JPWO2018052005A1 - 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 - Google Patents
改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018052005A1 JPWO2018052005A1 JP2018539739A JP2018539739A JPWO2018052005A1 JP WO2018052005 A1 JPWO2018052005 A1 JP WO2018052005A1 JP 2018539739 A JP2018539739 A JP 2018539739A JP 2018539739 A JP2018539739 A JP 2018539739A JP WO2018052005 A1 JPWO2018052005 A1 JP WO2018052005A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- sarcosine oxidase
- seq
- acid sequence
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
- C12N9/0034—Sarcosine oxidase (1.5.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
- C12Y105/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
- C12Y105/03001—Sarcosine oxidase (1.5.3.1)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
[1] 下記の性質を有する改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(a)作用:1モルのザルコシンを加水分解し、1モルのグリシン及び1モルのホルムアルデヒドを生成する、並びに
(b)基質特異性:ザルコシンに対する活性を100%として、L-プロリンに対する相対活性が、0.23%以下である。
[2] 以下から選択される改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(a)ザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号1のアミノ酸配列とアライメントした際に、以下の(i)〜(vi)の少なくとも1か所の部位が下記のアミノ酸に置換され、L-プロリンに対する相対活性が低下したザルコシンオキシダーゼ、すなわち、配列番号1の
(i)320位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、
(ii)324位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであり、
(iii)348位に相当する位置のアミノ酸がチロシンであり、
(iv)222位に相当する位置のアミノ酸がアラニン若しくはヒスチジンであり、
(v)260位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、かつ/又は
(vi)314位に相当する位置のアミノ酸がセリンであり、
L-プロリンに対して相対活性が野生型よりも低下したザルコシンオキシダーゼ、
(b−1)前記(a)におけるアミノ酸置換を1以上有し、配列番号1のアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
(b−2)前記(a)におけるアミノ酸置換を1以上有し、配列番号1のアミノ酸配列と75%以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号1の6〜86位、88〜92位、94〜97位、101〜102位、104〜109位、112〜114位、118位、120〜121位、127〜128位、130〜131位、133〜134位、136〜137位、139〜142位、144〜154位、156〜166位、168〜178位、181〜182位、184位、186位、188〜189位、191〜192位、194〜195位、197〜213位、216〜233位、235〜238位、242〜249位、252〜262位、264〜270位、272〜274位、276〜286位、288〜292位、294位、296〜300位、302〜306位、308〜311位、313〜332位、335〜358位、360〜362位、364〜375位、377〜378位、及び380〜382位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが95%以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(c−1)配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
(c−2)配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列と75%以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号1の6〜86位、88〜92位、94〜97位、101〜102位、104〜109位、112〜114位、118位、120〜121位、127〜128位、130〜131位、133〜134位、136〜137位、139〜142位、144〜154位、156〜166位、168〜178位、181〜182位、184位、186位、188〜189位、191〜192位、194〜195位、197〜213位、216〜233位、235〜238位、242〜249位、252〜262位、264〜270位、272〜274位、276〜286位、288〜292位、294位、296〜300位、302〜306位、308〜311位、313〜332位、335〜358位、360〜362位、364〜375位、377〜378位、及び380〜382位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが95%以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(d)配列番号2、3、4又は22のアミノ酸配列を含むタンパク質、或いは
(e)配列番号2、3、4又は22のアミノ酸配列において、配列番号1の222位、260位、314位、320位、324位、343位及び348位に相当する位置以外の位置において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
[3] 配列番号1のアミノ酸配列の320位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、324位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、1又は2に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
[4] さらに、配列番号1の348位に相当する位置のアミノ酸がチロシンである、3に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
[5] さらに、配列番号1の222位に相当する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、3又は4に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
[6] さらに、配列番号1の260位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンである、3〜5のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
[7] さらに、配列番号1の314位に相当する位置のアミノ酸がセリンである、3〜6のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
[8] さらに、配列番号1の343位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、3〜7のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
[9] 2〜8のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼをコードするザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターを含む、組み換え体DNA。
[10] 9記載の組み換え体DNAを含む、形質転換体又は形質導入体。
[11] 10記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取する工程を含む、改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。
[12] 1〜8のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含む、クレアチニン測定試薬。
[13] 1〜8のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ、又は12に記載の測定試薬を用いたクレアチニン測定方法。
本発明のザルコシンオキシダーゼは、ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を改変することにより得ることができる。改変に用いるザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、特に限定されず、例えば、バチルス属由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子(特公平6-65303号記載)等を挙げることができる。別の例として、ザルコシンオキシダーゼ遺伝子はアースロバクター・エスピーTE1826(Arthrobacter sp. TE1826)由来のものであり得る(Journal of Fermentation and Bioengineering,1993年, 75巻4号,p.239-244)。尚、本発明において用いることのできるベクターDNAは限定される事は無い。ある実施形態において、ベクターはpUTE300K’(特開2005-65583号公報記載)でありうる。
(a)作用:1モルのザルコシンを加水分解し、1モルのグリシン及び1モルのホルムアルデヒドを生成する、並びに
(b−1)基質特異性:ザルコシンに対する活性を100%として、L-プロリンに対する相対活性が、0.23%以下、0.22%以下、0.21%以下、例えば0.20%以下である、かつ/又は
(b−2)基質特異性:L-プロリンに対する相対活性が、改変前のタンパク質と比較して、75%以下、74%以下、例えば73%以下である。
(i)320位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、
(ii)324位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであり、
(iii)348位に相当する位置のアミノ酸がチロシンであり、
(iv)222位に相当する位置のアミノ酸がアラニン若しくはヒスチジンであり、
(v)260位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、かつ/又は
(vi)314位に相当する位置のアミノ酸がセリンであり、
L-プロリンに対して相対活性が野生型よりも低下したザルコシンオキシダーゼであり得る。場合により、さらに
(vii)343位に相当する位置のアミノ酸はグリシンであってもよい。この場合、配列番号1の348位に相当する位置はチロシンであってもよく、またチロシンでなくともよい。
本酵素のザルコシン、L-プロリンに対する活性の測定は、下記条件下で行なうことができる。尚、ザルコシンに関し、1分間に1マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を1単位(U)とする。
反応用試薬として、以下の溶液を調製する。
1) 0.01M又は0.2M ザルコシン,100mM Tris-HCl,2mM KCl,0.1% Triton-X100(pH7.7)又は0.2M L-プロリン,100mM Tris-HCl,2mM KCl,0.1% Triton-X100(pH7.7)
2) 80U/ml POD溶液
3) 0.1% TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン)溶液又は0.1%フェノール溶液
4) 0.2% 4-aminoantipyrine溶液
5) 超純水
6) 0.3% SDS 溶液
7) 20mM Tris-HCl,1mM KCl,0.2% BSA(pH7.7)(酵素希釈液)
1) 5 ml
2) 1 ml
3) 2 ml
4) 1 ml
5) 1 ml
1) 活性測定液0.95mLを37℃、5分間、プレインキュベートする。
2) それぞれの基質に対し、適宜希釈した酵素液0.05mlを添加混合する。
3) 37℃において、ザルコシンの場合10分間反応、L-プロリンの場合60分間反応させる。
4) 10分間(4.8mM,95mMザルコシン)、60分間(95mM L-プロリン)の反応後、上記0.3% SDS溶液を混合し、反応を停止させる。
5) 25℃にて555nmの吸光度を測定する(ODsample)。
ブランク値は、酵素液の混合前に0.3% SDS溶液を混合することによって測定する(ODblank)。
6) 終濃度95mMザルコシン、95mM L-プロリンとの反応によって測定されたΔOD555nm(ODsample-ODblank)の比をまず確認し、続いて、野生型との相対活性比を計算する(95mM L-プロリン活性/95mMザルコシン活性)。
[実施例1]
組み換え体プラスミドDNA(ベクターpUTE300K’に配列番号1のSON遺伝子を組み入れたもの、以下、pSONと記載する)の含まれる大腸菌E.coli DH5α(pSON)を、LB培地(DIFCO社製)にて培養し、菌体を集菌した後、そこからGenElute Plasmid Miniprep Kit(SIGMA社)を使用して組み換え体プラスミドDNA pSON を抽出、精製した。得られた組み換え体プラスミドは、約100μgであった。
Y222A:配列番号7、8
Y222H:配列番号9、10
E324G:配列番号11、12
F348Y:配列番号13、14
F260I:配列番号15、16
A314S:配列番号17、18
K320N:配列番号19、20
K320N/E324G:フォワードのみ配列番号21(リバースは配列番号20)
上記のようにして得られた変異体のうち、M1,M2,M3の改変ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌(E.coli)DH5αを、25μg/ml カナマイシンを含むTY培地(1% バクト−トリプトン、0.5% バクト−イーストエクストラクト、0.5%% NaCl、pH7.5)100mlにて37℃で16時間振とう培養した後、同様に調製した7LのTY培地(但し、1mM IPTGを含む)に10ml接種した。接種後、回転数120r.p.m.、37℃にて約20時間培養した。
培養終了後、培養液7LをUF膜(MW50000)に供し、培地成分を除去し、10mM リン酸バッファー,1mM EDTAに置換した。そこへ、終濃度50mMとなるようにEDTA(pH8.0)を添加、圧力式ホモジナイザーにて処理し、菌体を破砕した。破砕した菌体液に関しては遠心分離を行ってデブリを沈殿させ、粗酵素液を得た。
このようにして得られた粗酵素500mlに対して20%の硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行なった。硫安沈殿後、100mM KCl、10mMリン酸カリウム緩衝液1mM EDTAからなる緩衝液に沈殿を溶解、合わせて、同バッファーにて透析することにより硫安を除去した。更に、透析を施した処理液に対し、遠心分離(10,000g、30分間)を行い、粗酵素液の清澄化を行った。
Qセファロースファストフロー(商標、GEヘルスケア社製)担体500mlを充填したカラムに上記粗酵素液を吸着させ、1500mlの100mM KCl、10mM リン酸カリウム緩衝液1mM EDTA(pH8.0)で洗浄した後、300mM KCl 10mM リン酸カリウム緩衝液1mM EDTA(pH8.0)で溶出を行なった。溶出終了後、精製度の高い画分を回収し、濃縮、150mM KCl、1mM EDTAを含む10mMリン酸緩衝液pH8.0にて透析を行なった。
150mM KCl、1mM EDTAを含む10mM リン酸カリウム緩衝液でバッファライズしたQセファロースFF(商標、GEヘルスケア社製)担体500mlを充填したカラムに、ステップ3で処理した酵素液500mlをチャージし、200mM KCl、1mM EDTAを含む10mM リン酸緩衝液1500mlにて洗浄の後、200mM−300mM KClのグラジエント(総液量7500ml)緩衝液は、10mMリン酸カリウム、1mM EDTAにて溶出を行い、フラクションを回収した。回収したフラクションを分析し、比活性(U/OD280nm)の高い画分を混合し、10mM リン酸カリウム緩衝液pH8.0にて透析を行い、酵素標品とした。
上記の方法で精製した改変型ザルコシンオキシダーゼM1,M2,M3及び改変前のザルコシンオキシダーゼのL-プロリンに対する反応性をザルコシン活性を約33.0U/mlに統一した酵素液を用いて比較した。尚、本反応においては、発色剤としてフェノールを用いた。
上記の方法で精製した改変型ザルコシンオキシダーゼM1,M2,M3及び改変前のザルコシンオキシダーゼについて、ザルコシンに対する活性を100%としたときの、L-プロリンに対する相対活性(%)を調べた。実験条件としては、実施例1と同じ点順で、基質としてザルコシン95mMを用いたときの吸光度を100%とし、基質としてプロリン95mMを用いたときの吸光度を評価した。発色剤はフェノールを用いた。結果を以下に示す。
上記で取得した各種ザルコシンオキシダーゼを、クレアチニン測定試薬に適用した際のプロリンの影響度を評価した。クレアチニン測定試薬は下記の通りである。
アスコルビン酸オキシダーゼ 10 U/mL
カタラーゼ 300U/mL
クレアチナーゼ 35U/mL
ザルコシンオキシダーゼ 11U/mL
TES(2-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]エタンスルホン酸)バッファー 20mM、pH 8.2
N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル−m−トルイジン)(TOOS) 1.0 mM
トリトンX−100 0.1 %
塩化カリウム 70mM
(第2試薬)
4−アミノアンチピリン 4.0 mM
クレアチニナーゼ 370U/mL
ペルオキシダーゼ 15U/mL
TESバッファー 20mM、pH 8.0
トリトンX−100 0.1 %
塩化カリウム 70mM
アジ化ナトリウム 0.09%
尚、各酵素に関し、1分間に1マイクロモルの生成物を生成する酵素活性を、それぞれの酵素についての1単位(U)とする。
M4の作製方法
簡単に説明すると、SOD-M1のプラスミドを鋳型として、下記のプライマー(配列番号23、24)を用いて、PCR法により、変異K320N/E324G/Y222H/A314S/F343Gを有する改変型ザルコシンオキシダーゼM4(配列番号22)を作製した。
gcagctggtggttctggacatggatttaaa(配列番号23)
atgtccagaaccaccagctgcaattgcaac(配列番号24)
プラスミドの取得手順やPCR条件は、実施例1と同様であった。得られたプラスミドDNAを配列決定し、変異の導入を確認した。
作製したM4の改変ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌(E.coli)DH5αを、実施例2と同じ手順で培養し、精製酵素液を調整した。次いで、改変型ザルコシンオキシダーゼM4について、実施例5と同じ手順で、クレアチニン測定試薬に適用した際のプロリンの影響度を評価した。クレアチニン測定試薬は実施例5と同様であった。また血清は以下のものを用いた:
PreciControlClinChemMulti1 Lot.168 332-02
EXA Liquid 3 normal Lot.NL052G
SeikenLiquidNormal V Lot.VNO10103。
配列番号1:Bacillus NS-129由来の野生型ザルコシンオキシダーゼ
配列番号2:改変型ザルコシンオキシダーゼM1(K320N/E324G/Y222H/F348Y/A314S)
配列番号3:改変型ザルコシンオキシダーゼM2(K320N/E324G/F260I)
配列番号4:改変型ザルコシンオキシダーゼM3(K320N/E324G/F260I/Y222A)
配列番号5:エラープローンPCR用N末端側配列atgagcacgcattttgacgta
配列番号6:エラープローンPCR用C末端側配列ttattttactgcttctttttttaatgcatc
配列番号7−21:変異導入用プライマー
配列番号22:改変型ザルコシンオキシダーゼM4(K320N/E324G/Y222H/A314S/F343G)
配列番号23−24:変異導入用プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (13)
- 下記の性質を有する改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(a)作用:1モルのザルコシンを加水分解し、1モルのグリシン及び1モルのホルムアルデヒドを生成する、並びに
(b)基質特異性:ザルコシンに対する活性を100%として、L-プロリンに対する相対活性が、0.23%以下である。 - 以下から選択される改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(a)ザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号1のアミノ酸配列とアライメントした際に、以下の(i)〜(vi)の少なくとも1か所の部位が下記のアミノ酸に置換され、L-プロリンに対する相対活性が低下したザルコシンオキシダーゼ、すなわち、配列番号1の
(i)320位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、
(ii)324位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであり、
(iii)348位に相当する位置のアミノ酸がチロシンであり、
(iv)222位に相当する位置のアミノ酸がアラニン若しくはヒスチジンであり、
(v)260位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、かつ/又は
(vi)314位に相当する位置のアミノ酸がセリンであり、
L-プロリンに対して相対活性が野生型よりも低下したザルコシンオキシダーゼ、
(b−1)前記(a)におけるアミノ酸置換を1以上有し、配列番号1のアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
(b−2)前記(a)におけるアミノ酸置換を1以上有し、配列番号1のアミノ酸配列と75%以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号1の6〜86位、88〜92位、94〜97位、101〜102位、104〜109位、112〜114位、118位、120〜121位、127〜128位、130〜131位、133〜134位、136〜137位、139〜142位、144〜154位、156〜166位、168〜178位、181〜182位、184位、186位、188〜189位、191〜192位、194〜195位、197〜213位、216〜233位、235〜238位、242〜249位、252〜262位、264〜270位、272〜274位、276〜286位、288〜292位、294位、296〜300位、302〜306位、308〜311位、313〜332位、335〜358位、360〜362位、364〜375位、377〜378位、及び380〜382位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが95%以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(c−1)配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
(c−2)配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列と75%以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号1の6〜86位、88〜92位、94〜97位、101〜102位、104〜109位、112〜114位、118位、120〜121位、127〜128位、130〜131位、133〜134位、136〜137位、139〜142位、144〜154位、156〜166位、168〜178位、181〜182位、184位、186位、188〜189位、191〜192位、194〜195位、197〜213位、216〜233位、235〜238位、242〜249位、252〜262位、264〜270位、272〜274位、276〜286位、288〜292位、294位、296〜300位、302〜306位、308〜311位、313〜332位、335〜358位、360〜362位、364〜375位、377〜378位、及び380〜382位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが95%以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
(d)配列番号2、3、4又は22のアミノ酸配列を含むタンパク質、或いは
(e)配列番号2、3、4又は22のアミノ酸配列において、配列番号1の222位、260位、314位、320位、324位、343位及び348位に相当する位置以外の位置において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 - 配列番号1のアミノ酸配列の320位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、324位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、請求項1又は2に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
- さらに、配列番号1の348位に相当する位置のアミノ酸がチロシンである、請求項3に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
- さらに、配列番号1の222位に相当する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、請求項3又は4に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
- さらに、配列番号1の260位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンである、請求項3〜5のいずれか1項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
- さらに、配列番号1の314位に相当する位置のアミノ酸がセリンである、請求項3〜6のいずれか1項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
- さらに、配列番号1の343位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、請求項3〜7のいずれか1項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
- 請求項2〜8のいずれか1項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼをコードするザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターを含む、組み換え体DNA。
- 請求項9記載の組み換え体DNAを含む、形質転換体又は形質導入体。
- 請求項10記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取する工程を含む、改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含む、クレアチニン測定試薬。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ、又は請求項12に記載の測定試薬を用いたクレアチニン測定方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016180796 | 2016-09-15 | ||
JP2016180796 | 2016-09-15 | ||
PCT/JP2017/032992 WO2018052005A1 (ja) | 2016-09-15 | 2017-09-13 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018052005A1 true JPWO2018052005A1 (ja) | 2019-06-24 |
JP7090547B2 JP7090547B2 (ja) | 2022-06-24 |
Family
ID=61619543
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018539739A Active JP7090547B2 (ja) | 2016-09-15 | 2017-09-13 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11479757B2 (ja) |
JP (1) | JP7090547B2 (ja) |
CN (1) | CN109715799B (ja) |
WO (1) | WO2018052005A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111876397A (zh) * | 2020-08-07 | 2020-11-03 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 一种在大肠杆菌中发酵生产肌氨酸氧化酶的方法 |
WO2023190087A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 東洋紡株式会社 | クレアチニン高値検体測定時の正確性向上 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10248572A (ja) * | 1997-03-10 | 1998-09-22 | Toyobo Co Ltd | 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 |
JP2000175685A (ja) * | 1998-12-14 | 2000-06-27 | Kikkoman Corp | ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法 |
JP2004159566A (ja) * | 2002-11-13 | 2004-06-10 | Toyobo Co Ltd | 改変型ザルコシンオキシダーゼ |
JP2009055919A (ja) * | 2008-10-15 | 2009-03-19 | Toyobo Co Ltd | 改変型ザルコシンオキシダーゼ |
JP2009072196A (ja) * | 2008-10-15 | 2009-04-09 | Toyobo Co Ltd | 改変型ザルコシンオキシダーゼ |
CN101407795A (zh) * | 2008-11-17 | 2009-04-15 | 浙江大学 | 定向进化构建的耐热型肌氨酸氧化酶及其基因 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6029473B2 (ja) | 1977-10-04 | 1985-07-10 | 東洋醸造株式会社 | ザルコシン・オキシダ−ゼの製法 |
JPS5692790A (en) | 1979-12-26 | 1981-07-27 | Hideaki Yamada | Preparation of sarcosine oxidase |
DE3326888A1 (de) | 1983-07-26 | 1985-02-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Sarcosin-oxidase |
JPH0787780B2 (ja) | 1989-04-04 | 1995-09-27 | 東洋紡績株式会社 | 新規なザルコシンオキシダーゼおよびその製法 |
JPH05115281A (ja) | 1991-10-25 | 1993-05-14 | Kikkoman Corp | 新規なザルコシン・オキシダーゼm、その遺伝子、新規な組み換え体dna及びザルコシン・オキシダーゼmの製造法 |
EP1561812B1 (en) | 2002-11-13 | 2014-10-01 | Toyobo Co., Ltd. | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
JP2004159565A (ja) * | 2002-11-13 | 2004-06-10 | Toyobo Co Ltd | 基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 |
-
2017
- 2017-09-13 US US16/332,720 patent/US11479757B2/en active Active
- 2017-09-13 JP JP2018539739A patent/JP7090547B2/ja active Active
- 2017-09-13 CN CN201780056754.0A patent/CN109715799B/zh active Active
- 2017-09-13 WO PCT/JP2017/032992 patent/WO2018052005A1/ja active Application Filing
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10248572A (ja) * | 1997-03-10 | 1998-09-22 | Toyobo Co Ltd | 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 |
JP2000175685A (ja) * | 1998-12-14 | 2000-06-27 | Kikkoman Corp | ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法 |
JP2004159566A (ja) * | 2002-11-13 | 2004-06-10 | Toyobo Co Ltd | 改変型ザルコシンオキシダーゼ |
JP2009055919A (ja) * | 2008-10-15 | 2009-03-19 | Toyobo Co Ltd | 改変型ザルコシンオキシダーゼ |
JP2009072196A (ja) * | 2008-10-15 | 2009-04-09 | Toyobo Co Ltd | 改変型ザルコシンオキシダーゼ |
CN101407795A (zh) * | 2008-11-17 | 2009-04-15 | 浙江大学 | 定向进化构建的耐热型肌氨酸氧化酶及其基因 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JOURNAL OF ANALYTICAL BIO-SCIENCE, vol. 33, no. 2, JPN6017047783, 2010, pages 161 - 166, ISSN: 0004600984 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190218528A1 (en) | 2019-07-18 |
WO2018052005A1 (ja) | 2018-03-22 |
US11479757B2 (en) | 2022-10-25 |
JP7090547B2 (ja) | 2022-06-24 |
CN109715799B (zh) | 2023-04-04 |
CN109715799A (zh) | 2019-05-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2020439B1 (en) | Eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability, gene and recombinant DNA for the eukaryotic amadoriase, and process for production of eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability | |
JP5937547B2 (ja) | ピロロキノリンキノン依存性可溶性グルコース脱水素酵素の改善された変異体 | |
WO2010053161A1 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP4842938B2 (ja) | アミノ酸挿入を含む遺伝子操作されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JPH1033177A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
JPWO2018052005A1 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 | |
Baek et al. | Cloning and sequencing of the Klebsiella K‐36 astA gene, encoding an arylsulfate sulfotransferase | |
JP4133326B2 (ja) | 新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
JP4308768B2 (ja) | フルクトシルアミンオキシダーゼ | |
JP4349697B2 (ja) | 1,5−アンヒドログルシトール脱水素酵素 | |
CN115247158B (zh) | 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用 | |
JP3819969B2 (ja) | 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
US20110020896A1 (en) | Mutant dna polymerases and their genes | |
US7132253B2 (en) | Modified sarcosine oxidases, modified sarcosine oxidase genes, and methods for preparing the modified sarcosine oxidases | |
Amini-Bayat et al. | Cloning, Expression and Purification of Creatininase From Pseudomonas Pseudoalkaligene KF707 in E. coli. | |
EP1538211B1 (en) | Novel glycerol kinase, gene thereof and process for producing the glycerol kinase by using the gene | |
CN116286763A (zh) | 一种热稳定性提高的胱硫醚β-合成酶突变体及应用 | |
CN116970583A (zh) | 一种尿酸氧化酶及其应用 | |
WO2004044193A1 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200811 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210928 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220127 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220524 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220614 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7090547 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |