JP2004159565A - 基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 - Google Patents
基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004159565A JP2004159565A JP2002329427A JP2002329427A JP2004159565A JP 2004159565 A JP2004159565 A JP 2004159565A JP 2002329427 A JP2002329427 A JP 2002329427A JP 2002329427 A JP2002329427 A JP 2002329427A JP 2004159565 A JP2004159565 A JP 2004159565A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sarcosine oxidase
- sarcosine
- proline
- oxidase
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Abstract
【課題】本発明は、プロリンに対する反応性の小さい、基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼを提供することを目的とする。
【解決手段】３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．７％以下、Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：１５０ｍＭ以上、の少なくともいずれか一方の特性を有するザルコシンオキシダーゼ、該ザルコシンオキシダーゼの生産能を有する微生物を培養し、該培養物からザルコシンオキシダーゼを採取する基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼの製造法、該ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定用試薬、クレアチン測定用試薬。
【解決手段】３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．７％以下、Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：１５０ｍＭ以上、の少なくともいずれか一方の特性を有するザルコシンオキシダーゼ、該ザルコシンオキシダーゼの生産能を有する微生物を培養し、該培養物からザルコシンオキシダーゼを採取する基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼの製造法、該ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定用試薬、クレアチン測定用試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−プロリンに対する作用性の小さい、基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼとその製造法、および該ザルコシンオキシダーゼを含む試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ザルコシンオキシダーゼ（ＥＣ １．５．３．１）は、臨床的に筋疾患，腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチン，クレアチニンの測定用酵素として、他の酵素、例えばクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ペルオキシダーゼと共に使用されている。ザルコシンオキシダーゼは基質であるザルコシンに水、酸素の存在下で作用して、グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。
【０００３】
このようなザルコシンオキシダーゼは、バチルス属（特開昭５４−５２７８９号公報、特開昭６１−１６２１７４号公報）、コリネバクテリウム属（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８９， ５９９ （１９８１））、シリンドロカルポン属（特開昭５６−９２７９０号公報）、シュードモナス属（特開昭６０−４３３７９号公報）、アースロバクター属（特開平２−２６５４７８号公報）等の細菌が生産することが知られている。また、これら生産菌のザルコシンオキシダーゼ遺伝子を、遺伝子工学的手法により、大腸菌等の宿主を用いた大量生産する技術についても報告されている（特開平５−１１５２８１号公報、特開平６−１１３８４０号公報、特開平８−２３８０８７号公報）。
【０００４】
しかしながら、従来のザルコシンオキシダーゼは血中に存在するアミノ酸の１種であるプロリンに対しても作用することが知られており、クレアチニン、クレアチンの測定の際に正誤差を生じる原因となり得ることが指摘されている（臨床化学、２０，１４４−１５２（１９９１）、生物試料分析、１７，３３２−３３７（１９９４））。この問題を解消するために、我々のグループは野生型ザルコシンオキシダーゼを蛋白質工学的に改変し、プロリンに対する作用性を低下させたザルコシンオキシダーゼ（特開平１０−２４８５７２号公報）を報告したが、本来の基質であるザルコシンに対する作用性等ついては不明であり、更なる改良が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、プロリンに対する反応性の小さい、基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、ザルコシンに対する高い親和性を保持し、且つＬ−プロリンに対する作用性に小さいザルコシンオキシダーゼを造成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成から成る。
（１）３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、下記の少なくともいずれか一方の特性を有することを特徴とするザルコシンオキシダーゼ。
Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．７％以下
Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：１５０ｍＭ以上
（２）３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、下記の少なくともいずれか一方の特性を有することを特徴とするザルコシンオキシダーゼ。
Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．５％以下
Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：２００ｍＭ以上
（３）ザルコシンに対するＫｍ値が１０ｍＭ以下である、（１）又は（２）記載のザルコシンオキシダーゼ。
（４）ザルコシンに対するＫｍ値が５ｍＭ以下である、（１）又は（２）記載のザルコシンオキシダーゼ。
（５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載されるザルコシンオキシダーゼの生産能を有する微生物を培養し、該培養物からザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼの製造法
（６）（１）〜（４）のいずれか１つに記載されるザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定用試薬。
（７）（１）〜（４）のいずれか１つに記載されるザルコシンオキシダーゼを含むクレアチン測定用試薬。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、臨床検査分野におけるクレアチン、クレアチニンの分析に有用である。
本発明のザルコシンオキシダーゼは、プロリンに対する作用性が本来の基質であるザルコシンに比べて十分に小さいことを特徴とする。プロリンに対する作用性は、ザルコシンを基質とした際の酵素活性に対する、Ｌ−プロリンを基質とした際の酵素活性の相対比（％）より求めることができる。本願発明のザルコシンオキシダーゼは、Ｌ−プロリンに対する作用性がザルコシンに対する作用性の０．７％以下、好ましくは０．５％以下である。
【０００９】
また、本発明のザルコシンオキシダーゼは、プロリンに対するＫｍ値（ミカエリス−メンテナンス定数）が高く、クレアチニンやクレアチン測定用試薬に適用した場合、検体中のプロリンの影響を受けにくい。本願発明のザルコシンオキシダーゼは、Ｌ−プロリンに対するＫｍ値は１５０ｍＭ以上、好ましくは２００ｍＭ以上である。
【００１０】
更に、本願発明のザルコシンオキシダーゼは、測定試薬の必要添加量を抑えて、基質特異性の高さを活かすという観点から、ザルコシンに対するＫｍ値は好ましくは１０ｍＭ以下、更に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００１１】
本発明のザルコシンオキシダーゼは、上記の性質を有するものであれば、特に限定されるものではなく、例えば微生物や哺乳動物由来の酵素などを使用することができる。また、公知のザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学、蛋白質工学的技術を用いて改変した酵素、化学修飾により特性を改良した酵素も含まれる。
【００１２】
本発明では一例として、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（微工研菌寄第１０６３７号）のザルコシンオキシダーゼ（特開平２−２６５４７８号公報）を用いて、蛋白質工学的に改変した例を示す。本発明者らのグループは、既に、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６より抽出した染色体ＤＮＡよりザルコシンオキシダーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を決定し（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．７５ Ｎｏ．４ ｐｐ２３９−２４４ （１９９３）に記載）、本ザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なザルコシンオキシダーゼを安価に大量供給することを可能にしている（特開平６−１１３８４０号公報）。アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示す。また、これらのアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２に示す。
【００１３】
本発明のザルコシンオキシダーゼの製造方法は特に限定されないが、公知の酵素を蛋白質工学的手法を用いて改良する場合、以下に示すような手順で製造することが可能である。ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００１４】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００１５】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコ−ス，シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００１６】
また、本発明のザルコシンオキシダーゼを野生型酵素として保有する微生物であれば、各微生物の生育に適した培養条件で、適当な栄養培地を用いて培養して採取することができる。この際、該酵素の発現を誘導させるために、培地中にザルコシンやクレアチン、ジメチルグリシンなどを適量添加することが望ましい。
【００１７】
上記培養物中の、ザルコシンオキシダーゼをを含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って該酵素が培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、該酵素質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ザルコシンオキシダーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して該酵素を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００１８】
この様にして得られた粗抽出溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたザルコシンオキシダーゼを得ることができる。
【００１９】
本発明のクレアチン測定試薬は、上記プロリンに対する基質特異性が小さいザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、および過酸化水素検出試薬を含む。また、クレアチニン測定試薬は、上記プロリンに対する基質特異性が小さいザルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、および過酸化水素検出試薬を含む。過酸化水素検出試薬とは、ザルコシンオキシダーゼにより生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で、生成色素として測定する試薬であり、酸化系発色試薬及び必要に応じて４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどのカップラーである。本発明の過酸化水素測定試薬は、各種の市販のものなどを用いることができるが、特に限定されるものではない。更に上記のクレアチンまたはクレアチニン測定試薬は、金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖類、有機酸などを安定化剤として使用することもできる。試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で防腐剤や界面活性剤を添加してもよい。また通常、適当な緩衝液と共に使用される。緩衝液の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択されるが、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時のｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されることが好ましい
【００２０】
本発明において、ザルコシンオキシダーゼ活性の測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（２００ｍＭ ザルコシンおよび０．１％ トリト
ンＸ−１００を含む）
０．１％ ４−アミノアンチピリン
０．１％ フェノール
２５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
＜測定条件＞
上記トリス塩酸緩衝液、４−アミノアンチピリン溶液、フェノール溶液、ペルオキシダーゼ溶液を５：１：２：２の比率で混合し反応混液を調製する。反応混液１ｍｌを試験管に採り、３７℃で約５分間中予備加温した後、酵素溶液０．０５ｍｌを添加し、反応を開始させる。３７℃で正確に１０分間反応させた後、０．２５％ＳＤＳ水溶液２．０ｍｌを加えて反応を停止させ、この液の５００ｎｍの吸光度を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様の操作で吸光度を測定する。上記条件下で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素量を１単位とする。また、プロリンに対する反応性は、上記試薬中のザルコシンを同じ濃度のＬ−プロリンに置き換えた場合の活性の相対比として測定した。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。たとえば、後述の実施例３で示された９種類の改変型ザルコシンオキシダーゼのうち、ＳＡＯＭ２は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の９４位のバリンがグリシンに置換された変異体であるが、該変異体の性能に実質的な影響を与えない範囲で、さらに、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもさしつかえない。ＳＡＯＭ２以外の変異体についても同様である。
【００２２】
実施例１ ザルコシンオキシダーゼの発現プラスミドの構築
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６由来ザルコシンオキシダーゼの発現プラスミドｐＳＡＯＥＰ３は、特開平７−１６３３４１記載の方法に従って構築した。本発現プラスミドは、ＰＵＣ１８のマルチクローニングサイトに、ＴＥ１８２６のザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む約１．７Ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を含む。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるザルコシンオキシダーゼアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２３】
実施例２ 改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子の作製
ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＳＡＯＥＰ３と、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ１）を取得した。
ｐＳＡＯＥＰ３と、配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の９４番目のバリンがグリシンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ２）を取得した。
ｐＳＡＯＥＰ３と、配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２２番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ３）を取得した。
ｐＳＡＯＭ２と、配列表の配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の９４番目のバリンがグリシン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ４）を取得した。
ｐＳＡＯＭ４と、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ５）を取得した。
ｐＳＡＯＭ５と、配列表の配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ６）を取得した。
ｐＳＡＯＭ６と、配列表の配列番号８記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、２０４番目のメチオニンがアラニン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ７）を取得した。
ｐＳＡＯＭ７と、配列表の配列番号９記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、１６６番目のアスパラギンがリジン、２０４番目のメチオニンがアラニン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ８）を取得した。
ｐＳＡＯＭ８と、配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、１６６番目のアスパラギンがリジン、２０４番目のメチオニンがアラニン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミン、３２２番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ９）を取得した。
【００２４】
実施例３ 改変型ザルコシンオキシダーゼの作製
ｐＳＡＯＭ１、ｐＳＡＯＭ２、ｐＳＡＯＭ３、ｐＳＡＯＭ４、ｐＳＡＯＭ５、ｐＳＡＯＭ６、ｐＳＡＯＭ７、ｐＳＡＯＭ８、ｐＳＡＯＭ９の各組み換えプラスミドでエシェリヒアコリーＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
４００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを１００μｌ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒアコリーＪＭ１０９（ｐＳＡＯＭ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養した。培養終了時のザルコシンオキシダーゼ活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約９．５Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス製）、更に熱処理により分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。また、この変異体をＳＡＯＭ１と命名した。
ｐＳＡＯＭ２、ｐＳＡＯＭ３、ｐＳＡＯＭ４、ｐＳＡＯＭ５、ｐＳＡＯＭ６、ｐＳＡＯＭ７、ｐＳＡＯＭ８、ｐＳＡＯＭ９の各組み換えプラスミドによるエシェリヒアコリーＪＭ１０９形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。得られた酵素標品をそれぞれＳＡＯＭ２、ＳＡＯＭ３、ＳＡＯＭ４、ＳＡＯＭ５、ＳＡＯＭ６、ＳＡＯＭ７、ＳＡＯＭ８、ＳＡＯＭ９と命名した。
【００２５】
比較例１ 野生型ザルコシンオキシダーゼの作製
比較例として、ｐＳＡＯＥＰ３によるエシェリヒアコリーＪＭ１０９形質転換体について、上記方法と同様にして、改変前の精製酵素標品を取得した。
【００２６】
実施例４ 改変型ザルコシンオキシダーゼの評価
実施例３および比較例１で取得した各種ザルコシンオキシダーゼについて評価を実施した。
プロリン作用性は、上記活性測定法により、ザルコシンを基質とした際の酵素活性に対する、Ｌ−プロリンを基質とした際の酵素活性の相対比（％）より求めた。また、ザルコシンおよびＬ−プロリンに対するＫｍ値は、上記活性測定法の基質濃度を変化させて測定した。その結果を表１に示す。表１から判るように、改変型ザルコシンオキシダーゼは、プロリンに対する反応性が０．７％以下、若しくはＬ−プロリンに対するＫｍ値は１５０ｍＭ以上の少なくともいずれか一方を特性を有することが示された。
【００２７】
【表１】
【００２８】
実施例６ クレアチニンの測定試薬におけるプロリンの影響
実施例３および比較例１で取得した各種ザルコシンオキシダーゼを、クレアチニン測定試薬に適応した際のプロリンの影響度を評価した。１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（実施例３および比較例１で調整したもの）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニ水素ニナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００、０．０２％（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）、１００Ｕ／ｍｌクレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡製；ＣＮＨ−２１１）、５０Ｕ／ｍｌクレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製；ＣＲＨ−２２１）、１０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製；ＰＥＯ−３０１）を含む５０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌに、５ｍｇ／ｄｌクレアチニン水溶液１０μｌを加えて、３７℃で５分間反応させ、５４６ｎｍの吸光度変化をＨＩＴＡＣＨＩ７０６０型自動分析装置を用いて測定した。また、クレアチニン水溶液の代わりに１００ｍｇ／ｄｌＬ−プロリン水溶液を用いて、上記と同様の操作で吸光度変化を測定した。プロリンの影響度は、クレアチニンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加に対する、Ｌ−プロリンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加の相対比（％）より求めた。その結果を表２に示す。表２から判るように、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼを、クレアチニン測定試薬に用いることで、該試薬のプロリンの影響度が低減していることが確認された。
【００２９】
【表２】
【００３０】
実施例７ クレアチンの測定試薬におけるプロリンの影響
実施例３および比較例１で取得した各種ザルコシンオキシダーゼを、クレアチン測定試薬に適応した際のプロリンの影響度を評価した。１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（実施例３および比較例１で調整したもの）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニ水素ニナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００、０．０２％（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）、５０Ｕ／ｍｌクレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製；ＣＲＨ−２２１）、１０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製；ＰＥＯ−３０１）を含む５０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌに、５ｍｇ／ｄｌクレアチン水溶液１０μｌを加えて、３７℃で５分間反応させ、５４６ｎｍの吸光度変化をＨＩＴＡＣＨＩ７０６０型自動分析装置を用いて測定した。また、クレアチン水溶液の代わりに１００ｍｇ／ｄｌＬ−プロリン水溶液を用いて、上記と同様の操作で吸光度変化を測定した。プロリンの影響度は、クレアチンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加に対する、Ｌ−プロリンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加の相対比（％）より求めた。その結果を表３に示す。表３から判るように、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼを、クレアチン測定試薬に用いることで、該試薬のプロリンの影響度が低減していることが確認された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によって、Ｌ−プロリンに対する作用性の小さい、基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼを供給することが可能となった。本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼを、臨床的に筋疾患，腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチン，クレアチニンの測定用酵素として使用することで、共存物質の影響を受けにくい、正確なクレアチン，クレアチニン測定が可能である。
【００３２】
【表３】
【００３３】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−プロリンに対する作用性の小さい、基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼとその製造法、および該ザルコシンオキシダーゼを含む試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ザルコシンオキシダーゼ（ＥＣ １．５．３．１）は、臨床的に筋疾患，腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチン，クレアチニンの測定用酵素として、他の酵素、例えばクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ペルオキシダーゼと共に使用されている。ザルコシンオキシダーゼは基質であるザルコシンに水、酸素の存在下で作用して、グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。
【０００３】
このようなザルコシンオキシダーゼは、バチルス属（特開昭５４−５２７８９号公報、特開昭６１−１６２１７４号公報）、コリネバクテリウム属（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８９， ５９９ （１９８１））、シリンドロカルポン属（特開昭５６−９２７９０号公報）、シュードモナス属（特開昭６０−４３３７９号公報）、アースロバクター属（特開平２−２６５４７８号公報）等の細菌が生産することが知られている。また、これら生産菌のザルコシンオキシダーゼ遺伝子を、遺伝子工学的手法により、大腸菌等の宿主を用いた大量生産する技術についても報告されている（特開平５−１１５２８１号公報、特開平６−１１３８４０号公報、特開平８−２３８０８７号公報）。
【０００４】
しかしながら、従来のザルコシンオキシダーゼは血中に存在するアミノ酸の１種であるプロリンに対しても作用することが知られており、クレアチニン、クレアチンの測定の際に正誤差を生じる原因となり得ることが指摘されている（臨床化学、２０，１４４−１５２（１９９１）、生物試料分析、１７，３３２−３３７（１９９４））。この問題を解消するために、我々のグループは野生型ザルコシンオキシダーゼを蛋白質工学的に改変し、プロリンに対する作用性を低下させたザルコシンオキシダーゼ（特開平１０−２４８５７２号公報）を報告したが、本来の基質であるザルコシンに対する作用性等ついては不明であり、更なる改良が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、プロリンに対する反応性の小さい、基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、ザルコシンに対する高い親和性を保持し、且つＬ−プロリンに対する作用性に小さいザルコシンオキシダーゼを造成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成から成る。
（１）３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、下記の少なくともいずれか一方の特性を有することを特徴とするザルコシンオキシダーゼ。
Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．７％以下
Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：１５０ｍＭ以上
（２）３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、下記の少なくともいずれか一方の特性を有することを特徴とするザルコシンオキシダーゼ。
Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．５％以下
Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：２００ｍＭ以上
（３）ザルコシンに対するＫｍ値が１０ｍＭ以下である、（１）又は（２）記載のザルコシンオキシダーゼ。
（４）ザルコシンに対するＫｍ値が５ｍＭ以下である、（１）又は（２）記載のザルコシンオキシダーゼ。
（５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載されるザルコシンオキシダーゼの生産能を有する微生物を培養し、該培養物からザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼの製造法
（６）（１）〜（４）のいずれか１つに記載されるザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定用試薬。
（７）（１）〜（４）のいずれか１つに記載されるザルコシンオキシダーゼを含むクレアチン測定用試薬。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、臨床検査分野におけるクレアチン、クレアチニンの分析に有用である。
本発明のザルコシンオキシダーゼは、プロリンに対する作用性が本来の基質であるザルコシンに比べて十分に小さいことを特徴とする。プロリンに対する作用性は、ザルコシンを基質とした際の酵素活性に対する、Ｌ−プロリンを基質とした際の酵素活性の相対比（％）より求めることができる。本願発明のザルコシンオキシダーゼは、Ｌ−プロリンに対する作用性がザルコシンに対する作用性の０．７％以下、好ましくは０．５％以下である。
【０００９】
また、本発明のザルコシンオキシダーゼは、プロリンに対するＫｍ値（ミカエリス−メンテナンス定数）が高く、クレアチニンやクレアチン測定用試薬に適用した場合、検体中のプロリンの影響を受けにくい。本願発明のザルコシンオキシダーゼは、Ｌ−プロリンに対するＫｍ値は１５０ｍＭ以上、好ましくは２００ｍＭ以上である。
【００１０】
更に、本願発明のザルコシンオキシダーゼは、測定試薬の必要添加量を抑えて、基質特異性の高さを活かすという観点から、ザルコシンに対するＫｍ値は好ましくは１０ｍＭ以下、更に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００１１】
本発明のザルコシンオキシダーゼは、上記の性質を有するものであれば、特に限定されるものではなく、例えば微生物や哺乳動物由来の酵素などを使用することができる。また、公知のザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学、蛋白質工学的技術を用いて改変した酵素、化学修飾により特性を改良した酵素も含まれる。
【００１２】
本発明では一例として、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（微工研菌寄第１０６３７号）のザルコシンオキシダーゼ（特開平２−２６５４７８号公報）を用いて、蛋白質工学的に改変した例を示す。本発明者らのグループは、既に、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６より抽出した染色体ＤＮＡよりザルコシンオキシダーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を決定し（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．７５ Ｎｏ．４ ｐｐ２３９−２４４ （１９９３）に記載）、本ザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なザルコシンオキシダーゼを安価に大量供給することを可能にしている（特開平６−１１３８４０号公報）。アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示す。また、これらのアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２に示す。
【００１３】
本発明のザルコシンオキシダーゼの製造方法は特に限定されないが、公知の酵素を蛋白質工学的手法を用いて改良する場合、以下に示すような手順で製造することが可能である。ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００１４】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００１５】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコ−ス，シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００１６】
また、本発明のザルコシンオキシダーゼを野生型酵素として保有する微生物であれば、各微生物の生育に適した培養条件で、適当な栄養培地を用いて培養して採取することができる。この際、該酵素の発現を誘導させるために、培地中にザルコシンやクレアチン、ジメチルグリシンなどを適量添加することが望ましい。
【００１７】
上記培養物中の、ザルコシンオキシダーゼをを含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って該酵素が培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、該酵素質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ザルコシンオキシダーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して該酵素を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００１８】
この様にして得られた粗抽出溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたザルコシンオキシダーゼを得ることができる。
【００１９】
本発明のクレアチン測定試薬は、上記プロリンに対する基質特異性が小さいザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、および過酸化水素検出試薬を含む。また、クレアチニン測定試薬は、上記プロリンに対する基質特異性が小さいザルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、および過酸化水素検出試薬を含む。過酸化水素検出試薬とは、ザルコシンオキシダーゼにより生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で、生成色素として測定する試薬であり、酸化系発色試薬及び必要に応じて４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどのカップラーである。本発明の過酸化水素測定試薬は、各種の市販のものなどを用いることができるが、特に限定されるものではない。更に上記のクレアチンまたはクレアチニン測定試薬は、金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖類、有機酸などを安定化剤として使用することもできる。試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で防腐剤や界面活性剤を添加してもよい。また通常、適当な緩衝液と共に使用される。緩衝液の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択されるが、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時のｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されることが好ましい
【００２０】
本発明において、ザルコシンオキシダーゼ活性の測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（２００ｍＭ ザルコシンおよび０．１％ トリト
ンＸ−１００を含む）
０．１％ ４−アミノアンチピリン
０．１％ フェノール
２５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
＜測定条件＞
上記トリス塩酸緩衝液、４−アミノアンチピリン溶液、フェノール溶液、ペルオキシダーゼ溶液を５：１：２：２の比率で混合し反応混液を調製する。反応混液１ｍｌを試験管に採り、３７℃で約５分間中予備加温した後、酵素溶液０．０５ｍｌを添加し、反応を開始させる。３７℃で正確に１０分間反応させた後、０．２５％ＳＤＳ水溶液２．０ｍｌを加えて反応を停止させ、この液の５００ｎｍの吸光度を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様の操作で吸光度を測定する。上記条件下で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素量を１単位とする。また、プロリンに対する反応性は、上記試薬中のザルコシンを同じ濃度のＬ−プロリンに置き換えた場合の活性の相対比として測定した。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。たとえば、後述の実施例３で示された９種類の改変型ザルコシンオキシダーゼのうち、ＳＡＯＭ２は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列の９４位のバリンがグリシンに置換された変異体であるが、該変異体の性能に実質的な影響を与えない範囲で、さらに、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもさしつかえない。ＳＡＯＭ２以外の変異体についても同様である。
【００２２】
実施例１ ザルコシンオキシダーゼの発現プラスミドの構築
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６由来ザルコシンオキシダーゼの発現プラスミドｐＳＡＯＥＰ３は、特開平７−１６３３４１記載の方法に従って構築した。本発現プラスミドは、ＰＵＣ１８のマルチクローニングサイトに、ＴＥ１８２６のザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む約１．７Ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を含む。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるザルコシンオキシダーゼアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２３】
実施例２ 改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子の作製
ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＳＡＯＥＰ３と、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ１）を取得した。
ｐＳＡＯＥＰ３と、配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の９４番目のバリンがグリシンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ２）を取得した。
ｐＳＡＯＥＰ３と、配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２２番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ３）を取得した。
ｐＳＡＯＭ２と、配列表の配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の９４番目のバリンがグリシン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ４）を取得した。
ｐＳＡＯＭ４と、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ５）を取得した。
ｐＳＡＯＭ５と、配列表の配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ６）を取得した。
ｐＳＡＯＭ６と、配列表の配列番号８記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、２０４番目のメチオニンがアラニン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ７）を取得した。
ｐＳＡＯＭ７と、配列表の配列番号９記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、１６６番目のアスパラギンがリジン、２０４番目のメチオニンがアラニン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ８）を取得した。
ｐＳＡＯＭ８と、配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の操作により、配列番号１記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがアルギニン、９４番目のバリンがグリシン、１６６番目のアスパラギンがリジン、２０４番目のメチオニンがアラニン、２１３番目のセリンがプロリン、２５０番目のグルタミン酸がグルタミン、３２２番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ザルコシンオキシダーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＳＡＯＭ９）を取得した。
【００２４】
実施例３ 改変型ザルコシンオキシダーゼの作製
ｐＳＡＯＭ１、ｐＳＡＯＭ２、ｐＳＡＯＭ３、ｐＳＡＯＭ４、ｐＳＡＯＭ５、ｐＳＡＯＭ６、ｐＳＡＯＭ７、ｐＳＡＯＭ８、ｐＳＡＯＭ９の各組み換えプラスミドでエシェリヒアコリーＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
４００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを１００μｌ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒアコリーＪＭ１０９（ｐＳＡＯＭ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養した。培養終了時のザルコシンオキシダーゼ活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約９．５Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス製）、更に熱処理により分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。また、この変異体をＳＡＯＭ１と命名した。
ｐＳＡＯＭ２、ｐＳＡＯＭ３、ｐＳＡＯＭ４、ｐＳＡＯＭ５、ｐＳＡＯＭ６、ｐＳＡＯＭ７、ｐＳＡＯＭ８、ｐＳＡＯＭ９の各組み換えプラスミドによるエシェリヒアコリーＪＭ１０９形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。得られた酵素標品をそれぞれＳＡＯＭ２、ＳＡＯＭ３、ＳＡＯＭ４、ＳＡＯＭ５、ＳＡＯＭ６、ＳＡＯＭ７、ＳＡＯＭ８、ＳＡＯＭ９と命名した。
【００２５】
比較例１ 野生型ザルコシンオキシダーゼの作製
比較例として、ｐＳＡＯＥＰ３によるエシェリヒアコリーＪＭ１０９形質転換体について、上記方法と同様にして、改変前の精製酵素標品を取得した。
【００２６】
実施例４ 改変型ザルコシンオキシダーゼの評価
実施例３および比較例１で取得した各種ザルコシンオキシダーゼについて評価を実施した。
プロリン作用性は、上記活性測定法により、ザルコシンを基質とした際の酵素活性に対する、Ｌ−プロリンを基質とした際の酵素活性の相対比（％）より求めた。また、ザルコシンおよびＬ−プロリンに対するＫｍ値は、上記活性測定法の基質濃度を変化させて測定した。その結果を表１に示す。表１から判るように、改変型ザルコシンオキシダーゼは、プロリンに対する反応性が０．７％以下、若しくはＬ−プロリンに対するＫｍ値は１５０ｍＭ以上の少なくともいずれか一方を特性を有することが示された。
【００２７】
【表１】
実施例６ クレアチニンの測定試薬におけるプロリンの影響
実施例３および比較例１で取得した各種ザルコシンオキシダーゼを、クレアチニン測定試薬に適応した際のプロリンの影響度を評価した。１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（実施例３および比較例１で調整したもの）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニ水素ニナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００、０．０２％（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）、１００Ｕ／ｍｌクレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡製；ＣＮＨ−２１１）、５０Ｕ／ｍｌクレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製；ＣＲＨ−２２１）、１０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製；ＰＥＯ−３０１）を含む５０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌに、５ｍｇ／ｄｌクレアチニン水溶液１０μｌを加えて、３７℃で５分間反応させ、５４６ｎｍの吸光度変化をＨＩＴＡＣＨＩ７０６０型自動分析装置を用いて測定した。また、クレアチニン水溶液の代わりに１００ｍｇ／ｄｌＬ−プロリン水溶液を用いて、上記と同様の操作で吸光度変化を測定した。プロリンの影響度は、クレアチニンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加に対する、Ｌ−プロリンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加の相対比（％）より求めた。その結果を表２に示す。表２から判るように、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼを、クレアチニン測定試薬に用いることで、該試薬のプロリンの影響度が低減していることが確認された。
【００２９】
【表２】
実施例７ クレアチンの測定試薬におけるプロリンの影響
実施例３および比較例１で取得した各種ザルコシンオキシダーゼを、クレアチン測定試薬に適応した際のプロリンの影響度を評価した。１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（実施例３および比較例１で調整したもの）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニ水素ニナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００、０．０２％（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）、５０Ｕ／ｍｌクレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製；ＣＲＨ−２２１）、１０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製；ＰＥＯ−３０１）を含む５０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌに、５ｍｇ／ｄｌクレアチン水溶液１０μｌを加えて、３７℃で５分間反応させ、５４６ｎｍの吸光度変化をＨＩＴＡＣＨＩ７０６０型自動分析装置を用いて測定した。また、クレアチン水溶液の代わりに１００ｍｇ／ｄｌＬ−プロリン水溶液を用いて、上記と同様の操作で吸光度変化を測定した。プロリンの影響度は、クレアチンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加に対する、Ｌ−プロリンを基質にした際に生じる反応５分間の吸光度増加の相対比（％）より求めた。その結果を表３に示す。表３から判るように、本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼを、クレアチン測定試薬に用いることで、該試薬のプロリンの影響度が低減していることが確認された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によって、Ｌ−プロリンに対する作用性の小さい、基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼを供給することが可能となった。本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼを、臨床的に筋疾患，腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチン，クレアチニンの測定用酵素として使用することで、共存物質の影響を受けにくい、正確なクレアチン，クレアチニン測定が可能である。
【００３２】
【表３】
【配列表】
Claims (7)
- ３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、下記の少なくともいずれか一方の特性を有することを特徴とするザルコシンオキシダーゼ。
Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．７％以下
Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：１５０ｍＭ以上 - ３７℃、ｐＨ８．０の測定条件下で、下記の少なくともいずれか一方の特性を有することを特徴とするザルコシンオキシダーゼ。
Ｌ−プロリンに対する作用性：ザルコシン対して０．５％以下
Ｌ−プロリンに対するＫｍ値：２００ｍＭ以上 - ザルコシンに対するＫｍ値が１０ｍＭ以下である、請求項１又は２記載のザルコシンオキシダーゼ。
- ザルコシンに対するＫｍ値が５ｍＭ以下である、請求項１又は２記載のザルコシンオキシダーゼ。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載されるザルコシンオキシダーゼの生産能を有する微生物を培養し、該培養物からザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼの製造法
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載されるザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定用試薬。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載されるザルコシンオキシダーゼを含むクレアチン測定用試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002329427A JP2004159565A (ja) | 2002-11-13 | 2002-11-13 | 基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 |
| US10/534,583 US7229812B2 (en) | 2002-11-13 | 2003-11-13 | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
| AU2003284548A AU2003284548A1 (en) | 2002-11-13 | 2003-11-13 | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
| EP03774008.1A EP1561812B1 (en) | 2002-11-13 | 2003-11-13 | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
| CN200380103232.XA CN1711353B (zh) | 2002-11-13 | 2003-11-13 | 修饰的肌氨酸氧化酶,制备方法及其试剂组合物 |
| PCT/JP2003/014423 WO2004044193A1 (ja) | 2002-11-13 | 2003-11-13 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002329427A JP2004159565A (ja) | 2002-11-13 | 2002-11-13 | 基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004159565A true JP2004159565A (ja) | 2004-06-10 |
Family
ID=32807430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002329427A Withdrawn JP2004159565A (ja) | 2002-11-13 | 2002-11-13 | 基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004159565A (ja) |
| CN (1) | CN1711353B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7090547B2 (ja) * | 2016-09-15 | 2022-06-24 | キッコーマン株式会社 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法 |
| CN110029094B (zh) * | 2019-03-01 | 2020-11-17 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种突变的肌氨酸氧化酶及其在肌酐检测中的应用 |
| CN109957538A (zh) * | 2019-04-04 | 2019-07-02 | 大连大学 | 一种制备肌氨酸氧化酶的基因工程菌及其制备方法和应用 |
| CN109957553A (zh) * | 2019-04-04 | 2019-07-02 | 大连大学 | 一种产肌氨酸氧化酶的芽孢杆菌的发酵产酶方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1285404A (zh) * | 1999-08-18 | 2001-02-28 | 国家人类基因组南方研究中心 | 人肌氨酸氧化酶及其编码序列 |
-
2002
- 2002-11-13 JP JP2002329427A patent/JP2004159565A/ja not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-11-13 CN CN200380103232.XA patent/CN1711353B/zh not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1711353A (zh) | 2005-12-21 |
| CN1711353B (zh) | 2010-05-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4214264B2 (ja) | 基質との親和性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、および、クレアチニン測定用試薬組成物 | |
| EP1367120A2 (en) | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability | |
| JP2004344145A (ja) | 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 | |
| JP2004159565A (ja) | 基質特異性に優れたザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物 | |
| JP2004313180A (ja) | 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 | |
| JP4890133B2 (ja) | 安定な尿酸測定試薬 | |
| JP4419044B2 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP3904098B2 (ja) | 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 | |
| JPWO2004074477A1 (ja) | ホモシステインの測定方法 | |
| JP2009072196A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| US7229812B2 (en) | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same | |
| JP2009055919A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP3743534B2 (ja) | 新規な塩素イオン測定方法およびその試薬 | |
| JP2004313172A (ja) | 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 | |
| JP3743535B2 (ja) | 改変ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2004242526A (ja) | 安定化されたザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2001120273A (ja) | タンパク質の改変方法および改変タンパク質 | |
| JP2009095348A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2009055917A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2009055916A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2009055918A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP4066203B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
| JP2009034112A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2009022303A (ja) | 安定化されたザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2009055914A (ja) | 安定化されたザルコシンオキシダーゼ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051018 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20080918 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Effective date: 20081117 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 |