JP2729045B2 - サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents
サルコシンオキシダーゼおよびその製造法Info
- Publication number
- JP2729045B2 JP2729045B2 JP7331733A JP33173395A JP2729045B2 JP 2729045 B2 JP2729045 B2 JP 2729045B2 JP 7331733 A JP7331733 A JP 7331733A JP 33173395 A JP33173395 A JP 33173395A JP 2729045 B2 JP2729045 B2 JP 2729045B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gly
- glu
- leu
- ser
- val
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規サルコシンオ
キシダーゼの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸を
保持してなる形質転換体により該ポリデオキシリボ核酸
の遺伝情報を発現せしめて得られるサルコシンオキシダ
ーゼの製造法に関する。 【０００２】 【従来の技術】サルコシンオキシダーゼは、次の反応
式、 サルコシン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒ
ド＋Ｈ2 Ｏ2 の反応式で示されるようにそれぞれ１分子のサルコシ
ン、酸素および水からそれぞれ１分子のグリシン、ホル
ムアルデヒドおよび過酸化水素を生ずる反応を触媒する
酵素であって、自然界、特に動物臓器中に存在すること
が古くから知られており、また、ペニシリウム属（Peni
cillium)、シュードモナス属（Pseudomonas）〔以上 F
risell, W. R.＆ Mackenzie, C. G. (1970) Meth. Enzy
mol. 17A, 976 - 981〕、アルスロバクター属（Arthrob
acter) 〔特開昭５４−２８８９３号公報〕、バチルス
属（Bacillus）〔特開昭５４−５２７８９号公報，特開
昭６１−１６２１７４号公報〕、シリンドロカルポン属
（Cylindrocarpon）〔特開昭５６−９２７９０号公
報〕、シュードモナス属（Pseudomonas)〔特開昭６０−
４３３７９号公報〕、ストレプトミセス科（Streptomyc
etaceae ）〔特開昭６１−２８０２７１号公報〕に属す
る微生物に存在することが報告されている。 【０００３】この、サルコシンオキシダーゼは、サルコ
シンを基質とする酸化酵素であるので、血清などの体液
中に存在するサルコシンの定量に使用されるが、この酵
素は、これのみに留まらずクレアチニン或いはコリン代
謝系に関与しているので、特に前者の代謝系の他の酵素
即ちクレアチニナーゼ、クレアチナーゼと共役反応せし
めて、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成せし
め、それらの一方または両方を定量することにより、ク
レアチニン、クレアチンを簡便且つ特異的に定量するこ
とが可能である。従って、クレアチニン又はクレアチン
の従来の非特異的な化学的定量法に代わる生化学的定量
法における主要酵素となるもので、臨床診断分野、研究
分野において極めて有用である。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】従来より報告されてい
るサルコシンオキシダーゼ生産菌は、サルコシンオキシ
ダーゼの生産性が低く、もともと製造コストが高くなる
という難点があるだけでなく、製造時において、コリ
ン、サルコシンまたはクレアチン等のサルコシンオキシ
ダーゼ生産を誘導する物質の添加が必須であったため、
製造コストがより高いものとなり、また培養後において
の共存する他種酵素等の除去が非常に困難で、純度の高
い良質なサルコシンオキシダーゼを得るための精製工程
及びコストの面で問題があり、研究用試薬、臨床診断用
試薬として安易に広く用いるには必ずしも満足のいくも
のではなかった。 【０００５】ただ、最近、耐熱性菌より得られた耐熱性
サルコシンオキシダーゼは、加熱処理することにより、
夾雑酵素（例えばカタラーゼ，ウリカーゼ等）の活性を
完全に失活させることが可能である〔特開昭６１−１６
２１７４号公報〕と報告されているが、耐熱性菌由来の
夾雑酵素（例えばカタラーゼ，ウリカーゼ等）は何れに
しても多少の耐熱性を有し、実際、上述の公報記載の如
く夾雑酵素を完全に失活させることは非常に困難であっ
た。 【０００６】また、以下の理化学的性状を有するサルコ
シンオキシダーゼの詳細な一次構造は報告されていな
い。 （ａ）作用 サルコシン、一分子の酸素および一分子の水からグリシ
ン、ホルムアルデヒドおよび一分子の過酸化水素を生成
する下記の酵素反応を触媒する酵素である。 サルコシン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒ
ド＋Ｈ2 Ｏ2 （ｂ）基質特異性 サルコシンに基質特異性を有する 【０００７】 （ｃ）至適ｐＨ ８．０〜９．５ （ｄ）等電点 ４．７ （ｅ）分子量 ４万（ゲル濾過法により測定） （ｆ）熱安定性 ４０℃、１０分間処理で安定である。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、サルコシ
ンオキシダーゼについて、その生産性向上、共存する他
種酵素（夾雑酵素）の含量低減並びに製造コストの低減
を図るべく鋭意検討をおこなっていたところ、微生物中
から新規なサルコシンオキシダーゼ遺伝子の採取ならび
にその一次構造の解析に成功すると共に遺伝子工学的手
法を応用することによって、以下に述べる如く、高生産
性であり、且つ生産時培地中に誘導物質を必要としない
サルコシンオキシダーゼの製造法を確立した。 【０００９】すなわち、本発明は、以下の理化学的性状
を有するサルコシンオキシダーゼを構成成分としてなる
ポリペプチドの後述するアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含むポリデオキシリボ核酸を発現ベクターに組み
入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入して形質転換体
を得、該形質転換体を培養して該ポリデオキシリボ核酸
の遺伝情報を発現させ、次いで該サルコシンオキシダー
ゼを構成成分としてなるポリペプチドを採取してなる当
該サルコシンオキシダーゼの製造法である。 【００１０】また本発明は下記の理化学的性状を示し、 （ａ）作用 サルコシン、一分子の酸素および一分子の水からグリシ
ン、ホルムアルデヒドおよび一分子の過酸化水素を生成
する下記の酵素反応を触媒する酵素である。 サルコシン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒ
ド＋Ｈ2 Ｏ2 （ｂ）基質特異性 サルコシンに基質特異性を有する 【００１１】 （ｃ）至適ｐＨ ８．０〜９．５ （ｄ）等電点 ４．７ （ｅ）分子量 ４万（ゲル濾過法により測定） （ｆ）熱安定性 ４０℃、１０分間処理で安定である。 【００１２】かつサルコシンオキシダーゼ活性１単位に
対し、夾雑酵素であるカタラーゼ、クレアチナーゼ、Ｎ
−エチル−グリシンオキシダーゼの活性が、カタラーゼ
活性０．０５単位以下、クレアチナーゼ活性０．０００
４単位以下、Ｎ−エチル−グリシンオキシダーゼ活性
０．０３単位以下であるサルコシンオキシダーゼであ
る。 【００１３】さらに本発明のサルコシンオキシダーゼに
おける該ポリペプチドはＮ末端側より式 10 Ａ−Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala 20 30 Ala Gly Tyr Gln Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe 40 50 Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His 60 70 Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu 80 Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val 90 100 Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala 110 120 Ala Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys 130 140 Arg Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn 150 160 Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu 170 Ala Arg Gly Ala Lys Val Leu Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp Ile Ser 180 190 Pro Asp Ser Val Lys Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu 200 210 Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp 220 230 Ile Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu Ser 240 250 Lys Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro Asn Gly 260 Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His 270 280 Thr Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr 290 300 Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala 310 320 Asn Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu 330 340 His Phe Ile Ile Asp Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly 350 Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln 360 370 Leu Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg 380 Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile −Ｂ （Ｉ） 【００１４】（式中、Ａはアミノ酸残基，水素原子また
はアセチル基を示し、Ｂはアミノ酸残基，−ＯＨまたは
−ＮＨ2 を示す）で表されるサルコシン、１分子の酸素
および１分子の水からグリシン、ホルムアルデヒドおよ
び１分子の過酸化水素を生ずる反応を触媒するサルコシ
ンオキシダーゼを構成するポリペプチドであり、また該
形質転換体の取得には、該ポリデオキシリボ核酸を発現
ベクターに組み入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入
することにより目的が達成され、さらに該形質転換体を
培養して該ポリデオキシリボ核酸の遺伝情報を発現さ
せ、次いで上述の理化学的性状を有するサルコシンオキ
シダーゼの構成成分としてなるポリペプチドを採取して
なるサルコシンオキシダーゼの製造法に関するものであ
る。 【００１５】ポリペプチド（Ｉ）に関し、Ａで示される
アミノ酸残基としては、一個または複数個のアミノ酸残
基よりなり、Ａとしては、好ましくは、水素原子若しく
はＭｅｔまたはシグナルペプチドが挙げられる。Ｂで示
されるものとしては、酸アミドであってもよく、また一
個以上のアミノ酸残基であってもよい。 【００１６】上述の理化学的性状を有するサルコシンオ
キシダーゼの遺伝子であるポリデオキシリボ核酸として
は、少なくとも上述の理化学的性状を有するサルコシン
オキシダーゼの遺伝子それ自体を含むポリデオキシリボ
核酸であればよく、例えば該サルコシンオキシダーゼ遺
伝子それ自体としてはＮ末端側より式 【００１７】 10 Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala 20 30 Gly Tyr Gln Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp 40 50 Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala 60 70 Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Trp 80 90 Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu 100 Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala 110 120 Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys Arg 130 140 Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser 150 160 Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala 170 180 Arg Gly Ala Lys Val Leu Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp Ile Ser Pro 190 Asp Ser Val Lys Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu Ile 200 210 Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp Ile 220 230 Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu Ser Lys 240 250 Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro Asn Gly Ile 260 270 Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His Thr 280 Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro 290 300 Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn 310 320 Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu His 330 340 Phe Ile Ile Asp Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly Phe 350 360 Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln Leu 370 Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro 380 Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile （II） 【００１８】で表されるサルコシンオキシダーゼの構成
成分としてなるポリペプチドのアミノ酸配列を、コード
する塩基配列であるポリデオキシリボ核酸を挙げること
が出来る。 【００１９】また、式（II）で表されるサルコシンオキ
シダーゼであるポリペプチドのアミノ酸配列において、
各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちのいずれか１
個のコドンからなるポリデオキシリボ核酸であればよ
く、さらに該ポリデオキシリボ核酸の５’末端に１個以
上のナンセンスコドン以外のコドンおよび／または３’
末端に１個以上のコドンを有するポリデオキシリボ核酸
であってもよい。例えば、その代表例として５’末端側
より式 【００２０】 30 Ｘ−AGC ACA CAT TTT GAT GTC ATC GTT GTT GGA GCT GGA TCA ATG GGA ATG GCG 60 90 GCA GGT TAT CAA TTA GCA AAG CAA GGA GTC AAA ACA TTA TTA GTG GAT GCA TTT 120 150 GAT CCG CCG CAT ACA AAC GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACT CGT ATC ATC CGC CAT 180 210 GCT TAC GGT GAG GGA AGA GAA TAT GTT CCT CTT GCA TTA AGA TCA CAA GAG TTA 240 TGG TAT GAA CTA GAA AAA GAA ACA CAC CAT AAA ATA TTC ACG AAA ACG GGC GTA 270 300 CTC GTA TTT GGT CCT AAA GGT GAA TCG GCT TTC GTT GCA GAA ACG ATG GAA GCG 330 360 GCA AAG GAA CAT TCA TTG ACT GTT GAT TTA CTG GAA GGT GAT GAA ATA AAT AAG 390 420 CGT TGG CCG GGT ATA ACG GTT CCG GAA AAC TAC AAT GCT ATT TTC GAA CCG AAC 450 480 TCA GGT GTA TTA TTC AGT GAA AAT TGT ATT CGT GCC TAC CGC GAG TTA GCT GAA 510 GCG CGA GGT GCT AAA GTT CTA ACA CAT ACA CGC GTT GAG GAC TTT GAC ATT TCA 540 570 CCG GAC TCA GTC AAA ATC GAA ACA GCA AAT GGA TCA TAC ACA GCT GAT AAA TTA 600 630 ATT GTT AGC ATG GGA GCT TGG AAT AGC AAA CTA CTT TCA AAA CTA AAT CTT GAC 660 690 ATC CCA TTA CAG CCA TAT CGT CAA GTG GTA GGT TTC TTT GAA TCC GAT GAA TCA 720 750 AAG TAT AGC AAT GAT ATT GAT TTC CCA GGA TTC ATG GTT GAA GTG CCA AAT GGT 780 ATT TAT TAC GGA TTC CCA AGC TTC GGC GGC TGT GGA TTG AAA CTA GGA TAT CAT 810 840 ACG TTC GGG CAG AAA ATT GAC CCT GAT ACA ATT AAT CGC GAA TTT GGC GTT TAT 870 900 CCA GAA GAT GAA AGT AAT CTT CGC GCT TTC TTG GAA GAA TAT ATG CCA GGA GCA 930 960 AAT GGA GAG TTA AAA AGA GGG GCA GTC TGC ATG TAC ACG AAA ACA TTA GAT GAA 990 1020 CAT TTC ATT ATA GAC TTA CAT CCT GAA CAT TCC AAC GTA GTC ATC GCT GCC GGC 1050 TTC TCT GGC CAT GGA TTT AAG TTT TCC AGT GGA GTT GGT GAA GTG CTA AGT CAA 1080 1110 TTA GCT TTA ACT GGT AAA ACA GAG CAC GAT ATT TCA ATC TTC TCC ATT AAC CGT 1140 CCT GCT TTG AAA GAA TCG TTA CAA AAA ACA ACT ATC −Ｙ （III) （式中、ＸはTAA, TAGおよびTGA 以外のコドンまたは水
素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す）で表
される塩基配列を有するポリデオキシリボ核酸を挙げる
ことができる。 【００２１】式（III)で表される塩基配列に関し、Ｘで
示されるコドンは、アミノ酸をコードするコドンであれ
ばいずれでもよく、更に、その５’末端側にアミノ酸を
コードするコドンを１個以上有してもよいが、好ましく
はＡＴＧまたはシグナルペプチドに対応するポリデオキ
シリボ核酸を挙げることができる。 【００２２】Ｙで示されるコドンは、翻訳終止コドンま
たはアミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよ
く、更に、その３’末端側にアミノ酸をコードするコド
ンを１個以上有していてもよいが、その場合には、この
複数個のコドンの３’末端にさらに翻訳終止コドンを有
することが好ましい。 【００２３】サルコシンオキシダーゼ遺伝子を構成成分
としてなるポリデオキシリボ核酸または、式（II）で表
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝
子であるポリデオキシリボ核酸または、式（III)で表さ
れるポリデオキシリボ核酸は、例えばサルコシンオキシ
ダーゼを生産するサルコシンオキシダーゼ遺伝子の供与
体である微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した
後、超音波、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと
切断してリニヤーにした発現ベクターとを両ＤＮＡの平
滑または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより
結合閉環させる。 【００２４】斯くして得られた組換えＤＮＡベクターを
複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカ
ーとサルコシンオキシダーゼの活性とを指標としてスク
リーニングして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持
する微生物を培養し、該培養菌体から該組換えＤＮＡベ
クターを分離精製し、次いで該組換えＤＮＡベクターか
らサルコシンオキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリ
ボ核酸を採取すればよい。 【００２５】サルコシンオキシダーゼ遺伝子の供与体で
ある微生物としては、サルコシンオキシダーゼ産生能を
有する微生物であればよく、例えば、特開昭５４−２８
８９３号公報、特開昭５４−５２７８９号公報、特開昭
５６−９２７９０号公報、特開昭６０−４３３７９号公
報、特開昭６１−１６２１７４号公報、特開昭６１−２
８０２７１号公報などに示されているバチルス・エスピ
ー（Bacillus sp ）Ｂ−０６１８株、バチルス・エスピ
ー（Bacillus sp ）ＮＳ−１２９株等のバチルス科サル
コシンオキシダーゼ生産菌、アルスロバクター・ウレア
フアシエンス（Arthrobacter ureafashiense）ＩＦＯ
１２１４０株等のアルスロバクター属サルコシンオキシ
ダーゼ生産菌、シリンドロカルポン・デイデイマム（ハ
ルテイグ）ウオレンウイバー（Cylindrocarpon didymum
(Hartig) Wollenweber ）Ｍ−１株等のシリンドロカル
ポン属サルコシンオキシダーゼ生産菌、シュードモナス
・マルトフイリア（Pseudomonas maltophilia ）ＢＭＴ
Ｕ２５４株、シュードモナス・マルトフイリア（Pseudo
monas maltophilia ）ＢＭＴＵ２８８株等のシュードモ
ナス属サルコシンオキシダーゼ生産菌およびカイニア・
プルプロゲナ（Chainia purpurogena ）ＤＳＭ４３１５
６株，カイニア・オクラツエー（Chainia ochraceae ）
ＤＳＭ４３１５５株、ストレプトマイセス・フロツクル
ス（Streptomyces flocculus）ＤＳＭ４０３２７株、ス
トレプトフエテイシリウム・エスピー（Streptovertici
lliun sp）ＤＳＭ４０２３７株、キタサトア・プルプレ
ア（Kitasatoa purpurea）ＤＳＭ４３３６２株等のスト
レプトマイセス科サルコシンオキシダーゼ生産菌等の群
から適宜選ばれる。 【００２６】これらの内で、好ましくは、バチルス・エ
スピー（Bacillus sp)Ｂ−０６１８株のサルコシンオキ
シダーゼ生産菌が挙げられるが特に、上述の理化学的性
状を有するサルコシンオキシダーゼ産生能を有する微生
物が挙げられ例えば、特開昭５４−２８８９３号公報な
どに示されているバチルス・エスピー（Bacillus sp)Ｂ
−０６１８株が挙げられる。また、遺伝子組換え技術を
駆使して、該サルコシンオキシダーゼ産生能を付与せし
めた形質転換微生物をサルコシンオキシダーゼ遺伝子の
供与体として利用してもよい。 【００２７】遺伝子の供与体である微生物から由来する
ＤＮＡは次の如く採取される。即ち、供与微生物である
上述した微生物のいずれかを、例えば、液体培地で約１
〜３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離し
て集菌し、次いでこれを溶菌させることによって該サル
コシンオキシダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製すること
ができる。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ−
グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施さ
れ、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル
硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細
胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処
理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよい。 【００２８】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離、精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌク
レアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を
適宜組み合わせることにより行うことができる。 【００２９】分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方
法は、例えば、超音波処理、制限酵素処理などにより行
うことができるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの
結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌ
クレオチド配列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄIII 、ＢａｍＨＩなどのII型制限酵素が適してい
る。 【００３０】ベクターとしては、宿主微生物体内で自律
的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組
換え用として構築されたものが適している。ファージと
しては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）を宿主微生物とする場合には、λｇｔ・λＣ，λｇ
ｔ・λＢなどが使用できる。 【００３１】また、プラスミドとしては、例えば、エシ
ェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、
ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などが、バチルス
・ズブチルス（Bacillus subtillis）を宿主微生物とす
る場合には、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４などが使用で
き、さらに、エシェリヒア・コリおよびサッカロマイセ
ス・セレビシアなどのグラム陰・陽両性にまたがる二種
以上の宿主微生物体内で自律的に増殖可能なシャトルベ
クターを利用することもできる。このようなベクター
を、先に述べたサルコシンオキシダーゼ遺伝子供与体で
ある微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限
酵素で切断して、ベクター断片を得ることが好ましい。 【００３２】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベク
ター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮ
Ａリガーゼの作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断
片との組換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガ
ーゼを利用し組換えＤＮＡを作成することもできる。 【００３３】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発
現のできるものであればよく、例えば、宿主微生物がエ
シェリヒア・コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１、
エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＷ
３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用出来
る。 【００３４】宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法
としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属す
る微生物の場合には、カルシュウムイオンの存在下で組
換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する微生
物の場合には、コンピテントセル法またはリポソーム組
換えＤＮＡのプロトプラスト宿主細胞への電気的な融合
移入法などを採用することができ、更にマイクロインジ
ェクション法を用いてもよい。かくして得られた形質転
換体である微生物は、栄養培地に培養されることにより
多量のサルコシンオキシダーゼを安定して産生し得るこ
とを見出した。 【００３５】宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有
無についての選択は、目的ＤＮＡ断片を保持する組換え
ＤＮＡであるベクターの薬剤耐性マーカーと該サルコシ
ンオキシダーゼとを同時に発現し得る微生物を検索すれ
ばよく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で
生育し、且つ該サルコシンオキシダーゼを生成する微生
物を選択すればよい。 【００３６】このようにして一度選択された該サルコシ
ンオキシダーゼ遺伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質
転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入する
ことも容易に実施できる。また、該サルコシンオキシダ
ーゼ遺伝子を保持する組換えＤＮＡから制限酵素などに
より切断して該サルコシンオキシダーゼ遺伝子であるＤ
ＮＡを切り出し、これと同様な方法により切断して得ら
れる他のベクター末端とを結合させて新規な特徴を有す
る組換えＤＮＡを作成して、他の宿主微生物に移入する
ことも容易に実施できる。 【００３７】また、本質的にサルコシンオキシダーゼ活
性であるサルコシンオキシダーゼムテインのＤＮＡは、
本発明のサルコシンオキシダーゼ遺伝子から遺伝子工学
的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この
人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法および目的遺伝
子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡ断片で置換するな
どの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、斯く
して取得された人工変異遺伝子のうち特に優れた性質を
有するサルコシンオキシダーゼムテインＤＮＡは、最終
的には、このムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて
組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させる
ことによって、サルコシンオキシダーゼムテインの製造
が可能である。 【００３８】さらに、上述の方法により得られた該サル
コシンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２１４ １２０５〜１２１０（１９８１年）に示さ
れているジデオキシ法で解読し、また該サルコシンオキ
シダーゼのアミノ酸配列は、塩基配列より予測決定し
た。一方、該サルコシンオキシダーゼであるペプチドの
Ｎ末端部を構成する部分アミノ酸配列は、以下の如くに
して決定した。 【００３９】即ち、サルコシンオキシダーゼ産生能を有
するサルコシンオキシダーゼ遺伝子供与微生物を栄養培
地で培養して菌体内に該サルコシンオキシダーゼを産生
蓄積せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌
体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破
壊し、また必要に応じてＥＤＴＡおよび／または適当な
界面活性剤等を添加してサルコシンオキシダーゼが可溶
化され、水溶液として分離採取された。 【００４０】この様にして得られた該サルコシンオキシ
ダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく
硫安分画、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーにより処理して、高純度該サル
コシンオキシダーゼが得られ、高純度該サルコシンオキ
シダーゼを用いて液相プロテイン シーケンサー（ベッ
クマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０Ｍ
Ｅ）によりサルコシンオキシダーゼであるペプチドのＮ
末端部を構成する部分アミノ酸配列が決定され、少なく
とも、該部分アミノ酸配列は遺伝子操作によって得られ
た該サルコシンオキシダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列
と一致するものであることを確認した。 【００４１】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
良く、通常多くの場合は、液体培養で行うか、工業的に
は深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養
源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く
使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物
であればよく、例えばグルコース、シュクロース、ラク
トース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用さ
れる。 【００４２】窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カ
ゼイン加水分解物などが使用される。その他、リン酸
塩，炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリ
ウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ
酸，特定のビタミンなどが必要に応じて使用され、通常
の該サルコシンオキシダーゼ生産菌の該サルコシンオキ
シダーゼ製造において必要とされるコリン、サルコシン
またはクレアチン等の該サルコシンオキシダーゼ生産誘
導物質は、当該製造法では必要としない。 【００４３】培養温度は菌が発育し、該サルコシンオキ
シダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリ
ヒア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度であ
る。培養時間は、条件によって多少異なるが、該サルコ
シンオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって
適当な時期に培養を終了すればよく、通常は１２〜４８
時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、該サルコシン
オキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に
好ましくはｐＨ６〜８程度である。 【００４４】培養物中のサルコシンオキシダーゼが培養
物中に存在する場合には、菌体を含む培養液そのままを
採取し、利用することもできるが、一般には常法に従っ
て、濾過、遠心分離などにより培養液中のサルコシンオ
キシダーゼと微生物菌体とを分離した後のサルコシンオ
キシダーゼ溶液が利用される。サルコシンオキシダーゼ
が菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過ま
たは遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いで
この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方
法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤
および／または界面活性剤を添加してサルコシンオキシ
ダーゼを可溶化し水溶液として分離採取する。 【００４５】この様にして得られたサルコシンオキシダ
ーゼ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫
安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈澱法により沈澱せしめればよい。次いでこ
の沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、よ
り低分子量の不純物を除去することができる。また吸着
剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより精
製し、これらの手段を用いて得られるサルコシンオキシ
ダーゼ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の処理にてより
精製されたサルコシンオキシダーゼを得ることができ
る。 【００４６】斯くして得られたサルコシンオキシダーゼ
は以下の活性測定法により測定される。即ち、まず、次
の反応液を用意する。 ０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．５ｍl １５ｍＭ４−アミノアンチピリン ０．５ｍl ０．２％（ｗ／ｖ）フェノール ０．５ｍl パーオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍl ） ０．５ｍl １．０Ｍサルコシン水溶液 １．０ｍl 水 ２．０ｍl 【００４７】上記の反応液０．５ｍl を試験管にとり、
３７℃３分間予備加温した後、１０μl のサルコシンオ
キシダーゼ（ＳＯＸ）含有酵素液を加え、正確に５分間
３７℃で保温する。２．５ｍl のエタノールを加え反応
を停止し、４８０ｎｍで比色定量し、その値をＡとす
る。１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を
１単位（Ｕ）とした。よって、サルコシンオキシダーゼ
活性値（ＳＯＸ活性値）（Ｕ／ｍl ）は次式により求め
られる。 【００４８】 Ａ0 ；酵素液の代わりに緩衝液を加え、上記と同様な操
作を行って得られる４８０ｎｍで比色値。また、不純物
酵素の含量は、以下に示す酵素活性測定法により求め
る。 【００４９】１．カタラーゼ活性測定法 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈された酵素
溶液０．５ｍl を試験管にとり、３０℃５分間予備加熱
した後、０．４％過酸化水素溶液０．５ｍl 加え、正確
に５分間３０℃で保温する。２．５ｍl の０．１Ｍ過塩
素酸溶液を加え反応を停止し、２４０ｎｍで比色定量
し、その値をＢとする。 【００５０】また、０．４％過酸化水素溶液０．５ｍl
を試験管にとり、３０℃５分間予備加温した後、２．５
ｍl の０．１Ｍ過塩素酸溶液を加え、その後、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈された酵素溶液０．
５ｍl 加え、２４０ｎｍで比色定量し、その値をＢ0 と
し、１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を
１単位（Ｕ）と定めれば、カタラーゼ活性値（ＣＬ活性
値）（Ｕ／ｍl ）が、次式により求められる。 【００５１】 【００５２】２．クレアチナーゼ活性測定法 本発明に用いるクレアチナーゼの活性測定法は次の通り
である。まず次の各溶液を用意する。 第１液 ０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．５ｍl ５０ｍＭクレアチン水溶液 ４．５ｍl 第２液 ０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．５ｍl １５ｍＭ４−アミノアンチピリン水溶液 ０．５ｍl ０．２％フェノール ０．５ｍl パーオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍl ） ０．５ｍl サルコシンオキシダーゼ（３０Ｕ／ｍl ） １．０ｍl ０．５ｍＭｐ−クロロマーキュリーベンゼン ２．０ｍl 第３液 ０．５ｍＭｐ−クロロマーキュリーベンゼン ０．５ｍl 【００５３】上記の第１液を試験管にとり、３７℃３分
間予備加温した後、１０μl の酵素液を加え、正確に５
分間保温する。０．５ｍl の第３液を加え、次に０．５
ｍlの第２液を加えて３７℃でさらに２０分間反応後、
１．５ｍl の蒸留水を加え５００ｎｍで比色定量し、１
分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を１単位
（Ｕ）と定めた。 【００５４】３．Ｎ−エチルグリシンオキシダーゼの活
性測定法 まず、次の反応液を用意する。 ０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．５ｍl １５ｍＭ４−アミノアンチピリン ０．５ｍl ０．２％（ｗ／ｖ）フェノール ０．５ｍl パーオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍｌ） ０．５ｍl １．０Ｍ Ｎ−エチルグリシン水溶液 １．０ｍl 水 ２．０ｍl 【００５５】上記の反応液０．５ｍl を試験管にとり、
３７℃３分間予備加温した後、１０μl の酵素液を加
え、正確に５分間３７℃で保温する。２．５ｍl のエタ
ノールを加え反応を停止し、４８０ｎｍで比色定量し、
その値をＡとする。１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素
を生じる活性を１単位（Ｕ）と定めた。 【００５６】以上の酵素活性測定法を用い、本発明サル
コシンオキシダーゼ標品は、サルコシンオキシダーゼ１
単位に対し、夾雑酵素であるカタラーゼ、クレアチナー
ゼ、Ｎ−エチル−グリシンオキシダーゼの活性が、カタ
ラーゼ活性０．０５単位以下、クレアチナーゼ活性０．
０００４単位以下、Ｎ−エチル−グリシンオキシダーゼ
活性０．０３単位以下であるサルコシンオキシダーゼで
あり、極めて夾雑酵素の少ない臨床診断に用いる酵素と
して、極めて優れた特性のある酵素である。 【００５７】斯くして得られたサルコシンオキシダーゼ
は、他に以下に述べる理化学的性質を有するものであ
る。 （ａ）作用 サルコシン、一分子の酸素および一分子の水からグリシ
ン、ホルムアルデヒドおよび一分子の過酸化水素を生成
する下記の酵素反応を培養する酵素である。サルコシン
＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ2 Ｏ
2 【００５８】（ｂ）基質特異性 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０５ｍ
l 、０．２％フェノール０．０５ｍl 、０．５ｍｇ／ｍ
l のパーオキシダーゼ０．０５ｍl 、蒸留水０．２ｍl
および下記化合物を基質とする０．５Ｍ基質溶液０．２
０ｍl よりなる反応液０．５ｍl に、該サルコシンオキ
シダーゼ０．５ｕを添加し、３７℃、５分間反応せし
め、次いで２．５ｍl エタノールを加えて反応を停止せ
しめた後４８０ｎｍにて比色した。 【００５９】 基質 相対活性（％） サルコシン １００．０ コリン ０ セリン ０ スレオニン ０ アラニン ０ バリン ０ Ｎ−メチルエタノールアミン ０ Ｎ−ジメチルエタノールアミン ０ 【００６０】 （ｃ）至適ｐＨ ４−アミノアンチピリン−フェノール−パーオキシダー
ゼの発色系に及ぼす影響を避けるため、アセチルアセト
ン法にて、生成するホルムアルデヒドを定量した結果、
該サルコシンオキシダーゼの至適ｐＨは８．０〜９．５
付近と認められる。用いた緩衝液としては、ｐＨ：４．
７：ジメチルグルタル酸緩衝液、ｐＨ：６〜８：リン酸
緩衝液、ｐＨ７．５〜９：トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９
〜１０：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０
〜１１：炭酸ナトリウム−ホウ酸ナトリウム緩衝液であ
る。 【００６１】（ｄ）等電点 ４．７付近（キャリアアンホライトを用いる等電点分画
法） （ｅ）分子量 約４万（ゲル濾過法により測定） （ｆ）熱安定性 酵素蛋白質２０μｇ／ｍl を含有してなる１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍl を各温度にて
１０分間放置し、次いで、上述のサルコシンに対する酵
素活性を測定した結果、４０℃における処理にても、１
００％の残存活性を有していた。 【００６２】 （ｇ）至適温度 上述のサルコシンに対する酵素活性測定法を利用して、
その温度条件を変えて酵素反応を行いサルコシンに対す
る酵素活性を測定した結果、その至適温度は５０℃付近
と認められた。 【００６３】（ｈ）ｐＨ安定性 緩衝液として、ｐＨ４〜７：ジメチルグルタル酸緩衝
液、ｐＨ：６〜８：リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９：ト
リス−塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１０：グリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ１０〜１１：炭酸ナトリウム−ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液を用い、各ｐＨの緩衝液０．１ｍ
l に、酵素溶液（酵素蛋白濃度１００μｇ／ｍl ）１０
０μl を加え、３７℃６０分間放置した。 【００６４】次いで、これに１．０Ｍトリス−塩酸緩衝
液、（ｐＨ８．０）０．３ｍl を加えてｐＨを調整した
後２０μl を分取し、反応液に加え、上述のサルコシン
に対する酵素活性測定法に従い、酵素活性を測定した結
果、そのｐＨ安定性は６．０〜１０．０付近と認められ
る。 【００６５】本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核
酸、核酸関連物質、その他に関する略号は、それらの当
該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を
以下に列記する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すも
のとする。 【００６６】ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＲＮＡ ： リボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン Ａｌａ ： アラニン Ａｒｇ ： アルギニン Ａｓｎ ： アスパラギン Ａｓｐ ： アスパラギン酸 【００６７】Ｃｙｓ ： システイン Ｇｌｎ ： グルタミン Ｇｌｕ ： グルタミン酸 Ｇｌｙ ： グリシン Ｈｉｓ ： ヒスチジン Ｉｌｅ ： イソロイシン Ｌｅｕ ： ロイシン Ｌｙｓ ： リジン Ｍｅｔ ： メチオニン 【００６８】Ｐｈｅ ： フェニルアラニン Ｐｒｏ ： プロリン Ｓｅｒ ： セリン Ｔｈｒ ： スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｔｙｒ ： チロシン Ｖａｌ ： バリン 【００６９】 【実施例】以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、
本発明は何らこれらによって限定されるものではない。 実施例 １ 染色体ＤＮＡの分離 バチルス・エスピー（Bacillus sp ）Ｂ−０６１８株
〔微工研菌寄託第０７５０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−０７５
０）〕の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を
１５０ｍl の普通ブイヨン培地（０．５％チオ硫酸ソー
ダ含有）で３７℃一晩振盪培養後遠心（３０００回転／
分（ｒｐｍ）、１０分）により集菌した。１０％サツカ
ロース、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍl に懸濁させ、１ｍl の
リゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍl ）を加え３７℃、１５
分間保温し、次いで１ｍl の１０％ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）溶液を加えた。 【００７０】この懸濁液に等量のクロロホルム−フェノ
ール混合液（１：１）を加え、撹拌混合し、１００００
回転／分、３分の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を分
取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層
し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒
にまきつかせて分離した。これを１０ｍl の１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ
溶液（以下ＴＥと略す）で溶解した。これを等量のクロ
ロホルム−フェノール混合液（１：１）を加え前記と同
様な処理をし、水層を分取し、２倍量のエタノールを加
えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２ｍl のＴ
Ｅに溶解した。 【００７１】実施例 ２ ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド
ＤＮＡの分離 ｐＡＣＹＣ１８４を保有するエシェリヒア・コリｐＭ１
９１〔Ｊ．Bacteriol., １３４，１１４１（１９８
１）；ＡＴＣＣ３７０３３〕を１l のＢＨＩ培地（Ｄｉ
ｆｃｏ社製）で振盪培養した。濁度がＯＤ660＝１．０
に増殖したとき、スペクチノマイシン（最終濃度３００
μｇ／ｍl ）を加え、さらに３７℃で１６時間以上振盪
を続けた。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心により集菌
し、リゾチーム−ＳＤＳ法とセシウムクロライド−エチ
ジウムブロマイド法〔Maniatisら，Molecular, Clonin
g, 86 〜 94 Cold Spring Harbor（１９８２）〕に従
いプラスミドＤＮＡを調製した。 【００７２】実施例 ３ サルコシンオキシダーゼ（Ｓ
ＯＸ）遺伝子を有するプラスミドｐＯＸＩ１０１の作成 （ｉ）実施例１で調製したバチルス・エスピーＢ−０６
１８株の染色体ＤＮＡ２μl （約０．５μｇ）と１０倍
濃度のＥｃｏＲＩ切断用バツファー（５００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ ＭｇＣl2、１Ｍ Ｎａ
Ｃl 、７０ｍＭメルカプトエタノール）１μl 、Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造製、１０ｕｎｉｔ／μl ）１μl 、水６μ
l を混合し、３７℃１時間切断した。 【００７３】別に調製したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４
ＤＮＡ約０．３μｇを同様な方法を用いてＥｃｏＲＩで
切断し、さらにアルカリ性フォスファターゼ（以下ＢＡ
Ｐと略すことがある、宝酒造製）０．６ｕｎｉｔを加
え、６５℃１時間処理した。これらのＥｃｏＲＩで切断
した２種のＤＮＡ溶液を混合し、その１／１０量の３Ｍ
酢酸ナトリウムを加え、さらに全体量と等量のクロロホ
ルム−フェノール混液で処理し、遠心分離により水層を
分取した。 【００７４】この水層に２倍容のエタノールを加え、遠
心でＤＮＡを沈澱させたのち減圧乾燥した。得られたＤ
ＮＡを水８９μl で溶解後、１０倍濃度のライゲーショ
ンバツファ〔０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６），０．１Ｍ ＭｇＣl2、０．１Ｍジチオスレイトー
ル，１０ｍＭスペルミジン，１０ｍＭ ＡＴＰ〕１０μ
lとＴ４ＤＮＡリガーゼ１μl （宝酒造製、１７５ｕｎ
ｉｔ／μl ）を加え混合し、４℃で一晩放置した。この
ＤＮＡ溶液をクロロホルム−フェノール処理し、エタノ
ール沈澱をさせたのち、得られた沈澱物を遠心分離によ
り集め、減圧乾燥した後，１０μl ＴＥに溶解した。 【００７５】（ii）１００ｍl のＢＨＩ培地（Brein He
art Infusion培地，Difco社製）で培養した対数増殖期
のエシェリヒア・コリＤＨ１株（国立遺伝学研究所より
分与を受けた、ストック番号ＭＥ８５６９）を遠心分離
により集菌し（１００００ｒｐｍ，２分間）４０ｍl の
氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ ＲｂＣ
l、１０ｍＭ ＣａＣl2、５０ｍＭ ＭｎＣl2および１
５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ５．８）で懸濁し
た。 【００７６】次いで、０℃で５分間放置した後、遠心
し、上清をすて、さらに４ｍl の１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩
衝液（ドータイト社製）、７５ｍＭ ＣａＣl2、１０ｍ
Ｍ ＲｂＣl および１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐ
Ｈ６．５）で懸濁し、０℃で１５分間放置してコンピテ
ント細胞とした。 【００７７】（iii ）この大腸菌懸濁液２００μl に
（ｉ）で調製したＤＮＡ溶液１０μl を加え、３０分間
０℃で放置した。ＢＨＩ培地１ｍl を加え、３７℃で９
０分間保温後、この１００μl をテトラサイクリン（１
５μｇ／ｍl ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３
７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体を
検出培地（組成はペプトン５ｇ，肉エキス２ｇ，イース
トエキス５ｇ，ＮａＣl １ｇ，Ｋ2 ＨＰＯ4１ｇ，Ｍｇ
ＳＯ4０．５ｇ，パーオキシダーゼ５００ＩＵ，ジアニ
シジン０．１ｇ，サルコシン９ｇ，寒天１５ｇ，蒸留水
１l ，ｐＨ７．０）のプレートにレプリカし、３７℃で
さらに一晩培養した。 【００７８】約６０００コロニーの形質転換体を調べた
ところ、コロニーの周辺が茶褐色に変色したもの４株を
得、この中の１株をエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）ＤＨ１ ｐＯＸＩ１０１株と命名した。この菌を
純粋分離後ＢＨＩ培地で３７℃一晩培養し、実施例２と
同様にしてプラスミドを分離し、サルコシンオキシダー
ゼ遺伝子を含み、ｐＡＣＹＣ１８４遺伝子を含むプラス
ミドを得、ｐＯＸＩ１０１と命名した。 【００７９】実施例 ４ ｐＯＸＩ１０１のマッピング
およびサブクローニング ｐＯＸＩ１０１にＤＮＡについて制限酵素ＣｌａＩ、Ｈ
ｐａＩ、ＳalＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ（いずれも宝酒造
製）による切断地図を作成した。その結果を図１に示し
た。実施例３（ｉ）と同様にしてｐＯＸＩ１０１から得
られる２つのＸｈｏＩ切断部位を含むＥｃｏＲＩ−Ｃｌ
ａＩ ５．３ｋｂ断片とｐＢＲ３２２から得られるＥｃ
ｏＲＩ−ＣｌａＩ ４．３ｋｂ断片との各断片を得、こ
れらの断片を用いて実施例３と同様な方法により、接
合、エシェリヒア・コリＤＨ１の形質転換、形質転換後
のスクリーニング等サブクローニング操作を試みたとこ
ろ、サルコシンオキシダーゼ生産性のあるクローンを１
株得、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ１
ｐＯＸＩ１０３株と命名した〔微工研菌寄託第９４９
４号（ＦＥＲＭ Ｐ−９４９４）〕。 【００８０】尚本菌株は、ブダペスト条約に基づく寄託
に移管されて、微工研条寄第１８２８号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１８２８）として寄託されている。この株から実施
例２の如くして、プラスミドＤＮＡを分離し、ｐＯＸＩ
１０３と命名した。ｐＯＸＩ１０３にＤＮＡについて制
限酵素ＣｌａＩ、ＨｐａＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、Ｘｈ
ｏＩ（いずれも宝酒造製）による切断地図を作成したと
ころ、ＳｍａＩ切断部位を含んでいるＥｃｏＲＩからＸ
ｈｏＩ付近までが欠如しているクローンであることが判
明し、図２に示した。 【００８１】このエシェリヒア・コリＤＨ１ ｐＯＸＩ
１０３株をＢＨＩ培地で３７℃一晩培養したところ、サ
ルコシンオキシダーゼの生産性は、前述のサルコシンオ
キシダーゼ活性測定法によると約２ｕ／ｍl のサルコシ
ンオキシダーゼ活性を有していた。サルコシンオキシダ
ーゼ遺伝子を含んだＤＮＡの塩基配列をＭ１３ファージ
を用いたジデオキシ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２
０５−１２１０，（１９８１）〕を用いて決定した。サ
ルコシンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列並びにアミノ酸
配列を図３および図４に示した。 【００８２】実施例 ５ サルコシンオキシダーゼの製
造方法 エシェリヒア・コリＤＨＩ ｐＯＸＩ１０３株を２０ｌ
のＢＨＩ培地で３７℃、１８時間３０ｌ容ジャーファー
メンターで通気攪拌培養し、５０００ｒｐｍ、１０分間
の遠心で集菌した。この時のサルコシンオキシダーゼの
生産性は４．６ｕ／ｍｌであった。生理食塩水２ｌで、
洗浄後、２ｌの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．
５）に懸濁した。塩化リゾチームを０．１％、ＥＤＴＡ
−２Ｎａを２ｍＭになる様に加え、３７℃で６０分間攪
拌しながら保温後、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心
分離により、上清液１．８ｌを得た。 【００８３】この液に飽和硫安１．８l を加え生じた沈
澱を１２０００ｒｐｍ，１０分間の遠心により集め、３
００ｍl の１０ｍＭリン酸バツファー（ｐＨ７．５）に
溶解した。１０ｍＭリン酸バツファー（ｐＨ７．５）で
平衡化したセファデックスＧ−２５（商品名）で脱塩
後、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを用いたイオン
交換クロマトグラフィーを行い活性画分を分取した。 【００８４】脱塩後、凍結乾燥により粉末標品０．８０
７ｇを得、この時の回収収率は３６％で、比活性は４１
Ｕ／ｍｇであった。また、得られたサルコシンオキシダ
ーゼをゲル濾過法による分子量を測定した所、分子量約
４００００で、アミノ酸配列から計算される分子量とほ
ぼ一致するものであった。 【００８５】 【発明の効果】本発明によって、サルコシンオキシダー
ゼ遺伝子および、サルコシンオキシダーゼのアミノ酸配
列が明らかになり、また、遺伝子工学手法による効率的
なサルコシンオキシダーゼの製造方法を提供した。ま
た、本発明のサルコシンオキシダーゼ遺伝子と種々の遺
伝子工学的手法とを用いることによって、より効率的な
サルコシンオキシダーゼの製造方法をもたらしめるもの
である。 【００８６】 【配列表】 配列の長さ：１２８８塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルス・エスピー 株名：Ｂ−０６１８ 配列の特徴： ２８−１１９８ Ｅ サルコシンオキシダーゼ遺伝子 配列 TTTAAATAGT TTTCTAGGAG GAATGTT ATG AGC ACA CAT TTT GAT GTC ATC GTT 55 Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val 1 5 GTT GGA GCT GGA TCA ATG GGA ATG GCG GCA GGT TAT CAA TTA GCA AAG 103 Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Gln Leu Ala Lys 10 15 20 25 CAA GGA GTC AAA ACA TTA TTA GTG GAT GCA TTT GAT CCG CCG CAT ACA 151 Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Pro Pro His Thr 30 35 40 AAC GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACT CGT ATC ATC CGC CAT GCT TAC GGT 199 Asn Gly Ser His His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly 45 50 55 GAG GGA AGA GAA TAT GTT CCT CTT GCA TTA AGA TCA CAA GAG TTA TGG 247 Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Trp 60 65 70 TAT GAA CTA GAA AAA GAA ACA CAC CAT AAA ATA TTC ACG AAA ACG GGC 295 Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly 75 80 85 GTA CTC GTA TTT GGT CCT AAA GGT GAA TCG GCT TTC GTT GCA GAA ACG 343 Val Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr 90 95 100 105 ATG GAA GCG GCA AAG GAA CAT TCA TTG ACT GTT GAT TTA CTG GAA GGT 391 Met Glu Ala Ala Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly 110 115 120 GAT GAA ATA AAT AAG CGT TGG CCG GGT ATA ACG GTT CCG GAA AAC TAC 439 Asp Glu Ile Asn Lys Arg Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr 125 130 135 AAT GCT ATT TTC GAA CCG AAC TCA GGT GTA TTA TTC AGT GAA AAT TGT 487 Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys 140 145 150 ATT CGT GCC TAC CGC GAG TTA GCT GAA GCG CGA GGT GCT AAA GTT CTA 535 Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala Arg Gly Ala Lys Val Leu 155 160 165 ACA CAT ACA CGC GTT GAG GAC TTT GAC ATT TCA CCG GAC TCA GTC AAA 583 Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp Ile Ser Pro Asp Ser Val Lys 170 175 180 185 ATC GAA ACA GCA AAT GGA TCA TAC ACA GCT GAT AAA TTA ATT GTT AGC 631 Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu Ile Val Ser 190 195 200 ATG GGA GCT TGG AAT AGC AAA CTA CTT TCA AAA CTA AAT CTT GAC ATC 679 Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp Ile 205 210 215 CCA TTA CAG CCA TAT CGT CAA GTG GTA GGT TTC TTT GAA TCC GAT GAA 727 Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu 220 225 230 TCA AAG TAT AGC AAT GAT ATT GAT TTC CCA GGA TTC ATG GTT GAA GTG 775 Ser Lys Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val 235 240 245 CCA AAT GGT ATT TAT TAC GGA TTC CCA AGC TTC GGC GGC TGT GGA TTG 823 Pro Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu 250 255 260 265 AAA CTA GGA TAT CAT ACG TTC GGG CAG AAA ATT GAC CCT GAT ACA ATT 871 Lys Leu Gly Tyr His Thr Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile 270 275 280 AAT CGC GAA TTT GGC GTT TAT CCA GAA GAT GAA AGT AAT CTT CGC GCT 919 Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala 285 290 295 TTC TTG GAA GAA TAT ATG CCA GGA GCA AAT GGA GAG TTA AAA AGA GGG 967 Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Arg Gly 300 305 310 GCA GTC TGC ATG TAC ACG AAA ACA TTA GAT GAA CAT TTC ATT ATA GAC 1015 Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu His Phe Ile Ile Asp 315 320 325 TTA CAT CCT GAA CAT TCC AAC GTA GTC ATC GCT GCC GGC TTC TCT GGC 1063 Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly 330 335 340 345 CAT GGA TTT AAG TTT TCC AGT GGA GTT GGT GAA GTG CTA AGT CAA TTA 1111 His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln Leu 350 355 360 GCT TTA ACT GGT AAA ACA GAG CAC GAT ATT TCA ATC TTC TCC ATT AAC 1159 Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn 365 370 375 CGT CCT GCT TTG AAA GAA TCG TTA CAA AAA ACA ACT ATC TAA 1201 Arg Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile *** 380 385 390 TTGTAGTCTA ATCGTTGAGT CGTCTGTTTT TATCTGTCTA ACAGAATCAT ATATAAATTG 1261 AAAAACAGAA AATCTAATTC GAAATTT 1288
キシダーゼの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸を
保持してなる形質転換体により該ポリデオキシリボ核酸
の遺伝情報を発現せしめて得られるサルコシンオキシダ
ーゼの製造法に関する。 【０００２】 【従来の技術】サルコシンオキシダーゼは、次の反応
式、 サルコシン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒ
ド＋Ｈ2 Ｏ2 の反応式で示されるようにそれぞれ１分子のサルコシ
ン、酸素および水からそれぞれ１分子のグリシン、ホル
ムアルデヒドおよび過酸化水素を生ずる反応を触媒する
酵素であって、自然界、特に動物臓器中に存在すること
が古くから知られており、また、ペニシリウム属（Peni
cillium)、シュードモナス属（Pseudomonas）〔以上 F
risell, W. R.＆ Mackenzie, C. G. (1970) Meth. Enzy
mol. 17A, 976 - 981〕、アルスロバクター属（Arthrob
acter) 〔特開昭５４−２８８９３号公報〕、バチルス
属（Bacillus）〔特開昭５４−５２７８９号公報，特開
昭６１−１６２１７４号公報〕、シリンドロカルポン属
（Cylindrocarpon）〔特開昭５６−９２７９０号公
報〕、シュードモナス属（Pseudomonas)〔特開昭６０−
４３３７９号公報〕、ストレプトミセス科（Streptomyc
etaceae ）〔特開昭６１−２８０２７１号公報〕に属す
る微生物に存在することが報告されている。 【０００３】この、サルコシンオキシダーゼは、サルコ
シンを基質とする酸化酵素であるので、血清などの体液
中に存在するサルコシンの定量に使用されるが、この酵
素は、これのみに留まらずクレアチニン或いはコリン代
謝系に関与しているので、特に前者の代謝系の他の酵素
即ちクレアチニナーゼ、クレアチナーゼと共役反応せし
めて、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成せし
め、それらの一方または両方を定量することにより、ク
レアチニン、クレアチンを簡便且つ特異的に定量するこ
とが可能である。従って、クレアチニン又はクレアチン
の従来の非特異的な化学的定量法に代わる生化学的定量
法における主要酵素となるもので、臨床診断分野、研究
分野において極めて有用である。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】従来より報告されてい
るサルコシンオキシダーゼ生産菌は、サルコシンオキシ
ダーゼの生産性が低く、もともと製造コストが高くなる
という難点があるだけでなく、製造時において、コリ
ン、サルコシンまたはクレアチン等のサルコシンオキシ
ダーゼ生産を誘導する物質の添加が必須であったため、
製造コストがより高いものとなり、また培養後において
の共存する他種酵素等の除去が非常に困難で、純度の高
い良質なサルコシンオキシダーゼを得るための精製工程
及びコストの面で問題があり、研究用試薬、臨床診断用
試薬として安易に広く用いるには必ずしも満足のいくも
のではなかった。 【０００５】ただ、最近、耐熱性菌より得られた耐熱性
サルコシンオキシダーゼは、加熱処理することにより、
夾雑酵素（例えばカタラーゼ，ウリカーゼ等）の活性を
完全に失活させることが可能である〔特開昭６１−１６
２１７４号公報〕と報告されているが、耐熱性菌由来の
夾雑酵素（例えばカタラーゼ，ウリカーゼ等）は何れに
しても多少の耐熱性を有し、実際、上述の公報記載の如
く夾雑酵素を完全に失活させることは非常に困難であっ
た。 【０００６】また、以下の理化学的性状を有するサルコ
シンオキシダーゼの詳細な一次構造は報告されていな
い。 （ａ）作用 サルコシン、一分子の酸素および一分子の水からグリシ
ン、ホルムアルデヒドおよび一分子の過酸化水素を生成
する下記の酵素反応を触媒する酵素である。 サルコシン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒ
ド＋Ｈ2 Ｏ2 （ｂ）基質特異性 サルコシンに基質特異性を有する 【０００７】 （ｃ）至適ｐＨ ８．０〜９．５ （ｄ）等電点 ４．７ （ｅ）分子量 ４万（ゲル濾過法により測定） （ｆ）熱安定性 ４０℃、１０分間処理で安定である。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、サルコシ
ンオキシダーゼについて、その生産性向上、共存する他
種酵素（夾雑酵素）の含量低減並びに製造コストの低減
を図るべく鋭意検討をおこなっていたところ、微生物中
から新規なサルコシンオキシダーゼ遺伝子の採取ならび
にその一次構造の解析に成功すると共に遺伝子工学的手
法を応用することによって、以下に述べる如く、高生産
性であり、且つ生産時培地中に誘導物質を必要としない
サルコシンオキシダーゼの製造法を確立した。 【０００９】すなわち、本発明は、以下の理化学的性状
を有するサルコシンオキシダーゼを構成成分としてなる
ポリペプチドの後述するアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含むポリデオキシリボ核酸を発現ベクターに組み
入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入して形質転換体
を得、該形質転換体を培養して該ポリデオキシリボ核酸
の遺伝情報を発現させ、次いで該サルコシンオキシダー
ゼを構成成分としてなるポリペプチドを採取してなる当
該サルコシンオキシダーゼの製造法である。 【００１０】また本発明は下記の理化学的性状を示し、 （ａ）作用 サルコシン、一分子の酸素および一分子の水からグリシ
ン、ホルムアルデヒドおよび一分子の過酸化水素を生成
する下記の酵素反応を触媒する酵素である。 サルコシン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒ
ド＋Ｈ2 Ｏ2 （ｂ）基質特異性 サルコシンに基質特異性を有する 【００１１】 （ｃ）至適ｐＨ ８．０〜９．５ （ｄ）等電点 ４．７ （ｅ）分子量 ４万（ゲル濾過法により測定） （ｆ）熱安定性 ４０℃、１０分間処理で安定である。 【００１２】かつサルコシンオキシダーゼ活性１単位に
対し、夾雑酵素であるカタラーゼ、クレアチナーゼ、Ｎ
−エチル−グリシンオキシダーゼの活性が、カタラーゼ
活性０．０５単位以下、クレアチナーゼ活性０．０００
４単位以下、Ｎ−エチル−グリシンオキシダーゼ活性
０．０３単位以下であるサルコシンオキシダーゼであ
る。 【００１３】さらに本発明のサルコシンオキシダーゼに
おける該ポリペプチドはＮ末端側より式 10 Ａ−Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala 20 30 Ala Gly Tyr Gln Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe 40 50 Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His 60 70 Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu 80 Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val 90 100 Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala 110 120 Ala Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys 130 140 Arg Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn 150 160 Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu 170 Ala Arg Gly Ala Lys Val Leu Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp Ile Ser 180 190 Pro Asp Ser Val Lys Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu 200 210 Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp 220 230 Ile Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu Ser 240 250 Lys Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro Asn Gly 260 Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His 270 280 Thr Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr 290 300 Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala 310 320 Asn Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu 330 340 His Phe Ile Ile Asp Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly 350 Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln 360 370 Leu Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg 380 Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile −Ｂ （Ｉ） 【００１４】（式中、Ａはアミノ酸残基，水素原子また
はアセチル基を示し、Ｂはアミノ酸残基，−ＯＨまたは
−ＮＨ2 を示す）で表されるサルコシン、１分子の酸素
および１分子の水からグリシン、ホルムアルデヒドおよ
び１分子の過酸化水素を生ずる反応を触媒するサルコシ
ンオキシダーゼを構成するポリペプチドであり、また該
形質転換体の取得には、該ポリデオキシリボ核酸を発現
ベクターに組み入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入
することにより目的が達成され、さらに該形質転換体を
培養して該ポリデオキシリボ核酸の遺伝情報を発現さ
せ、次いで上述の理化学的性状を有するサルコシンオキ
シダーゼの構成成分としてなるポリペプチドを採取して
なるサルコシンオキシダーゼの製造法に関するものであ
る。 【００１５】ポリペプチド（Ｉ）に関し、Ａで示される
アミノ酸残基としては、一個または複数個のアミノ酸残
基よりなり、Ａとしては、好ましくは、水素原子若しく
はＭｅｔまたはシグナルペプチドが挙げられる。Ｂで示
されるものとしては、酸アミドであってもよく、また一
個以上のアミノ酸残基であってもよい。 【００１６】上述の理化学的性状を有するサルコシンオ
キシダーゼの遺伝子であるポリデオキシリボ核酸として
は、少なくとも上述の理化学的性状を有するサルコシン
オキシダーゼの遺伝子それ自体を含むポリデオキシリボ
核酸であればよく、例えば該サルコシンオキシダーゼ遺
伝子それ自体としてはＮ末端側より式 【００１７】 10 Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala 20 30 Gly Tyr Gln Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp 40 50 Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala 60 70 Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Trp 80 90 Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu 100 Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala 110 120 Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys Arg 130 140 Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser 150 160 Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala 170 180 Arg Gly Ala Lys Val Leu Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp Ile Ser Pro 190 Asp Ser Val Lys Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu Ile 200 210 Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp Ile 220 230 Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu Ser Lys 240 250 Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro Asn Gly Ile 260 270 Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His Thr 280 Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro 290 300 Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn 310 320 Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu His 330 340 Phe Ile Ile Asp Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly Phe 350 360 Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln Leu 370 Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro 380 Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile （II） 【００１８】で表されるサルコシンオキシダーゼの構成
成分としてなるポリペプチドのアミノ酸配列を、コード
する塩基配列であるポリデオキシリボ核酸を挙げること
が出来る。 【００１９】また、式（II）で表されるサルコシンオキ
シダーゼであるポリペプチドのアミノ酸配列において、
各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちのいずれか１
個のコドンからなるポリデオキシリボ核酸であればよ
く、さらに該ポリデオキシリボ核酸の５’末端に１個以
上のナンセンスコドン以外のコドンおよび／または３’
末端に１個以上のコドンを有するポリデオキシリボ核酸
であってもよい。例えば、その代表例として５’末端側
より式 【００２０】 30 Ｘ−AGC ACA CAT TTT GAT GTC ATC GTT GTT GGA GCT GGA TCA ATG GGA ATG GCG 60 90 GCA GGT TAT CAA TTA GCA AAG CAA GGA GTC AAA ACA TTA TTA GTG GAT GCA TTT 120 150 GAT CCG CCG CAT ACA AAC GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACT CGT ATC ATC CGC CAT 180 210 GCT TAC GGT GAG GGA AGA GAA TAT GTT CCT CTT GCA TTA AGA TCA CAA GAG TTA 240 TGG TAT GAA CTA GAA AAA GAA ACA CAC CAT AAA ATA TTC ACG AAA ACG GGC GTA 270 300 CTC GTA TTT GGT CCT AAA GGT GAA TCG GCT TTC GTT GCA GAA ACG ATG GAA GCG 330 360 GCA AAG GAA CAT TCA TTG ACT GTT GAT TTA CTG GAA GGT GAT GAA ATA AAT AAG 390 420 CGT TGG CCG GGT ATA ACG GTT CCG GAA AAC TAC AAT GCT ATT TTC GAA CCG AAC 450 480 TCA GGT GTA TTA TTC AGT GAA AAT TGT ATT CGT GCC TAC CGC GAG TTA GCT GAA 510 GCG CGA GGT GCT AAA GTT CTA ACA CAT ACA CGC GTT GAG GAC TTT GAC ATT TCA 540 570 CCG GAC TCA GTC AAA ATC GAA ACA GCA AAT GGA TCA TAC ACA GCT GAT AAA TTA 600 630 ATT GTT AGC ATG GGA GCT TGG AAT AGC AAA CTA CTT TCA AAA CTA AAT CTT GAC 660 690 ATC CCA TTA CAG CCA TAT CGT CAA GTG GTA GGT TTC TTT GAA TCC GAT GAA TCA 720 750 AAG TAT AGC AAT GAT ATT GAT TTC CCA GGA TTC ATG GTT GAA GTG CCA AAT GGT 780 ATT TAT TAC GGA TTC CCA AGC TTC GGC GGC TGT GGA TTG AAA CTA GGA TAT CAT 810 840 ACG TTC GGG CAG AAA ATT GAC CCT GAT ACA ATT AAT CGC GAA TTT GGC GTT TAT 870 900 CCA GAA GAT GAA AGT AAT CTT CGC GCT TTC TTG GAA GAA TAT ATG CCA GGA GCA 930 960 AAT GGA GAG TTA AAA AGA GGG GCA GTC TGC ATG TAC ACG AAA ACA TTA GAT GAA 990 1020 CAT TTC ATT ATA GAC TTA CAT CCT GAA CAT TCC AAC GTA GTC ATC GCT GCC GGC 1050 TTC TCT GGC CAT GGA TTT AAG TTT TCC AGT GGA GTT GGT GAA GTG CTA AGT CAA 1080 1110 TTA GCT TTA ACT GGT AAA ACA GAG CAC GAT ATT TCA ATC TTC TCC ATT AAC CGT 1140 CCT GCT TTG AAA GAA TCG TTA CAA AAA ACA ACT ATC −Ｙ （III) （式中、ＸはTAA, TAGおよびTGA 以外のコドンまたは水
素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す）で表
される塩基配列を有するポリデオキシリボ核酸を挙げる
ことができる。 【００２１】式（III)で表される塩基配列に関し、Ｘで
示されるコドンは、アミノ酸をコードするコドンであれ
ばいずれでもよく、更に、その５’末端側にアミノ酸を
コードするコドンを１個以上有してもよいが、好ましく
はＡＴＧまたはシグナルペプチドに対応するポリデオキ
シリボ核酸を挙げることができる。 【００２２】Ｙで示されるコドンは、翻訳終止コドンま
たはアミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよ
く、更に、その３’末端側にアミノ酸をコードするコド
ンを１個以上有していてもよいが、その場合には、この
複数個のコドンの３’末端にさらに翻訳終止コドンを有
することが好ましい。 【００２３】サルコシンオキシダーゼ遺伝子を構成成分
としてなるポリデオキシリボ核酸または、式（II）で表
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝
子であるポリデオキシリボ核酸または、式（III)で表さ
れるポリデオキシリボ核酸は、例えばサルコシンオキシ
ダーゼを生産するサルコシンオキシダーゼ遺伝子の供与
体である微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した
後、超音波、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと
切断してリニヤーにした発現ベクターとを両ＤＮＡの平
滑または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより
結合閉環させる。 【００２４】斯くして得られた組換えＤＮＡベクターを
複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカ
ーとサルコシンオキシダーゼの活性とを指標としてスク
リーニングして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持
する微生物を培養し、該培養菌体から該組換えＤＮＡベ
クターを分離精製し、次いで該組換えＤＮＡベクターか
らサルコシンオキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリ
ボ核酸を採取すればよい。 【００２５】サルコシンオキシダーゼ遺伝子の供与体で
ある微生物としては、サルコシンオキシダーゼ産生能を
有する微生物であればよく、例えば、特開昭５４−２８
８９３号公報、特開昭５４−５２７８９号公報、特開昭
５６−９２７９０号公報、特開昭６０−４３３７９号公
報、特開昭６１−１６２１７４号公報、特開昭６１−２
８０２７１号公報などに示されているバチルス・エスピ
ー（Bacillus sp ）Ｂ−０６１８株、バチルス・エスピ
ー（Bacillus sp ）ＮＳ−１２９株等のバチルス科サル
コシンオキシダーゼ生産菌、アルスロバクター・ウレア
フアシエンス（Arthrobacter ureafashiense）ＩＦＯ
１２１４０株等のアルスロバクター属サルコシンオキシ
ダーゼ生産菌、シリンドロカルポン・デイデイマム（ハ
ルテイグ）ウオレンウイバー（Cylindrocarpon didymum
(Hartig) Wollenweber ）Ｍ−１株等のシリンドロカル
ポン属サルコシンオキシダーゼ生産菌、シュードモナス
・マルトフイリア（Pseudomonas maltophilia ）ＢＭＴ
Ｕ２５４株、シュードモナス・マルトフイリア（Pseudo
monas maltophilia ）ＢＭＴＵ２８８株等のシュードモ
ナス属サルコシンオキシダーゼ生産菌およびカイニア・
プルプロゲナ（Chainia purpurogena ）ＤＳＭ４３１５
６株，カイニア・オクラツエー（Chainia ochraceae ）
ＤＳＭ４３１５５株、ストレプトマイセス・フロツクル
ス（Streptomyces flocculus）ＤＳＭ４０３２７株、ス
トレプトフエテイシリウム・エスピー（Streptovertici
lliun sp）ＤＳＭ４０２３７株、キタサトア・プルプレ
ア（Kitasatoa purpurea）ＤＳＭ４３３６２株等のスト
レプトマイセス科サルコシンオキシダーゼ生産菌等の群
から適宜選ばれる。 【００２６】これらの内で、好ましくは、バチルス・エ
スピー（Bacillus sp)Ｂ−０６１８株のサルコシンオキ
シダーゼ生産菌が挙げられるが特に、上述の理化学的性
状を有するサルコシンオキシダーゼ産生能を有する微生
物が挙げられ例えば、特開昭５４−２８８９３号公報な
どに示されているバチルス・エスピー（Bacillus sp)Ｂ
−０６１８株が挙げられる。また、遺伝子組換え技術を
駆使して、該サルコシンオキシダーゼ産生能を付与せし
めた形質転換微生物をサルコシンオキシダーゼ遺伝子の
供与体として利用してもよい。 【００２７】遺伝子の供与体である微生物から由来する
ＤＮＡは次の如く採取される。即ち、供与微生物である
上述した微生物のいずれかを、例えば、液体培地で約１
〜３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離し
て集菌し、次いでこれを溶菌させることによって該サル
コシンオキシダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製すること
ができる。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ−
グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施さ
れ、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル
硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細
胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処
理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよい。 【００２８】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離、精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌク
レアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を
適宜組み合わせることにより行うことができる。 【００２９】分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方
法は、例えば、超音波処理、制限酵素処理などにより行
うことができるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの
結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌ
クレオチド配列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄIII 、ＢａｍＨＩなどのII型制限酵素が適してい
る。 【００３０】ベクターとしては、宿主微生物体内で自律
的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組
換え用として構築されたものが適している。ファージと
しては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）を宿主微生物とする場合には、λｇｔ・λＣ，λｇ
ｔ・λＢなどが使用できる。 【００３１】また、プラスミドとしては、例えば、エシ
ェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、
ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などが、バチルス
・ズブチルス（Bacillus subtillis）を宿主微生物とす
る場合には、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４などが使用で
き、さらに、エシェリヒア・コリおよびサッカロマイセ
ス・セレビシアなどのグラム陰・陽両性にまたがる二種
以上の宿主微生物体内で自律的に増殖可能なシャトルベ
クターを利用することもできる。このようなベクター
を、先に述べたサルコシンオキシダーゼ遺伝子供与体で
ある微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限
酵素で切断して、ベクター断片を得ることが好ましい。 【００３２】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベク
ター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮ
Ａリガーゼの作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断
片との組換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガ
ーゼを利用し組換えＤＮＡを作成することもできる。 【００３３】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発
現のできるものであればよく、例えば、宿主微生物がエ
シェリヒア・コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１、
エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＷ
３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用出来
る。 【００３４】宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法
としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属す
る微生物の場合には、カルシュウムイオンの存在下で組
換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する微生
物の場合には、コンピテントセル法またはリポソーム組
換えＤＮＡのプロトプラスト宿主細胞への電気的な融合
移入法などを採用することができ、更にマイクロインジ
ェクション法を用いてもよい。かくして得られた形質転
換体である微生物は、栄養培地に培養されることにより
多量のサルコシンオキシダーゼを安定して産生し得るこ
とを見出した。 【００３５】宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有
無についての選択は、目的ＤＮＡ断片を保持する組換え
ＤＮＡであるベクターの薬剤耐性マーカーと該サルコシ
ンオキシダーゼとを同時に発現し得る微生物を検索すれ
ばよく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で
生育し、且つ該サルコシンオキシダーゼを生成する微生
物を選択すればよい。 【００３６】このようにして一度選択された該サルコシ
ンオキシダーゼ遺伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質
転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入する
ことも容易に実施できる。また、該サルコシンオキシダ
ーゼ遺伝子を保持する組換えＤＮＡから制限酵素などに
より切断して該サルコシンオキシダーゼ遺伝子であるＤ
ＮＡを切り出し、これと同様な方法により切断して得ら
れる他のベクター末端とを結合させて新規な特徴を有す
る組換えＤＮＡを作成して、他の宿主微生物に移入する
ことも容易に実施できる。 【００３７】また、本質的にサルコシンオキシダーゼ活
性であるサルコシンオキシダーゼムテインのＤＮＡは、
本発明のサルコシンオキシダーゼ遺伝子から遺伝子工学
的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この
人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法および目的遺伝
子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡ断片で置換するな
どの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、斯く
して取得された人工変異遺伝子のうち特に優れた性質を
有するサルコシンオキシダーゼムテインＤＮＡは、最終
的には、このムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて
組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させる
ことによって、サルコシンオキシダーゼムテインの製造
が可能である。 【００３８】さらに、上述の方法により得られた該サル
コシンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２１４ １２０５〜１２１０（１９８１年）に示さ
れているジデオキシ法で解読し、また該サルコシンオキ
シダーゼのアミノ酸配列は、塩基配列より予測決定し
た。一方、該サルコシンオキシダーゼであるペプチドの
Ｎ末端部を構成する部分アミノ酸配列は、以下の如くに
して決定した。 【００３９】即ち、サルコシンオキシダーゼ産生能を有
するサルコシンオキシダーゼ遺伝子供与微生物を栄養培
地で培養して菌体内に該サルコシンオキシダーゼを産生
蓄積せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌
体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破
壊し、また必要に応じてＥＤＴＡおよび／または適当な
界面活性剤等を添加してサルコシンオキシダーゼが可溶
化され、水溶液として分離採取された。 【００４０】この様にして得られた該サルコシンオキシ
ダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく
硫安分画、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーにより処理して、高純度該サル
コシンオキシダーゼが得られ、高純度該サルコシンオキ
シダーゼを用いて液相プロテイン シーケンサー（ベッ
クマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０Ｍ
Ｅ）によりサルコシンオキシダーゼであるペプチドのＮ
末端部を構成する部分アミノ酸配列が決定され、少なく
とも、該部分アミノ酸配列は遺伝子操作によって得られ
た該サルコシンオキシダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列
と一致するものであることを確認した。 【００４１】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
良く、通常多くの場合は、液体培養で行うか、工業的に
は深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養
源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く
使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物
であればよく、例えばグルコース、シュクロース、ラク
トース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用さ
れる。 【００４２】窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カ
ゼイン加水分解物などが使用される。その他、リン酸
塩，炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリ
ウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ
酸，特定のビタミンなどが必要に応じて使用され、通常
の該サルコシンオキシダーゼ生産菌の該サルコシンオキ
シダーゼ製造において必要とされるコリン、サルコシン
またはクレアチン等の該サルコシンオキシダーゼ生産誘
導物質は、当該製造法では必要としない。 【００４３】培養温度は菌が発育し、該サルコシンオキ
シダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリ
ヒア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度であ
る。培養時間は、条件によって多少異なるが、該サルコ
シンオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって
適当な時期に培養を終了すればよく、通常は１２〜４８
時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、該サルコシン
オキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に
好ましくはｐＨ６〜８程度である。 【００４４】培養物中のサルコシンオキシダーゼが培養
物中に存在する場合には、菌体を含む培養液そのままを
採取し、利用することもできるが、一般には常法に従っ
て、濾過、遠心分離などにより培養液中のサルコシンオ
キシダーゼと微生物菌体とを分離した後のサルコシンオ
キシダーゼ溶液が利用される。サルコシンオキシダーゼ
が菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過ま
たは遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いで
この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方
法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤
および／または界面活性剤を添加してサルコシンオキシ
ダーゼを可溶化し水溶液として分離採取する。 【００４５】この様にして得られたサルコシンオキシダ
ーゼ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫
安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈澱法により沈澱せしめればよい。次いでこ
の沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、よ
り低分子量の不純物を除去することができる。また吸着
剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより精
製し、これらの手段を用いて得られるサルコシンオキシ
ダーゼ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の処理にてより
精製されたサルコシンオキシダーゼを得ることができ
る。 【００４６】斯くして得られたサルコシンオキシダーゼ
は以下の活性測定法により測定される。即ち、まず、次
の反応液を用意する。 ０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．５ｍl １５ｍＭ４−アミノアンチピリン ０．５ｍl ０．２％（ｗ／ｖ）フェノール ０．５ｍl パーオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍl ） ０．５ｍl １．０Ｍサルコシン水溶液 １．０ｍl 水 ２．０ｍl 【００４７】上記の反応液０．５ｍl を試験管にとり、
３７℃３分間予備加温した後、１０μl のサルコシンオ
キシダーゼ（ＳＯＸ）含有酵素液を加え、正確に５分間
３７℃で保温する。２．５ｍl のエタノールを加え反応
を停止し、４８０ｎｍで比色定量し、その値をＡとす
る。１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を
１単位（Ｕ）とした。よって、サルコシンオキシダーゼ
活性値（ＳＯＸ活性値）（Ｕ／ｍl ）は次式により求め
られる。 【００４８】 Ａ0 ；酵素液の代わりに緩衝液を加え、上記と同様な操
作を行って得られる４８０ｎｍで比色値。また、不純物
酵素の含量は、以下に示す酵素活性測定法により求め
る。 【００４９】１．カタラーゼ活性測定法 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈された酵素
溶液０．５ｍl を試験管にとり、３０℃５分間予備加熱
した後、０．４％過酸化水素溶液０．５ｍl 加え、正確
に５分間３０℃で保温する。２．５ｍl の０．１Ｍ過塩
素酸溶液を加え反応を停止し、２４０ｎｍで比色定量
し、その値をＢとする。 【００５０】また、０．４％過酸化水素溶液０．５ｍl
を試験管にとり、３０℃５分間予備加温した後、２．５
ｍl の０．１Ｍ過塩素酸溶液を加え、その後、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈された酵素溶液０．
５ｍl 加え、２４０ｎｍで比色定量し、その値をＢ0 と
し、１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を
１単位（Ｕ）と定めれば、カタラーゼ活性値（ＣＬ活性
値）（Ｕ／ｍl ）が、次式により求められる。 【００５１】 【００５２】２．クレアチナーゼ活性測定法 本発明に用いるクレアチナーゼの活性測定法は次の通り
である。まず次の各溶液を用意する。 第１液 ０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．５ｍl ５０ｍＭクレアチン水溶液 ４．５ｍl 第２液 ０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．５ｍl １５ｍＭ４−アミノアンチピリン水溶液 ０．５ｍl ０．２％フェノール ０．５ｍl パーオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍl ） ０．５ｍl サルコシンオキシダーゼ（３０Ｕ／ｍl ） １．０ｍl ０．５ｍＭｐ−クロロマーキュリーベンゼン ２．０ｍl 第３液 ０．５ｍＭｐ−クロロマーキュリーベンゼン ０．５ｍl 【００５３】上記の第１液を試験管にとり、３７℃３分
間予備加温した後、１０μl の酵素液を加え、正確に５
分間保温する。０．５ｍl の第３液を加え、次に０．５
ｍlの第２液を加えて３７℃でさらに２０分間反応後、
１．５ｍl の蒸留水を加え５００ｎｍで比色定量し、１
分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を１単位
（Ｕ）と定めた。 【００５４】３．Ｎ−エチルグリシンオキシダーゼの活
性測定法 まず、次の反応液を用意する。 ０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．５ｍl １５ｍＭ４−アミノアンチピリン ０．５ｍl ０．２％（ｗ／ｖ）フェノール ０．５ｍl パーオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍｌ） ０．５ｍl １．０Ｍ Ｎ−エチルグリシン水溶液 １．０ｍl 水 ２．０ｍl 【００５５】上記の反応液０．５ｍl を試験管にとり、
３７℃３分間予備加温した後、１０μl の酵素液を加
え、正確に５分間３７℃で保温する。２．５ｍl のエタ
ノールを加え反応を停止し、４８０ｎｍで比色定量し、
その値をＡとする。１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素
を生じる活性を１単位（Ｕ）と定めた。 【００５６】以上の酵素活性測定法を用い、本発明サル
コシンオキシダーゼ標品は、サルコシンオキシダーゼ１
単位に対し、夾雑酵素であるカタラーゼ、クレアチナー
ゼ、Ｎ−エチル−グリシンオキシダーゼの活性が、カタ
ラーゼ活性０．０５単位以下、クレアチナーゼ活性０．
０００４単位以下、Ｎ−エチル−グリシンオキシダーゼ
活性０．０３単位以下であるサルコシンオキシダーゼで
あり、極めて夾雑酵素の少ない臨床診断に用いる酵素と
して、極めて優れた特性のある酵素である。 【００５７】斯くして得られたサルコシンオキシダーゼ
は、他に以下に述べる理化学的性質を有するものであ
る。 （ａ）作用 サルコシン、一分子の酸素および一分子の水からグリシ
ン、ホルムアルデヒドおよび一分子の過酸化水素を生成
する下記の酵素反応を培養する酵素である。サルコシン
＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ2 Ｏ
2 【００５８】（ｂ）基質特異性 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０５ｍ
l 、０．２％フェノール０．０５ｍl 、０．５ｍｇ／ｍ
l のパーオキシダーゼ０．０５ｍl 、蒸留水０．２ｍl
および下記化合物を基質とする０．５Ｍ基質溶液０．２
０ｍl よりなる反応液０．５ｍl に、該サルコシンオキ
シダーゼ０．５ｕを添加し、３７℃、５分間反応せし
め、次いで２．５ｍl エタノールを加えて反応を停止せ
しめた後４８０ｎｍにて比色した。 【００５９】 基質 相対活性（％） サルコシン １００．０ コリン ０ セリン ０ スレオニン ０ アラニン ０ バリン ０ Ｎ−メチルエタノールアミン ０ Ｎ−ジメチルエタノールアミン ０ 【００６０】 （ｃ）至適ｐＨ ４−アミノアンチピリン−フェノール−パーオキシダー
ゼの発色系に及ぼす影響を避けるため、アセチルアセト
ン法にて、生成するホルムアルデヒドを定量した結果、
該サルコシンオキシダーゼの至適ｐＨは８．０〜９．５
付近と認められる。用いた緩衝液としては、ｐＨ：４．
７：ジメチルグルタル酸緩衝液、ｐＨ：６〜８：リン酸
緩衝液、ｐＨ７．５〜９：トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９
〜１０：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０
〜１１：炭酸ナトリウム−ホウ酸ナトリウム緩衝液であ
る。 【００６１】（ｄ）等電点 ４．７付近（キャリアアンホライトを用いる等電点分画
法） （ｅ）分子量 約４万（ゲル濾過法により測定） （ｆ）熱安定性 酵素蛋白質２０μｇ／ｍl を含有してなる１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍl を各温度にて
１０分間放置し、次いで、上述のサルコシンに対する酵
素活性を測定した結果、４０℃における処理にても、１
００％の残存活性を有していた。 【００６２】 （ｇ）至適温度 上述のサルコシンに対する酵素活性測定法を利用して、
その温度条件を変えて酵素反応を行いサルコシンに対す
る酵素活性を測定した結果、その至適温度は５０℃付近
と認められた。 【００６３】（ｈ）ｐＨ安定性 緩衝液として、ｐＨ４〜７：ジメチルグルタル酸緩衝
液、ｐＨ：６〜８：リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９：ト
リス−塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１０：グリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ１０〜１１：炭酸ナトリウム−ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液を用い、各ｐＨの緩衝液０．１ｍ
l に、酵素溶液（酵素蛋白濃度１００μｇ／ｍl ）１０
０μl を加え、３７℃６０分間放置した。 【００６４】次いで、これに１．０Ｍトリス−塩酸緩衝
液、（ｐＨ８．０）０．３ｍl を加えてｐＨを調整した
後２０μl を分取し、反応液に加え、上述のサルコシン
に対する酵素活性測定法に従い、酵素活性を測定した結
果、そのｐＨ安定性は６．０〜１０．０付近と認められ
る。 【００６５】本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核
酸、核酸関連物質、その他に関する略号は、それらの当
該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を
以下に列記する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すも
のとする。 【００６６】ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＲＮＡ ： リボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン Ａｌａ ： アラニン Ａｒｇ ： アルギニン Ａｓｎ ： アスパラギン Ａｓｐ ： アスパラギン酸 【００６７】Ｃｙｓ ： システイン Ｇｌｎ ： グルタミン Ｇｌｕ ： グルタミン酸 Ｇｌｙ ： グリシン Ｈｉｓ ： ヒスチジン Ｉｌｅ ： イソロイシン Ｌｅｕ ： ロイシン Ｌｙｓ ： リジン Ｍｅｔ ： メチオニン 【００６８】Ｐｈｅ ： フェニルアラニン Ｐｒｏ ： プロリン Ｓｅｒ ： セリン Ｔｈｒ ： スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｔｙｒ ： チロシン Ｖａｌ ： バリン 【００６９】 【実施例】以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、
本発明は何らこれらによって限定されるものではない。 実施例 １ 染色体ＤＮＡの分離 バチルス・エスピー（Bacillus sp ）Ｂ−０６１８株
〔微工研菌寄託第０７５０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−０７５
０）〕の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を
１５０ｍl の普通ブイヨン培地（０．５％チオ硫酸ソー
ダ含有）で３７℃一晩振盪培養後遠心（３０００回転／
分（ｒｐｍ）、１０分）により集菌した。１０％サツカ
ロース、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍl に懸濁させ、１ｍl の
リゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍl ）を加え３７℃、１５
分間保温し、次いで１ｍl の１０％ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）溶液を加えた。 【００７０】この懸濁液に等量のクロロホルム−フェノ
ール混合液（１：１）を加え、撹拌混合し、１００００
回転／分、３分の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を分
取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層
し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒
にまきつかせて分離した。これを１０ｍl の１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ
溶液（以下ＴＥと略す）で溶解した。これを等量のクロ
ロホルム−フェノール混合液（１：１）を加え前記と同
様な処理をし、水層を分取し、２倍量のエタノールを加
えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２ｍl のＴ
Ｅに溶解した。 【００７１】実施例 ２ ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド
ＤＮＡの分離 ｐＡＣＹＣ１８４を保有するエシェリヒア・コリｐＭ１
９１〔Ｊ．Bacteriol., １３４，１１４１（１９８
１）；ＡＴＣＣ３７０３３〕を１l のＢＨＩ培地（Ｄｉ
ｆｃｏ社製）で振盪培養した。濁度がＯＤ660＝１．０
に増殖したとき、スペクチノマイシン（最終濃度３００
μｇ／ｍl ）を加え、さらに３７℃で１６時間以上振盪
を続けた。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心により集菌
し、リゾチーム−ＳＤＳ法とセシウムクロライド−エチ
ジウムブロマイド法〔Maniatisら，Molecular, Clonin
g, 86 〜 94 Cold Spring Harbor（１９８２）〕に従
いプラスミドＤＮＡを調製した。 【００７２】実施例 ３ サルコシンオキシダーゼ（Ｓ
ＯＸ）遺伝子を有するプラスミドｐＯＸＩ１０１の作成 （ｉ）実施例１で調製したバチルス・エスピーＢ−０６
１８株の染色体ＤＮＡ２μl （約０．５μｇ）と１０倍
濃度のＥｃｏＲＩ切断用バツファー（５００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ ＭｇＣl2、１Ｍ Ｎａ
Ｃl 、７０ｍＭメルカプトエタノール）１μl 、Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造製、１０ｕｎｉｔ／μl ）１μl 、水６μ
l を混合し、３７℃１時間切断した。 【００７３】別に調製したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４
ＤＮＡ約０．３μｇを同様な方法を用いてＥｃｏＲＩで
切断し、さらにアルカリ性フォスファターゼ（以下ＢＡ
Ｐと略すことがある、宝酒造製）０．６ｕｎｉｔを加
え、６５℃１時間処理した。これらのＥｃｏＲＩで切断
した２種のＤＮＡ溶液を混合し、その１／１０量の３Ｍ
酢酸ナトリウムを加え、さらに全体量と等量のクロロホ
ルム−フェノール混液で処理し、遠心分離により水層を
分取した。 【００７４】この水層に２倍容のエタノールを加え、遠
心でＤＮＡを沈澱させたのち減圧乾燥した。得られたＤ
ＮＡを水８９μl で溶解後、１０倍濃度のライゲーショ
ンバツファ〔０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６），０．１Ｍ ＭｇＣl2、０．１Ｍジチオスレイトー
ル，１０ｍＭスペルミジン，１０ｍＭ ＡＴＰ〕１０μ
lとＴ４ＤＮＡリガーゼ１μl （宝酒造製、１７５ｕｎ
ｉｔ／μl ）を加え混合し、４℃で一晩放置した。この
ＤＮＡ溶液をクロロホルム−フェノール処理し、エタノ
ール沈澱をさせたのち、得られた沈澱物を遠心分離によ
り集め、減圧乾燥した後，１０μl ＴＥに溶解した。 【００７５】（ii）１００ｍl のＢＨＩ培地（Brein He
art Infusion培地，Difco社製）で培養した対数増殖期
のエシェリヒア・コリＤＨ１株（国立遺伝学研究所より
分与を受けた、ストック番号ＭＥ８５６９）を遠心分離
により集菌し（１００００ｒｐｍ，２分間）４０ｍl の
氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ ＲｂＣ
l、１０ｍＭ ＣａＣl2、５０ｍＭ ＭｎＣl2および１
５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ５．８）で懸濁し
た。 【００７６】次いで、０℃で５分間放置した後、遠心
し、上清をすて、さらに４ｍl の１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩
衝液（ドータイト社製）、７５ｍＭ ＣａＣl2、１０ｍ
Ｍ ＲｂＣl および１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐ
Ｈ６．５）で懸濁し、０℃で１５分間放置してコンピテ
ント細胞とした。 【００７７】（iii ）この大腸菌懸濁液２００μl に
（ｉ）で調製したＤＮＡ溶液１０μl を加え、３０分間
０℃で放置した。ＢＨＩ培地１ｍl を加え、３７℃で９
０分間保温後、この１００μl をテトラサイクリン（１
５μｇ／ｍl ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３
７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体を
検出培地（組成はペプトン５ｇ，肉エキス２ｇ，イース
トエキス５ｇ，ＮａＣl １ｇ，Ｋ2 ＨＰＯ4１ｇ，Ｍｇ
ＳＯ4０．５ｇ，パーオキシダーゼ５００ＩＵ，ジアニ
シジン０．１ｇ，サルコシン９ｇ，寒天１５ｇ，蒸留水
１l ，ｐＨ７．０）のプレートにレプリカし、３７℃で
さらに一晩培養した。 【００７８】約６０００コロニーの形質転換体を調べた
ところ、コロニーの周辺が茶褐色に変色したもの４株を
得、この中の１株をエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）ＤＨ１ ｐＯＸＩ１０１株と命名した。この菌を
純粋分離後ＢＨＩ培地で３７℃一晩培養し、実施例２と
同様にしてプラスミドを分離し、サルコシンオキシダー
ゼ遺伝子を含み、ｐＡＣＹＣ１８４遺伝子を含むプラス
ミドを得、ｐＯＸＩ１０１と命名した。 【００７９】実施例 ４ ｐＯＸＩ１０１のマッピング
およびサブクローニング ｐＯＸＩ１０１にＤＮＡについて制限酵素ＣｌａＩ、Ｈ
ｐａＩ、ＳalＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ（いずれも宝酒造
製）による切断地図を作成した。その結果を図１に示し
た。実施例３（ｉ）と同様にしてｐＯＸＩ１０１から得
られる２つのＸｈｏＩ切断部位を含むＥｃｏＲＩ−Ｃｌ
ａＩ ５．３ｋｂ断片とｐＢＲ３２２から得られるＥｃ
ｏＲＩ−ＣｌａＩ ４．３ｋｂ断片との各断片を得、こ
れらの断片を用いて実施例３と同様な方法により、接
合、エシェリヒア・コリＤＨ１の形質転換、形質転換後
のスクリーニング等サブクローニング操作を試みたとこ
ろ、サルコシンオキシダーゼ生産性のあるクローンを１
株得、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ１
ｐＯＸＩ１０３株と命名した〔微工研菌寄託第９４９
４号（ＦＥＲＭ Ｐ−９４９４）〕。 【００８０】尚本菌株は、ブダペスト条約に基づく寄託
に移管されて、微工研条寄第１８２８号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１８２８）として寄託されている。この株から実施
例２の如くして、プラスミドＤＮＡを分離し、ｐＯＸＩ
１０３と命名した。ｐＯＸＩ１０３にＤＮＡについて制
限酵素ＣｌａＩ、ＨｐａＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、Ｘｈ
ｏＩ（いずれも宝酒造製）による切断地図を作成したと
ころ、ＳｍａＩ切断部位を含んでいるＥｃｏＲＩからＸ
ｈｏＩ付近までが欠如しているクローンであることが判
明し、図２に示した。 【００８１】このエシェリヒア・コリＤＨ１ ｐＯＸＩ
１０３株をＢＨＩ培地で３７℃一晩培養したところ、サ
ルコシンオキシダーゼの生産性は、前述のサルコシンオ
キシダーゼ活性測定法によると約２ｕ／ｍl のサルコシ
ンオキシダーゼ活性を有していた。サルコシンオキシダ
ーゼ遺伝子を含んだＤＮＡの塩基配列をＭ１３ファージ
を用いたジデオキシ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２
０５−１２１０，（１９８１）〕を用いて決定した。サ
ルコシンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列並びにアミノ酸
配列を図３および図４に示した。 【００８２】実施例 ５ サルコシンオキシダーゼの製
造方法 エシェリヒア・コリＤＨＩ ｐＯＸＩ１０３株を２０ｌ
のＢＨＩ培地で３７℃、１８時間３０ｌ容ジャーファー
メンターで通気攪拌培養し、５０００ｒｐｍ、１０分間
の遠心で集菌した。この時のサルコシンオキシダーゼの
生産性は４．６ｕ／ｍｌであった。生理食塩水２ｌで、
洗浄後、２ｌの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．
５）に懸濁した。塩化リゾチームを０．１％、ＥＤＴＡ
−２Ｎａを２ｍＭになる様に加え、３７℃で６０分間攪
拌しながら保温後、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心
分離により、上清液１．８ｌを得た。 【００８３】この液に飽和硫安１．８l を加え生じた沈
澱を１２０００ｒｐｍ，１０分間の遠心により集め、３
００ｍl の１０ｍＭリン酸バツファー（ｐＨ７．５）に
溶解した。１０ｍＭリン酸バツファー（ｐＨ７．５）で
平衡化したセファデックスＧ−２５（商品名）で脱塩
後、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを用いたイオン
交換クロマトグラフィーを行い活性画分を分取した。 【００８４】脱塩後、凍結乾燥により粉末標品０．８０
７ｇを得、この時の回収収率は３６％で、比活性は４１
Ｕ／ｍｇであった。また、得られたサルコシンオキシダ
ーゼをゲル濾過法による分子量を測定した所、分子量約
４００００で、アミノ酸配列から計算される分子量とほ
ぼ一致するものであった。 【００８５】 【発明の効果】本発明によって、サルコシンオキシダー
ゼ遺伝子および、サルコシンオキシダーゼのアミノ酸配
列が明らかになり、また、遺伝子工学手法による効率的
なサルコシンオキシダーゼの製造方法を提供した。ま
た、本発明のサルコシンオキシダーゼ遺伝子と種々の遺
伝子工学的手法とを用いることによって、より効率的な
サルコシンオキシダーゼの製造方法をもたらしめるもの
である。 【００８６】 【配列表】 配列の長さ：１２８８塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルス・エスピー 株名：Ｂ−０６１８ 配列の特徴： ２８−１１９８ Ｅ サルコシンオキシダーゼ遺伝子 配列 TTTAAATAGT TTTCTAGGAG GAATGTT ATG AGC ACA CAT TTT GAT GTC ATC GTT 55 Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val 1 5 GTT GGA GCT GGA TCA ATG GGA ATG GCG GCA GGT TAT CAA TTA GCA AAG 103 Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Gln Leu Ala Lys 10 15 20 25 CAA GGA GTC AAA ACA TTA TTA GTG GAT GCA TTT GAT CCG CCG CAT ACA 151 Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Pro Pro His Thr 30 35 40 AAC GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACT CGT ATC ATC CGC CAT GCT TAC GGT 199 Asn Gly Ser His His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly 45 50 55 GAG GGA AGA GAA TAT GTT CCT CTT GCA TTA AGA TCA CAA GAG TTA TGG 247 Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Trp 60 65 70 TAT GAA CTA GAA AAA GAA ACA CAC CAT AAA ATA TTC ACG AAA ACG GGC 295 Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly 75 80 85 GTA CTC GTA TTT GGT CCT AAA GGT GAA TCG GCT TTC GTT GCA GAA ACG 343 Val Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr 90 95 100 105 ATG GAA GCG GCA AAG GAA CAT TCA TTG ACT GTT GAT TTA CTG GAA GGT 391 Met Glu Ala Ala Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly 110 115 120 GAT GAA ATA AAT AAG CGT TGG CCG GGT ATA ACG GTT CCG GAA AAC TAC 439 Asp Glu Ile Asn Lys Arg Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr 125 130 135 AAT GCT ATT TTC GAA CCG AAC TCA GGT GTA TTA TTC AGT GAA AAT TGT 487 Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys 140 145 150 ATT CGT GCC TAC CGC GAG TTA GCT GAA GCG CGA GGT GCT AAA GTT CTA 535 Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala Arg Gly Ala Lys Val Leu 155 160 165 ACA CAT ACA CGC GTT GAG GAC TTT GAC ATT TCA CCG GAC TCA GTC AAA 583 Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp Ile Ser Pro Asp Ser Val Lys 170 175 180 185 ATC GAA ACA GCA AAT GGA TCA TAC ACA GCT GAT AAA TTA ATT GTT AGC 631 Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu Ile Val Ser 190 195 200 ATG GGA GCT TGG AAT AGC AAA CTA CTT TCA AAA CTA AAT CTT GAC ATC 679 Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp Ile 205 210 215 CCA TTA CAG CCA TAT CGT CAA GTG GTA GGT TTC TTT GAA TCC GAT GAA 727 Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu 220 225 230 TCA AAG TAT AGC AAT GAT ATT GAT TTC CCA GGA TTC ATG GTT GAA GTG 775 Ser Lys Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val 235 240 245 CCA AAT GGT ATT TAT TAC GGA TTC CCA AGC TTC GGC GGC TGT GGA TTG 823 Pro Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu 250 255 260 265 AAA CTA GGA TAT CAT ACG TTC GGG CAG AAA ATT GAC CCT GAT ACA ATT 871 Lys Leu Gly Tyr His Thr Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile 270 275 280 AAT CGC GAA TTT GGC GTT TAT CCA GAA GAT GAA AGT AAT CTT CGC GCT 919 Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala 285 290 295 TTC TTG GAA GAA TAT ATG CCA GGA GCA AAT GGA GAG TTA AAA AGA GGG 967 Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Arg Gly 300 305 310 GCA GTC TGC ATG TAC ACG AAA ACA TTA GAT GAA CAT TTC ATT ATA GAC 1015 Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu His Phe Ile Ile Asp 315 320 325 TTA CAT CCT GAA CAT TCC AAC GTA GTC ATC GCT GCC GGC TTC TCT GGC 1063 Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly 330 335 340 345 CAT GGA TTT AAG TTT TCC AGT GGA GTT GGT GAA GTG CTA AGT CAA TTA 1111 His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln Leu 350 355 360 GCT TTA ACT GGT AAA ACA GAG CAC GAT ATT TCA ATC TTC TCC ATT AAC 1159 Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn 365 370 375 CGT CCT GCT TTG AAA GAA TCG TTA CAA AAA ACA ACT ATC TAA 1201 Arg Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile *** 380 385 390 TTGTAGTCTA ATCGTTGAGT CGTCTGTTTT TATCTGTCTA ACAGAATCAT ATATAAATTG 1261 AAAAACAGAA AATCTAATTC GAAATTT 1288
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＯＸＩ１０１ベクターの構成を示す模式図で
ある。 【図２】ｐＯＸＩ１０３ベクターの構成を示す模式図で
ある。 【図３】サルコシンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡのコード
鎖（５’→３’）および得られる翻訳生成物のそれぞれ
の配列を示す。 【図４】サルコシンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡのコード
鎖（５’→３’）および得られる翻訳生成物のそれぞれ
の配列を示す。
ある。 【図２】ｐＯＸＩ１０３ベクターの構成を示す模式図で
ある。 【図３】サルコシンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡのコード
鎖（５’→３’）および得られる翻訳生成物のそれぞれ
の配列を示す。 【図４】サルコシンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡのコード
鎖（５’→３’）および得られる翻訳生成物のそれぞれ
の配列を示す。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記の理化学的性状を示し、 （ａ）作用 サルコシン、一分子の酵素および一分子の水からグリシ
ン、ホルムアルデヒドおよび一分子の過酸化水素を生成
する下記の酵素反応を触媒する酵素である。 サルコシン＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ２Ｏ２ （ｂ）基質特異性 サルコシンに基質特異性を有する （ｃ）至適ｐＨ ８．０〜９．５ （ｄ）等電点 ４．７ （ｅ）分子量 ４万（ゲル濾過法により測定） （ｆ）熱安定性 ４０℃、１０分間処理で安定である かつ、サルコシンオキシダーゼ活性１単位に対し、夾雑
酵素であるカタラーゼ、クレアチナーゼ、Ｎ−エチル−
グリシンオキシダーゼの活性が、カタラーゼ活性０．０
５単位以下、クレアチナーゼ活性０．０００４単位以
下、Ｎ−エチル−グリシンオキシダーゼ活性０．０３単
位以下であるサルコシンオキシダーゼ。 ２．下記のサルコシンオキシダーゼのポリペプチドアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリデオキシリボ
核酸を発現ベクターに組み入れた組換えＤＮＡを宿主微
生物に移入して形質転換体を得、該形質転換体を培養し
て該ポリデオキシリボ核酸の遺伝情報を発現させ、次い
で該サルコシンオキシダーゼを構成成分としてなるポリ
ペプチドを採取してなる請求項１記載のサルコシンオキ
シダーゼの製造法。Ｎ末端側より式 Ａ−Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Gln Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys Arg Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala Arg Gly Ala Lys Val Leu Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp Ile Ser Pro Asp Ser Val Lys Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp Ile Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu Ser Lys Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His Thr Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu His Phe Ile Ile Asp Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln Leu Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile −Ｂ （式中、Ａはアミノ酸残基，水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基，−ＯＨまたは−ＮＨ2 を示
す）で表わされるアミノ酸配列。 ３．該ポリデオキシリボ核酸が、５’末端側より式 Ｘ−AGC ACA CAT TTT GAT GTC ATC GTT GTT GGA GCT GGA TCA ATG GGA ATG GCG GCA GGT TAT CAA TTA GCA AAG CAA GGA GTC AAA ACA TTA TTA GTG GAT GCA TTT GAT CCG CCG CAT ACA AAC GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACT CGT ATC ATC CGC CAT GCT TAC GGT GAG GGA AGA GAA TAT GTT CCT CTT GCA TTA AGA TCA CAA GAG TTA TGG TAT GAA CTA GAA AAA GAA ACA CAC CAT AAA ATA TTC ACG AAA ACG GGC GTA CTC GTA TTT GGT CCT AAA GGT GAA TCG GCT TTC GTT GCA GAA ACG ATG GAA GCG GCA AAG GAA CAT TCA TTG ACT GTT GAT TTA CTG GAA GGT GAT GAA ATA AAT AAG CGT TGG CCG GGT ATA ACG GTT CCG GAA AAC TAC AAT GCT ATT TTC GAA CCG AAC TCA GGT GTA TTA TTC AGT GAA AAT TGT ATT CGT GCC TAC CGC GAG TTA GCT GAA GCG CGA GGT GCT AAA GTT CTA ACA CAT ACA CGC GTT GAG GAC TTT GAC ATT TCA CCG GAC TCA GTC AAA ATC GAA ACA GCA AAT GGA TCA TAC ACA GCT GAT AAA TTA ATT GTT AGC ATG GGA GCT TGG AAT AGC AAA CTA CTT TCA AAA CTA AAT CTT GAC ATC CCA TTA CAG CCA TAT CGT CAA GTG GTA GGT TTC TTT GAA TCC GAT GAA TCA AAG TAT AGC AAT GAT ATT GAT TTC CCA GGA TTC ATG GTT GAA GTG CCA AAT GGT ATT TAT TAC GGA TTC CCA AGC TTC GGC GGC TGT GGA TTG AAA CTA GGA TAT CAT ACG TTC GGG CAG AAA ATT GAC CCT GAT ACA ATT AAT CGC GAA TTT GGC GTT TAT CCA GAA GAT GAA AGT AAT CTT CGC GCT TTC TTG GAA GAA TAT ATG CCA GGA GCA AAT GGA GAG TTA AAA AGA GGG GCA GTC TGC ATG TAC ACG AAA ACA TTA GAT GAA CAT TTC ATT ATA GAC TTA CAT CCT GAA CAT TCC AAC GTA GTC ATC GCT GCC GGC TTC TCT GGC CAT GGA TTT AAG TTT TCC AGT GGA GTT GGT GAA GTG CTA AGT CAA TTA GCT TTA ACT GGT AAA ACA GAG CAC GAT ATT TCA ATC TTC TCC ATT AAC CGT CCT GCT TTG AAA GAA TCG TTA CAA AAA ACA ACT ATC −Ｙ （式中、ＸはTAA, TAGおよびTGA 以外のコドンまたは水
素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す）で表
わされる塩基配列である請求項２記載の製造法。 ４．形質転換体が、エシェリヒア属に属する微生物であ
る請求項２記載の製造法。 ５．エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア
コリに属する微生物である請求項４記載の製造法。 ６．エシェリヒア・コリに属する微生物が、エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨＩ
ｐＯＸＩ１０３（ＦＥＲＭＢＰ−１８２８）である請
求項５記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7331733A JP2729045B2 (ja) | 1995-12-20 | 1995-12-20 | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7331733A JP2729045B2 (ja) | 1995-12-20 | 1995-12-20 | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08238087A JPH08238087A (ja) | 1996-09-17 |
| JP2729045B2 true JP2729045B2 (ja) | 1998-03-18 |
Family
ID=18247001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7331733A Expired - Lifetime JP2729045B2 (ja) | 1995-12-20 | 1995-12-20 | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2729045B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000175685A (ja) | 1998-12-14 | 2000-06-27 | Kikkoman Corp | ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法 |
| US7229812B2 (en) | 2002-11-13 | 2007-06-12 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
| CN109957553A (zh) * | 2019-04-04 | 2019-07-02 | 大连大学 | 一种产肌氨酸氧化酶的芽孢杆菌的发酵产酶方法 |
-
1995
- 1995-12-20 JP JP7331733A patent/JP2729045B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣＨＥＭ．ＰＨＡＲＭ．ＢＵＬＬ．３５（２）Ｐ．７１１−７１７（１９８７） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08238087A (ja) | 1996-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2641285A1 (fr) | Gene de la glucose-6-phosphate deshydrogenase, plasmide et microorganisme le contenant et procede de preparation de la glucose-6-phosphate deshydrogenase | |
| JPH11243949A (ja) | Ｐｑｑを補欠分子族とするグルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造方法 | |
| CA2045839C (en) | Cloned n-methylhydantoinase | |
| JP2729045B2 (ja) | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 | |
| JP3251976B2 (ja) | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産する実質上純粋な微生物 | |
| JP3325128B2 (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 | |
| JP2706223B2 (ja) | ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途 | |
| JP2942564B2 (ja) | 乳酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 | |
| US4960877A (en) | DNA having genetic information of L-α-glycerophosphate oxidase and application thereof | |
| JP3132618B2 (ja) | 安定化された改変タンパク質 | |
| JP2593481B2 (ja) | サルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 | |
| JPH10174585A (ja) | 安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ | |
| JPH11155579A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法 | |
| JP3018092B2 (ja) | 放線菌由来のサルコシンオキシダーゼの遺伝子およびその用途 | |
| JPH06303981A (ja) | ホルムアルデヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにホルムアルデヒド脱水素酵素の製造法 | |
| JPH10248574A (ja) | 新規な乳酸酸化酵素 | |
| JP3335287B2 (ja) | ヘキソキナーゼ遺伝子 | |
| JP3829950B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
| JP2001275669A (ja) | 新規カタラーゼ遺伝子及び該遺伝子を用いた新規カタラーゼの製造方法 | |
| JP3173619B2 (ja) | ピログルタミルアミノペプチダーゼの製造法 | |
| JPH10248572A (ja) | 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 | |
| JP3003785B2 (ja) | イソクエン酸脱水素酵素の遺伝子情報を有するｄｎａおよびその用途 | |
| JP3201483B2 (ja) | ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを生産する実質上純粋な微生物 | |
| JP2764415B2 (ja) | Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡおよびその用途 | |
| JP2000083674A (ja) | β−ホスホグルコムターゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びβ−ホスホグルコムターゼの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19971202 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071212 Year of fee payment: 10 |