KR19980701652A - 효소적으로 활성인 재조합 카르복시펩티다제 ｂ의 생산 - Google Patents

효소적으로 활성인 재조합 카르복시펩티다제 ｂ의 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ProCPB를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 세포를, 상기 DNA가 ProCPB의 발현을 지시하도록, 처리하는 단계와; 상기 발현된 ProCPB를 세포로부터 회수하는 단계와; 상기 ProCPB의 폴딩(folding)을 허용하는 조건 하에서 상기 회수된 ProCPB를 처리하는 단계와; 효소적으로 활성인 CPB를 생산하기 위해 상기 폴딩된 ProCPB를 효소분해하는 단계와; 상기 효소적으로 활성인 CPB를 정제하는 단계를 포함하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산방법을 제공한다.

Description

효소적으로 활성인 재조합 카르복시펩티다제 Ｂ의 생산
본 발명은 1995년 1월 25일에 출원된 미국출원번호 08/378,233의 일부계속 출원으로 그 내용이 본 명세서에 참고로 삽입되어 있다.
본 명세서를 통해 다양한 간행물이 괄호 안의 아라비아 숫자로 참조된다. 이러한 참고문헌에 대한 완전한 인용은 명세서의 끝부분 청구항 직전에서 나타나 있다. 상기 간행물의 전체 개시 내용은 본 발명이 속하는 기술분야를 더욱 상세히 설명하기 위해 본 명세서에 참고로 삽입된다.
자연 발생적 카르복시펩티다제 B[Peptidyl-L-lysine(L-arginine) hydrolase EC 3.4.17.2]는 펩티드로부터 C-말단 Arg, Lys 또는 Orn을 특이적으로 제거하는 아연-함유 췌장 엑소펩티다제(pancreatic exopeptidase)이다 (1, 2).
자연 발생적 래트 카르복시펩티다제 B(rat carboxypeptidase)는 신호 서열(13개의 아미노산)과 활성화 펩티드(activation peptide)(95개의 아미노산)를 포함하는 108개의 아미노산 길이의 N-말단 절편(N-terminal fragment)을 함유하는 전구 단백질(precursor protein)인 프리프로카르복시펩티다제 B로부터 생산된다. 프리프로카르복시펩티다제 B는 효소적으로 비활성이다.
프리프로카르복시펩티다제 B가 소포체(endoplasmatic reticulum)로 운반되는 동안, 신호 펩티드는 절단되고, 효소적으로 비활성인 프로카르복시펩티다제 B 전구체는 셀로부터 분비된다. 이어서, 효소적으로 활성인 카르복시펩티다제 B는 트립신에 의해 활성화 펩티드를 절단함으로 형성된다(7).
성숙한 래트 카르복시펩티다제 B는 307개의 아미노산을 함유하고(5), 35kD라는 겉보기 분자량을 가진다. 상기 래트 카르복시펩티다제 B는 7개의 시스테인 잔기를 함유하는데, 이중에 6개는 S-S 결합(S-S bonds)으로 쌍을 이룬다.
카르복시펩티다제 B는 인슐린과 다른 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 생산 및 단백질 서열 분석과 같은 연구 목적과 상업적 목적으로 널리 사용되고 있다.
돼지의 췌장에서 정제된 상업적으로 이용가능한 카르복시펩티다제 B는 매우 비싸고 다른 프로테아제들(proteases)이 전혀 들어 있지 않은 것은 아니다.
돼지의 전구 프로카르복시펩티다제 B의 부분 아미노산 서열과 소의 카르복시펩티다제 B의 완전한 아미노산 서열은 (각각 3, 4) 공개되었다. 또한, 인간 cDNA와 래트의 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열은 (각각 5, 6) 공개되었다.
야마모또 등(6)은 활성화 펩티드의 첫번째 11개의 아미노산이 결여된 효소적으로 비활성인 인간 프로카르복시펩티다제 B의 재조합 발현을 발표했다.
야마모또 등은 프로카르복시펩티다제가 활성화 펩티드의 제 1 11개의 아미노산이 결여된 효소적으로 비활성인 β-갈락토시다제-프로카르복시펩티다제 B 융합 단백질의 재조합 발현을 또한 발표한다.
유럽 특허 공개 번호 588118 A2는 OSF-5라는 이름의 뼈-관련 유사 카르복시펩티다제 단백질을 기술하고 있다. OSF-5가 흡착 분자(adhesion molecule) 또는 성장 인자(growth factor)로서 작용하는 것과, 뼈 대사 작용 질환(bone metabolic diseases)을 치료하기 위한 약제로서 사용될 수 있다는 것이 생각된다. 그러나, OSF-5의 실제 기능 또는 활성은 전혀 개시되지 않았고, 자연 발생적 또는 재조합의 생물학적으로 활성인 단백질의 생산도 실현되지 않았다.
본 발명은 재조합되고, 고도로 정제되고, 효소적으로 활성인 값싼 카르복시펩티다제 B의 생산을 개시한다. 효소적으로 활성인 카르복시펩티다제 B의 생산은 이전에 보고된 적이 없으며, 따라서 본 명세서의 개시 내용은 신규성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 프로카르복시펩티다제 B를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 세포를, 상기 DNA가 프로카르복시펩티다제 B의 발현을 지시하도록, 처리하는 단계와, 발현된 프로카르복시펩티다제 B를 세포로부터 회수하는 단계, 상기 프로카르복시펩티다제 B의 폴딩(folding)을 허용하는 조건 하에서 상기 회수된 프로카르복시펩티다제 B를 처리하는 단계와, 효소적으로 활성인 카르복시펩티다제를 생산하기 위해 폴딩된 프로카르복시펩티다제 B를 효소분해하는 단계와, 상기 효소적으로 활성인 카르복시펩티다제 B를 정제하는 단계를 포함하는 효소적으로 활성인 카르복시펩티다제 B의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 효소적으로 활성인 카르복시펩티다제 B를 또한 제공한다.
도 2 및 3에 나타난 플라스미드의 제한 지도는 플라스미드 상에 있는 제한 부위 모두를 나타내지는 않는다. 그러나, 본 발명을 완전하게 이해하기 위해 필요한 제한 부위들은 나타나 있다.
도 1: 췌장 래트 프로카르복시펩티다제 B의 아미노산 및 이에 상응하는 cDNA 뉴클레오티드 서열.
성숙한 카르복시펩티다제 B 뉴클레오티드 서열과 활성화 펩티드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 췌장 래트 프로카르복시펩티다제 B의 cDNA 뉴클레오티드 서열과 이에 상응하는 아미노산 서열이 나타나 있다. 상기 DNA 서열은 클라우저(Clauser) 등(5)에 의해 발표된 DNA 서열과는 4개의 뉴클레오티드가 다르고, 상기 4개의 뉴클레오티드 중 2개의 뉴클레오티드는 아미노산의 변화(Lys14-〉Asn 및 Arg142-〉Asp)를 초래한다.
클로닝(실시예 1)하는 동안 사용되는 3개의 프라이머(primers)의 DNA 뉴클레오티드 서열이 또한 (대형 타입으로) 나타난다: 프로카르복시펩티다제 B 5'-말단 프라이머, 성숙한 카르복시펩티다제 B 5'-말단 프라이머 및 카르복시펩티다제 B 3'-말단 프라이머.
아미노산의 계수는 소 췌장(10, 12)의 카르복시펩티다제 A와 상동성(homology)에 따라 이루어졌고, 여기서 성숙한 래트의 캬르복시펩티다제 B의 첫번째 아미노산(Ala)은 4번으로 계수된다. 별표(*)는 래트 카르복시펩티다제 B가 카르복시펩티다제 A와 비교하여 추가적으로 가지는 아미노산(Leu)을 가리킨다.
도 2: 플라스미드 pCPB 및 플라스미드 pCPB-C의 제작.
플라스미드 pABN를 BamHI와 NcoI로 소화했다. 2500 bp 절편을 분리해서, (실시예 1에서 기술한 바와 같이 얻어진) BamHI-NcoI 940 bp 카르복시펩티다제 B cDNA 절편에 연결했다. 새로 얻은 플라스미드를 pCPB라고 명명하며,이. 콜라이4300을 형질전환시키는데 사용했다.
플라스미드 pCPB를 BamHI와 NdeI로 소화하여, 큰 절편을 분리하였다. 또 플라스미드 pCPB를 AseI와 ScaI로 소화하여 큰 절편을 분리하였다.
부위-특위적 돌연변이 유발을 위해 준비된 5' 말단 인산화(phosphorylated)올리고뉴클레오티드와 폴리머라제-리가제 버퍼(5 x 버퍼: 32.5 mM Tris-HCL pH 7.5, 40mM MgCl2, 5mM 2-Mercaptoethanol, 0.5M NaCl)(9)와 상기 2개의 큰 절편을 혼합함으로 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성했다. DNA 스트랜드(DNA strands)를 변성하기 위해 상기 혼합물을 끓이고, 상기 DNA를 복원하기 위해 점차로 냉각시켰다. 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해이. 콜라이1645를 형질전화하기 위해 상기 반응 생산물을 사용했다. 형질전환체(transformants)를 앰피실린을 함유하는 LB 아가 상에서 성장시키고, 그리고 돌연변이 유발을 위해 준비한 5'-말단 인산화 올리고뉴클레오티드를 사용하여인 시튜콜로니 차등 하이브리다이제이션(colony differential hybridization)에 의해 선별했다.
플라스미드 DNA를 양성 콜로니(positive colonies)로부터 추출했고, 제한 효소 분석과 DNA 뉴클레오티드를 시퀀싱 한 후 돌연변이체SpeI 부위를 가진 콜로니를 선택했다. 새로 얻은 플라스미드를 pCPB-C라고 명명했고, 상기 pCPB-C는 아미노산 290에서 시스테인으로부터 세린(serine)으로 돌연변이가 일어난 카르복시펩티다제 B를 암호화한다.이. 콜라이4300을 형질변환하기 위해 플라스미드 pCPB-C를 사용했다.
도 3: 플라스미드 pProCPB-C 및 플라스미드 pλProCPB의 제작.
활성화 펩티드와 카르복시펩티다제 B의 일부를 암호화하는 470 bp 절편을 분리하기 위해, 실시예 1에서 기술한 바와 같이 얻어진 프로카르복시펩티다제 B cDNA를NdeI 및ClaI로 절단했다.
Cys290-〉Ser 돌연변이를 포함하는 카르복시펩티다제 B의 나머지를 암호화하는 760 bp 절편을 분리하기 위해, 플라스미드 pCPB-C를BamHI와ClaI로 절단했다.
세균에서의 발현에 필요한 요소 모두를 암호화하는 2500 bp 절편을 분리하기 위해, 플라스미드 pAB를NdeI와BamHI로 절단했다(실시예 1을 참조).
상기 3개의 절편을 연결시키고 새로 얻은 플라스미드를 pProCPB-C라고 정했다.
플라스미드 pProCPB-C와 pCPB를StuI와XhoI로 절단했다. 세균에서의 발현(실시예 1)에 필요한 모든 요소와, 활성화 펩티드 전체와, 카르복시펩티다제 B의 일부를 암호화하는 3700 bp 절편을 플라스미드 ProCPB-C로부터 분리시켰다.
상기 카르복시펩티다제 B의 나머지를 암호화하는 440 bp 절편을 플라스미드 pCPB로부터 분리시켰다.
상기 2개의 절편을 연결하고, 새로 형성한 플라스미드를 pλProCPB라고 했다.
도 4는 재조합 카르복시펩티다제 B와 자연발생적 카르복시펩티다제 B의 성 비교를 나타낸다.
시판용 돼지의 카르복시펩티다제 B(시그마)의 활성과 실시예 5에 기술한 바와 같이 만든 재조합 카르복시펩티다제 B의 활성을, Hippuryl-L-Arg 기질을 사용하는 포크(Folk)(11)의 방법에 따라, 판정했다. 0.025-1.0mM 사이의 기질 농도(substrate concentrations)를 사용하여 촉매 반응의 V0를 측정했다.
플라스미드 pλProCPB는이. 콜라이(E. coli)에 도입되어 1994, 8.4일짜 ATCC 수탁번호 69673으로 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852에 위치한 ATCC(the American Type Culture Collection)에 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인(the International Recognition of the Deposit of Microorganisms)에 관한 부다페스트 조약의 요구사항에 따라서, 그리고 부다페스트 조약의 요청에 부합하도록 기탁됐다.
본 명세서에서, ProCPB는 재조합 DNA 방법 또는 다른 방법으로 만들어졌든간에 폴리펩티드를 의미한다. 여기서 상기 폴리펩티드는 자연 발생적인 포유동물의 카르복시펩티다제 B와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 따라서 CPB라는 용어는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 10개 이하의 아미노산에 의해 자연 발생적 카르복시펩티다제 Bs와 다른 폴리펩티드를 포함한다
본 명세서에서, CPB는 재조합 DNA 방법 또는 다른 방법으로 만들어졌든간에 폴리펩티드를 의미한다. 여기서 상기 폴리펩티드는 자연 발생적인 포유동물의 카르복시펩티다제 B와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 따라서 ProCPB라는 용어는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 10개 이하의 아미노산에 의해 자연 발생적 프로카르복시펩티다제 Bs와 다른 폴리펩티드를 포함한다.
당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람들은 예를 들어 폴리펩티드의 세균 발현을 코딩하는 DNA 서열의 디자인과 제조, 부위-특위적 돌연변이 유발 기술(site-directed mutagenesis techniques)에 의한 게놈 서열(genomic sequences)과 cDNA의 변형, 재조합 단백질과 발현 벡터(expression vectors)의 제작, 폴리펩티드의 세균 발현을 위한 종래의 방법, 및 종래의 생화학적 분석법을 사용하는 폴리펩티드의 생화학적 활성의 측량을 포함하는 기존의 주지 방법을 사용함으로, 어떤 아미노산 잔기가 부가될지, 결실될지, 또는 치환될지 (또는 어떤 아미노산으로 치환될지)를 용이하게 판단할 수 있다.
본 명세서에서, 효소적으로 활성인 CPB는 자연 발생적 포유동물의 카르복시펩티다제 B의 생물학적 활성을 가지는 CPB를 의미한다. 정의하자면, 자연 발생적 카르복시펩티다제 B의 생물학적 활성은 펩티드로부터 C-말단 아르기닌, 리신, 또는 오르니틴(ornithine)을 특이적으로 제거하는 능력이다.
본 명세서에서 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 여기서 아미노산 서열에서 아미노산의 치환 및/또는 결실 및/또는 부가를 포함하는 것으로 정의되며, 예를 들어, 문헌(Lehninger, Biochemistry, 2nd ed. Worth Pub., N.Y. (1975), Chapter 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, England (1989); 및 Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972), Chapter 9)에 기술된 바와 같이 동족 또는 등가군(homologous and equivalent groups)에 따라 10개까지의 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 치환은 당업자들에게는 익히 아는 바이다.
바람직한 구체예에서, ProCPB 또는 CPB를 암호화하는 DNA를 인간, 래트, 소, 또는 돼지의 기원에서 얻을 수도 있다. 상기 DNA를 역전사, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR:polymerase chain reaction), 합성 또는 반합성 수단, 또는 이러한 방법을 두가지 이상 사용하거나, 당해 기술분야의 기존의 방법들에 의해 얻을 수도 있다
ProCPB 또는 CPB 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 예를 들어 문헌(Bauer et al. (1985), Gene37:73-81)과 같은 당업자들이 아는 방법으로 돌연변이시킬 수도 있다. 상기 돌연변이된 서열은 본 명세서에서 기술한 바와 같이 적합한 발현 벡터에 삽입될 수도 있다. 여기서 상기 발현 벡터는 돌연변이된 DNA가 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 처리된 세포로 도입된다.
당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람들은 본 출원서와 관련하여 기탁된 플라스미드가 폴리펩티드의 발현을 암호화하기 위해 기존의 기술(예를 들어, 부위-특위적 돌연변이 유발 또는 링커의 삽입)에 의해 용이하게 변형될 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 기술은 예를 들어 문헌(Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press )에 기술되어 있다.
CPB 또는 ProCPB를 암호화하는 핵산을 발현하는데 사용될 수도 있는 벡터의 보기로는 예를 들어 (파지 람브다(phage lambda)와 같은) 박테리오파지(bacteriophages)와, 코스미드(cosmids)와, 플라스미드와, 다른 벡터들인 세균 바이러스(bacterial virus)와 같은 바이러스들이 있다. ProCPB 또는 CPB를 암호화하는 cDNA를 당해 기술분야에 잘 알려진 방법으로 적절한 벡터에 삽입한다. 예를 들어, 종래의 제한 엔도누클레아제 효소 부위(restriction endonuclease enzyme sites)를 사용함으로, 삽입물과 벡터 DNA는 서로 염기쌍을 형성하고 이어서 DNA 리가제에 의해 함께 연결되는 상보적 말단을 만들어내기 위해 절단될 수 있다. 다른 대안으로, 벡터 DNA의 제한 부위에 상보적인 염기 서열을 가지는 합성 링커들(synthetic linkers)이 삽입 DNA에 연결될 수 있고, 이어서 삽입 DNA는 상기 부위에서 절단하는 제한 요소에 의해 소화된다. 다른 방법들도 또한 사용될 수 있다.
ProCPB 또는 CPB를 암호화하는 서열을 포함하는 본 발명의 벡터는 예를 들어 CHO, 치킨 엠브리오(chicken embryo), 피브로블라스트(fibroblast), 신장(kidney) 또는 알려진 다른 세포주(cell line)와 같은 포유동물 세포, 곤충 세포(insect cells), 균류, 효모, 또는 세균인 광범위한 원핵 및 진핵 숙주세포(prokaryotic and eucaryotic host cells)에서의 발현을 위해 변형될 수도 있다.
상기 벡터들은 숙주 세포에서 클로닝된 유전자의 발현을 위해 필요한 조절요소(regulatory elements)를 추가로 포함하며, 상기 조절요소는 ProCPB 또는 CPB를 암호화하는 핵산에 대해 핵산이 발현하게끔 위치한다.
발현에 요구되는 조절요소는 프로모터 및 오퍼레이터 서열과 리보솜 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 세균 발현 벡터는 λPLOL또는데오프로모터(deopromoters)와 같은 프로모터-오퍼레이터 서열을 포함할 수도 있다. 번역의 개시를 위해, λCII또는데오리보솜 결합 부위를 사용할 수 있다. 이러한 벡터는 상업적으로 구입하거나 당해 기술분야에 주지된 방법에 의해 기술된 서열들로부터 조립할 수 있다.
예를 들어 1989, 5.16에 특허된 함께 양도된 미국 특허번호 4,831,120과 1992, 9.1에 특허된, 함께 양도된 미국 특허번호 5,143,836은 λPL 프로모터에 관한 방법을 개시하고 있다. 또한 함께 양도된 유럽특허출원 공개번호 303,972는데오프로모터에 관한 방법을 개시하고 있다. 리프레서(repressors)와 인핸서(enhancers)와 같은 적절한 추가 요소 또한 있을 수도 있다. 당업자들은 다양한 발현 시스템을 위해 절절한 조절 요소를 사용하는 방법을 알고 있다.
본 발명의 발현 플라스미드는 적합한 숙주 세포에서 ProCPB 또는 CPB 폴리펩티드를 발현하기 위해 ProCPB 또는 CPB 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 대해 플라스미드 내에 위치하는 적합한 조절요소를 포함한다. 이러한 조절요소는 예를 들어데오P1P2및 λPL과 같은 오퍼레이터와,데오및 CII인 리보솜 결합 부위와, 프로모터와, 리프레서와, 인핸서들이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 조절요소는 ProCPB 또는 CPB를 암호화하는 DNA에 가까운 업스트림에 위치한다.
본 발명의 플라스미드는 ATG 개시 코돈(ATG initiation codon)을 또한 포함한다. ProCPB 또는 CPB를 암호화하는 상기 DNA는 ATG 개시 코돈과 같은 위상에 있다.
본 발명의 플라스미드는 호스트 세포에서 자가 복제(autonomous replication)를 할 수 있는 세균 플라스미드로부터 유래한 복제기점을 포함하는 DNA 서열을 포함한다. 적합한 복제기점은 플라스미드 pBR322(ATCC 수탁번호 37017)와 같은 수 많은 소오스로부터 얻을 수도 있다.
본 발명의 플라스미드는 앰피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 테트라시클린(tetracycline)에 대한 저항성인 약물 저항성 유전자와 같은, 플라스미드가 숙주세포에 있을 때 선택가능하거나 식별가능한 표현 형질(phenotypic trait)과 관련된 유전자를 포함하는 DNA 서열을 또한 포함한다.
바람직한 세균 숙주세포는이. 콜라이세포이다. 적합한이. 콜라이세포의 예는 스트레인(strain) 4300이지만, 다른이. 콜라이스트레인과 다른 세균도 플라스미드를 위한 호스트(hosts)로서 또한 사용될 수 있다.
호스트로 사용되는 상기 세균은 (A1645와 같은) 옥소트로픽(auxotrophic), (A4255와 같은) 프로토트로픽(prototrophic), 및 리틱(lytic) 스트레인; F+및 F-스트레인; (A1645 및 A4255와 같은) λ프로파지(λ prophage)의 cI857리프레서 서열을 가지는 스트레인과데오리프레서 및/또는데오유전자가 없는 스트레인을 포함하는 여하한 스트레인일 수도 있다 (1989, 2.22일에 공개된 유럽 특허 출원 공개 번호 0303972를 참조).이. 콜라이스트레인 4300은 ATCC 수탁번호 69363으로 수탁되어 있다.
상기한 모든이. 콜라이호스트 스트레인에서 예를 들어Bacteriol. Review 33, 210 (1969)에서 R.P. Novick에 의해 기술된 에티디움 브로마이드 방법(ethidium bromide method)과 같은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 상기 스트레인이 가지는 플라스미드를 제거할 수 있다.
본 발명은 ProCPB를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 세포를, 상기 DNA가 ProCPB의 발현을 지시하게끔 처리하는 단계와, 세포로부터 발현된 ProCPB를 회수하는 단계와, ProCPB의 폴딩을 허용하는 조건 하에서 회수된 ProCPB를 처리하는 단계와, 효소적으로 활성인 CPB를 생산하기 위해 상기 폴딩된 ProCPB를 효소분해하는 단계와, 상기 효소적으로 활성인 CPB를 정제하는 단계를 포함하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 재조합 세포로부터 ProCPB를 회수하는 단계는 용해물을 생산하기 위해 재조합 세포의 세포벽 또는 그의 절편을 붕괴하는 단계와, 원심분리로 용해물로부터 세포내 침전물을 분리하는 단계와, 적합한 버퍼에서 상기 세포내 침전물을 용해하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 회수된 ProCPB를 처리하는 단계는 실온에서, 약 20-24 시간동안, 약 pH 9-9.5로 상기 ProCPB를 인큐베이션하는 것을 포함한다.
또다른 구체예에서, 상기 회수된 ProCPB를 처리하는 단계는 실온으로, 약 20-24시간동안, 약 pH 9-9.5로 ZnCl2, 산화된 글루타티온(GSSG)와 환원된 클루타티온(GSH)의 존재 하에서 ProCPB를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
상기 폴딩된 ProCPB를 효소분해하는 단계는 pH를 약 8.5로 조절하는 단계와 트립신으로 37℃에서 약 60분동안 ProCPB를 절단하는 단계를 포함하는 것이 생각된다.
상기 효소적으로 활성인 CPB를 정제하는 단계는 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 포함하는 것이 또한 생각된다.
당해자들은 어떠한 이온-교환 크로마토그래피든지 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. DEAE-세파로즈(DEAE-Sepharose)와 같은 약 음이온 교환 칼럼(weak anion exchange column)이 바람직하다. 약 음이온 교환 칼럼은 작용기(function group)로서 삼차 아민(tertiary amine (diethylaminoethyl))을 가지지만, 사차 아민 에틸(quaternary amine ethyl) 또는 사차 아민(quaternary amie) 또한 사용될 수도 있다.
매트릭스는 무기 화합물, 합성 수지, 다당류(polysaccharides), 또는 유기 폴리머에 기초할 수도 있으며; 가능 매트릭스들은 아가로스, 셀룰로스, 트리스아크릴(trisacryl), 덱스트란(dextran), 글래스 비드(glass beads), 옥시란 아크릴 비드(oxiran acrylic beads), 아크릴아미드(acrylamide), 아가로스/폴리아크릴아미드 코폴리머, 또는 친수성 비닐 폴리머이다.
상기 효소적으로 활성인 CPB를 정제하는 단계는 이온-교환 크로마토그래피와 소수성 크로마토그래피를 포함하는 것이 또한 생각된다.
당해자들은 어떠한 친수성 칼럼이든 사용될 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 페닐-세파로스(Penyl-Sepharose)가 바람직하다. 상기 작용기는 페닐, 벤질, 옥틸(octyl), 또는 부틸(butyl)일 수도 있다. 상기 매트릭스는 상기한 페닐, 벤질, 옥틸, 및 부틸 중 어떤 것이 될 수도 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 효소적으로 활성인 CPB를 정제하는 단계는 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 그리고 디아필트레이션(diafiltration)을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 ProCPB는 ATCC 수탁번호 69673으로 기탁된 플라스미드 pλProCPB에 의해 발현된다.
본 발명은 포유동물의 기원의 다른 물질이 없는 효소적으로 활성인 CPB를 또한 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기위한 것이며, 결코 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며 그렇게 해석되어서도 않된다. 실시예들은 벡터의 제작, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 그러한 벡터내로의 삽입 또는 그렇게해서 합성된 플라스미드의 숙주로의 도입에서 사용된 종래 방법에 대해서는 자세한 설명을 포함하고 있지 않는다. 또한 실시예들은 그러한 숙주 벡터 시스템에 의해 생산된 폴리펩티드를 분석하기 위해 사용된 종래 방법에 대해서도 자세한 설명을 포함하고 있지 않는다. 그러한 방법들은 당 기술분야에서의 당업자에게는 잘 알려진 것이며 많은 간행물에 개재되어 있다. 상기 간행물의 개시내용은 하기 예를 포함해서 본 명세서에 참고로 삽입된다:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. 와 Maniatis, T.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
실시예 1: PCR에 의한 래트 카르복시펩티다제 B cDNA의 클로닝
Ⅰ.DNA 증폭
전체 RNA를 스프레그-돌레이 레트(sprague-dawley rat)의 췌장에서 추출했다. 전체 RNA로 부터, 40μg의 폴리A+mRNA를 분리했다(올리고 dT-셀룰로스 칼럼에 의해 분리). 그렇게 얻은 폴리A+mRNA의 부분표본(an aliquot)(10μg)을 합성 카르복시펩티다제 B 3'-말단 프라이머의 존재하에 역전사 반응에서 주형(a template)으로 사용하였다(5)(도 1).
단일 가닥의 상보 DNA(ss-cDNA)를 합성한 다음, 상기 mRNA를 에탄올로 침전시켰다. 이어서 ss-cDNA의 부분표본을 PCR 증폭시켰다:
CPB(940 bp)를 암호화하는 DNA의 증폭을 위해, 카르복시펩티다제 B의 3'-말단에 상응하는 합성 프라이머와 성숙한 카르복시펩티다제 B의 5'-말단에 상응하는 합성 프라이머를 사용했다(도 1).
ProCPB(1230 bp)를 암호화하는 DNA의 증폭을 위해, 카르복시펩티다제 B의 3'-말단에 상응하는 합성 프라이머와 프로카르복시펩티다제 B의 5'-말단에 상응하는 합성 프라이머를 사용했다(도 1).
PCR 증폭 조건은 다음과 같다:
1. 프라이머 3'-말단 2μg
2. 프라이머 5'-말단 2μg
3. ss-cDNA 5μl
4. 버퍼:
dNTP's 0.2mM
Tris-HCl 50mM
KCl 20mM
MgCl28mM
5. 태그 폴리머라제 Ⅰ2.5 단위(units)
전체 부피: 100μl
6. 천연 오일(증발에 대비하여) 50μl
7. 1 사이클 x [92℃에서 1'; 40℃에서 2' 그리고 72℃에서 4']
8. 35 사이클 x [92℃에서 1'; 53℃ 에서 2' 그리고 72℃에서 3']
9. 1 사이클 x [92℃에서 1'; 53℃ 에서 2' 그리고 72℃에서 15']
PCR 증폭 산물을 1% 아가로스 겔상에서 분석했다. 비증폭된 대조구(controls)와 사이즈 마커(size marker)도 또한 포함되었다. 약 940 bp와 1230 bp의 별개의 두 개의 밴드를 관찰했다. 940 bp 밴드는 CPB 뉴클레오티드 서열을 나타내고 1230 bp 밴드는 활성화 펩티드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ProCPB 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
PCR 증폭한 다음, DNA를 반응 혼합물로 부터 클로로포름과 페놀 추출 및 암모니움 아세테이트 그리고 이소프로판올 침전에 의해 정제했다.
Ⅱ.플라스미드 pCPB
CPB cDNA를BamHⅠ와NcoⅠ로 소화시키고 겔 정제한 다음에 상기 절편을, 세균에서 발현하기에 필요한 하기 요소들을 암호화하는 플라스미드 pABN의 2500 bpBamHⅠ와NcoⅠ절편내로 서브클로닝시킴으로서 플라스미드 pCPB(도 2)를 제작했다:
ⅰ) 유도, 즉 온도민감성 리프레서 cI857을 불활성화하는 30℃에서 42℃로의 온도전이에 의해를 옮김으로서이.콜라이세포로 부터 유전자 발현이 가능한 λPL프로모터;
ⅱ)데오리보솜 결합 부위(rbs);
ⅲ) trp 전사 터미네이터(8);
ⅳ) 플라스미드 pBR322의 앰피실린 저항성 유전자; 그리고
ⅴ) pBR322 복제기점.
Ⅲ.플라스미드 pCPB-C
자연적으로 발생하는 카르복시펩티다제 B 아미노산 서열은 7 개의 시스테인 잔기를 포함하고, 그 중 6개는 S-S 결합으로 쌍을 이루고 그 중 하나(Cys290)는 유리 시스테인 잔기이다(1). 이 유리 시스테인 잔기가 재조합 CPB를 다시 폴딩하는 동안 바람직하지 못한 분자간 또는 분자내 S-S 결합을 형성할지도 모른다고 믿었다. Cys290은 촉매 부위에서도 카르복시펩티다제 B의 기질 결합 부위에서도 존재하지 않고 겉보기에는 효소의 효소 활성에도 필요하지 않다(1,2). 따라서, 이 시스테인을 세린으로 교체된 CPB를 생산하는 것을 결정하였고; 이 CPB를 CPB-C로 정한다.
2개의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 A 5' 말단 인산화 올리고뉴클레오티드를 제조했다:
카르복시펩티다제 B에서 원래 서열
돌연변이체 서열
이 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Cys290을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도 2에 나타난 바와 같이 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 플라스미드 pCPB에서 세린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 치환했다. 새롭게 얻은 플라스미드를 pCPB-C로 정했다.
Ⅳ.플라스미드 pProCPB-C
ProCPB-C 뉴클레오티드 서열(Cys290- Ser 돌연변이를 함유함)을 가지는 pProCPB-C로 정해진 플라스미드를 제작하고(도 3) 이것을 사용하여이.콜라이4300을 형질전환시켰다.
Ⅴ.플라스미드 pλProCPB
ProCPB 뉴클레오티드 서열을 포함한 pλProCPB로 정해진 플라스미드를 제작하고(도 3) 이것을 사용하여이.콜라이4300을 형질전화시켰다. 이 플라스미드를 1994년 8월 4일 ATCC에 ATCC 수탁번호 69673로 기탁하였다.
플라스미드 pCPB, pCPB-C, pλProCPB, pProCPB-C로 부터 플라스미드 DNA를 제조하고, 제한 효소 분석과 뉴클레오티드 시퀀싱을 행하여 올바른 서열의 존재를 확인했다.
실시예 2: ProCPB와 CPB의 발효, 성장 조건 그리고 정제
Ⅰ.스톡 배양(stock cultures)
플라스미드 pλProCPB를 가지는이.콜라이4300의 스톡 배양물을 앰피실린(100μg/ml)으로 보충된 100 ml LB 배지상에서 성장시켰다.
Ⅱ.접종(Inoculum)
상기 접종물을 30℃에서 세포 농도가 2.0의 O.D.660에 도달할 때까지 앰피실린(100μg/ml)으로 보충된 100ml LB 배지에서 증식시켰다.
생산 배지(LB 배지 + 앰피실린(100μg/ml))를 접종시키고, 30℃에서 인큐베이션시키고, 통기, 진탕시키고 그리고 pH를 NH3로 7.2에서 유지하였다. 20 그램의 글루코스를 성장과정 동안에 상기 배양물에 가했다. 세포 농도가 12의 O.D.660에 달하면, 온도를 42℃까지 높여서 ProCPB의 발현이 가능하게 했다. 2시간 후에, 세포 농도는 22 내지 29의 O.D.660에 도달했고 세균을 수확했다.
Ⅲ.정제(Purification)
플라스미드 pλProCPB에 의해 발현된 ProCPB는 세포내 침전물내에 축적되었고 이것은 하기 방법에 의해 분리되었다: 40 그램(습식 무게)의 세균 케이크를 1mM PMSF(시그마), 50mM Tris-HCl, pH 8, 10mM EDTA를 함유한 450ml 버퍼에 현탁시키고 37℃에서 2시간 동안 최종 농도가 50μg/ml이 되도록 리소자임(시그마)으로 처리하였다.
이어서 상기 혼합물을 초음파처리하고 트리톤 X-100(Merck)을 최종 농도가 2%가 되도록 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 세포내 조침전물을 원심분리(14000 rpm, 30분, 4℃)에 의해서 펠릿으로 만들고 물로 세척하였다.
ProCPB를 포함하는 세포내 침전물을 25mM NaCl, 8M 우레아, 10mM DTT, 20mM Bis-Tris pH 7을 포함하는 버퍼 B에 용해시켰다. 상기 용액을 버퍼 B에서 평형화된 DEAE-세파로스 페스트 플로우 칼럼상에서 크로마토그래피를 하고, 상기 단백질을 버퍼 B중의 약 100mM NaCl로 용출시키고 ProCPB를 (NH4)2SO4로 0℃에서 40% 포화로 침전시켰다.
후에 효소적으로 활성인 CPB는 전구 단백질의 생산을 거쳐서만 생산될 수 있었다는 것을 발견했다. 하지만, 처음에는, 폴리펩티드 CPB와 CPB-C를 위에서 설명된 ProCPB의 생산과 유사한 방법으로 생산하고; ProCPB-C 또한 유사하게 생산했다. 사용된 플라스미드는 각각 pCPB, pCPB-C와 pProCPB-C이다(실시예1에서 설명된 바와 같다). 이러한 플라스미드를 가지는이.콜라이의 성장 조건과 폴리펩티드의 정제는 ProCPB에 대해 상기한 바와 실질적으로 같았고, 단지 재조합 CPB 또는 CPB-C를 포함하는 세포내 침전물을 용해시키기 위해 사용된 버퍼가 20mM 에탄올아민 pH 9, 10mM DTT 및 8M 우레아를 포함한 것만이 달랐다.
각각의 경우에서, 상기한 바와 같이 생산되고 정제된 폴리펩티드는 여하한 효소적 활성을 가지지 않았다는 것을 주목하기 바란다. 효소적으로 활성인 단백질을 생산하려고 행한 폴리펩티드의 폴딩을 실시예 3에서 설명한다.
실시예 3: ProCPB-C의 폴딩 그리고 활성화
폴리펩티드 CPB와 CPB-C를 실시예 2에서 설명된 것과 같이 생산했지만, 효소적 활성을 가지지 않는다는 것을 알아냈다. 공지된 폴딩 방법(하기에 설명)을 사용했지만 효소적으로 활성인 단백질을 얻지 못했다.
효소적으로 활성인 단백질을 얻을 수 없는 문제점을 해결하기 위해서, 전구 단백질의 발현과 폴딩한 다음 상기 폴딩된 전구 단백질의 활성화 펩티드 부분을 제거하기 위한 처리를 포함하는 다른 방법을 개발했다. 이 방법은 하기와 같은 절차를 가진다.
실시예 2에서 설명된 것과 같이 생산된 ProCPB-C를 8M 우레아, 5mM HCl중에 10mg/ml의 농도로 용해시키고 그리고 100mM 글리신, 0.2mM ZnCl2중에 pH 9, 10 그리고 11에서 1mg/ml이 되도록 희석시켰다. 이들은 폴딩 용액이었다.
폴딩을 상기 폴딩 용액을 17시간 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로서 행했다. 그렇게 생산된 ProCPB-C는 이 단계에서는 효소적 활성을 가지지 않았다(표 Ⅰ 참조바람).
이어서 폴딩된 ProCPB-C를 함유하는 상기 용액의 pH를 약 8.5까지 HCl로 조정하고 트립신(1:200 w/w)으로 30분 동안 37℃에서 처리하여 활성화 펩티드를 제거했다. 이 반응을 종결하기 위해, PMSF를 최종 농도가 0.1mM되도록 가했다.
그렇게 얻어진 폴딩된 CPB-C의 효소적 활성을 폴크(Folk)(1970)(11)에 따라 시험했다(표 Ⅰ): 활성의 일 단위(u)를 25℃에서 분 당 Hippuryl-L-Arg 기질 1 μmol의 가수분해를 촉매하고, 254nm 및 1cm 경로 길이에서 0.12의 흡광도의 증가를 야기시키는 효소의 양으로 정의한다. 시판용 돼지의 카르복시펩티다제 B(시그마)의 비활성도(specific activity)는 230u/mg이다.
각종 조건하에서 ProCPB-C(그리고 그것에서 유래된 CPB-C)의 비활성도
반응 비활성도(u/mg)
1. 기질만 0.0
2. pH 9에서 폴딩,트립신 처리,ProCPB-C 부재 0.0
3. pH 9에서 폴딩,트립신 처리 4.3
4. pH 9에서 폴딩만 0.0
5. pH 10에서 폴딩,트립신 처리 1.7
6. pH 11에서 폴딩,트립신 처리 0.3
7. 시판용 돼지의 CPB 230
표 Ⅰ은 상기 설명된 바와같은 예비 조건을 사용하여 ProCPB-C의 폴딩 그리고 상기 폴딩된 ProCPB-C의 트립신 처리후에 효소적으로 활성인 CPB-C가 얻어짐을 나타낸다.
표 Ⅰ은 또한 CPB-C의 비활성도가 폴딩 혼합물의 pH가 10 또는 11일 때보다 폴딩 혼합물의 pH가 9일 때 더 높음을 나타낸다.
실시예 4: 개선된 폴딩 조건
하기 실험들을 최적의 폴딩과 활성화 조건을 확립하기 위해 실행했다. 폴딩된 ProCPB-C의 트립신 절단에 의해 얻어진 CPB-C의 비활성도가 높으면 높을수록, ProCPB-C의 폴딩조건은 더욱 최적이라고 가정했다. 기질만과 시판용 돼지의 카르복시펩티다제 대조구를 하기 실험에 부가하여 실행했다.
처음에, 상기 결과(실시예 3에서 설명된 결과)는 폴딩을 pH 9.5에서 0.05 내지 0.1mg/ml ProCPB-C를 사용하여 행했을 때 개선되었다.
Ⅰ.ProCPB-C의 폴딩에 대한 온도의 효과
ProCPB-C의 폴딩을, 100mM 글리신, pH 9.5중에서 90시간 동안 10 내지 37℃사이의 온도에서 0.05 mg/ml 폴리펩티드를 인큐베이션시킴으로서 실행하였다. 폴딩된 ProCPB-C의 시료를 트립신(1:200 w/w)으로 처리하고 그렇게 얻어진 CPB-C의 비활성도를 실시예 3에서와 같이 측정하였다. ProCPB-C의 폴딩을 20 내지 30℃사이에서 수행했을 때, 가장 높은 CPB-C의 비활성도를 얻었다.
Ⅱ.ProCPB-C의 폴딩에 대한 산화된 글루타티온과 환원된 글루타티온의 효과
ProCPB-C의 폴딩을 100mM 글리신 버퍼 pH 9.5, 0.01mM ZnCl2중에서 25℃에서 산화 및/또는 환원된 글루타티온(GSSG/GSH) 또는 아스코르브산의 존재하에 0.05mg/ml 폴리펩티드를 인큐베이션시킴으로서 실행하였다(표 Ⅱ). 그런 다음에, 인큐베이션된 용액을 트립신(1:200 w/w)으로 1시간 동안 37℃에서 처리하고 CPB-C의 비활성도를 18과 45시간 후에 측정했다(실시예 3에서 설명된 바와 같다).
폴딩된 용액내에서 산화제/환원제의 존재의 함수로써의 CPB-C의 비활성도
폴딩 용액에 첨가된산화제/환원제 비활성도 (u/mg)
18 시간 45 시간
0.1mM GSSG 2.18 16.39
0.1mM GSSG, 1mM GSH 16.37 26.90
16.5μM 아스코르브산* 4.06 9.24
대조구(아무것도 첨가되지 않음) 1.19 5.39
* 아스코르브산을 SH기 1몰당 2.5 몰의 농도로 첨가했다.
표 Ⅱ는 GSSG와 GSH의 CPB-C를 함께 첨가하는 것은 비활성도의 극적인 증가와 그에 따라 아마도 ProCPB-C의 폴딩 효율성의 극적인 증가를 야기시킴을 나타낸다. GSSH 단독 첨가 또한 ProCPB-C의 폴딩 효율성을 증가시키고 비록 낮은 정도이지만 아스코르브산도 마찬가지이다.
또다른 일련의 실험에서 ProCPB-C의 최적의 폴딩이 0.1mM GSSG와 0.5mM GSH를 상기 폴딩용액에 첨가함으로서 얻어짐을 알아냈다.
Ⅲ.트립신에 의한 폴딩된 ProCPB-C의 활성화
가장 활성인 CPB-C는 활성화 펩티드를 제거하기 위해 ProCPB-C를 트립신으로 절단할 때 상기 인큐베이션된 폴딩 용액을 트립신 1:50 w/w로 1시간 동안 37℃에서 처리함으로써 얻어짐을 확립했다.
Ⅳ.PoCPB-C의 폴딩에 대한 pH의 효과
ProCPB-C의 폴딩에 대한 pH의 효과를 미리 최적화한 조건하에서 일련의 반응에서 결정하였다.
ProCPB-C의 폴딩은 100mM 글리신, 0.02mM ZnCl2, 0.5mM 환원된 글루타티온(GSH), 0.1mM 산화된 글루타티온(GSSG)중에서 0.1mg/ml의 농도에서 25℃에서 24시간 동안 다양한 pH 값(8.75-10.00)에서 실행하였다. 폴딩된 ProCPB-C의 시료를 트립신으로 처리하고(1:50w/w; 1mM HCl, 10mM CaCl2에 용해시킴), 그렇게 얻어진 CPB-C의 비활성도를 실시예 3과 같이 측정하였다.
가장 높은 CPB-C의 비활성도를 pH 9.25에서 ProCPB-C의 폴딩을 행했을 때 얻었다.
Ⅴ.ProCPB-C의 폴딩에 대한 ZnCl 2 의 효과
ProCPB-C의 폴딩에 대한 폴딩 용액에서 ZnCl2농도의 효과를 앞서 최적화한 조건하에서 일련의 반응으로 측정하였다. 추정된 CPB-C 농도(mol/mol)보다 ZnCl2농도가 2-20배 높을 때, 생산된 CPB-C의 비활성도는 가장 높았다. ZnCl2를 첨가하지 않고 폴딩을 수행했을 때, 그리고 EDTA를 폴딩 혼합물에 첨가하여 여하한 잔여의 2가 이온을 킬레이트화시킬 때, CPB-C의 비활성도는 0으로 감소했다.
Ⅵ.ProCPB-C의 폴딩에 대한 단백질 농도의 효과
ProCPB-C의 폴딩을 24시간 동안 최적 조건(위에서 설명된 바와 같음)하에서 표 Ⅲ에 나타낸 단백질 농도로 수행하였다. 트립신 소화후에 CPB-C의 활성을 실시예 3과 같이 측정하였다.
폴딩 용액내의 단백질 농도의 함수로써의 CPB-C의 비활성도
단백질 농도 (mg/ml) 비활성도 (u/mg)
0.05 35.1
0.10 31.8
0.20 20.3
표 Ⅲ는 생산된 CPB-C의 비활성도가 0.05mg/ml의 단백질 농도에서 가장 높음을 나타낸다.
Ⅶ.CPB-C의 비활성도의 함수로써의 폴딩 시간
ProCPB-C의 최적의 폴딩 시간을 앞서 최적화한 조건하에서 일련의 반응에서 판정하였다.
ProCPB-C의 폴딩을 100mM 글리신, pH 9.25, 0.1mM GSSG, 0.5mM GSH와 0.01mM ZnCl2중에서 0.1 mg/ml의 농도에서 수행했다. 폴딩된 ProCPB-C의 시료를 트립신(1:50w/w)으로 처리하고, 그렇게 얻어진 CPB-C의 비활성도를 실시예 3과 같이 폴딩시작에서 부터 다양한 시간점(0-40 시간)에서 측정하였다.
폴딩 시작에서 20시간 후에 상기 폴딩된 ProCPB-C를 트립신으로 분해했을 때 CPB-C의 가장 높은 활성을 얻었다. 20시간이상 행한 폴딩은 CPB-C의 비활성도를 변화시키지 않았다.
실시예 5: 상이한 CPB 단백질의 폴딩과 활성화
실시에 2와 같이 생산되고 정제된 CPB, CPB-C, ProCPB 그리고 ProCPB-C를 100 mM 글리신 버퍼, pH 9.25, 0.01mM ZnCl2, 0.5mM GSH, 0.1mM GSSG중에서 0.1 mg/ml에서 실온으로 24시간 동안 폴딩하였다. 다시 말하면, 사용된 폴딩 조건은 본질적으로 실시예 4에서 확립된 최적 조건이었다.
폴딩된 CPB, CPB-C, ProCPB 그리고 ProCPB-C를 포함하는 각 용액의 pH를 HCl로 8.5가 되도록 조정하고 ProCPB와 ProCPB-C를 포함하는 용액을 트립신(1:50 w/w)으로 1시간 동안 37℃에서 처리하여 활성화 펩티드를 제거했다. 상기 반응을 종결시키기 위해, PMSF를 최종농도가 0.1mM이 되도록 가했다. CPB, CPB-C, ProCPB 그리고 ProCPB-C의 비활성도를 실시예 3과 같이 측정하였다.
최적의 조건에서 폴딩과 활성화후에 CPB, CPB-C, ProCPB 그리고 ProCPB-C의 비활성도
폴딩 비활성도(u/mg)
대조구1- 트립신 처리않함 0.00
- 단백질 없음 0.00
폴딩 - CPB 0.00
- CPB-C 0.08
- ProCPB 42.90
- ProCPB-C 20.90
1트립신 처리않함 대조구는 ProCPB-C에 대해서만 행했다.
표 Ⅳ는 활성화 펩티드를 포함하는 전구체를 발현시키는 세포로 부터만 효소적으로 활성인 CPB가 생산될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 활성화 펩티드는 CPB의 올바른 폴딩을 위해 필요하다.
표 Ⅳ는 또한 Cys290- Ser 돌연변이를 포함하는 ProCPB-C의 폴딩과 활성화로 부터가 아닌 유리 Cys290잔기를 포함하는 ProCPB(플라스미드 pλProCPB에 의해 발현됨)의 폴딩과 활성화로 부터 최적의 비활성도를 가진 CPB가 생산된다는 것을 나타낸다. 따라서, Cys290은 분명히 CPB의 최적의 폴딩 및/또는 가장 높은 활성을 위해 필요하다.
실시예 6: ProCPB의 개선된 폴딩
Ⅰ.세포내 조침전물의 ProCPB의 폴딩
ProCPB를 위한 최적의 폴딩 조건이 본질적으로 실시예 4에서 결정된 ProCPB-C를 위한 최적의 폴딩 조건과 동일하다는 것이 밝혀졌다.
세포내 조침전물을 사용하여 ProCPB의 폴딩과 활성화를 위한 단순화된 방법을 수행함으로서 실시예 2, Ⅲ부분에서 설명한 것과 같은 초기 정제 단계의 필요성이 없어졌다.
ProCPB(실시예 2에서 설명된 것과 같이 생산된 ProCPB)를 포함하는 세포내 조침전물이 100mM 글리신, pH 9.5 그리고 8M 우레아에 고도의 단백질 농도(표 Ⅴ)로 용해될 수 있다는 것을 알아냈다.
폴딩을 최적화된 조건하에서 24시간 동안 실온에서 수행하였다. pH를 최적 pH 9.5(미리 결정된 pH)까지 올렸다. 폴딩된 ProCPB를 트립신(1:50w/w)으로 절단하고 CPB의 비활성도를 실시예 3에서 설명한 것과 같이 측정하였다.
세포내 조침전물을 포함하는 폴딩 용액에서 단백질 농도의 함수로써의 CPB의 비활성도
단백질 농도(mg/ml) 비활성도(u/mg)
0.1 10.5
0.2 10.9
0.5 11.9
1.0 12.1
2.0 11.4
표 Ⅴ는 세포내 조침전물의 ProCPB의 폴딩과 그 다음 트립신 소화에 의해 효소적으로 활성인 CPB가 얻어 질 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 CPB는 측정된 모든 단백질 농도에서 비슷한 수준으로 효소적으로 활성이다. 폴딩하기 전에 DEAE-세파로스상에서 정제된(실시예 2) CPB의 비활성도가 폴딩 혼합물내에서 단백질 농도가 증가할 때 감소했기 때문에, 이는 예측하지 못한 결과이다. 분명히, 세포내 침전물은 ProCPB의 폴딩을 돕는 인자를 포함한다.
Ⅱ.세포내 조침전물의 ProCPB의 폴딩에 의한 CPB의 증가(scaling up)
(ⅰ) 생산
CPB를 플라스미드 pλProCPB를 가지며 ProCPB를 발현시키는 42 리터의이.콜라이4300으로 거의 균일하게 되도록 정제했다. 발효와 성장 조건은 본질적으로 실시예 2와 같았다.
세포내 조침전물을 물로 세척하고 100mM 글리신, pH 9.5, 8M 우레아에 20mg/ml로 용해시키고 1mg/ml까지 되도록 100mM 글리신, pH 9.5로 희석시켰다. 0.1mM ZnCl2, 0.5mM GSH와 0.1mM GSSG를 가하고 그 결과로 만들어진 폴딩 용액을 25℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 pH를 8.5가 되도록 HCl로 조정하고 폴딩된 ProCPB를 트립신(20μm/ml)으로 37℃에서 1시간 동안 소화시켰다. 트립신을 0.1mM PMSF로 불활성화시켰다.
(ⅱ) 정제
효소적으로 활성인 CPB를 20mM Tris-HCl, pH 8로 평형화시킨 DEAE-세파로스 패스트-플로우 칼럼(파마시아(Pharmacia))상에 수지 ml 당 20mg으로 적하시켰다. CPB를 80mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8로 용출시켰다. 황산 암모니움(0.8M)을 DEAE 용출풀(elution pool)에 가하고 이것을 20mM Tris-HCl, pH 8, 0.8M 황산 암모니움으로 평형화시킨 페닐-세파로스 패스트-플로우 칼럼(파마시아)상에서 추가로 크로마토그래피했다. CPB를 0.4M 황산 암모니움으로 용출시키고, 농축시켜서 100mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8에 대해 디아필트레이션시키고 -20℃에서 저장했다.
상기 정제 과정에서, O.D.660=36인 플라스미드 pλProCPB를 가지는 42 리터의이.콜라이4300를 위에서 설명한 것과 같이 처리하고 637 u/mg의 비활성도를 가지는 1.25그램의 효소적으로 활성인 CPB를 얻었다. 전체 공정 수율은 약 60%였다.
동일한 실험 조건하에서 측정된 시판용 돼지의 카르복시펩티다제 B의 비활성는 298u/mg이었다.
실시예 7: 효소적으로 활성인 CPB의 특성
실시예 5와 6에서와 같이 생산된 CPB는 돼지 카르복시펩티다제 B와 비견할 만한 생화학적 특성과 효소적 특성을 가진다.
재조합 CPB의 아미노산 조성물을 기초로하여 계산한 재조합 CPB의 흡광계수(extinction coefficient)는 ε1% 280=19.7이다. 시판용 돼지의 카르복시펩티다제 B의 흡광계수는 ε1% 280=21.4이다(1).
재조합 CPB는 637u/mg의 비활성도(Hippuryl-L-Arg 기질)를 가지며 원자 흡광에 의해 측정된 바와 같이 효소 mol당 Zn 1 mol을 포함한다.
N-말단 아미노산 서열 분석은 성숙한 래트 카르복시펩티다제 B의 아미노산 서열 분석으로 예상된 바와 같이(5) Ala-Ser-His-Ser를 나타냈다.
재조합 CPB 활성을 위한 최적의 pH는 25mM의 하기 버퍼: NaOAc, pH 4-6와; Bis-Tris, pH 6-7.5와; Tris-HCl, pH 7.5-9와; 그리고 글리신, pH 9-12을 사용하여 결정했다. CPB 비활성를 실시예 3과 같이 측정했다. CPB의 최적의 효소 활성을 pH 8에서 얻었다. 55℃에서 CPB의 인큐베이션하는 것은 활성의 50% 손실을 초래하고 완전한 불활성화는 65℃에서 일어났다.
재조합 CPB의 반응속도법 분석(kinetic analysis)을 Hippuryl-L-Arg 기질을 사용하여 행했다(도 4). 0.5mM 이상의 기질 농도에서 CPB 활성의 억제가 있었다.
추가 연구결과 재조합 CPB가 카르복시펩티다제 B의 경쟁 억제제인 촉매작용 산물 아르기닌에 의해 억제된다는 것이 밝혀졌다. 해당 라인웨버-버크 곡선(Lineweaver-Burk curve)은 0.38mM의 Km 값을 보였다.
재조합 CPB는 또한 강한 2가 이온 킬레이터인 1,10-페난트롤린에 의해 억제되고, 따라서 CPB의 효소 활성에 대한 Zn 이온의 중요성을 증명했다. 1mM 1,10 페난트롤린의 존재하에서, 1mg/ml 재조합 CPB 활성의 50% 손실이 관찰된다.
실시예 8: CPB에 의한 프로인슐린의 인슐린으로의 전환
EP 347781 B1에서 설명된 것과 같은 미니-프로인슐린을 트립신과 실시예 5와 6에서 생산된 것과 같은 재조합 CPB로 처리함으로서 인슐린으로 전환시킬 수도 있다.
트립신은 특이적으로 아르기닌 잔기와 A 사슬사이를 절단한다. 그 다음에 CPB는 특이적으로 B 사슬의 C-말단에서 아르기닌 잔기를 가수분해한다.
시판용 인간 인슐린(Boegringer-Mannheim)을 트립신과 시판용 돼지의 카르복시펩티다제 B에 의해 분해된 미니-프로인슐린과 트립신 단독에 의해 분해된 미니-프로인슐린과 마찬가지로 표준으로 사용할 수도 있다.
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(1) 일반 정보:
(ⅰ) 출원인: 바이오-테크놀로지 제너럴 코퍼레이션
(ⅱ) 발명의 명칭: 효소적으로 활성인 재조합 카르복시펩티다제 B의 생산
(ⅲ) 서열의 개수: 8개
(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이:36 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: cDNA
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
(ⅳ) 안티-센스: 아니오
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이: 285 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: cDNA
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
(ⅳ) 안티-센스: 아니오
(ⅸ) 특징적 부분:
(A) 명칭/키:CDS
(B) 위치: 1..285
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이: 95 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: 단백질
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 3:
(2)서열 번호 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: cDNA
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
(ⅳ) 안티-센스: 아니오
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: cDNA
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
(ⅳ) 안티-센스: 아니오
(ⅸ) 특징적 부분:
(A) 명칭/키:CDS
(B) 위치: 1..927
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: 단백질
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 6:
(2) 서열 번호 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: cDNA
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류: cDNA
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
(xi) 서열의 기술: 서열 번호 8:

Claims (10)

  1. (a) ProCPB를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 세포를, 상기 DNA가 ProCPB의 발현을 지시하도록, 처리하는 단계와;
    (b) 상기 발현된 ProCPB를 세포로부터 회수하는 단계와;
    (c) 상기 ProCPB의 폴딩(folding)을 허용하는 조건 하에서 회수된 ProCPB를 처리하는 단계와;
    (d) 효소적으로 활성인 CPB를 생산하기 위해 상기 폴딩된 ProCPB를 효소분해하는 단계와;
    (e)상기 효소적으로 활성인 CPB를 정제하는 단계를 포함하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    회수하는 단계(b)는 (ⅰ) 용해물을 생산하기 위해 재조합 세포의 세포벽 또는 그의 절편을 붕괴하는 단계와;
    (ⅱ) 원심분리를 통해 상기 용해물로부터 세포내 침전물을 분리하는 단계와;
    (ⅲ) 상기 세포내 침전물을 용해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법.
  3. PCT 공개사본에 기재되어 있지 않음
  4. PCT 공개사본에 기재되어 있지 않음
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 단계(d)는 (ⅰ) pH를 약 8.5로 조절하는 단계와;
    (ⅱ) 트립신으로 37℃에서 약 60분동안 ProCPB를 절단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 정제하는 단계(e)는 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 정제하는 단계(e)는 이온-교환 크로마토그래피와 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography)를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 정제하는 단계(e)는 이온-교환 크로마토그래피와, 소수성 크로마토그래피와, 디아필트레이션(diafiltration)을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 ProCPB는 ATCC 수탁번호 69673 하에 기탁된 플라스미드 pλProCPB에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 효소적으로 활성인 CPB의 생산 방법.
  10. 포유동물 기원의 다른 물질이 없는 효소적으로 활성인 CPB.
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