmaI-Sal I断片と入れ換えｐＶ８Ｄを作製した
（図１２）。当該プラスミドより発現される野生型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の融合蛋白質のアミノ
酸配列を図１３に示す。野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｄは天然型プロテアーゼのＣ末端の５６アミノ酸を欠い
た誘導体である。
【００６５】当該融合蛋白においては、天然型Ｖ８プロ
テアーゼのＮ末端から２１２番目のアミノ酸（EcoRV 部
位）までを用いて融合蛋白を作製した。即ち、当該融合
蛋白質は、野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）
のＮ末端及びＣ末端部においてＲ６リンカー配列を介し
てβーガラクトシダーゼ誘導体及びアミノグルコシド
３’−ホスホトランスフェラーゼの一部（ｔＡＰＴ）と
各々融合した構造をもつ。なお、Ｒ６リンカーは、アミ
ノ酸配列としてRLYRRHHRWGRSGSPLRAHEQFLEを有し、当該
配列中のＲＲの中央のペプチド結合が大腸菌のｏｍｐＴ
プロテアーゼにより切断される構造を有している。
テアーゼのＮ末端から２１２番目のアミノ酸（EcoRV 部
位）までを用いて融合蛋白を作製した。即ち、当該融合
蛋白質は、野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）
のＮ末端及びＣ末端部においてＲ６リンカー配列を介し
てβーガラクトシダーゼ誘導体及びアミノグルコシド
３’−ホスホトランスフェラーゼの一部（ｔＡＰＴ）と
各々融合した構造をもつ。なお、Ｒ６リンカーは、アミ
ノ酸配列としてRLYRRHHRWGRSGSPLRAHEQFLEを有し、当該
配列中のＲＲの中央のペプチド結合が大腸菌のｏｍｐＴ
プロテアーゼにより切断される構造を有している。
【００６６】実施例８ 発現ベクターｐＶ８Ｆの作製 野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）を不活性な
封入体として発現させるプラスミドであるｐＶ８Ｆは、
上記野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）よりも
Ｖ８プロテアーゼ部分がＣ末端側に３アミノ酸長い誘導
体を融合蛋白質として発現するプラスミドであり、ＰＣ
Ｒ法と遺伝子クローニングを用いて以下の方法により作
製した。
封入体として発現させるプラスミドであるｐＶ８Ｆは、
上記野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）よりも
Ｖ８プロテアーゼ部分がＣ末端側に３アミノ酸長い誘導
体を融合蛋白質として発現するプラスミドであり、ＰＣ
Ｒ法と遺伝子クローニングを用いて以下の方法により作
製した。
【００６７】まず、プライマーＩＶ；
【化１】
【００６８】及びプライマーＶ；
【化２】
【００６９】を合成し、鋳型ＤＮＡとして実施例２で作
製したｐＶ８ＲＰＴ（−）を0.1 μg用いて野生型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体遺伝子側の増幅反応を行った後、Ec
oR I及びSac I で切断し0.1kb の遺伝子断片を調製し
た。
製したｐＶ８ＲＰＴ（−）を0.1 μg用いて野生型Ｖ８
プロテアーゼ誘導体遺伝子側の増幅反応を行った後、Ec
oR I及びSac I で切断し0.1kb の遺伝子断片を調製し
た。
【００７０】一方、プライマーＶＩ；
【化３】
【００７１】及びプライマーＶＩＩ；
【化４】
【００７２】を合成し、鋳型ＤＮＡとしてｐＶ８Ｄを0.
1 μg 用いてＲ６リンカー配列とアミノグルコシド３’
−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子部の増幅反応を行っ
た後、EcoT22I 及びSac I で切断し0.3kb の遺伝子断片
を調製した。なお、ＰＣＲは実施例１の条件に従った。
1 μg 用いてＲ６リンカー配列とアミノグルコシド３’
−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子部の増幅反応を行っ
た後、EcoT22I 及びSac I で切断し0.3kb の遺伝子断片
を調製した。なお、ＰＣＲは実施例１の条件に従った。
【００７３】上記のようにして得られた0.1kb 及び0.3k
b の遺伝子と、ｐＶ８ＤのEcoRI-EcoT22I 断片（4.2kb
）を連結しｐＶ８Ｆを作製した（図１４）。当該プラ
スミドより発現される野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ
（Ｖ８Ｆ）の融合蛋白質のアミノ酸配列を図１５に示
す。野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆは天然型プロテア
ーゼのＣ末端の５３アミノ酸を欠いた誘導体である。
b の遺伝子と、ｐＶ８ＤのEcoRI-EcoT22I 断片（4.2kb
）を連結しｐＶ８Ｆを作製した（図１４）。当該プラ
スミドより発現される野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ
（Ｖ８Ｆ）の融合蛋白質のアミノ酸配列を図１５に示
す。野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆは天然型プロテア
ーゼのＣ末端の５３アミノ酸を欠いた誘導体である。
【００７４】実施例９ 変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｄ（Ｖ８Ｄ）及び同Ｆ（Ｖ８Ｆ）の生産、及び尿素耐性
の確認 ｐＶ８Ｄ及びｐＶ８Ｆを用いて変異型Ｖ８プロテアーゼ
誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）及び同Ｆ（Ｖ８Ｆ）の高発現を試み
た。 （１）変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ 図１６に示すように、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８Ｒ
ＰＴ（−）５及びｐＶ８ＲＰＴ（−）８由来の 0.7kbp
Bgl II-EcoR I 断片を、ｐＶ８Ｄの3.9kbp BglII- EcoR
I 断片にそれぞれ挿入してｐＶ８Ｄ１、 ｐＶ８Ｄ５
及びｐＶ８Ｄ８を作製した。
Ｄ（Ｖ８Ｄ）及び同Ｆ（Ｖ８Ｆ）の生産、及び尿素耐性
の確認 ｐＶ８Ｄ及びｐＶ８Ｆを用いて変異型Ｖ８プロテアーゼ
誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）及び同Ｆ（Ｖ８Ｆ）の高発現を試み
た。 （１）変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ 図１６に示すように、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８Ｒ
ＰＴ（−）５及びｐＶ８ＲＰＴ（−）８由来の 0.7kbp
Bgl II-EcoR I 断片を、ｐＶ８Ｄの3.9kbp BglII- EcoR
I 断片にそれぞれ挿入してｐＶ８Ｄ１、 ｐＶ８Ｄ５
及びｐＶ８Ｄ８を作製した。
【００７５】これらのプラスミドを有するＪＭ１０１を
ファーメンター（小松川化工機製、30L Kit Fermenter
）を用いて、4 g/L K2HPO4、4 g/L KH2PO4、2.7 g/L N
a2HPO4 、0.2 g/L NH4Cl 、1.2 g/L (NH4)2SO4 、4 g/L
酵母エキス、2 g/L MgSO4 ・7H2O、40 mg/L CaCl2 ・2
H2O、40 mg/L FeSO4 ・7H2O、10 mg/L MnSO4 ・nH2O、1
0 mg/L AlCl3 ・6H2O、4 mg/L CoCl2・6H2O、2 mg/L Zn
SO4・7H2O、2 mg/L Na2MoO4・2H2O、1 mg/L CuCl2・2H2
O、0.5 mg/L H3BO4, 10mg/L テトラサイクリンを含む
培地（20L, pH7.0）でグリセリンを逐次添加しながら、
３７℃でＯＤ６６０が１０になるまで培養後、最終濃度
２mMのＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養をした。
ファーメンター（小松川化工機製、30L Kit Fermenter
）を用いて、4 g/L K2HPO4、4 g/L KH2PO4、2.7 g/L N
a2HPO4 、0.2 g/L NH4Cl 、1.2 g/L (NH4)2SO4 、4 g/L
酵母エキス、2 g/L MgSO4 ・7H2O、40 mg/L CaCl2 ・2
H2O、40 mg/L FeSO4 ・7H2O、10 mg/L MnSO4 ・nH2O、1
0 mg/L AlCl3 ・6H2O、4 mg/L CoCl2・6H2O、2 mg/L Zn
SO4・7H2O、2 mg/L Na2MoO4・2H2O、1 mg/L CuCl2・2H2
O、0.5 mg/L H3BO4, 10mg/L テトラサイクリンを含む
培地（20L, pH7.0）でグリセリンを逐次添加しながら、
３７℃でＯＤ６６０が１０になるまで培養後、最終濃度
２mMのＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養をした。
【００７６】培養液をマントンゴリーンホモジナイザー
（マントンゴーリン社製、モデル15M-8TBA）により600K
g/cm2 の条件でホモジナイズ処理し、7000 rpm、３０分
の遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿のＯＤ６６
０値が１００となるように脱イオン水を添加した後、15
ml を採取し1M Tris-HCl （pH8.0 ）を2.5ml 、1 Mジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）を250 μl 、及び尿素を１
２ｇ加え封入体を溶解し、50 ml になるように脱イオン
水を加え、３７℃で６時間加温した。
（マントンゴーリン社製、モデル15M-8TBA）により600K
g/cm2 の条件でホモジナイズ処理し、7000 rpm、３０分
の遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿のＯＤ６６
０値が１００となるように脱イオン水を添加した後、15
ml を採取し1M Tris-HCl （pH8.0 ）を2.5ml 、1 Mジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）を250 μl 、及び尿素を１
２ｇ加え封入体を溶解し、50 ml になるように脱イオン
水を加え、３７℃で６時間加温した。
【００７７】その後、0.4M (NH4)2SO4を含む 10 mMリン
酸カリウムバッファー（pH7.5 ）で２１倍希釈し、氷中
に一晩放置した。このリフォールディング操作により約
80μg/mlの各々の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ、即
ち、ｐＶ８Ｄ１、ｐＶ８Ｄ５及びｐＶ８Ｄ８由来の変異
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＤであるＶ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５
及びＶ８Ｄ８が得られた。
酸カリウムバッファー（pH7.5 ）で２１倍希釈し、氷中
に一晩放置した。このリフォールディング操作により約
80μg/mlの各々の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ、即
ち、ｐＶ８Ｄ１、ｐＶ８Ｄ５及びｐＶ８Ｄ８由来の変異
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＤであるＶ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５
及びＶ８Ｄ８が得られた。
【００７８】次に、各々のプロテアーゼを精製するた
め、(NH4)2SO4 を最終1.8Mになるように添加した後、30
0ml をブチルトヨパール650M（東ソー株式会社製）を用
いた精製に供した。1.8 M (NH4)2SO4 を含む 10 mMリン
酸カリウムバッファー（pH7.5）で平衡化したφ16mmX62
mm のカラムに試料を添加し、(NH4)2SO4 濃度1.8 M か
ら0 M への直線濃度勾配により精製を行った。各々のプ
ロテアーゼは(NH4)2SO4濃度0.9 M の付近で溶出され、
精製酵素が約２０ｍｇ得られた。なお、精製酵素の活性
は実施例３に記載の方法により測定した。
め、(NH4)2SO4 を最終1.8Mになるように添加した後、30
0ml をブチルトヨパール650M（東ソー株式会社製）を用
いた精製に供した。1.8 M (NH4)2SO4 を含む 10 mMリン
酸カリウムバッファー（pH7.5）で平衡化したφ16mmX62
mm のカラムに試料を添加し、(NH4)2SO4 濃度1.8 M か
ら0 M への直線濃度勾配により精製を行った。各々のプ
ロテアーゼは(NH4)2SO4濃度0.9 M の付近で溶出され、
精製酵素が約２０ｍｇ得られた。なお、精製酵素の活性
は実施例３に記載の方法により測定した。
【００７９】精製したＶ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ８
を用いて、尿素に対する耐性を再度調べた。３Ｍ尿素、
50mM Tris-HCl (pH 8.0)、２％ＤＭＳＯを含む反応液 9
60μl に各変異型酵素（Ｖ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ
８）を 40 μl （濃度150μg/ml）添加し、３０℃で３
０分放置後、合成基質(Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide)
を最終濃度0.4mM になるように添加し、酵素添加直後の
活性を１００％とした際の各酵素の残存活性を測定し
た。これらの対照としてｐＶ８Ｄ由来の野性型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）を同操作で生産したものを
用いた。その結果、Ｖ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ８は
Ｖ８Ｄに比べ残存活性が高く、これらの変異の導入によ
り、尿素に対する耐性が向上した変異型Ｖ８プロテアー
ゼ誘導体Ｄが生産できることが明らかになった（図１
７）。
を用いて、尿素に対する耐性を再度調べた。３Ｍ尿素、
50mM Tris-HCl (pH 8.0)、２％ＤＭＳＯを含む反応液 9
60μl に各変異型酵素（Ｖ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ
８）を 40 μl （濃度150μg/ml）添加し、３０℃で３
０分放置後、合成基質(Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide)
を最終濃度0.4mM になるように添加し、酵素添加直後の
活性を１００％とした際の各酵素の残存活性を測定し
た。これらの対照としてｐＶ８Ｄ由来の野性型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）を同操作で生産したものを
用いた。その結果、Ｖ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ８は
Ｖ８Ｄに比べ残存活性が高く、これらの変異の導入によ
り、尿素に対する耐性が向上した変異型Ｖ８プロテアー
ゼ誘導体Ｄが生産できることが明らかになった（図１
７）。
【００８０】（２）変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ ｐＶ８Ｆへの変異の導入についても検討を行った。図１
８に示す手順により、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８Ｒ
ＰＴ（−）５、ｐＶ８ＲＰＴ（−）７、ｐＶ８ＲＰＴ
（−）８及びｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８由来の 0.7kbp
Bgl II-EcoR I 断片を、ｐＶ８Ｆの3.9kbp Bgl II- Eco
R I 断片に挿入してｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ
７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８を作製した。
８に示す手順により、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８Ｒ
ＰＴ（−）５、ｐＶ８ＲＰＴ（−）７、ｐＶ８ＲＰＴ
（−）８及びｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８由来の 0.7kbp
Bgl II-EcoR I 断片を、ｐＶ８Ｆの3.9kbp Bgl II- Eco
R I 断片に挿入してｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ
７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８を作製した。
【００８１】これらのプラスミドを持つＪＭ１０１株を
用いて、各変異を持つ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｆ、即ち、ｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ
８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８由来の変異型Ｖ８プロテアー
ゼ誘導体ＦであるＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８
Ｆ８及びＶ８Ｆ１５８を上記の方法により分離した。精
製したＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８Ｆ８、Ｖ８
Ｆ１５８、及びこれらの対照としてｐＶ８Ｆ由来の野性
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）を同操作で生産
したものを用いて尿素に対する耐性を再度調べた。その
結果、各変異酵素は５Ｍ尿素存在下において尿素耐性に
優れていることが再確認され（図１９）、これにより尿
素耐性に優れた変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆが生産
できることが示された。
用いて、各変異を持つ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｆ、即ち、ｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ
８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８由来の変異型Ｖ８プロテアー
ゼ誘導体ＦであるＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８
Ｆ８及びＶ８Ｆ１５８を上記の方法により分離した。精
製したＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８Ｆ８、Ｖ８
Ｆ１５８、及びこれらの対照としてｐＶ８Ｆ由来の野性
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）を同操作で生産
したものを用いて尿素に対する耐性を再度調べた。その
結果、各変異酵素は５Ｍ尿素存在下において尿素耐性に
優れていることが再確認され（図１９）、これにより尿
素耐性に優れた変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆが生産
できることが示された。
【００８２】実施例１０ ドデシル硫酸ナトリウム（0.
1 ％）及び熱（50℃）に対するＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ
８Ｆ８の安定性のついての検討 実施例９で得られたＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８を用
いて、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）及び熱
に対する安定性についての検討を行った。ＳＤＳの場
合、0.1 ％ＳＤＳ、50mM Tris-HCl （pH8.0 ）、天然型
Ｖ８プロテアーゼ4.0μg ／mlの酵素活性に相当する各
酵素（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８）を含んだ溶液を
３０℃でインキュベートし、一定時間ごとにそれより90
0 μl 採取した後、100 μl の4mM Z-Phe-Leu-Glu-4-ni
troanilide、２０％ＤＭＳＯ溶液を添加し、それらの残
存活性を測定した。
1 ％）及び熱（50℃）に対するＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ
８Ｆ８の安定性のついての検討 実施例９で得られたＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８を用
いて、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）及び熱
に対する安定性についての検討を行った。ＳＤＳの場
合、0.1 ％ＳＤＳ、50mM Tris-HCl （pH8.0 ）、天然型
Ｖ８プロテアーゼ4.0μg ／mlの酵素活性に相当する各
酵素（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８）を含んだ溶液を
３０℃でインキュベートし、一定時間ごとにそれより90
0 μl 採取した後、100 μl の4mM Z-Phe-Leu-Glu-4-ni
troanilide、２０％ＤＭＳＯ溶液を添加し、それらの残
存活性を測定した。
【００８３】また、５０℃に対する熱安定性について
は、50mM Tris-HCl （pH8.0 ）、天然型Ｖ８プロテアー
ゼ 4.0μg ／mlの酵素活性に相当する各酵素（Ｖ８Ｆ
１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８）を含んだ溶液を50℃でインキ
ュベートし、一定時間ごとにそれらより900 μl 採取後
氷冷し、それらの残存活性を測定した。
は、50mM Tris-HCl （pH8.0 ）、天然型Ｖ８プロテアー
ゼ 4.0μg ／mlの酵素活性に相当する各酵素（Ｖ８Ｆ
１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８）を含んだ溶液を50℃でインキ
ュベートし、一定時間ごとにそれらより900 μl 採取後
氷冷し、それらの残存活性を測定した。
【００８４】図２０に示すように変異型の酵素であるＶ
８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８は対照である野性型のＦに
比べ失活速度が減少し、0.1 ％ＳＤＳに対する安定性が
上昇している。このことより３種の尿素耐性変異、Lys1
47Arg （Ｖ８Ｆ１）、Asn71Ser（Ｖ８Ｆ５）及びAsp44G
lu (Ｖ８Ｆ８) の導入はＳＤＳに対する変性に対しても
有効であることが判明した。また、５０℃における熱失
活については、Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５が野性型Ｖ８Ｆに比
べ失活速度が減少し、Lys147Arg 及びAsn71Serの変異は
耐熱性も付与することが明らかとなった（図２１）。
８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８は対照である野性型のＦに
比べ失活速度が減少し、0.1 ％ＳＤＳに対する安定性が
上昇している。このことより３種の尿素耐性変異、Lys1
47Arg （Ｖ８Ｆ１）、Asn71Ser（Ｖ８Ｆ５）及びAsp44G
lu (Ｖ８Ｆ８) の導入はＳＤＳに対する変性に対しても
有効であることが判明した。また、５０℃における熱失
活については、Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５が野性型Ｖ８Ｆに比
べ失活速度が減少し、Lys147Arg 及びAsn71Serの変異は
耐熱性も付与することが明らかとなった（図２１）。
【００８５】実施例１１ Ｖ８Ｆ１５８による融合蛋白
質の切断 Ｖ８Ｆ１５８（３重変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ）
を用い、尿素存在下における蛋白質の切断実験を行っ
た。実験にはｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３由
来の融合蛋白質を基質として用いた。当該融合蛋白質β
−ｇａｌ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３は、保護ペ
プチド（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒトＣ型ナトリウム
ペプチド（ｈＣＮＰ）がリンカーを介して融合され、Ｖ
８プロテアーゼによりｈＣＮＰが遊離される構造を有し
ている（特開平５−３２８９９２）。
質の切断 Ｖ８Ｆ１５８（３重変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ）
を用い、尿素存在下における蛋白質の切断実験を行っ
た。実験にはｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３由
来の融合蛋白質を基質として用いた。当該融合蛋白質β
−ｇａｌ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３は、保護ペ
プチド（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒトＣ型ナトリウム
ペプチド（ｈＣＮＰ）がリンカーを介して融合され、Ｖ
８プロテアーゼによりｈＣＮＰが遊離される構造を有し
ている（特開平５−３２８９９２）。
【００８６】５Ｍ尿素存在下における融合蛋白質からの
ｈＣＮＰの切り出しについて天然型Ｖ８プロテアーゼと
Ｖ８Ｆ１５８で比較した。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２
２Ｒ５−３由来の融合蛋白質、当該融合蛋白質の発現、
当該発現封入体の回収、Ｖ８プロテアーゼの反応条件、
融合蛋白質及び遊離したｈＣＮＰの分析は特開平５−３
２８９９２に記載の条件に従った。但し、反応時の尿素
濃度は５Ｍとし、Ｖ８Ｆ１５８は天然型Ｖ８プロテアー
ゼに換算して4 μg/mlの活性に相当する量を添加した。
ｈＣＮＰの切り出しについて天然型Ｖ８プロテアーゼと
Ｖ８Ｆ１５８で比較した。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２
２Ｒ５−３由来の融合蛋白質、当該融合蛋白質の発現、
当該発現封入体の回収、Ｖ８プロテアーゼの反応条件、
融合蛋白質及び遊離したｈＣＮＰの分析は特開平５−３
２８９９２に記載の条件に従った。但し、反応時の尿素
濃度は５Ｍとし、Ｖ８Ｆ１５８は天然型Ｖ８プロテアー
ゼに換算して4 μg/mlの活性に相当する量を添加した。
【００８７】３０分反応後、切断効率（切断された融合
蛋白質の割合）をＨＰＬＣのピークから算出したとこ
ろ、天然型Ｖ８プロテアーゼが６０％であったのに対
し、Ｖ８Ｆ１５８は９８％であり、高濃度の尿素下にお
けるＶ８Ｆ１５８の有効性が融合蛋白質の切断反応にお
いても示された。
蛋白質の割合）をＨＰＬＣのピークから算出したとこ
ろ、天然型Ｖ８プロテアーゼが６０％であったのに対
し、Ｖ８Ｆ１５８は９８％であり、高濃度の尿素下にお
けるＶ８Ｆ１５８の有効性が融合蛋白質の切断反応にお
いても示された。
【００８８】
【発明の効果】従来公知の天然型Ｖ８プロテアーゼは２
Ｍ程度の尿素を含む酵素反応液中でもある程度の切断反
応を行なうために遺伝子組換え法による有用ペプチド等
の製造に用いられているが、上述したように、本発明に
係る酵素はこの天然型酵素の性質に更に尿素耐性が付加
されている。従って、本発明に係る酵素を用いれば高濃
度の尿素存在下でも酵素活性の失活が抑えられることに
より、尿素存在下の反応系に加える酵素量が少なくてす
み、また、反応時間の短縮が行なえる。更には高濃度尿
素存在下で蛋白切断が行なえることにより今まで得られ
なかったペプチド断片が得られる等の利点がある。
Ｍ程度の尿素を含む酵素反応液中でもある程度の切断反
応を行なうために遺伝子組換え法による有用ペプチド等
の製造に用いられているが、上述したように、本発明に
係る酵素はこの天然型酵素の性質に更に尿素耐性が付加
されている。従って、本発明に係る酵素を用いれば高濃
度の尿素存在下でも酵素活性の失活が抑えられることに
より、尿素存在下の反応系に加える酵素量が少なくてす
み、また、反応時間の短縮が行なえる。更には高濃度尿
素存在下で蛋白切断が行なえることにより今まで得られ
なかったペプチド断片が得られる等の利点がある。
【図１】図１は、（ａ）スタフィロコッカス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus ）Ｖ８プロテアーゼ遺伝子
の構成と当該遺伝子におけるアニーリング部位、及び
（ｂ）クローニングに用いたＰＣＲ用プライマーの塩基
配列を示す図である。
ス（Staphylococcus aureus ）Ｖ８プロテアーゼ遺伝子
の構成と当該遺伝子におけるアニーリング部位、及び
（ｂ）クローニングに用いたＰＣＲ用プライマーの塩基
配列を示す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
［Ｇ］Ｒ６及びプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］
Ｒ１０の作製過程を示す図である。
［Ｇ］Ｒ６及びプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］
Ｒ１０の作製過程を示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）の作製
過程を示す図である。
過程を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）中にコ
ードされている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図であ
る。下線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）の配列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーの
アミノ酸配列を示す。
ードされている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図であ
る。下線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）の配列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーの
アミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、（ａ）クローニングに用いたＰＣＲ用
プライマーの塩基配列、及び（ｂ）プラスミドｐＶ８Ｒ
ＰＴ（−）の構成と当該プラスミドに係る遺伝子におけ
るアニーリング部位を示す図である。
プライマーの塩基配列、及び（ｂ）プラスミドｐＶ８Ｒ
ＰＴ（−）の構成と当該プラスミドに係る遺伝子におけ
るアニーリング部位を示す図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）へのＰ
ＣＲ変異の導入を示す図である。
ＣＲ変異の導入を示す図である。
【図７】図７は、５Ｍ尿素存在下における変異型Ｖ８プ
ロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の反応経時変化を示す図
である。
ロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の反応経時変化を示す図
である。
【図８】図８は、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ
（−）における変異部位の同定結果を示す図である。
（−）における変異部位の同定結果を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８
の作製過程を示す図である。
の作製過程を示す図である。
【図１０】図１０は、２重変異及び３重変異を持つ変異
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の５Ｍ尿素存在
下における反応経時変化を示す図である。
型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の５Ｍ尿素存在
下における反応経時変化を示す図である。
【図１１】図１１は、 プラスミドｐＶ８ｈＣＴ〔Ｇ〕
の作製過程を示す図である。
の作製過程を示す図である。
【図１２】図１２は、 プラスミドｐＶ８Ｄの作製過程
を示す図である。
を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＶ８Ｄ中にコードさ
れている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下
線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の配
列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーのアミノ酸配
列を示す。また、矢印はＯｍｐＴプロテアーゼにより切
断される部位を表す。
れている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下
線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の配
列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーのアミノ酸配
列を示す。また、矢印はＯｍｐＴプロテアーゼにより切
断される部位を表す。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＶ８Ｆの作製過程を
示す図である。Ｖ８Ｆ遺伝子は野性型Ｖ８プロテアーゼ
誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）をコードする遺伝子である。
示す図である。Ｖ８Ｆ遺伝子は野性型Ｖ８プロテアーゼ
誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）をコードする遺伝子である。
【図１５】図１５は、プラスミドｐＶ８Ｆ中にコードさ
れている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下
線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の配
列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーのアミノ酸配
列を示す。また、矢印はＯｍｐＴプロテアーゼにより切
断される部位を表す。
れている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下
線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の配
列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーのアミノ酸配
列を示す。また、矢印はＯｍｐＴプロテアーゼにより切
断される部位を表す。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＶ８Ｄ１、ｐＶ８Ｄ
５及びｐＶ８Ｄ８の作製過程を示す図である。
５及びｐＶ８Ｄ８の作製過程を示す図である。
【図１７】図１７は、プラスミドｐＶ８Ｄ１、ｐＶ８Ｄ
５及びｐＶ８Ｄ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼＤ（Ｖ
８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５、Ｖ８Ｄ８）とｐＶ８Ｄ由来の野性型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の３Ｍ尿素存在下
での残存活性を示す図である。
５及びｐＶ８Ｄ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼＤ（Ｖ
８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５、Ｖ８Ｄ８）とｐＶ８Ｄ由来の野性型
Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の３Ｍ尿素存在下
での残存活性を示す図である。
【図１８】図１８は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ
５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８の作製
過程を示す図である。
５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８の作製
過程を示す図である。
【図１９】図１９は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ
５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８由来の
変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ
５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８Ｆ８及びＶ８Ｆ１５８）とｐＶ８Ｆ
由来の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ) の５
Ｍ尿素存在下での反応経時変化を示す図である。
５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８由来の
変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ
５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８Ｆ８及びＶ８Ｆ１５８）とｐＶ８Ｆ
由来の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ) の５
Ｍ尿素存在下での反応経時変化を示す図である。
【図２０】図２０は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ
５及びｐＶ８Ｆ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５及びＶ８Ｆ８）と野性型Ｖ８プ
ロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の０．１％ＳＤＳにおけ
る安定性を示す図である。
５及びｐＶ８Ｆ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体
Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５及びＶ８Ｆ８）と野性型Ｖ８プ
ロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の０．１％ＳＤＳにおけ
る安定性を示す図である。
【図２１】図２１は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ
５及ｐＶ８Ｆ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ
（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５及びＶ８Ｆ８）と野性型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の５０℃における熱安定性
を示す図である。
５及ｐＶ８Ｆ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ
（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５及びＶ８Ｆ８）と野性型Ｖ８プロ
テアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の５０℃における熱安定性
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 蛋白変性をもたらす環境条件下において
も酵素活性を有する変異型スタフィロコッカス・アウレ
ウスＶ８プロテアーゼ。 - 【請求項２】 請求項１記載の変異型スタフィロコッカ
ス・アウレウスＶ８プロテアーゼをコードする遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２記載の遺伝子を有する発現ベク
ター。 - 【請求項４】 請求項３記載の発現ベクタ−により形質
転換された組換え細胞。 - 【請求項５】 蛋白変性をもたらす環境条件下において
も酵素活性を有する変異型スタフィロコッカス・アウレ
ウスＶ８プロテアーゼの製造方法において、請求項４の
組換え細胞を培養した後、当該培養物から目的の該プロ
テアーゼ蛋白を採取することを特徴とする当該プロテア
ーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16047596A JP3852982B2 (ja) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | 変異型スタフィロコッカス・アウレウスｖ８プロテアーゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-170086 | 1995-06-02 | ||
| JP17008695 | 1995-06-02 | ||
| JP16047596A JP3852982B2 (ja) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | 変異型スタフィロコッカス・アウレウスｖ８プロテアーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0947291A true JPH0947291A (ja) | 1997-02-18 |
| JP3852982B2 JP3852982B2 (ja) | 2006-12-06 |
Family
ID=15898392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16047596A Expired - Lifetime JP3852982B2 (ja) | 1995-06-02 | 1996-06-03 | 変異型スタフィロコッカス・アウレウスｖ８プロテアーゼ |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0745669B1 (ja) |
| JP (1) | JP3852982B2 (ja) |
| KR (1) | KR100650960B1 (ja) |
| AT (1) | ATE254177T1 (ja) |
| DE (1) | DE69630630T2 (ja) |
| ES (1) | ES2206546T3 (ja) |
| HU (1) | HUP9601487A3 (ja) |
| IL (2) | IL118473A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2119785A1 (en) | 1999-07-23 | 2009-11-18 | Kenji Kangawa | Novel peptides |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1090132A1 (en) * | 1998-06-26 | 2001-04-11 | PPL Therapeutics (Scotland) Limited | Methods for production of recombinant polypeptides |
| EP2336331A1 (en) * | 1999-08-31 | 2011-06-22 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
| US7217554B2 (en) * | 1999-08-31 | 2007-05-15 | Novozymes A/S | Proteases and variants thereof |
| US6558939B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-05-06 | Novozymes, A/S | Proteases and variants thereof |
| ATE430799T1 (de) * | 1999-10-19 | 2009-05-15 | Bharat Biotech International L | Expression von rekombinantem, reifem lysostaphin |
| IL162780A0 (en) | 2002-04-11 | 2005-11-20 | Kenji Kangawa | Method for producing modified peptide |
Family Cites Families (3)
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|---|---|---|---|---|
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| US5536655A (en) * | 1989-09-26 | 1996-07-16 | Midwest Research Institute | Gene coding for the E1 endoglucanase |
| ATE253639T1 (de) * | 1991-08-19 | 2003-11-15 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Verfahren zur herstellung von peptiden |
-
1996
- 1996-05-30 IL IL11847396A patent/IL118473A0/xx unknown
- 1996-05-31 AT AT96303939T patent/ATE254177T1/de active
- 1996-05-31 ES ES96303939T patent/ES2206546T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-31 DE DE69630630T patent/DE69630630T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-31 EP EP96303939A patent/EP0745669B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-31 HU HU9601487A patent/HUP9601487A3/hu unknown
- 1996-06-01 KR KR1019960019544A patent/KR100650960B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-03 US US08/657,192 patent/US5747321A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-03 JP JP16047596A patent/JP3852982B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-05-30 IL IL11847399A patent/IL118473A/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2119785A1 (en) | 1999-07-23 | 2009-11-18 | Kenji Kangawa | Novel peptides |
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| DE69630630T2 (de) | 2004-09-23 |
| KR100650960B1 (ko) | 2007-03-02 |
| DE69630630D1 (de) | 2003-12-18 |
| EP0745669A3 (en) | 1999-05-26 |
| EP0745669A2 (en) | 1996-12-04 |
| HU9601487D0 (en) | 1996-08-28 |
| HUP9601487A3 (en) | 2001-08-28 |
| HUP9601487A2 (en) | 1997-05-28 |
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| EP0745669B1 (en) | 2003-11-12 |
| ATE254177T1 (de) | 2003-11-15 |
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| ES2206546T3 (es) | 2004-05-16 |
| IL118473A (en) | 2005-03-20 |
| US5747321A (en) | 1998-05-05 |
| IL118473A0 (en) | 1996-09-12 |
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