WO2018052005A1 - 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 - Google Patents

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WO2018052005A1
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WO
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amino acid
sarcosine oxidase
seq
acid sequence
proline
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PCT/JP2017/032992
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Inventor
えりこ 吉原
圭介 古川
一彦 下地
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キッコーマン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a modified sarcosine oxidase, a modified sarcosine oxidase gene, and a modified sarcosine oxidase whose reactivity to L-proline is lower than that of the enzyme before modification.
  • Sarcosine oxidase is a catalytic enzyme that hydrolyzes sarcosine to produce glycine and formaldehyde, and can be used to measure the amount of creatinine in human serum or urine. It can be used as a diagnostic agent for various diseases.
  • sarcosine oxidase is, for example, a genus Corynebacterium (see, for example, Non-Patent Document 1), a genus Bacillus (see, for example, Patent Document 1), a genus Silindrocarbon (for example, see Patent Document 2), and the like. It is known to be produced by strains such as Pseudomonas (for example, see Patent Document 3), Arthrobacter (for example, see Patent Document 4), and the like.
  • Patent Document 6 TE1826-derived modified sarcosine oxidase (Patent Document 6) and a modified sarcosine oxidase of a heptad mutant using genetic engineering techniques (Patent Document 6)
  • Patent Document 6 a modified sarcosine oxidase of a heptad mutant using genetic engineering techniques
  • JP-A-54-52789 JP-A-56-92790 Japanese Unexamined Patent Publication No. 60-43379 JP-A-2-265478 Japanese Patent Laid-Open No. 5-115281 JP 10-248572 A (Patent No. 3904098) JP 2004-159566 A (Patent No. 4194904)
  • An object of the present invention is to provide sarcosine oxidase with reduced reactivity to L-proline.
  • the present inventors obtained sarcosine oxidase with reduced reactivity to L-proline as a result of genetic modification of the sarcosine oxidase gene derived from Bacillus (described in Japanese Patent Publication No. 6-65303). Successfully completed the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • Modified sarcosine oxidase having the following properties, (A) Action: Hydrolyzes 1 mol of sarcosine to produce 1 mol of glycine and 1 mol of formaldehyde, and (b) Substrate specificity: relative activity to L-proline with 100% activity against sarcosine. 0.23% or less.
  • Modified sarcosine oxidase selected from: (A) When the amino acid sequence of sarcosine oxidase is aligned with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, at least one site of the following (i) to (vi) is substituted with the following amino acid, and against L-proline:
  • the relative activity of sarcosine oxidase that is, the amino acid at the position corresponding to position (i) 320 of SEQ ID NO: 1 is asparagine, (ii) the amino acid at the position corresponding to position 324 is glycine; (iii) the amino acid at the position corresponding to position 348 is tyrosine, (iv) the amino acid at the position corresponding to position 222 is alanine or histidine; (v) the amino acid at the position corresponding to position 260 is isoleucine, and / or (vi) the amino acid at the position corresponding to position 314 is serine, Sarcosine oxida
  • a protein having cosin oxidase activity further comprising positions 6 to 86, 88 to 92, 94 to 97, 101 to 102, 104 to 109, 112 to 114, 118, 120 of SEQ ID NO: 1 -121, 127-128, 130-131, 133-134, 136-137, 139-142, 144-154, 156-166,
  • a modified sarcosine oxidase having 95% or more amino acid sequence identity (D) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 22, or (e) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 22, position 222, position 260, position 314 of SEQ ID NO: 1, It includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added at positions other than positions corresponding to positions 320, 324, 343, and 348, and the reactivity with L-proline is the same as before the modification. Protein with reduced sarcosine oxidase activity compared to protein.
  • the modified sarcosine oxidase according to 1 or 2 wherein the amino acid at the position corresponding to position 320 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is asparagine, and the amino acid at the position corresponding to position 324 is glycine.
  • the modified sarcosine oxidase according to 3 wherein the amino acid at the position corresponding to position 348 of SEQ ID NO: 1 is tyrosine.
  • the modified sarcosine oxidase according to 3 or 4 wherein the amino acid at the position corresponding to position 222 of SEQ ID NO: 1 is alanine or histidine.
  • a recombinant DNA comprising a vector containing a sarcosine oxidase gene encoding the modified sarcosine oxidase according to any one of 2 to 8.
  • a transformant or transductant comprising the recombinant DNA according to 9.
  • a method for producing modified sarcosine oxidase comprising culturing the transformant or transductant according to 10 in a medium and collecting sarcosine oxidase from the culture.
  • a reagent for measuring creatinine comprising the modified sarcosine oxidase according to any one of 1 to 8.
  • the modified sarcosine oxidase of the present invention can be used as a reagent for measuring creatinine or creatine. Since the reagent using this modified sarcosine oxidase is less susceptible to L-proline, more accurate measurement is possible.
  • proline The influence of proline with respect to modified sarcosine oxidase and sarcosine oxidase before modification is shown.
  • the influence of proline on modified sarcosine oxidase and sarcosine oxidase before modification is shown (serum: PreciControlClinChemMulti1).
  • the effect of proline on modified sarcosine oxidase and sarcosine oxidase before modification is shown (serum: EXA Liquid 3 normal).
  • the sarcosine oxidase of the present invention can be obtained by modifying a gene encoding sarcosine oxidase.
  • the gene encoding sarcosine oxidase used for modification is not particularly limited, and examples thereof include a sarcosine oxidase gene derived from Bacillus (described in Japanese Patent Publication No. 6-65303).
  • the sarcosine oxidase gene may be derived from Arthrobacter sp. TE1826 (Journal of Fermentation and Bioengineering, 1993, Vol. 75, No. 4, p.239-244).
  • the vector DNA that can be used in the present invention is not limited. In one embodiment, the vector may be pUTE300K ′ (described in JP-A-2005-65583).
  • a sarcosine oxidase gene for example, a sarcosine oxidase expression plasmid containing the sarcosine oxidase gene derived from the genus Bacillus genus, a chemical mutation agent such as hydroxylamine or nitrite
  • a site-directed mutagenesis method which is a well-known technique for generating point mutations such as a method of contacting a protein or a method of random conversion using a PCR method, or a site-specific substitution or deletion mutation using a commercially available kit; Examples include a method of selectively cleaving this recombinant plasmid DNA, then removing or adding the selected oligonucleotide, and ligating; a method of inducing oligonucleotide mutation.
  • the modified sarcosine oxidase of the present invention has the following properties. That is, (A) Action: hydrolyzes 1 mol of sarcosine to produce 1 mol of glycine and 1 mol of formaldehyde, and (b-1) substrate specificity: relative to L-proline, with 100% activity against sarcosine. The activity is 0.23% or less, 0.22% or less, 0.21% or less, such as 0.20% or less, and / or (b-2) substrate specificity: the relative activity to L-proline is Compared with the protein before modification, it is 75% or less, 74% or less, for example 73% or less.
  • the relative activity with respect to L-proline when the activity with respect to sarcosine is defined as 100% is that the change in absorbance of the color former when sarcosine is used as a substrate at a specific concentration (for example, 95 mM) is 100%. Instead, it can be determined from the absorbance when L-proline is used as a substrate at the same concentration (for example, 95 mM).
  • the amino acid at a position corresponding to position 320 of SEQ ID NO: 1 is asparagine
  • the amino acid at the position corresponding to position 324 is glycine
  • the amino acid at the position corresponding to position 348 is tyrosine
  • the amino acid at the position corresponding to position 222 is alanine or histidine
  • the amino acid at the position corresponding to position 260 is isoleucine
  • the amino acid at the position corresponding to position 314 is serine
  • It may be a sarcosine oxidase with a relative activity reduced with respect to L-proline than that of the wild type.
  • the amino acid at a position corresponding to position 343 may be glycine. In this case, the position corresponding to position 348 of SEQ ID NO: 1 may or may not
  • the amino acid at the position corresponding to position 320 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is asparagine, and the amino acid at the position corresponding to position 324 is glycine.
  • the amino acid at a position corresponding to position 348 of SEQ ID NO: 1 is tyrosine.
  • the amino acid at a position corresponding to position 222 of SEQ ID NO: 1 is alanine or histidine.
  • the amino acid at a position corresponding to position 260 of SEQ ID NO: 1 is isoleucine. In one embodiment, in the modified sarcosine oxidase of the present invention, the amino acid at a position corresponding to position 314 of SEQ ID NO: 1 is serine. In one embodiment, the modified sarcosine oxidase of the present invention may further be such that the position corresponding to position 343 of SEQ ID NO: 1 is glycine, in which case the position corresponding to position 348 of SEQ ID NO: 1 is Tyrosine may be used, but phenylalanine may be used.
  • the amino acid sequences are compared using a known algorithm such as the Lippmann-Person method, and the largest conserved amino acid residue in the amino acid sequence of each protein is This can be done by giving identity.
  • a known algorithm such as the Lippmann-Person method
  • the positions of homologous amino acid residues in the full-length sequence can be determined regardless of insertions or deletions in the amino acid sequence.
  • the corresponding position (corresponding position) is considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and is assumed to have a similar function in the target sarcosine oxidase.
  • the modified sarcosine oxidase of the present invention has one or more of the amino acid substitutions (i) to (vii) above, and further, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and 70%, 71%, 72%, 73 %, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more amino acid sequences that show identity, and the reactivity to L-proline is before modification Has reduced sarcosine oxidase activity compared to protein.
  • Amino acid sequence identity is calculated by programs such as GENETYX (GENETYX) maximum matching and search homology, DNASIS Pro (Hitachi Solutions) maximum matching and multiple alignment, or CLUSTAL W multiple alignment. can do.
  • GENETYX GENETYX
  • DNASIS Pro Haitachi Solutions
  • CLUSTAL W multiple alignment CLUSTAL W multiple alignment.
  • amino acid sequence identity when two or more sarcosine oxidases are aligned, the positions of amino acids that are identical in the two or more sarcosine oxidases can be examined. Based on such information, the same region in the amino acid sequence can be determined.
  • the percent identity is defined by using the total number of amino acids in the region that can be aligned when the alignment of two or more amino acid sequences is performed using an algorithm such as Blosum62, as the denominator. The percentage when the number of positions occupied by the same amino acid is used as a molecule. Therefore, usually, when there is a region where no identity is found in two or more amino
  • a region consisting of 380 to 382 positions referred to as a "hom
  • the modified sarcosine oxidase of the present invention has one or more of the amino acid substitutions (i) to (vii) above, and further, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and 70%, 71%, 72%, 73 %, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, An amino acid sequence comprising 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more of the full-length amino acid sequence identity, and the amino acid of SEQ ID NO: 1
  • the homology region consisting of the above position in the sequence and the homology region consisting of the corresponding position of the modified sarcosine oxidase are 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96 , 97%, showed a 9
  • Sarcosine oxidase is known to bind to a coenzyme through a specific amino acid sequence motif.
  • the motif sequence that binds to coenzyme FAD is Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly (where Xaa represents any amino acid), which is a variety of FAD-bound types High preservation in sarcosine oxidase.
  • the motif sequence is found in the amino acid sequence at positions corresponding to positions 11 to 16 of SEQ ID NO: 1.
  • the sarcosine oxidase has a Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly amino acid sequence at positions corresponding to positions 11 to 16 of SEQ ID NO: 1 (where Xaa represents any amino acid) It is.
  • a modified sarcosine oxidase of the invention has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 22 and 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77 %, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more amino acid sequence having sarcosine oxidase activity with reduced reactivity to L-proline compared to the protein before modification .
  • the modified sarcosine oxidase of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 22. In one embodiment, the modified sarcosine oxidase of the present invention has positions 222, 260, 314, 320, 324, 343 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 22. And a monkey having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added at a position other than the position corresponding to position 348, and the reactivity to L-proline is reduced compared to the protein before modification. Has cosin oxidase activity.
  • the term “several amino acids” refers to, for example, 10, for example, 5, 4, for example, 3 amino acids.
  • the modified sarcosine oxidase of the present invention may further have additional mutations.
  • the amino acid at the position corresponding to position 61 of SEQ ID NO: 1 may be lysine
  • the amino acid at the position corresponding to position 241 of SEQ ID NO: 1 may be glycine
  • the amino acid at the position corresponding to may be histidine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 343 of SEQ ID NO: 1 may be glycine.
  • the vector DNA used may be any, for example, plasmid DNA or bacteriophage DNA.
  • the vector may be pUTE300K '(described in JP-A-2005-65583).
  • the recombinant DNA after the above treatment is purified using, for example, GenElute Plasmid Miniprep Kit (SIGMA) to obtain various recombinant DNAs.
  • GenElute Plasmid Miniprep Kit SIGMA
  • E. coli K12 preferably E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), XL1-Blue (manufactured by STRATAGENE), etc. are transformed or transduced.
  • a transformant or transductant containing a recombinant DNA carrying a sarcosine oxidase gene into which various mutations have been introduced can be obtained as a colony.
  • transformants or transductants possessing various mutations are cultured for each colony, they are crushed with ultrasound, a surfactant or the like to obtain a sarcosine oxidase crude enzyme solution possessing various mutations.
  • the reaction ratio of each crude enzyme solution prepared from each colony to L-proline and sarcosine was determined based on the L-proline activity / sarcosine activity of wild-type sarcosine oxidase before modification.
  • the transformant or transductant with reduced reactivity to L-proline is selected.
  • a change in affinity for sarcosine is confirmed by reacting each crude enzyme solution prepared from each colony with dilute sarcosine.
  • a large amount of modified sarcosine oxidase can be produced by culturing the excellent modified product thus obtained in a nutrient medium.
  • the culture medium include one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat straw leachate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sulfuric acid.
  • nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat straw leachate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sulfuric acid.
  • One or more inorganic salts such as magnesium, ferric chloride, ferric sulfate, or manganese sulfate are added, and a saccharide raw material, vitamins, and the like are added as necessary.
  • Culturing is preferably carried out at 30 to 42 ° C., preferably around 37 ° C. for 6 to 24 hours, by aeration / agitation deep culture, shaking culture, stationary culture, or the like.
  • usual enzyme collecting means can be used.
  • the cells are separated from the culture by, for example, operations such as filtration and centrifugation, and washed. It is preferable to collect sarcosine oxidase from the cells.
  • the cells can be used as they are, but the cell walls using a cell wall lytic enzyme such as lysozyme, a method of destroying the cells using various disrupting means such as an ultrasonic crusher, a French press, or Dynamil. It is preferable to collect sarcosine oxidase from the microbial cells by a method for dissolving the microbial cells, a method for extracting an enzyme from the microbial cells using a surfactant such as Triton X-100, and the like.
  • a surfactant such as Triton X-100
  • a conventional method for enzyme purification can be used.
  • an ammonium sulfate salting-out method, an organic solvent precipitation method, an ion exchange chromatography method, a gel filtration chromatography method, an adsorption chromatography method, an electrophoresis method or the like is preferably used in an appropriate combination.
  • a creatinine measurement reagent containing the modified sarcosine oxidase of the present invention is provided.
  • the creatinine measurement reagent may contain other appropriate components or reagents such as a buffer or stabilizer, creatininase, creatinase, peroxidase, color former, and the like. Each component can be the same or a separate reagent.
  • a modified sarcosine oxidase of the present invention or a method for measuring creatinine using the measurement reagent is provided.
  • This method for measuring creatinine includes a step of bringing the modified sarcosine oxidase of the present invention into contact with a sample that can contain sarcosine or a sample that can produce sarcosine by the action of an enzyme or the like.
  • Enzyme activity The activity of this enzyme against sarcosine and L-proline can be measured under the following conditions.
  • the enzyme activity that produces 1 micromole of urea per minute is defined as 1 unit (U).
  • reaction reagent preparation The following solutions are prepared as reaction reagents. 1) 0.01M or 0.2M sarcosine, 100 mM Tris-HCl, 2 mM KCl, 0.1% Triton-X100 (pH 7.7) or 0.2 M L-proline, 100 mM Tris-HCl, 2 mM KCl, 0.1% Triton-X100 (pH 7.).
  • the measurement can be performed as follows. 1) Preincubate 0.95 mL of activity measurement solution at 37 ° C for 5 minutes. 2) Add and mix 0.05 ml of enzyme solution diluted appropriately for each substrate. 3) At 37 ° C, react with sarcosine for 10 minutes and with L-proline for 60 minutes. 4) After the reaction for 10 minutes (4.8 mM, 95 mM sarcosine) and 60 minutes (95 mM L-proline), the above 0.3% SDS solution is mixed to stop the reaction. 5) Measure the absorbance at 555nm at 25 °C (OD sample ). The blank value is measured by mixing 0.3% SDS solution before mixing the enzyme solution (OD blank ).
  • the present invention provides a mutant sarcosine oxidase having a K320N / E324G mutation. This is referred to herein as the M0 variant.
  • the present invention provides mutant sarcosine oxidase M1 (SEQ ID NO: 2).
  • the M1 mutant has the K320N / E324G / Y222H / F348Y / A314S mutation.
  • the present invention provides mutant sarcosine oxidase M2 (SEQ ID NO: 3).
  • the M2 mutant has the K320N / E324G / F260I mutation.
  • the present invention provides mutant sarcosine oxidase M3 (SEQ ID NO: 4).
  • the M3 mutant has the K320N / E324G / F260I / Y222A mutation.
  • the present invention provides mutant sarcosine oxidase M4 (SEQ ID NO: 22).
  • the M4 mutant has the K320N / E324G / Y222H / A314S / F343G mutation.
  • Mutant sarcosine oxidase M0, M1, M2, M3, and M4 can be appropriately purified and formulated into a creatinine measurement reagent. Moreover, the reactivity with respect to L-proline in a reagent can be evaluated using serum artificially mixed with L-proline. Regarding the mutations constituting the mutant sarcosine oxidase (that is, K320N, E324G, Y222H, Y222A, F348Y, A314S, and F260I, and further F343G), the effect of each single mutation is applied to the crude enzyme solution or the purified enzyme. Can be confirmed. In addition, if necessary, multiple mutants can be prepared to confirm the effect.
  • E. coli DH5 ⁇ (pSON) containing recombinant plasmid DNA (vector pUTE300K ′ incorporating the SON gene of SEQ ID NO: 1, hereinafter referred to as pSON) is cultured in LB medium (manufactured by DIFCO). After collecting the cells, the recombinant plasmid DNA pSON was extracted from the cells using the GenElute Plasmid Miniprep Kit (SIGMA) and purified. The obtained recombinant plasmid was about 100 ⁇ g.
  • Error-prone PCR was performed using N-terminal and C-terminal primers (SEQ ID NOs: 5 and 6). Error-prone PCR was performed using GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit (Agilent Technologies). After the reaction was completed, E. coli DH5 ⁇ (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was transformed with the sarcosine oxidase gene library introduced with various mutations to produce mutant sarcosine oxidase to obtain a transformant library .
  • the obtained colonies were cultured in 2 ml TY medium (containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 1 mM IPTG). After culturing at 37 ° C for 18-24 hours, the cells are collected by centrifugation, replaced with 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM KCl (pH 7.7), and subjected to ultrasonic disruption. Centrifugation (12000 rpm, 3 minutes) was performed.
  • the activity of the obtained crushed supernatant was measured using sarcosine and L-proline as substrates. Screening for enzymes whose relative activity of proline (95mM L-proline activity / 95mM sarcosine activity) is reduced and affinity for sarcosine (4.8mM sarcosine / 95mM sarcosine) is maintained or improved compared to the pre-mutation enzyme did. Regarding error-prone PCR and screening, screening was performed for about 1500 strains per cycle, and the following error-prone PCR was performed using a mutant plasmid with good results. Three cycles of error-prone PCR ⁇ screening were performed.
  • mutant M1 composed of five mutation sites was first obtained. Two more effective mutations were also confirmed. Next, a single mutant was prepared for each effective mutation, and the effect was confirmed.
  • the primers used for the production of single mutants are as follows (described in the order of forward and reverse).
  • Y222A SEQ ID NOs: 7 and 8 Y222H: SEQ ID NOs: 9, 10 E324G: SEQ ID NO: 11, 12 F348Y: SEQ ID NOs: 13 and 14 F260I: SEQ ID NOS: 15 and 16 A314S: SEQ ID NOs: 17, 18 K320N: SEQ ID NOs: 19, 20 K320N / E324G: Forward only SEQ ID NO: 21 (reverse is SEQ ID NO: 20)
  • Results are shown below. The results are for the crude enzyme solution. The reaction used TOOS as a color former.
  • the relative activity ratio of each single mutant when the relative activity of each substrate of sarcosine oxidase before modification is 100% is as shown in the table, and the effect of each mutation was confirmed.
  • mutants M0, M2, and M3 were obtained by arbitrarily combining the confirmed mutations based on the results of reaction with sarcosine and L-proline. These were also prepared using the above primers.
  • the relative activity ratios of the M1 and M0, M2, and M3 mutants to the wild type of the crude enzyme solution are shown in the following table. This reaction was performed using TOOS as a color former.
  • E. coli DH5 ⁇ containing the modified sarcosine oxidase gene of M1, M2, and M3 was added to TY medium (1% bacto-tryptone, 25 ⁇ g / ml kanamycin). 0.5% Bacto-Yeast Extract, 0.5% NaCl, pH 7.5) After shaking culture at 37 ° C. for 16 hours in 100 ml, inoculate 10 ml of 7 L of TY medium (including 1 mM IPTG) prepared in the same manner did. After inoculation, the cells were cultured for about 20 hours at a rotation speed of 120 rpm and 37 ° C.
  • Step 1 preparation of crude enzyme solution
  • 7 L of the culture broth was applied to a UF membrane (MW 50000), the medium components were removed, and the medium was replaced with 10 mM phosphate buffer and 1 mM EDTA.
  • EDTA pH 8.0
  • the crushed cell solution was centrifuged to precipitate debris to obtain a crude enzyme solution.
  • Step 2 Ammonium sulfate precipitation treatment
  • Ammonium sulfate precipitation was performed by adding 20% ammonium sulfate to 500 ml of the crude enzyme thus obtained. After ammonium sulfate precipitation, the precipitate was dissolved in a buffer solution consisting of 100 mM KCl, 10 mM potassium phosphate buffer 1 mM EDTA, combined, and dialyzed with the same buffer to remove ammonium sulfate. Further, the dialyzed treatment solution was centrifuged (10,000 g, 30 minutes) to clarify the crude enzyme solution.
  • Step 3 Q Sepharose FF ion exchange chromatography, batch type
  • Q Sepharose Fast Flow trademark, manufactured by GE Healthcare
  • Elution was performed with 300 mM KCl, 10 mM potassium phosphate buffer, 1 mM EDTA (pH 8.0).
  • a highly purified fraction was collected, concentrated, and dialyzed against 10 mM phosphate buffer pH 8.0 containing 150 mM KCl and 1 mM EDTA.
  • Step 4 Q Sepharose FF ion exchange chromatography, gradient
  • a column packed with 500 ml of Q Sepharose FF (trademark, manufactured by GE Healthcare) carrier buffered with 10 mM potassium phosphate buffer containing 150 mM KCl and 1 mM EDTA is charged with 500 ml of the enzyme solution treated in Step 3, and 200 mM.
  • the gradient of 200 mM to 300 mM KCl total volume 7500 ml
  • the collected fractions were analyzed, and fractions with high specific activity (U / OD 280 nm ) were mixed and dialyzed against 10 mM potassium phosphate buffer pH 8.0 to obtain an enzyme preparation.
  • Example 3 The reactivity of modified sarcosine oxidase M1, M2, M3 purified by the above method and sarcosine oxidase before modification to L-proline was compared using an enzyme solution in which sarcosine activity was unified to about 33.0 U / ml. In this reaction, phenol was used as a color former.
  • Example 4 With respect to the modified sarcosine oxidase M1, M2, M3 purified by the above method and the sarcosine oxidase before modification, the relative activity (%) against L-proline was examined when the activity against sarcosine was defined as 100%. As experimental conditions, in the same order as in Example 1, the absorbance when sarcosine 95 mM was used as a substrate was taken as 100%, and the absorbance when proline 95 mM was used as a substrate was evaluated. Phenol was used as the color former. The results are shown below.
  • Example 5 The degree of influence of proline when the various sarcosine oxidases obtained above were applied to creatinine measurement reagents was evaluated.
  • the creatinine measuring reagent is as follows.
  • the following first reagent and second reagent were prepared, and creatinine was measured using a commercially available control serum (PreciControlClinChemMulti1, EXA Liquid 3 normal, or SeikenLiquidNormal V) as a sample.
  • L-proline was added to the control serum so that the concentrations were 0, 10, 20, 30, 40, and 50 mg / dL. Measurement was started by adding 125 ⁇ L of the first reagent to 7 ⁇ L of the sputum sample. 5 minutes after the start of measurement, 63.0 ⁇ L of the second reagent was added.
  • the reagent blank used physiological saline as a sample. In advance, a reagent blank and an aqueous solution having a known creatinine concentration were measured, a calibration curve was prepared, and a value to be measured was determined as creatinine at the time of sample measurement.
  • the effect of proline was reduced in the modified sarcosine oxidase compared to the sarcosine oxidase before the modification.
  • the reactivity of creatinine 5.0 mg / dL was compared with a reagent using modified sarcosine oxidase and sarcosine oxidase before modification.
  • the modified sarcosine oxidase did not change the reaction compared to the sarcosine oxidase before modification, and the influence of proline was suppressed.
  • Example 6 Method for preparing M4 Briefly, a modified form having mutation K320N / E324G / Y222H / A314S / F343G by PCR using the following primers (SEQ ID NOS: 23 and 24) using SOD-M1 plasmid as a template.
  • Sarcosine oxidase M4 (SEQ ID NO: 22) was prepared.
  • gcagctggtggttctggacatggatttaaaa SEQ ID NO: 23
  • Plasmid acquisition procedures and PCR conditions were the same as in Example 1.
  • the resulting plasmid DNA was sequenced to confirm the introduction of the mutation.
  • M4 was not only less reactive to proline than sarcosine oxidase before modification, but also less reactive to proline than M1 (FIGS. 3-5).
  • SEQ ID NO: 1 Wild-type sarcosine oxidase derived from Bacillus NS-129
  • SEQ ID NO: 2 Modified sarcosine oxidase M1 (K320N / E324G / Y222H / F348Y / A314S)
  • Sequence number 3 Modified sarcosine oxidase M2 (K320N / E324G / F260I)
  • SEQ ID NO: 4 Modified sarcosine oxidase M3 (K320N / E324G / F260I / Y222A)
  • SEQ ID NO: 6 C-terminal sequence for error-prone PCR ttattttactgcttcttttttttaatgcatc

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Abstract

ザルコシンオキシダーゼの反応におけるL-プロリンの影響を低下させること。　L-プロリンに対する反応性の低下した改変ザルコシンオキシダーゼを提供する。

Description

改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法
　本発明は、L-プロリンに対する反応性が改変前の酵素と比べて低下した改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法に関する。
　ザルコシンオキシダーゼは、ザルコシンを加水分解してグリシン及びホルムアルデヒドを生成する触媒作用を有する酵素であり、ヒトの血清中又は尿中のクレアチニン量の測定に用いることができ、腎臓病をはじめとする各種の疾患の診断薬として利用することができる。
　従来、ザルコシンオキシダーゼは、例えば、コリネバクテリウム属（例えば、非特許文献１参照。）、バチルス属（例えば、特許文献１参照。）、シリンドロカーボン属（例えば、特許文献２参照。）、シュードモナス属（例えば、特許文献３参照。）、アースロバクター属（例えば、特許文献４参照。）等の菌株により生産されることが知られている。
　また、本出願人等は、バチルス属よりザルコシンオキシダーゼ遺伝子を単離し、遺伝子工学的手法により本酵素を大量に発現させることに成功した（例えば、特許文献５参照。）。
　しかしながら、ザルコシンオキシダーゼは、輸液成分であるL-プロリンに対しても僅かながら反応することが知られている。したがってクレアチニン又はクレアチンを正確に測定するために、L-プロリンの影響を受けにくいザルコシンオキシダーゼが求められていた。また、L-プロリンへの反応が低下したザルコシンオキシダーゼに関しては、Arthrobacter sp. TE1826由来の改変ザルコシンオキシダーゼ（特許文献６）や、遺伝子工学的手法を用いた七重変異体の改変型サルコシンオキシダーゼ（特許文献７等参照）が知られているが、依然としてL-プロリンへの反応が低下したサルコシンオキシダーゼが求められていた。
特開昭54-52789号公報 特開昭56-92790号公報 特開昭60-43379号公報 特開平2-265478号公報 特開平5-115281号公報 特開平10-248572号公報（特許第3904098号公報） 特開2004-159566号公報（特許第4419044号公報）
J.Biochem.，89，1981，p.599
　本発明は、L-プロリンに対する反応性の低下したザルコシンオキシダーゼを提供することを目的とする。
　本発明者等は、上記課題に鑑み、バチルス由来のザルコシンオキシダーゼ遺伝子（特公平6-65303号公報記載）の遺伝子改変を行なった結果、L-プロリンに対する反応性の低下したザルコシンオキシダーゼを取得することに成功し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、以下を包含する。 　
[１]　下記の性質を有する改変型ザルコシンオキシダーゼ、
（ａ）作用：１モルのザルコシンを加水分解し、１モルのグリシン及び１モルのホルムアルデヒドを生成する、並びに
（ｂ）基質特異性：ザルコシンに対する活性を１００％として、L-プロリンに対する相対活性が、０．２３％以下である。 　
[２]　以下から選択される改変型ザルコシンオキシダーゼ、
（ａ）ザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした際に、以下の(i)～(vi)の少なくとも１か所の部位が下記のアミノ酸に置換され、L-プロリンに対する相対活性が低下したザルコシンオキシダーゼ、すなわち、配列番号１の
　(i)３２０位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、
　(ii)３２４位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであり、
　(iii)３４８位に相当する位置のアミノ酸がチロシンであり、
　(iv)２２２位に相当する位置のアミノ酸がアラニン若しくはヒスチジンであり、
　(v)２６０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、かつ／又は
　(vi)３１４位に相当する位置のアミノ酸がセリンであり、
L-プロリンに対して相対活性が野生型よりも低下したザルコシンオキシダーゼ、
（ｂ－１）前記（ａ）におけるアミノ酸置換を１以上有し、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ－２）前記（ａ）におけるアミノ酸置換を１以上有し、配列番号１のアミノ酸配列と７５％以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号１の６～８６位、８８～９２位、９４～９７位、１０１～１０２位、１０４～１０９位、１１２～１１４位、１１８位、１２０～１２１位、１２７～１２８位、１３０～１３１位、１３３～１３４位、１３６～１３７位、１３９～１４２位、１４４～１５４位、１５６～１６６位、１６８～１７８位、１８１～１８２位、１８４位、１８６位、１８８～１８９位、１９１～１９２位、１９４～１９５位、１９７～２１３位、２１６～２３３位、２３５～２３８位、２４２～２４９位、２５２～２６２位、２６４～２７０位、２７２～２７４位、２７６～２８６位、２８８～２９２位、２９４位、２９６～３００位、３０２～３０６位、３０８～３１１位、３１３～３３２位、３３５～３５８位、３６０～３６２位、３６４～３７５位、３７７～３７８位、及び３８０～３８２位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
（ｃ－１）配列番号２、３、又は４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ－２）配列番号２、３、又は４のアミノ酸配列と７５％以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号１の６～８６位、８８～９２位、９４～９７位、１０１～１０２位、１０４～１０９位、１１２～１１４位、１１８位、１２０～１２１位、１２７～１２８位、１３０～１３１位、１３３～１３４位、１３６～１３７位、１３９～１４２位、１４４～１５４位、１５６～１６６位、１６８～１７８位、１８１～１８２位、１８４位、１８６位、１８８～１８９位、１９１～１９２位、１９４～１９５位、１９７～２１３位、２１６～２３３位、２３５～２３８位、２４２～２４９位、２５２～２６２位、２６４～２７０位、２７２～２７４位、２７６～２８６位、２８８～２９２位、２９４位、２９６～３００位、３０２～３０６位、３０８～３１１位、３１３～３３２位、３３５～３５８位、３６０～３６２位、３６４～３７５位、３７７～３７８位、及び３８０～３８２位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
（ｄ）配列番号２、３、４又は２２のアミノ酸配列を含むタンパク質、或いは
（ｅ）配列番号２、３、４又は２２のアミノ酸配列において、配列番号１の２２２位、２６０位、３１４位、３２０位、３２４位、３４３位及び３４８位に相当する位置以外の位置において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 　
[３]　配列番号１のアミノ酸配列の３２０位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、３２４位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、１又は２に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。 　
[４]　さらに、配列番号１の３４８位に相当する位置のアミノ酸がチロシンである、３に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。 　
[５]　さらに、配列番号１の２２２位に相当する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、３又は４に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
[６]　さらに、配列番号１の２６０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンである、３～５のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。 　
[７]　さらに、配列番号１の３１４位に相当する位置のアミノ酸がセリンである、３～６のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。 　
[８]　さらに、配列番号１の３４３位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、３～７のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。 　
[９]　２～８のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼをコードするザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターを含む、組み換え体ＤＮＡ。 　
[１０]　９記載の組み換え体ＤＮＡを含む、形質転換体又は形質導入体。 　
[１１]　１０記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取する工程を含む、改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。 　
[１２]　１～８のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含む、クレアチニン測定試薬。 　
[１３]　１～８のいずれかに記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ、又は１２に記載の測定試薬を用いたクレアチニン測定方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-180796号の開示内容を包含する。
　本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、クレアチニン又はクレアチンの測定試薬として使用できる。本改変型ザルコシンオキシダーゼを使用した試薬は、L-プロリンの影響を受けにくいことから、より正確な測定が可能となる。
改変ザルコシンオキシダーゼ及び改変前のザルコシンオキシダーゼに対するプロリンの影響を示す。 改変ザルコシンオキシダーゼ又は改変前のザルコシンオキシダーゼを添加したクレアチニン測定試薬の反応性を示す。 改変ザルコシンオキシダーゼ及び改変前のザルコシンオキシダーゼに対するプロリンの影響を示す（血清：PreciControlClinChemMulti1）。 改変ザルコシンオキシダーゼ及び改変前のザルコシンオキシダーゼに対するプロリンの影響を示す（血清：EXA Liquid 3 normal）。 改変ザルコシンオキシダーゼ及び改変前のザルコシンオキシダーゼに対するプロリンの影響を示す（血清：SeikenLiquidNormal V）。
　以下、本発明を詳細に説明する。 　
　本発明のザルコシンオキシダーゼは、ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を改変することにより得ることができる。改変に用いるザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、特に限定されず、例えば、バチルス属由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子（特公平6-65303号記載）等を挙げることができる。別の例として、ザルコシンオキシダーゼ遺伝子はアースロバクター・エスピーTE1826（Arthrobacter sp. TE1826）由来のものであり得る（Journal of Fermentation and Bioengineering,1993年, 75巻4号,p.239-244）。尚、本発明において用いることのできるベクターDNAは限定される事は無い。ある実施形態において、ベクターはpUTE300K’(特開2005-65583号公報記載)でありうる。
　上記遺伝子を改変する手法としては、既知の如何なる方法でもよく、ザルコシンオキシダーゼ遺伝子、例えば、前記バチルス属由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含むザルコシンオキシダーゼ発現プラスミドに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸等の化学変異剤を接触させる方法又はＰＣＲ法を用いてランダムに変換する方法等の点変異、市販のキットを利用する部位特異的な置換又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；この組み換え体プラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、次の性質を有する。すなわち、
（ａ）作用：１モルのザルコシンを加水分解し、１モルのグリシン及び１モルのホルムアルデヒドを生成する、並びに
（ｂ－１）基質特異性：ザルコシンに対する活性を１００％として、L-プロリンに対する相対活性が、０．２３％以下、０．２２％以下、０．２１％以下、例えば０．２０％以下である、かつ／又は
（ｂ－２）基質特異性：L-プロリンに対する相対活性が、改変前のタンパク質と比較して、７５％以下、７４％以下、例えば７３％以下である。
　ここで、ザルコシンに対する活性を１００％としたときのL-プロリンに対する相対活性は、基質としてザルコシンを特定の濃度（例えば95mM）にて用いたときの発色剤の吸光度変化を１００％とし、ザルコシンの代わりに基質としてL-プロリンを同濃度（例えば95mM）にて用いたときの吸光度から決定することができる。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、配列番号１の
　(i)３２０位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、
　(ii)３２４位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであり、
　(iii)３４８位に相当する位置のアミノ酸がチロシンであり、
　(iv)２２２位に相当する位置のアミノ酸がアラニン若しくはヒスチジンであり、
　(v)２６０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、かつ／又は
　(vi)３１４位に相当する位置のアミノ酸がセリンであり、
L-プロリンに対して相対活性が野生型よりも低下したザルコシンオキシダーゼであり得る。場合により、さらに
　(vii)３４３位に相当する位置のアミノ酸はグリシンであってもよい。この場合、配列番号１の３４８位に相当する位置はチロシンであってもよく、またチロシンでなくともよい。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列の３２０位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ、３２４位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである。ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、さらに、配列番号１の３４８位に相当する位置のアミノ酸がチロシンである。ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、さらに、配列番号１の２２２位に相当する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである。ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、さらに、配列番号１の２６０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンである。ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、さらに、配列番号１の３１４位に相当する位置のアミノ酸がセリンである。ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、さらに、配列番号１の３４３位に相当する位置がグリシンであってもよく、この場合において、配列番号１の３４８位に相当する位置はチロシンでもよいが、フェニルアラニンでもよい。
　アミノ酸配列における「相当する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各タンパク質のアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の全長配列における位置を決めることができる。相当する位置（対応する位置）は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるザルコシンオキシダーゼにおいて類似した機能を有すると推定される。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、上記(i)～(vii)のアミノ酸置換を1以上有し、さらに配列番号１のアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する。
　アミノ酸配列の同一性は、GENETYX（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはDNASIS Pro（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のザルコシンオキシダーゼをアライメントしたときに、該２以上のザルコシンオキシダーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、当該領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
　本明細書において、配列番号１のアミノ酸配列における、６～８６位、８８～９２位、９４～９７位、１０１～１０２位、１０４～１０９位、１１２～１１４位、１１８位、１２０～１２１位、１２７～１２８位、１３０～１３１位、１３３～１３４位、１３６～１３７位、１３９～１４２位、１４４～１５４位、１５６～１６６位、１６８～１７８位、１８１～１８２位、１８４位、１８６位、１８８～１８９位、１９１～１９２位、１９４～１９５位、１９７～２１３位、２１６～２３３位、２３５～２３８位、２４２～２４９位、２５２～２６２位、２６４～２７０位、２７２～２７４位、２７６～２８６位、２８８～２９２位、２９４位、２９６～３００位、３０２～３０６位、３０８～３１１位、３１３～３３２位、３３５～３５８位、３６０～３６２位、３６４～３７５位、３７７～３７８位、及び３８０～３８２位からなる領域を、ザルコシンオキシダーゼの「相同性領域」とよぶ。相同性領域に関し、対応する位置が存在しない場合は、当該位置は同一性％の計算から除外する。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、上記(i)～(vii)のアミノ酸置換を1以上有し、さらに配列番号１のアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１のアミノ酸配列における上記位置からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とは、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上のアミノ酸配列同一性を示し、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する。
　ザルコシンオキシダーゼは特定のアミノ酸配列モチーフを介して補酵素と結合することが知られている。FAD結合型ザルコシンオキシダーゼでは、補酵素FADと結合するモチーフ配列は、Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）であり、これは各種のFAD結合型ザルコシンオキシダーゼにおいて保存性が高い。同モチーフ配列は、配列番号１の１１～１６位に対応する位置のアミノ酸配列に見られる。したがって、ある実施形態において、ザルコシンオキシダーゼは、配列番号１の１１～１６位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、配列番号２、３、４又は２２のアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、配列番号２、３、４又は２２のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、配列番号２、３、４又は２２のアミノ酸配列において、配列番号１の２２２位、２６０位、３１４位、３２０位、３２４位、３４３位、及び３４８位に相当する位置以外の位置において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する。ここで、数個のアミノ酸とは、例えば１０個、例えば５個、４個、例えば３個のアミノ酸をいう。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、さらに、追加の変異を有し得る。例えば、配列番号１の６１位に相当する位置のアミノ酸がリシンであってもよく、配列番号１の２４１位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであってもよく、及び／又は配列番号１の２６９に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンであってもよい。また、配列番号１の３４３位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであってもよい。
　用いられるベクターＤＮＡは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ又はバクテリオファージＤＮＡ等でもよい。ある実施形態において、ベクターは、pUTE300K’(特開2005-65583号公報記載)でありうる。
　次いで、上記処理後の組み換え体ＤＮＡを、例えば、GenElute Plasmid Miniprep Kit(SIGMA社)等を用いて精製し、種々の組み換え体ＤＮＡを得る。
　このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K12、好ましくは大腸菌DH5α、大腸菌JM109(東洋紡績社製)、XL1-Blue（STRATAGENE社製）等を形質転換又は形質導入し、種々の変異の導入されたザルコシンオキシダーゼ遺伝子を保有する組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体をコロニーとして得ることができる。そして、種々の変異を保有する形質転換体又は形質導入体をコロニー毎に培養後、超音波、界面活性剤等で破砕し、種々の変異を保有するザルコシンオキシダーゼ粗酵素液を得る。
　次いで、各コロニー毎のザルコシンオキシダーゼ粗酵素液のL-プロリンに対する反応性を確認する。具体的には、各コロニーから調製した各粗酵素液のL-プロリンとザルコシンに対する反応比（L-プロリン活性/ザルコシン活性）を、改変前の野生型ザルコシンオキシダーゼのL-プロリン活性/ザルコシン活性と比較することにより、L-プロリンに対する反応性が低下した形質転換体又は形質導入体を選択する。併せて、各コロニーから調製した各粗酵素液を希薄なザルコシンと反応させることにより、ザルコシンへの親和性の変化も確認する。
　このようにして得られた優良な改変体を、栄養培地で培養することにより大量の改変型ザルコシンオキシダーゼを生産させることができる。培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　なお、培地の初発pHは、7～9に調整するのが適当である。また培養は、30～42℃、好ましくは37℃前後で6～24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物よりザルコシンオキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
　培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からザルコシンオキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体からザルコシンオキシダーゼを採取するのが好ましい。
　このようにして得られた粗酵素液からザルコシンオキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。
　ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼを含む、クレアチニン測定試薬を提供する。クレアチニン測定試薬は、緩衝剤や安定化剤、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ペルオキシダーゼ、発色剤等、他の適当な成分又は試薬を含み得る。各成分は同一又は別個の試薬であり得る。ある実施形態において、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼ、又は上記測定試薬を用いたクレアチニン測定方法を提供する。このクレアチニン測定方法は、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼと、ザルコシンを含み得るサンプル又は酵素の作用等によりザルコシンが生成されうるサンプルを接触させる工程を含む。
（酵素活性）
　本酵素のザルコシン、L-プロリンに対する活性の測定は、下記条件下で行なうことができる。尚、ザルコシンに関し、1分間に1マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を1単位（Ｕ）とする。
（試薬調製）
　反応用試薬として、以下の溶液を調製する。
1) 0.01M又は0.2M　ザルコシン，100mM　Tris-HCl，2mM　KCl，0.1%　Triton-X100(pH7.7)又は0.2M　L-プロリン，100mM　Tris-HCl，2mM　KCl，0.1%　Triton-X100(pH7.7)
2) 80U/ml　POD溶液
3) 0.1%　TOOS（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン）溶液又は0.1%フェノール溶液
4) 0.2%　4-aminoantipyrine溶液
5) 超純水
6) 0.3%　SDS 溶液
7) 20mM　Tris-HCl，1mM　KCl，0.2%　BSA(pH7.7)（酵素希釈液）
　次いで、上記各溶液を以下の数量混合し、活性測定液を調製する。 　
1) 5 ml
2) 1 ml
3) 2 ml
4) 1 ml
5) 1 ml
　測定は以下のようにして行うことができる。 　
1) 活性測定液0.95mLを37℃、5分間、プレインキュベートする。 　
2) それぞれの基質に対し、適宜希釈した酵素液0.05mlを添加混合する。 　
3) 37℃において、ザルコシンの場合10分間反応、L-プロリンの場合60分間反応させる。
4) 10分間（4.8mM,95mMザルコシン）、60分間（95mM L-プロリン）の反応後、上記0.3%　SDS溶液を混合し、反応を停止させる。 　
5) 25℃にて555nmの吸光度を測定する（ＯＤsample）。 　
　ブランク値は、酵素液の混合前に0.3%　SDS溶液を混合することによって測定する（ＯＤblank）。
6) 終濃度95mMザルコシン、95mM L-プロリンとの反応によって測定されたΔOD555nm(ＯＤsample-ＯＤblank)の比をまず確認し、続いて、野生型との相対活性比を計算する（95mM L-プロリン活性/95mMザルコシン活性）。
　また、4.8mMザルコシン活性も併せて測定することにより、親和性（4.8mMザルコシン活性/95mMザルコシン活性）を確認し、野生型との相対活性比を計算する。
　ある実施形態において、本発明はK320N/E324G変異を有する変異型ザルコシンオキシダーゼを提供する。これを本明細書においてM0変異体と呼ぶ。別の実施形態において、本発明は変異型ザルコシンオキシダーゼM1（配列番号２）を提供する。M1変異体は、K320N/E324G/Y222H/F348Y/A314S変異を有する。別の実施形態において、本発明は変異型ザルコシンオキシダーゼM2（配列番号３）を提供する。M2変異体は、K320N/E324G/F260I変異を有する。別の実施形態において、本発明は変異型ザルコシンオキシダーゼM3（配列番号４）を提供する。M3変異体はK320N/E324G/F260I/Y222A変異を有する。別の実施形態において、本発明は変異型ザルコシンオキシダーゼM4（配列番号２２）を提供する。M4変異体はK320N/E324G/Y222H/A314S/F343G変異を有する。これらの変異体タンパク質は、例えば野生型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子について、当該変異を導入するプライマーを適宜設計し、突然変異を導入し、改変遺伝子を発現させることで取得しうる。
　変異型ザルコシンオキシダーゼM0、M1、M2、M3、およびM4は、適宜精製し、クレアチニン測定試薬に処方しうる。また、L-プロリンを人為的に混入した血清を用いて、試薬中でのL-プロリンに対する反応性を評価しうる。また、前記変異型ザルコシンオキシダーゼを構成する変異（すなわちK320N、E324G、Y222H、Y222A、F348Y、A314S、及びF260I、さらにはF343G）に関しては、単変異毎の効果に関し、粗酵素液又は精製酵素にて確認することができる。また必要に応じて多重変異体を作製しその効果を確認し得る。
　以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
［実施例１］
　組み換え体プラスミドＤＮＡ（ベクターpUTE300K’に配列番号１のSON遺伝子を組み入れたもの、以下、pSONと記載する）の含まれる大腸菌E.coli　DH5α(pSON)を、LB培地（DIFCO社製）にて培養し、菌体を集菌した後、そこからGenElute Plasmid Miniprep Kit(SIGMA社)を使用して組み換え体プラスミドＤＮＡ　pSON　を抽出、精製した。得られた組み換え体プラスミドは、約100μｇであった。
　得られた組み換え体プラスミドをもとにN末端、C末端用プライマー（配列番号５及び６）を用いてエラープローンPCRを行なった。エラープローンPCRについては、GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社製)を用いて行った。反応終了後、種々な変異の導入されたザルコシンオキシダーゼ遺伝子ライブラリを用いてE.coli DH5α(日本ジーン社製)を形質転換し、変異型ザルコシンオキシダーゼを生産し、形質転換体ライブラリを得た。
　次いで、得られたコロニーを、2ml　TY培地（25μg/ml　カナマイシン、1mM　IPTGを含む）にて培養した。37℃で18～24時間の培養の後、遠心分離にて菌体を集菌して20mM　Tris-HCl(pH8.0)、1mM　KCl(pH7.7)に置換して超音波破砕を行ない、遠心分離（12000r.p.m.、3分間）を行なった。
　得られた破砕上清の活性を、ザルコシン及びL-プロリンを基質として測定した。変異前の酵素と比較して、プロリンの相対活性（95mM L-プロリン活性/95mMザルコシン活性）が低下し、ザルコシンへの親和性(4.8mMザルコシン/95mMザルコシン)が維持、もしくは向上した酵素をスクリーニングした。エラープローンPCR及びスクリーニングに関しては、1サイクル1500株程度スクリーニングを行い、結果の良好だった変異体のプラスミドを用いて次のエラープローンPCRを行った。エラープローンPCR→スクリーニングのサイクルを3サイクル行った。
　スクリーニングによって得られた優良変異体に関しては、DNAシーケンスを行い、変異部位を特定した。また、単変異によるザルコシン反応、L-プロリン反応に関する効果も併せて確認した。本スクリーニングを行うことにより、５か所の変異部位により構成された変異体M1をまず取得した。また、更に２か所の有効な変異を確認した。次に、それぞれの有効な変異について、単変異体を作製し、その効果を確認した。単変異体作製に用いたプライマーは以下のとおりである（フォワード、リバースの順にそれぞれ記載）。　 
Y222A：配列番号７、８
Y222H：配列番号９、１０
E324G：配列番号１１、１２
F348Y：配列番号１３、１４
F260I：配列番号１５、１６
A314S：配列番号１７、１８
K320N：配列番号１９、２０
K320N/E324G:フォワードのみ配列番号２１（リバースは配列番号２０）
　結果を下記に示す。結果は粗酵素液でのものである。尚、反応はTOOSを発色剤として用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　改変前ザルコシンオキシダーゼの各基質での相対活性を100％とした時の各単変異体の相対活性比は、表の通りとなり、各変異の効果がそれぞれ確認された。
　また、確認された変異をザルコシン、L-プロリンへの反応結果を基にし、任意で組み合わせることにより、優良な変異体、M0、M2、M3を得た。これらも上記プライマーを使用して作製した。M1及び、M0、M2、M3変異体の粗酵素液の野生型に対する相対活性比を以下の表に示す。尚、本反応には、発色剤としてTOOSを用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　いずれの変異体もザルコシンに対する反応性は維持されている一方で、プロリンに対する反応性は野生型と比較して有意に低下していた。
［実施例２］
　上記のようにして得られた変異体のうち、M1,M2,M3の改変ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌(E.coli)DH5αを、25μg/ml　カナマイシンを含むＴＹ培地（1%　バクト－トリプトン、0.5%　バクト－イーストエクストラクト、0.5%％　NaCl、pH7.5）100mlにて37℃で16時間振とう培養した後、同様に調製した７LのＴＹ培地（但し、1mM　IPTGを含む）に10ml接種した。接種後、回転数120r.p.m.、37℃にて約20時間培養した。
ステップ１（粗酵素液の調整）
　培養終了後、培養液７ＬをUF膜（MW50000）に供し、培地成分を除去し、10mM　リン酸バッファー,1mM EDTAに置換した。そこへ、終濃度50mMとなるようにEDTA(pH8.0)を添加、圧力式ホモジナイザーにて処理し、菌体を破砕した。破砕した菌体液に関しては遠心分離を行ってデブリを沈殿させ、粗酵素液を得た。
ステップ２（硫安沈澱処理）
　このようにして得られた粗酵素500mlに対して20%の硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行なった。硫安沈殿後、100mM　KCl、10mMリン酸カリウム緩衝液1mM　EDTAからなる緩衝液に沈殿を溶解、合わせて、同バッファーにて透析することにより硫安を除去した。更に、透析を施した処理液に対し、遠心分離（10,000g、30分間）を行い、粗酵素液の清澄化を行った。
ステップ３（QセファロースFF　イオン交換クロマト、バッチ式）
　Qセファロースファストフロー（商標、GEヘルスケア社製）担体500mlを充填したカラムに上記粗酵素液を吸着させ、1500mlの100mM　KCl、10mM リン酸カリウム緩衝液1mM　EDTA(pH8.0)で洗浄した後、300mM　KCl 10mM リン酸カリウム緩衝液1mM　EDTA(pH8.0)で溶出を行なった。溶出終了後、精製度の高い画分を回収し、濃縮、150mM　KCl、1mM　EDTAを含む10mMリン酸緩衝液pH8.0にて透析を行なった。
ステップ４（QセファロースFF　イオン交換クロマト、グラジエント）
　150mM　KCl、1mM　EDTAを含む10mM　リン酸カリウム緩衝液でバッファライズしたQセファロースFF（商標、GEヘルスケア社製）担体500mlを充填したカラムに、ステップ3で処理した酵素液500mlをチャージし、200mM　KCl、1mM　EDTAを含む10mM　リン酸緩衝液1500mlにて洗浄の後、200mM－300mM KClのグラジエント（総液量7500ml）緩衝液は、10mMリン酸カリウム、1mM EDTAにて溶出を行い、フラクションを回収した。回収したフラクションを分析し、比活性（U/OD280nm）の高い画分を混合し、10mM リン酸カリウム緩衝液pH8.0にて透析を行い、酵素標品とした。
［実施例３］
　上記の方法で精製した改変型ザルコシンオキシダーゼM1,M2,M3及び改変前のザルコシンオキシダーゼのL-プロリンに対する反応性をザルコシン活性を約33.0U/mlに統一した酵素液を用いて比較した。尚、本反応においては、発色剤としてフェノールを用いた。
　結果を下記に示す。改変前ザルコシンオキシダーゼの各基質での相対活性を100％としたとき、改変型ザルコシンオキシダーゼM1のL-プロリンに対する相対活性比は51.5％、M2は73.0％、M3は68.7％となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例４］
　上記の方法で精製した改変型ザルコシンオキシダーゼM1,M2,M3及び改変前のザルコシンオキシダーゼについて、ザルコシンに対する活性を１００％としたときの、L-プロリンに対する相対活性（％）を調べた。実験条件としては、実施例１と同じ点順で、基質としてザルコシン95mMを用いたときの吸光度を１００％とし、基質としてプロリン95mMを用いたときの吸光度を評価した。発色剤はフェノールを用いた。結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例５］
　上記で取得した各種ザルコシンオキシダーゼを、クレアチニン測定試薬に適用した際のプロリンの影響度を評価した。クレアチニン測定試薬は下記の通りである。
　下記の第１試薬と第２試薬とを準備し、試料として市販のコントロール血清（PreciControlClinChemMulti1、EXA Liquid 3 normal、又はSeikenLiquidNormal V）を使用してクレアチニンの測定を行った。
  （第１試薬）
アスコルビン酸オキシダーゼ                １０ Ｕ/ｍＬ
カタラーゼ                               ３００Ｕ/ｍＬ
クレアチナーゼ                           ３５Ｕ/ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ                   １１Ｕ/ｍＬ
ＴＥＳ（2-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]エタンスルホン酸）バッファー                      ２０ｍＭ、ｐＨ ８．２
Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル－ｍ－トルイジン）（ＴＯＯＳ）     　　　　　　　          　　　　　１．０ ｍＭ
トリトンＸ－１００                       ０．１  ％
塩化カリウム                             ７０ｍＭ
　（第２試薬）
４－アミノアンチピリン                   ４．０ ｍＭ
クレアチニナーゼ                        ３７０Ｕ/ｍＬ
ペルオキシダーゼ                          １５Ｕ/ｍＬ
ＴＥＳバッファー                         ２０ｍＭ、ｐH ８．０
トリトンＸ－１００                      ０．１ ％
塩化カリウム                                ７０ｍM
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　０．０９％
　尚、各酵素に関し、1分間に1マイクロモルの生成物を生成する酵素活性を、それぞれの酵素についての1単位（Ｕ）とする。
　測定試料としてコントロール血清にＬ－プロリンを ０、１０、２０、３０、４０、５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加した。 試料７μＬに、第１試薬を１２５μＬ添加して測定を開始した。測定開始から５分後に第２試薬を６３．０μＬ添加した。測定は、日本電子社製のＢＭ－１６５０自動分析装置を用い、測定波長は、主波長＝５４５ｎｍ、副波長＝６５８ｎｍとした。試薬ブランクは、試料として生理食塩水を使用した。あらかじめ、試薬ブランクとクレアチニン濃度既知水溶液を測定し、検量線を作成し、ここから試料測定時のクレアチニンとして、測定される値を求めた。
　図１に示す通り、改変ザルコシンオキシダーゼは、改変前のザルコシンオキシダーゼに比べ、プロリンの影響が下がっていた。
　クレアチニン５．０ｍｇ／ｄＬの反応性を改変ザルコシンオキシダーゼ、改変前のザルコシンオキシダーゼを用いた試薬で比較した。
　図２に示す通り、改変ザルコシンオキシダーゼを用いた試薬は、改変前のザルコシンオキシダーゼを用いた試薬と反応性は変わらないことが分かった。
　よって、改変ザルコシンオキシダーゼは改変前のザルコシンオキシダーゼと比べ、反応が変わらず、プロリンの影響が抑えられていることが分かった。
［実施例６］
M4の作製方法
　簡単に説明すると、SOD-M1のプラスミドを鋳型として、下記のプライマー（配列番号２３、２４）を用いて、PCR法により、変異K320N/E324G/Y222H/A314S/F343Gを有する改変型ザルコシンオキシダーゼM4（配列番号２２）を作製した。 　
gcagctggtggttctggacatggatttaaa（配列番号２３）
atgtccagaaccaccagctgcaattgcaac（配列番号２４）
　プラスミドの取得手順やPCR条件は、実施例１と同様であった。得られたプラスミドDNAを配列決定し、変異の導入を確認した。
M4の評価方法
　作製したM4の改変ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌(E.coli)DH5αを、実施例２と同じ手順で培養し、精製酵素液を調整した。次いで、改変型ザルコシンオキシダーゼM4について、実施例５と同じ手順で、クレアチニン測定試薬に適用した際のプロリンの影響度を評価した。クレアチニン測定試薬は実施例５と同様であった。また血清は以下のものを用いた：
PreciControlClinChemMulti1  Lot.168 332-02
EXA Liquid 3 normal   Lot.NL052G
SeikenLiquidNormal V  Lot.VNO10103。
　その結果、M4は、改変前のザルコシンオキシダーゼよりもプロリンに対する反応性が低いのみならず、M1よりもさらに、プロリンに対する反応性が低減されていた（図３－５）。
　なお、クレアチニン５．０ｍｇ／ｄＬの反応性を改変ザルコシンオキシダーゼM4と改変前のザルコシンオキシダーゼ（配列番号１）と用いた試薬で比較したところ、改変の前後で反応性は変わらなかった。よって、改変ザルコシンオキシダーゼM4は改変前のザルコシンオキシダーゼと比べ、反応が変わらず、プロリンの影響が抑えられていることが分かった。
配列の簡単な説明
配列番号１：Bacillus NS-129由来の野生型ザルコシンオキシダーゼ
配列番号２：改変型ザルコシンオキシダーゼM1（K320N/E324G/Y222H/F348Y/A314S）
配列番号３：改変型ザルコシンオキシダーゼM2（K320N/E324G/F260I）
配列番号４：改変型ザルコシンオキシダーゼM3（K320N/E324G/F260I/Y222A）
配列番号５：エラープローンPCR用N末端側配列atgagcacgcattttgacgta
配列番号６：エラープローンPCR用C末端側配列ttattttactgcttctttttttaatgcatc
配列番号７－２１：変異導入用プライマー
配列番号２２：改変型ザルコシンオキシダーゼM4（K320N/E324G/Y222H/A314S/F343G）
配列番号２３－２４：変異導入用プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　下記の性質を有する改変型ザルコシンオキシダーゼ、
    （ａ）作用：１モルのザルコシンを加水分解し、１モルのグリシン及び１モルのホルムアルデヒドを生成する、並びに
    （ｂ）基質特異性：ザルコシンに対する活性を１００％として、L-プロリンに対する相対活性が、０．２３％以下である。
  2. 　以下から選択される改変型ザルコシンオキシダーゼ、
    （ａ）ザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした際に、以下の(i)～(vi)の少なくとも１か所の部位が下記のアミノ酸に置換され、L-プロリンに対する相対活性が低下したザルコシンオキシダーゼ、すなわち、配列番号１の
    　(i)３２０位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、
    　(ii)３２４位に相当する位置のアミノ酸がグリシンであり、
    　(iii)３４８位に相当する位置のアミノ酸がチロシンであり、
    　(iv)２２２位に相当する位置のアミノ酸がアラニン若しくはヒスチジンであり、
    　(v)２６０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、かつ／又は
    　(vi)３１４位に相当する位置のアミノ酸がセリンであり、
    L-プロリンに対して相対活性が野生型よりも低下したザルコシンオキシダーゼ、
    （ｂ－１）前記（ａ）におけるアミノ酸置換を１以上有し、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
    （ｂ－２）前記（ａ）におけるアミノ酸置換を１以上有し、配列番号１のアミノ酸配列と７５％以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号１の６～８６位、８８～９２位、９４～９７位、１０１～１０２位、１０４～１０９位、１１２～１１４位、１１８位、１２０～１２１位、１２７～１２８位、１３０～１３１位、１３３～１３４位、１３６～１３７位、１３９～１４２位、１４４～１５４位、１５６～１６６位、１６８～１７８位、１８１～１８２位、１８４位、１８６位、１８８～１８９位、１９１～１９２位、１９４～１９５位、１９７～２１３位、２１６～２３３位、２３５～２３８位、２４２～２４９位、２５２～２６２位、２６４～２７０位、２７２～２７４位、２７６～２８６位、２８８～２９２位、２９４位、２９６～３００位、３０２～３０６位、３０８～３１１位、３１３～３３２位、３３５～３５８位、３６０～３６２位、３６４～３７５位、３７７～３７８位、及び３８０～３８２位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
    （ｃ－１）配列番号２、３、又は４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
    （ｃ－２）配列番号２、３、又は４のアミノ酸配列と７５％以上の全長アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、さらに、配列番号１の６～８６位、８８～９２位、９４～９７位、１０１～１０２位、１０４～１０９位、１１２～１１４位、１１８位、１２０～１２１位、１２７～１２８位、１３０～１３１位、１３３～１３４位、１３６～１３７位、１３９～１４２位、１４４～１５４位、１５６～１６６位、１６８～１７８位、１８１～１８２位、１８４位、１８６位、１８８～１８９位、１９１～１９２位、１９４～１９５位、１９７～２１３位、２１６～２３３位、２３５～２３８位、２４２～２４９位、２５２～２６２位、２６４～２７０位、２７２～２７４位、２７６～２８６位、２８８～２９２位、２９４位、２９６～３００位、３０２～３０６位、３０８～３１１位、３１３～３３２位、３３５～３５８位、３６０～３６２位、３６４～３７５位、３７７～３７８位、及び３８０～３８２位からなる相同性領域と、当該改変型ザルコシンオキシダーゼのそれぞれ対応する位置からなる相同性領域とが９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、改変型ザルコシンオキシダーゼ、
    （ｄ）配列番号２、３、４又は２２のアミノ酸配列を含むタンパク質、或いは
    （ｅ）配列番号２、３、４又は２２のアミノ酸配列において、配列番号１の２２２位、２６０位、３１４位、３２０位、３２４位、３４３位及び３４８位に相当する位置以外の位置において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、L-プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　配列番号１のアミノ酸配列の３２０位に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、３２４位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、請求項１又は２に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
  4. 　さらに、配列番号１の３４８位に相当する位置のアミノ酸がチロシンである、請求項３に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
  5. 　さらに、配列番号１の２２２位に相当する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、請求項３又は４に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
  6. 　さらに、配列番号１の２６０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンである、請求項３～５のいずれか１項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
  7. 　さらに、配列番号１の３１４位に相当する位置のアミノ酸がセリンである、請求項３～６のいずれか１項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
  8. 　さらに、配列番号１の３４３位に相当する位置のアミノ酸がグリシンである、請求項３～７のいずれか１項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
  9. 　請求項２～８のいずれか１項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼをコードするザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターを含む、組み換え体ＤＮＡ。
  10. 　請求項９記載の組み換え体ＤＮＡを含む、形質転換体又は形質導入体。
  11. 　請求項１０記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取する工程を含む、改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。
  12. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含む、クレアチニン測定試薬。
  13. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の改変型ザルコシンオキシダーゼ、又は請求項１２に記載の測定試薬を用いたクレアチニン測定方法。
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