JP2000175685A - ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法 - Google Patents
ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法Info
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- C12Y105/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 下記の理化学的性質を有するザルコシン
オキシダーゼ及び (a)作用；１モルのザルコシンを酸化的に加水分解し、
１モルのグリシン、１モルのホルムアルデヒド及び１モ
ルの過酸化水素を生成する。 (b)基質特異性；ザルコシンに基質特異性を有する。 (c)至適pH；7.0〜8.0 (d)安定pH範囲；7.0〜9.5 (e)作用適温の範囲；50℃ (f)熱安定性；55℃以下 (g)分子量；44,000（野生型のアミノ酸配列より概算） 前記ザルコシンオキシダーゼ生産能を有する微生物を培
養し、その培養物からザルコシンオキシダーゼを採取す
ることを特徴とするザルコシンオキシダーゼの製造法。 【効果】 本発明によれば、クレアチニン測定時に、ビ
リルビンの影響を受けにくい、中性〜弱酸性域で比較的
高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼが効率よく製
造でき、また、通常の条件で使用する際にもより少ない
酵素使用量で充分な反応を行なうことができるため極め
て経済的であり、本発明は、産業上有用である。
オキシダーゼ及び (a)作用；１モルのザルコシンを酸化的に加水分解し、
１モルのグリシン、１モルのホルムアルデヒド及び１モ
ルの過酸化水素を生成する。 (b)基質特異性；ザルコシンに基質特異性を有する。 (c)至適pH；7.0〜8.0 (d)安定pH範囲；7.0〜9.5 (e)作用適温の範囲；50℃ (f)熱安定性；55℃以下 (g)分子量；44,000（野生型のアミノ酸配列より概算） 前記ザルコシンオキシダーゼ生産能を有する微生物を培
養し、その培養物からザルコシンオキシダーゼを採取す
ることを特徴とするザルコシンオキシダーゼの製造法。 【効果】 本発明によれば、クレアチニン測定時に、ビ
リルビンの影響を受けにくい、中性〜弱酸性域で比較的
高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼが効率よく製
造でき、また、通常の条件で使用する際にもより少ない
酵素使用量で充分な反応を行なうことができるため極め
て経済的であり、本発明は、産業上有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、中性域で高い反応
性を示すザルコシンオキシダーゼ及びその製造法に関す
る。
性を示すザルコシンオキシダーゼ及びその製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】 ザルコシンオキシダーゼは、ザルコシ
ンを酸化的に加水分解してグリシン、ホルムアルデヒド
及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であり、
クレアチニナーゼやクレアチナーゼと組み合わせて用い
ることによって、ヒトの血清中又は尿中のクレアチニン
又はクレアチン量を測定することができ、腎臓病をはじ
めとする各種疾患の診断用酵素として利用することがで
きる。従来のザルコシンオキシダーゼは、中性から弱酸
性域で反応させると、その反応性が極端に低下する欠点
があるため、弱アルカリ性での使用が一般的であった
（特公平1-34035号公報、特開平5-115281号公報、特開
平8-238087号公報 、特開平6-113840号公報、特開平4-9
4688号公報）。しかし、その至適pH域で血清と反応を行
なった場合、基質との反応は良好なものの、ビリルビン
の影響を受けやすく、測定誤差を生じる欠点があった。
それに対し、血清との反応をpH6.5付近で行なった場合
には、ビリルビンの影響を受けず、測定誤差を生じるこ
とがないため、中性から弱酸性域で使用可能なザルコシ
ンオキシダーゼが求められていた。更に、弱アルカリ性
域での酵素の反応性が高まれば（Km値が小さくなれ
ば）、本酵素を通常の条件で診断用酵素として利用する
際にも、より少ない酵素使用量で充分な反応を行なうこ
とができるため、極めて経済的である。
ンを酸化的に加水分解してグリシン、ホルムアルデヒド
及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であり、
クレアチニナーゼやクレアチナーゼと組み合わせて用い
ることによって、ヒトの血清中又は尿中のクレアチニン
又はクレアチン量を測定することができ、腎臓病をはじ
めとする各種疾患の診断用酵素として利用することがで
きる。従来のザルコシンオキシダーゼは、中性から弱酸
性域で反応させると、その反応性が極端に低下する欠点
があるため、弱アルカリ性での使用が一般的であった
（特公平1-34035号公報、特開平5-115281号公報、特開
平8-238087号公報 、特開平6-113840号公報、特開平4-9
4688号公報）。しかし、その至適pH域で血清と反応を行
なった場合、基質との反応は良好なものの、ビリルビン
の影響を受けやすく、測定誤差を生じる欠点があった。
それに対し、血清との反応をpH6.5付近で行なった場合
には、ビリルビンの影響を受けず、測定誤差を生じるこ
とがないため、中性から弱酸性域で使用可能なザルコシ
ンオキシダーゼが求められていた。更に、弱アルカリ性
域での酵素の反応性が高まれば（Km値が小さくなれ
ば）、本酵素を通常の条件で診断用酵素として利用する
際にも、より少ない酵素使用量で充分な反応を行なうこ
とができるため、極めて経済的である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、中性域で高
い反応性を示すザルコシンオキシダーゼ及びその製造法
を提供することを目的とするものである。
い反応性を示すザルコシンオキシダーゼ及びその製造法
を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記目的に鑑み更に検討し、バチルス由来のザルコシン
オキシダーゼ遺伝子(特公平6-65303号公報記載)の遺伝
子改変を行なった結果、単に弱アルカリ性域で野生型よ
り高い反応性（小さいKm値）を示すばかりでなく、中性
(pH7.0)においても比較的高い反応性を維持し得るザル
コシンオキシダーゼが得られること等を見い出し、本発
明を完成した。
上記目的に鑑み更に検討し、バチルス由来のザルコシン
オキシダーゼ遺伝子(特公平6-65303号公報記載)の遺伝
子改変を行なった結果、単に弱アルカリ性域で野生型よ
り高い反応性（小さいKm値）を示すばかりでなく、中性
(pH7.0)においても比較的高い反応性を維持し得るザル
コシンオキシダーゼが得られること等を見い出し、本発
明を完成した。
【０００５】即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有
するザルコシンオキシダーゼであり、 (a)作用；１モルのザルコシンを酸化的に加水分解し、
１モルのグリシン、１モルのホルムアルデヒド及び１モ
ルの過酸化水素を生成する。 (b)基質特異性；ザルコシンに基質特異性を有する。 (c)至適pH；7.0〜8.0 (d)安定pH範囲；7.0〜9.5 (e)作用適温の範囲；50℃ (f)熱安定性；55℃以下 (g)分子量；44,000（野生型のアミノ酸配列より概算） また、本発明は、前記ザルコシンオキシダーゼ生産能を
有する微生物を培養し、その培養物からザルコシンオキ
シダーゼを採取することを特徴とするザルコシンオキシ
ダーゼの製造法である。
するザルコシンオキシダーゼであり、 (a)作用；１モルのザルコシンを酸化的に加水分解し、
１モルのグリシン、１モルのホルムアルデヒド及び１モ
ルの過酸化水素を生成する。 (b)基質特異性；ザルコシンに基質特異性を有する。 (c)至適pH；7.0〜8.0 (d)安定pH範囲；7.0〜9.5 (e)作用適温の範囲；50℃ (f)熱安定性；55℃以下 (g)分子量；44,000（野生型のアミノ酸配列より概算） また、本発明は、前記ザルコシンオキシダーゼ生産能を
有する微生物を培養し、その培養物からザルコシンオキ
シダーゼを採取することを特徴とするザルコシンオキシ
ダーゼの製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のザルコシンオキシダーゼは、例えば、次のよう
にして得ることができる。先ず、単離したバチルス・エ
スピー．NS-129株由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を
含む組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡ（Agricultural
and Biological Chemistry, 55(5), 1259-1263, 1991）
を、大腸菌(E.coli)JM109(pSO12)から、例えば、QIAGEN
（フナコシ社製）を利用することにより抽出、精製す
る。なお、本発明において用いることのできるベクター
ＤＮＡとしては、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定
されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファー
ジベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等を用い
ることができる。具体的にはpUC18(宝酒造社製)等が好
ましい。
本発明のザルコシンオキシダーゼは、例えば、次のよう
にして得ることができる。先ず、単離したバチルス・エ
スピー．NS-129株由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を
含む組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡ（Agricultural
and Biological Chemistry, 55(5), 1259-1263, 1991）
を、大腸菌(E.coli)JM109(pSO12)から、例えば、QIAGEN
（フナコシ社製）を利用することにより抽出、精製す
る。なお、本発明において用いることのできるベクター
ＤＮＡとしては、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定
されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファー
ジベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等を用い
ることができる。具体的にはpUC18(宝酒造社製)等が好
ましい。
【０００７】次いで、配列番号１に示されるアミノ酸配
列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加されたアミノ酸配列からなり、かつザルコシン
オキシダーゼ活性、好ましくは、中性〜弱酸性域で比較
的高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするザルコシンオキシダーゼ遺伝
子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、この組
み換え体プラスミドＤＮＡに、例えば、ハイドロキシル
アミン、亜硝酸等の化学変異剤やＰＣＲ法を用いてラン
ダムに変換する方法等の点変異、市販のキットを利用す
る部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための
周知技術である部位特定変異誘導法；この組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオ
リゴヌクレオチドを除去または付加し、連結する方法；
オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加されたアミノ酸配列からなり、かつザルコシン
オキシダーゼ活性、好ましくは、中性〜弱酸性域で比較
的高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするザルコシンオキシダーゼ遺伝
子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、この組
み換え体プラスミドＤＮＡに、例えば、ハイドロキシル
アミン、亜硝酸等の化学変異剤やＰＣＲ法を用いてラン
ダムに変換する方法等の点変異、市販のキットを利用す
る部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための
周知技術である部位特定変異誘導法；この組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオ
リゴヌクレオチドを除去または付加し、連結する方法；
オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
【０００８】上記処理後の組み換え体ＤＮＡを脱塩カラ
ム、QIAGEN(フナコシ社製)等を用いて精製し、種々の組
み換え体ＤＮＡを得る。
ム、QIAGEN(フナコシ社製)等を用いて精製し、種々の組
み換え体ＤＮＡを得る。
【０００９】このようにして得られた種々の組み換え体
ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K12、好ましくは大腸
菌JM109(東洋紡社製)、XL1-Blue〔フナコシ(株)製〕等
を形質転換または形質導入し、種々のザルコシンオキシ
ダーゼ遺伝子断片を保有する組み換え体ＤＮＡを含む形
質転換体又は形質導入体を得ることができる。
ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K12、好ましくは大腸
菌JM109(東洋紡社製)、XL1-Blue〔フナコシ(株)製〕等
を形質転換または形質導入し、種々のザルコシンオキシ
ダーゼ遺伝子断片を保有する組み換え体ＤＮＡを含む形
質転換体又は形質導入体を得ることができる。
【００１０】そして、例えば、形質転換体の場合、得ら
れた形質転換体（その中に種々の変異型ザルコシンオキ
シダーゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドＤＮＡを含
有している。）より、目的の性質（中性域で高い反応性
を示す）を有するザルコシンオキシダーゼを生産する株
を得るには、次のような方法を用いることができる。
れた形質転換体（その中に種々の変異型ザルコシンオキ
シダーゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドＤＮＡを含
有している。）より、目的の性質（中性域で高い反応性
を示す）を有するザルコシンオキシダーゼを生産する株
を得るには、次のような方法を用いることができる。
【００１１】次いで、得られた上記形質転換体を各コロ
ニー毎にTY培地（50μg Ampicilin,1mM IPTG添加）等で
液体培養し、組み換え体プラスミドＤＮＡに含まれる種
々のザルコシンオキシダーゼを誘導生産させる。培養
後、得られた培養物に対し超音波破砕を行ない、その粗
酵素抽出液のザルコシンオキシダーゼ活性を測定する。
得られた活性値から100mUに相当する粗酵素液量を計算
し、その100mU相当の粗酵素を0.5mMザルコシン(Sarcosi
ne), 50mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて反応させる。また、
各変異株の測定結果に対し、同様にして抽出処理し、測
定した野生型タンパク質と比較を行ない目的とする形質
転換体を選択する。
ニー毎にTY培地（50μg Ampicilin,1mM IPTG添加）等で
液体培養し、組み換え体プラスミドＤＮＡに含まれる種
々のザルコシンオキシダーゼを誘導生産させる。培養
後、得られた培養物に対し超音波破砕を行ない、その粗
酵素抽出液のザルコシンオキシダーゼ活性を測定する。
得られた活性値から100mUに相当する粗酵素液量を計算
し、その100mU相当の粗酵素を0.5mMザルコシン(Sarcosi
ne), 50mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて反応させる。また、
各変異株の測定結果に対し、同様にして抽出処理し、測
定した野生型タンパク質と比較を行ない目的とする形質
転換体を選択する。
【００１２】上記のようにして得られた中性域で高い反
応性を示すザルコシンオキシダーゼ生産能を有する形質
転換体または形質導入体、好ましくは、エッシェリシア
属に属する菌株を用いて中性域で高い反応性を示すザル
コシンオキシダーゼを生産するには、下記のようにして
行なうことができる。上記微生物を培養するには、通常
の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法
を採用して培養するのが好ましい。
応性を示すザルコシンオキシダーゼ生産能を有する形質
転換体または形質導入体、好ましくは、エッシェリシア
属に属する菌株を用いて中性域で高い反応性を示すザル
コシンオキシダーゼを生産するには、下記のようにして
行なうことができる。上記微生物を培養するには、通常
の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法
を採用して培養するのが好ましい。
【００１３】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１
種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素
二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２
鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加
し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加し
たものが用いられる。
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１
種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素
二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２
鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加
し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加し
たものが用いられる。
【００１４】なお、培地の初発pHは、7〜9に調整するの
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりザルコシンオキシダーゼを採取するには、通
常の酵素採取手段を用いることができる。
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりザルコシンオキシダーゼを採取するには、通
常の酵素採取手段を用いることができる。
【００１５】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からザル
コシンオキシダーゼを採取することが好ましい。この場
合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕
機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を
用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶
解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ
-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方
法等により、菌体からザルコシンオキシダーゼを採取す
るのが好ましい。
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からザル
コシンオキシダーゼを採取することが好ましい。この場
合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕
機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を
用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶
解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ
-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方
法等により、菌体からザルコシンオキシダーゼを採取す
るのが好ましい。
【００１６】このようにして得られた粗酵素液からザル
コシンオキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に
用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過
クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法
等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。
コシンオキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に
用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過
クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法
等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。
【００１７】得られた本発明ザルコシンオキシダーゼの
理化学的性質は、下記の通りである。 (1) 作用 １モルのザルコシンを酸化的に加水分解し、１モルのグ
リシン、１モルのホルムアルデヒド及び１モルの過酸化
水素を生成する。
理化学的性質は、下記の通りである。 (1) 作用 １モルのザルコシンを酸化的に加水分解し、１モルのグ
リシン、１モルのホルムアルデヒド及び１モルの過酸化
水素を生成する。
【００１８】(2) 基質特異性 ザルコシンに基質特異性を有する。
【００１９】(3) 至適pH 緩衝液として、50mM MES緩衝液（pH5.5〜7.0）、50mM
リン酸緩衝液（pH6.5〜8.0）、50mM Tris-HCl緩衝液（p
H7.0〜8.5）及び50mM CAPS緩衝液（pH 9.0 〜9.5）を用
い、夫々のpHにおいて、温度37℃で10分間酵素反応を行
なった結果、その相対活性は、図１に示す通りであっ
た。図１より、本酵素の至適pHは、7.0〜8.0であった。
リン酸緩衝液（pH6.5〜8.0）、50mM Tris-HCl緩衝液（p
H7.0〜8.5）及び50mM CAPS緩衝液（pH 9.0 〜9.5）を用
い、夫々のpHにおいて、温度37℃で10分間酵素反応を行
なった結果、その相対活性は、図１に示す通りであっ
た。図１より、本酵素の至適pHは、7.0〜8.0であった。
【００２０】(4) 作用適温の範囲 後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なっ
た結果、図２に示す通りであった。図２より、本酵素の
作用適温の範囲は、50℃であった。
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なっ
た結果、図２に示す通りであった。図２より、本酵素の
作用適温の範囲は、50℃であった。
【００２１】(5) 安定pH範囲 緩衝液として、50mM MES緩衝液（pH6.0〜8.0）、50mM
リン酸緩衝液（pH6.0〜8.0）、50mM Tris-HCl緩衝液（p
H8.0〜9.0）、50mM CHES緩衝液（pH9.0〜10.0）及び50m
M CAPS緩衝液（pH10.0〜11.0）を用い、pH 6.0〜11.0に
おいて20 ℃で20時間夫々処理した後、本酵素の残存活
性を測定した結果、図３に示す通りであった。図３よ
り、安定pH範囲は、pH7.0〜9.5であった。 (6) 熱安定性 50mM リン酸緩衝液（pH7.7）を用いて、各温度で10分間
処理した場合の熱安定性の結果は、図４に示す通りであ
り、本酵素は、55℃付近迄安定であった。
リン酸緩衝液（pH6.0〜8.0）、50mM Tris-HCl緩衝液（p
H8.0〜9.0）、50mM CHES緩衝液（pH9.0〜10.0）及び50m
M CAPS緩衝液（pH10.0〜11.0）を用い、pH 6.0〜11.0に
おいて20 ℃で20時間夫々処理した後、本酵素の残存活
性を測定した結果、図３に示す通りであった。図３よ
り、安定pH範囲は、pH7.0〜9.5であった。 (6) 熱安定性 50mM リン酸緩衝液（pH7.7）を用いて、各温度で10分間
処理した場合の熱安定性の結果は、図４に示す通りであ
り、本酵素は、55℃付近迄安定であった。
【００２２】(7) 酵素活性測定法 0.2Mのザルコシン溶液0.3mlに、0.25Mのリン酸緩衝液(p
H7.7)0.1ml及び適当な濃度の本酵素液0.1mlを加え、37
℃で、10分間反応させた後、1.0Ｎの酢酸溶液0.5mlを添
加して反応を停止させ、次に、これにアセチル・アセト
ン呈色液〔アセチル・アセトン0.2％（V/V）、リン酸二
アンモニウム10％（W/V）〕（pH6.5）を3ml添加し、37
℃で40分間発色させて、光電比色計により波長410nmに
おける吸光度値を測定した。
H7.7)0.1ml及び適当な濃度の本酵素液0.1mlを加え、37
℃で、10分間反応させた後、1.0Ｎの酢酸溶液0.5mlを添
加して反応を停止させ、次に、これにアセチル・アセト
ン呈色液〔アセチル・アセトン0.2％（V/V）、リン酸二
アンモニウム10％（W/V）〕（pH6.5）を3ml添加し、37
℃で40分間発色させて、光電比色計により波長410nmに
おける吸光度値を測定した。
【００２３】そして、予め作製したホルムアルデヒドの
検量曲線より、その生成量を出し、37℃、１分間当り１
μMのホルムアルデヒドを生成する酵素量を１単位とし
た。
検量曲線より、その生成量を出し、37℃、１分間当り１
μMのホルムアルデヒドを生成する酵素量を１単位とし
た。
【００２４】(8) Km値 上記の活性測定法を用い、本酵素のKm値を測定したとこ
ろ、ラインウエーバー・バークのプロットから、Km値
は、約3.5mM（ザルコシンに対して）であった。
ろ、ラインウエーバー・バークのプロットから、Km値
は、約3.5mM（ザルコシンに対して）であった。
【００２５】(9) 中性における反応性 本改変酵素が中性（pH7.0）において、他のザルコシン
オキシダーゼと比べて高い反応性を有することを示すた
め、基質（ザルコシン）濃度0.5mMに対して30mU/mlの酵
素を反応させた際の反応性を、同程度のKm値を有する相
同性の高い他社のザルコシンオキシダーゼと比較した。
その結果は図５に示す通りである。弱アルカリ性(pH7.
5)において本酵素は他社酵素よりも若干低い反応性を示
す（ただし、野生型よりは大幅に反応性向上）が、中性
(pH7.0)〜弱酸性(pH6.5)においては、逆により高い反応
性を示す結果が得られた。 (10) 分子量 44,000（野生型のアミノ酸配列より概算）
オキシダーゼと比べて高い反応性を有することを示すた
め、基質（ザルコシン）濃度0.5mMに対して30mU/mlの酵
素を反応させた際の反応性を、同程度のKm値を有する相
同性の高い他社のザルコシンオキシダーゼと比較した。
その結果は図５に示す通りである。弱アルカリ性(pH7.
5)において本酵素は他社酵素よりも若干低い反応性を示
す（ただし、野生型よりは大幅に反応性向上）が、中性
(pH7.0)〜弱酸性(pH6.5)においては、逆により高い反応
性を示す結果が得られた。 (10) 分子量 44,000（野生型のアミノ酸配列より概算）
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明する。
明する。
【００２７】（実施例１） (1)組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡの調製 大腸菌(E.coli)JM109(pSO12)（Agricultural and Biolo
gical Chemistry, 55(5), 1259-1263, 1991）を、TY培
地（1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.25%NaCl、pH7.
5）20mlに接種して、37℃で18時間振とう培養し培養物
を得た。この培養物を6000rpmで10分間遠心分離するこ
とにより、集菌して菌体を得た。 この菌体より、QIAGE
N tip-100を用いて組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡを
抽出して精製し、組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡを7
0μg得た。
gical Chemistry, 55(5), 1259-1263, 1991）を、TY培
地（1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.25%NaCl、pH7.
5）20mlに接種して、37℃で18時間振とう培養し培養物
を得た。この培養物を6000rpmで10分間遠心分離するこ
とにより、集菌して菌体を得た。 この菌体より、QIAGE
N tip-100を用いて組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡを
抽出して精製し、組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡを7
0μg得た。
【００２８】(2) 変異操作 上記組み換え体プラスミドＤＮＡ100μgの内、2μgを用
いてXL1-RED（STRATAGENE社製）（増殖の際、プラスミ
ドの複製にエラーを起こし易く変異を生じ易い。）をD.
M. Morrisonの方法（Method in Enzymology, 68, 326-
331, 1979）に従って形質転換し、約1500の形質転換株
を得た．その内のコロニー500個をTY培地20mlに全て植
菌し、37℃、18時間振とう培養した。培養後、この培養
物を6000rpmで10分間遠心分離することにより集菌して
菌体を得た。この菌体より、QIAGEN tip-100（フナコシ
社製）を用いてプラスミドpSO12を抽出して精製し、被
変異型組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡを70μg得た。
このプラスミド5μgを用いD.M. Morrisonの方法（Metho
d in Enzymology, 68, 326-331, 1979）に従って、大腸
菌JM109株（東洋紡社製）を形質転換した結果、約2000
個の変異を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得
た。この形質転換体に対し、後述の項目(3)に記載の方
法で中性(pH7.0)にてスクリーニングを行なった結果、
中性域で高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼを生
産する大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)を得た。
いてXL1-RED（STRATAGENE社製）（増殖の際、プラスミ
ドの複製にエラーを起こし易く変異を生じ易い。）をD.
M. Morrisonの方法（Method in Enzymology, 68, 326-
331, 1979）に従って形質転換し、約1500の形質転換株
を得た．その内のコロニー500個をTY培地20mlに全て植
菌し、37℃、18時間振とう培養した。培養後、この培養
物を6000rpmで10分間遠心分離することにより集菌して
菌体を得た。この菌体より、QIAGEN tip-100（フナコシ
社製）を用いてプラスミドpSO12を抽出して精製し、被
変異型組み換え体プラスミドpSO12ＤＮＡを70μg得た。
このプラスミド5μgを用いD.M. Morrisonの方法（Metho
d in Enzymology, 68, 326-331, 1979）に従って、大腸
菌JM109株（東洋紡社製）を形質転換した結果、約2000
個の変異を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得
た。この形質転換体に対し、後述の項目(3)に記載の方
法で中性(pH7.0)にてスクリーニングを行なった結果、
中性域で高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼを生
産する大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)を得た。
【００２９】(3)中性域で高い反応性を示す変異株のス
クリーニング 先ず得られた上記形質転換体を各コロニー毎に2mlのTY
培地（50μg Ampicilin, 1mM IPTG添加）で液体培養
し、プラスミドに含まれる種々のザルコシンオキシダー
ゼを誘導生産させた。培養後、得られた培養物に対し超
音波破砕を行ない、その粗酵素抽出液のpH7.0での活性
を測定し、得られた活性値から100mUに相当する粗酵素
液量を計算した。100mUに相当する粗酵素液を0.5mMの基
質（ザルコシン）と反応させることにより、その反応性
を計測した。また、各変異株の測定結果に対し、同様に
して抽出処理し、測定した野生型ザルコシンオキシダー
ゼの反応性の比較を行ない、目的を満たす変異株を選択
したところ、変異株大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)よ
り、中性域で比較的高い反応性を示すザルコシンオキシ
ダーゼを得た。大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)は、工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-6597として
寄託されている。
クリーニング 先ず得られた上記形質転換体を各コロニー毎に2mlのTY
培地（50μg Ampicilin, 1mM IPTG添加）で液体培養
し、プラスミドに含まれる種々のザルコシンオキシダー
ゼを誘導生産させた。培養後、得られた培養物に対し超
音波破砕を行ない、その粗酵素抽出液のpH7.0での活性
を測定し、得られた活性値から100mUに相当する粗酵素
液量を計算した。100mUに相当する粗酵素液を0.5mMの基
質（ザルコシン）と反応させることにより、その反応性
を計測した。また、各変異株の測定結果に対し、同様に
して抽出処理し、測定した野生型ザルコシンオキシダー
ゼの反応性の比較を行ない、目的を満たす変異株を選択
したところ、変異株大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)よ
り、中性域で比較的高い反応性を示すザルコシンオキシ
ダーゼを得た。大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)は、工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-6597として
寄託されている。
【００３０】（実施例２）上記のようにして得られた変
異株、即ち、大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)を、1mMイ
ソプロピル-β-D-ガラクトシドを含むTY培地（1%トリプ
トン、0.5% 酵母エキス、0.25% NaCl、pH7.5）100mlの
分注された坂口フラスコで１６時間振とう培養したの
ち、同様に調製した30Ｌ培養槽中のTY培地20Ｌに火炎接
種した。接種後、回転数450rpm、通気量20Ｌ/min、37℃
にて約20時間培養した。
異株、即ち、大腸菌(E.coli)JM109(pSO12 EH)を、1mMイ
ソプロピル-β-D-ガラクトシドを含むTY培地（1%トリプ
トン、0.5% 酵母エキス、0.25% NaCl、pH7.5）100mlの
分注された坂口フラスコで１６時間振とう培養したの
ち、同様に調製した30Ｌ培養槽中のTY培地20Ｌに火炎接
種した。接種後、回転数450rpm、通気量20Ｌ/min、37℃
にて約20時間培養した。
【００３１】培養終了後、培養液20Ｌからマイクローザ
ー（旭化成社製、PW-303）を用いて菌体を集菌し、20mM
リン酸緩衝液（pH7.5）にて菌体を洗浄した後、菌体を
同緩衝液約10Ｌに懸濁した。
ー（旭化成社製、PW-303）を用いて菌体を集菌し、20mM
リン酸緩衝液（pH7.5）にて菌体を洗浄した後、菌体を
同緩衝液約10Ｌに懸濁した。
【００３２】上記菌体懸濁液（10Ｌ）に、リゾチーム20
g（50mM リン酸緩衝、pH7.5、100ml）及び0.55M EDTA
（pH8.0）１Ｌを添加、混合し、30℃で一晩放置した
後、5%プロタミン水溶液（pH8.0）500mlを撹拌しながら
滴下して除核酸処理を行なった。この水溶液を10mM リ
ン酸緩衝液（pH8.0）（以下緩衝液Ａとする）に対して
透析した。
g（50mM リン酸緩衝、pH7.5、100ml）及び0.55M EDTA
（pH8.0）１Ｌを添加、混合し、30℃で一晩放置した
後、5%プロタミン水溶液（pH8.0）500mlを撹拌しながら
滴下して除核酸処理を行なった。この水溶液を10mM リ
ン酸緩衝液（pH8.0）（以下緩衝液Ａとする）に対して
透析した。
【００３３】透析液（約28Ｌ）に、湿重量で約３ｋｇの
セルロースを添加、混合して、ザルコシンオキシダーゼ
を吸着させた後、5%グリセリン及び0.05% 2-メルカプト
エタノール含有緩衝液ＡにてDEAE-セルロースを洗浄
し、次いで、0.5M KCl含有緩衝液Ａにてザルコシンオキ
シダーゼを溶出して限外濃縮した。
セルロースを添加、混合して、ザルコシンオキシダーゼ
を吸着させた後、5%グリセリン及び0.05% 2-メルカプト
エタノール含有緩衝液ＡにてDEAE-セルロースを洗浄
し、次いで、0.5M KCl含有緩衝液Ａにてザルコシンオキ
シダーゼを溶出して限外濃縮した。
【００３４】濃縮液（約1.0Ｌ）に、緩衝液Ａで緩衝化
された湿重量で約1.0kgのDEAE-セファロース CL-4Bを添
加、混合して、ザルコシンオキシダーゼを吸着させ0.05
M KCl含有緩衝液ＡにてDEAE-セファロース CL-4Bを洗浄
し、次いで、0.3M KCl含有、緩衝液Ａにてザルコシンオ
キシダーゼを溶出して、限外濃縮した。
された湿重量で約1.0kgのDEAE-セファロース CL-4Bを添
加、混合して、ザルコシンオキシダーゼを吸着させ0.05
M KCl含有緩衝液ＡにてDEAE-セファロース CL-4Bを洗浄
し、次いで、0.3M KCl含有、緩衝液Ａにてザルコシンオ
キシダーゼを溶出して、限外濃縮した。
【００３５】次いで、この粗酵素液の一部を緩衝液Ａで
平衡化済みのＱＡＥ−セファデックスA-50カラム（6.0
×30cm）に吸着させ、0.4M塩化カリウムを含有する緩衝
液Ａを用いたグラジエントで溶出することにより、黄色
のザルコシンオキシダーゼ含有溶出画分が得られた。こ
のザルコシンオキシダーゼ含有溶出画分を、常法に従っ
て限外濃縮した後、凍結乾燥することにより、純化され
たザルコシンオキシダーゼ粉末約1gを得た。
平衡化済みのＱＡＥ−セファデックスA-50カラム（6.0
×30cm）に吸着させ、0.4M塩化カリウムを含有する緩衝
液Ａを用いたグラジエントで溶出することにより、黄色
のザルコシンオキシダーゼ含有溶出画分が得られた。こ
のザルコシンオキシダーゼ含有溶出画分を、常法に従っ
て限外濃縮した後、凍結乾燥することにより、純化され
たザルコシンオキシダーゼ粉末約1gを得た。
【発明の効果】本発明によれば、Km値が小さく、中性域
で高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼが効率よく
製造でき、本発明は、産業上有用である。
で高い反応性を示すザルコシンオキシダーゼが効率よく
製造でき、本発明は、産業上有用である。
【００３６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING
【００３７】 <110> KIKKOMAN CORPORATION <120> A SARCOSINE OXIDASE AND A PROCESS FOR PRODUCING THE SAME <130> P2027 <160> 1 <210> 1 <211> 387 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met 1 5 10 15 Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 Leu Leu Val Asp Ser Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His 35 40 45 His Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg 50 55 60 Glu Tyr Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu 65 70 75 Leu Glu Lys Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Gln Thr Gly Val 80 85 90 Leu Val Tyr Gly Pro Lys Gly Gly Ser Ala Phe Val Ser Glu Thr 95 100 105 Met Glu Ala Ala Asn Ile His Ser Leu Glu His Glu Leu Phe Glu 110 115 120 Gly Lys Gln Leu Thr Asp Arg Trp Ala Gly Val Glu Val Pro Asp 125 130 135 Asn Tyr Glu Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser 140 145 150 Glu Asn Cys Ile Gln Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala His Gly 155 160 165Ala Thr Val L
eu Thr Tyr Thr Pro Val Glu Asp Phe Glu Val Thr 170 175 180 Glu Asp Leu Val Thr Ile Lys Thr Ala Lys Gly Ser Tyr Thr Ala 185 190 195 Asn Lys Leu Val Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu 200 205 210 Ser Lys Leu Asp Val Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val 215 220 225 Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Ala Lys Tyr Ser Asn Asn Ala 230 235 240 His Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Glu Asn Gly Ile Tyr Tyr 245 250 255 Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Ser Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 Ser Tyr Gly Gln Gln Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe 275 280 285 Gly Ala Tyr Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu Arg Lys Phe Leu Glu 290 295 300 Gln Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val 305 310 315 Cys Met Tyr Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu 320 325 330 His Pro Lys Tyr Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly 335 340 345 His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ala Gln 350 355 360 Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser 365 370 375 Leu Asn Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys 380 385 390
eu Thr Tyr Thr Pro Val Glu Asp Phe Glu Val Thr 170 175 180 Glu Asp Leu Val Thr Ile Lys Thr Ala Lys Gly Ser Tyr Thr Ala 185 190 195 Asn Lys Leu Val Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu 200 205 210 Ser Lys Leu Asp Val Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln Val 215 220 225 Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Ala Lys Tyr Ser Asn Asn Ala 230 235 240 His Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Glu Asn Gly Ile Tyr Tyr 245 250 255 Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Ser Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 Ser Tyr Gly Gln Gln Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe 275 280 285 Gly Ala Tyr Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu Arg Lys Phe Leu Glu 290 295 300 Gln Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val 305 310 315 Cys Met Tyr Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu 320 325 330 His Pro Lys Tyr Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly 335 340 345 His Gly Phe Lys Phe Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ala Gln 350 355 360 Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser 365 370 375 Leu Asn Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys 380 385 390
【図１】本酵素の至適pHを示す図。
【図２】本酵素の作用適温の範囲を示す図。
【図３】本酵素の安定pH範囲を示す図。
【図４】本酵素の熱安定性を示す図。
【図５】本酵素の反応性を他社のザルコシンオキシダー
ゼ及び改変前の野生型ザルコシンオキシダーゼと比較し
た図。
ゼ及び改変前の野生型ザルコシンオキシダーゼと比較し
た図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA06 DA06 EA04 GA25 4B050 CC03 CC04 DD02 FF04E FF05E FF11E LL03 4B065 AA15Y AA26X AB01 AC14 CA28 CA46
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するザルコシン
オキシダーゼ。 (a)作用；１モルのザルコシンを酸化的に加水分解し、
１モルのグリシン、１モルのホルムアルデヒド及び１モ
ルの過酸化水素を生成する。 (b)基質特異性；ザルコシンに基質特異性を有する。 (c)至適pH；7.0〜8.0 (d)安定pH範囲；7.0〜9.5 (e)作用適温の範囲；50℃ (f)熱安定性；55℃以下 (g)分子量；44,000（野生型のアミノ酸配列より概算） - 【請求項２】 請求項１記載のザルコシンオキシダーゼ
生産能を有する微生物を培養し、その培養物からザルコ
シンオキシダーゼを採取することを特徴とするザルコシ
ンオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10354482A JP2000175685A (ja) | 1998-12-14 | 1998-12-14 | ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法 |
| US09/457,302 US6228626B1 (en) | 1998-12-14 | 1999-12-09 | Sarcosine oxidase and process for producing the same |
| DE19960271A DE19960271B4 (de) | 1998-12-14 | 1999-12-14 | Sarcosinoxidase und Verfahren zu deren Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10354482A JP2000175685A (ja) | 1998-12-14 | 1998-12-14 | ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000175685A true JP2000175685A (ja) | 2000-06-27 |
Family
ID=18437872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10354482A Pending JP2000175685A (ja) | 1998-12-14 | 1998-12-14 | ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法 |
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|---|---|
| US (1) | US6228626B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000175685A (ja) |
| DE (1) | DE19960271B4 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2018052005A1 (ja) * | 2016-09-15 | 2018-03-22 | キッコーマン株式会社 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 |
| US11384381B2 (en) | 2016-07-13 | 2022-07-12 | Kikkoman Corporation | Reaction accelerating agent |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1561812B1 (en) * | 2002-11-13 | 2014-10-01 | Toyobo Co., Ltd. | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
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|---|---|---|---|---|
| JPS6434035A (en) | 1987-07-30 | 1989-02-03 | Nec Corp | Retrieval communication system |
| JP3018092B2 (ja) | 1990-08-10 | 2000-03-13 | 旭化成工業株式会社 | 放線菌由来のサルコシンオキシダーゼの遺伝子およびその用途 |
| JPH05115281A (ja) | 1991-10-25 | 1993-05-14 | Kikkoman Corp | 新規なザルコシン・オキシダーゼｍ、その遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びザルコシン・オキシダーゼｍの製造法 |
| JP3216056B2 (ja) | 1992-06-19 | 2001-10-09 | 日研フード株式会社 | 免疫能賦活化物質、水溶性パラミロンおよびその製造方法 |
| JPH06113840A (ja) | 1992-10-02 | 1994-04-26 | Toyobo Co Ltd | ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質及びその遺伝情報を有するｄｎａ、並びにザルコシンオキシダーゼの製造法 |
| JP2729045B2 (ja) | 1995-12-20 | 1998-03-18 | 旭化成工業株式会社 | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 |
| JP3904098B2 (ja) * | 1997-03-10 | 2007-04-11 | 東洋紡績株式会社 | 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 |
-
1998
- 1998-12-14 JP JP10354482A patent/JP2000175685A/ja active Pending
-
1999
- 1999-12-09 US US09/457,302 patent/US6228626B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-14 DE DE19960271A patent/DE19960271B4/de not_active Expired - Fee Related
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| JPWO2018052005A1 (ja) * | 2016-09-15 | 2019-06-24 | キッコーマン株式会社 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 |
| JP7090547B2 (ja) | 2016-09-15 | 2022-06-24 | キッコーマン株式会社 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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