JPWO2004074477A1 - ホモシステインの測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の方法は、試料中のホモシステインを検出または測定する方法であって、（ａ）試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程；（ｂ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程；（ｃ）該還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程；および（ｄ）該生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程を含む。
Description
本発明は、試料中のホモシステインを検出または測定する方法に関する。より詳細には、試料中に存在するＤ−アミノ酸を予め除去する工程を含む、ホモシステインの測定方法に関する。
ホモシステインを測定するための方法として、試料中のホモシステインにホモシステインメチルトランスフェラーゼおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを作用させた後、生成したＤ−メチオニンをＤ−アミノ酸オキシダーゼで検出する方法が報告されている（国際公開第０２／０２８０２号パンフレット参照）。しかし、生体試料中には少量ながらＤ−アラニンやＤ−セリンなどのＤ−アミノ酸が含まれており、これらは腎疾患等の場合に増加することが知られている（例えば、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９９５年，第１８巻，第８号，ｐ．１１３０−１１３２参照）。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの基質となり得るＤ−アラニンおよびＤ−セリンは、上記のホモシステインの測定方法では正の影響を及ぼすと考えられる。したがって、上記国際公開第０２／０２８０２号パンフレット中にも記載されているように、試料中に元来存在する内因性Ｄ−アミノ酸の影響を回避するためには、ホモシステインメチルトランスフェラーゼを含まないこと以外は全く同様に操作を行って測定し、その値を同酵素を含む場合の測定値から差し引く必要がある。すなわち、各試料についてそれぞれ別に検体ブランクを設け、内因性Ｄ−アミノ酸量を測定する必要があった。
本発明の目的は、内因性Ｄ−アミノ酸の影響を受けない、すなわち検体ブランクをとる必要のないホモシステインの測定方法を提供することにある。
上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、Ｄ−アラニンおよび／またはＤ−セリンを酵素作用によりホモシステイン測定原理の反応系外に導くことにより、内因性Ｄ−アミノ酸の影響を受けない、すなわち検体ブランクをとる必要のないホモシステインの測定方法を提供することが可能となった。
本発明は、試料中のホモシステインを検出または測定する方法を提供し、該方法は、（ａ）試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程；（ｂ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程；（ｃ）該還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程；および（ｄ）該生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、を含む。
好適な実施態様では、上記工程（ａ）は、試料中に存在するＤ−アラニンに、アデノシン三リン酸の存在下でＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（以下、Ｄｄｌともいう）を作用させてＤ−アラニル−Ｄ−アラニンに変換する工程および／または試料中に存在するＤ−セリンに、Ｄ−セリンデヒドラターゼ（以下、Ｄｓｄともいう）を作用させてピルビン酸に変換する工程である。
好適な実施態様では、上記メチル転移酵素は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして上記メチル供与体は、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムである。
好適な実施態様では、上記工程（ｄ）において、上記生成した過酸化水素を、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定する。
本発明はまた、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼおよび／またはＤ−セリンデヒドラターゼ；チオール化合物；メチル転移酵素；メチル供与体；Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ；ＳＨ試薬；および酸化系発色剤を含む、ホモシステイン測定用試薬キットを提供する。
本発明はさらに、試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程を含むことを特徴とする、試料中のホモシステインを検出または測定する方法を提供する。
上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、Ｄ−アラニンおよび／またはＤ−セリンを酵素作用によりホモシステイン測定原理の反応系外に導くことにより、内因性Ｄ−アミノ酸の影響を受けない、すなわち検体ブランクをとる必要のないホモシステインの測定方法を提供することが可能となった。
本発明は、試料中のホモシステインを検出または測定する方法を提供し、該方法は、（ａ）試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程；（ｂ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程；（ｃ）該還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程；および（ｄ）該生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、を含む。
好適な実施態様では、上記工程（ａ）は、試料中に存在するＤ−アラニンに、アデノシン三リン酸の存在下でＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（以下、Ｄｄｌともいう）を作用させてＤ−アラニル−Ｄ−アラニンに変換する工程および／または試料中に存在するＤ−セリンに、Ｄ−セリンデヒドラターゼ（以下、Ｄｓｄともいう）を作用させてピルビン酸に変換する工程である。
好適な実施態様では、上記メチル転移酵素は、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして上記メチル供与体は、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムである。
好適な実施態様では、上記工程（ｄ）において、上記生成した過酸化水素を、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定する。
本発明はまた、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼおよび／またはＤ−セリンデヒドラターゼ；チオール化合物；メチル転移酵素；メチル供与体；Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ；ＳＨ試薬；および酸化系発色剤を含む、ホモシステイン測定用試薬キットを提供する。
本発明はさらに、試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程を含むことを特徴とする、試料中のホモシステインを検出または測定する方法を提供する。
図１は、ホモシステイントランスフェラーゼおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いるホモシステイン測定の反応概略図である。
図２は、発現ベクターｐＫｄｌＡの構築を示す模式図である。
図３は、発現ベクターｐＫｄｌＢの構築を示す模式図である。
図４は、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ濃度とホモシステイン測定感度との関係を示すグラフである。
図５は、Ｄ−セリンデヒドラターゼ濃度とホモシステイン測定感度との関係を示すグラフである。
図６は、それぞれ（ａ）従来１チャンネル法、（ｂ）従来２チャンネル法、および（ｃ）本発明法によるホモシステイン測定濃度とＨＰＬＣ法による測定濃度との相関性を示すグラフである。
図２は、発現ベクターｐＫｄｌＡの構築を示す模式図である。
図３は、発現ベクターｐＫｄｌＢの構築を示す模式図である。
図４は、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ濃度とホモシステイン測定感度との関係を示すグラフである。
図５は、Ｄ−セリンデヒドラターゼ濃度とホモシステイン測定感度との関係を示すグラフである。
図６は、それぞれ（ａ）従来１チャンネル法、（ｂ）従来２チャンネル法、および（ｃ）本発明法によるホモシステイン測定濃度とＨＰＬＣ法による測定濃度との相関性を示すグラフである。
ホモシステインの測定原理：
本発明のホモシステインの測定方法は、試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理し、メチル供与体存在下でメチル転移酵素を作用させた（第一工程）後、生成するＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸誘導体を測定する（第二工程）という原理に基づく。例えば、図１に示すように、第一工程で生成したＤ−メチオニンに、第二工程においてＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させた場合には、過酸化水素が生成するため、これをＳＨ試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。また、Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させた場合には、生成するコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシンセターゼ［ＥＣ ６．２．１．３］およびアシルコエンザイムＡ酸化酵素［ＥＣ １．３．３．６］を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。
本発明のホモシステインを検出または測定する方法は、Ｄ−アミノ酸を測定するにおいて内因性のＤ−アミノ酸の影響を排除するために、まず最初に、試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換することを特徴とする。
具体的には、本発明のホモシステインの検出または測定方法は、
（ａ）試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質にならない物質に変換する工程；
（ｂ）試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程；
（ｃ）該還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程；および
（ｄ）該生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、を含む。
本発明の方法によって検出または測定され得る試料としては、ホモシステインを含むと考えられる試料であればいずれでもよい。また、ホモシステインの存在様式としては、還元型ホモシステインのみならず、蛋白結合型、ホモシステイン２量体、ホモシステイン−システイン２量体などジスルフィド結合で他の分子に結合した酸化型ホモシステインのいずれでもよい。例えば、血清、血漿、血液、尿、およびそれらの希釈物などが挙げられる。
（ａ）工程：
本発明の方法において使用されるＤ−アミノ酸変換酵素としては、Ｄ−アミノ酸に作用して、Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質にならない物質に変換してホモシステイン測定原理の反応系外に導くことのできるものであればよい。本発明においては、Ｄ−アラニンおよび／またはＤ−セリンに作用するものが好ましい。Ｄ−アラニンに作用する酵素としては、例えばＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ［ＥＣ ６．３．２．４］、Ｄ−アラニンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．２．７］、Ｄ−アラニン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．２．１４］などを使用することができる。Ｄ−セリンに作用する酵素としては、例えば、Ｄ−セリンデヒドラターゼ［ＥＣ ４．３．１．１８］、ジアミノプロピオネートアンモニア−リアーゼ［ＥＣ ４．３．１．１８］などを使用することができる。これらの酵素は必要に応じて単独または組み合わせて用いることができる。Ｄ−アラニンに作用する酵素としてＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼを、Ｄ−セリンに作用する酵素としてＤ−セリンデヒドラターゼを使用することが好適である。
本発明の方法で使用されるＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（Ｄｄｌ）は、２分子のＤ−アラニンを縮合しＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを生成するものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、ほとんどすべての細菌が有しているＤｄｌを利用することができる。好ましくは、大腸菌由来の酵素である。本明細書でいう大腸菌とは、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８版（Ｒ．Ｅ．Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｎ．Ｅ．Ｇｉｂｂｏｎｓ編，Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，２９５〜２９６頁，１９７４年）に記載されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉならびにその変異株および改変体である。
本発明の方法で用いられるＤｄｌとしては、好ましくは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１６７３−１６８２（１９９１）に記載のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０５３１９またはＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６３：８０９−８１７（１９８６）に記載のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００１１８ ＲＥＧＩＯＮ：１８６８８．．１９６０８の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を有する大腸菌由来の酵素が用いられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属などの微生物に由来する酵素も使用され得る。そしてＤｄｌ活性が消失しない限りは、いくつかのアミノ酸の改変（例えば、１または２以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換）があってもよい。Ｄｄｌは、例えば、大腸菌（例えば、細菌などから取得したｄｄｌ遺伝子を導入して形質転換した大腸菌株）の培養菌体内容物から、粗酵素を調製し次いで各種クロマトグラフィーによって精製する方法など、当業者によく知られている方法によって得られ得る。
本発明の方法で使用されるＤ−セリンデヒドラターゼ（Ｄｓｄ）は、Ｄ−セリンアンモニア−リアーゼ、Ｄ−セリンデハイドラーゼ、Ｄ−ハイドロキシアミノ酸デヒドラターゼ、Ｄ−セリンヒドラーゼ、Ｄ−セリンデアミナーゼなどとも呼ばれる酵素であり、Ｄ−セリンを脱アミノ化しピルビン酸を生成するものであればどのような由来のものでも使用できる。好ましくは、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（３），１５０８−１５１２（１９８３）に記載のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０１６０３の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を有する大腸菌由来の酵素が用いられる。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属などの微生物に由来するＤｓｄを使用できる。そしてＤｓｄ活性が消失しない限りは、いくつかのアミノ酸の改変（例えば、１または２以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換）があってもよい。Ｄｓｄは、例えば、大腸菌（例えば、細菌などから取得したｄｓｄ遺伝子を導入して形質転換した大腸菌株）の培養菌体内容物から、粗酵素を調製し次いで各種クロマトグラフィーによって精製する方法など、当業者によく知られている方法によって得られ得る。
上記ｄｄｌ遺伝子およびｄｓｄ遺伝子は、上記推定アミノ酸配列に基づいて当業者が通常用いる方法で得られる。例えば、ＤｄｌもしくはＤｓｄをコードする遺伝子またはこれらを含む遺伝子の一部またはすべてをプローブとして使用し、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどの手段を行う方法が挙げられる。また、ＤｄｌもしくはＤｓｄの遺伝子源は、大腸菌に限らず、他の細菌種であってもよい。
本明細書において、ｄｄｌ遺伝子とは、Ｄｄｌの特徴を示すＤｄｌ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖またはＤＮＡ配列をいい、そしてｄｓｄ遺伝子とは、Ｄｓｄの特徴を示すＤｓｄ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖またはＤＮＡ配列をいう。いずれも、上述のように生理活性が変化しない程度のアミノ酸の改変（例えば、付加、欠失、または置換）を有するポリペプチドをコードしていてもよい。また、縮重などにより、同じポリペプチドをコードする配列は複数種あり得る。さらに、ｄｄｌ遺伝子もしくはｄｓｄ遺伝子は、天然物由来であっても、全合成または半合成のものであってもよい。
得られたｄｄｌ遺伝子もしくはｄｓｄ遺伝子は、例えば、大腸菌などの宿主において増殖可能な発現ベクターに連結され、宿主に導入される。ここで用いられる発現ベクターは、大腸菌に対して通常用いられるものであればどのようなものでもよく、例えば、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９などが好適に用いられる。
ＤｄｌもしくはＤｓｄをコードするＤＮＡを大腸菌内で大量に発現させるために、あるいは発現量を増加させるために、転写および翻訳を制御するプロモーターをベクターのＤＮＡ鎖の５’上流域におよび／またはターミネーターを３’下流域に組み込んでもよい。このようなプロモーターおよび／またはターミネーターとしては、ｄｄｌ遺伝子もしくはｄｓｄ遺伝子自体に由来するもの、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの既に知られている遺伝子に由来するもの、またはそれらを人工的に改良したものが挙げられる。そのため、発現ベクターとしては、このような制御配列が組み込まれているものが好適に用いられ、例えば、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３（以上、アマシャム・ファルマシア社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１（以上、ストラタジーン社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
ＤｄｌもしくはＤｓｄを発現させるための宿主となり得る微生物としては、どのような微生物でもよいが、好ましくは細菌、さらに好ましくは大腸菌である。ＤｄｌもしくはＤｓｄを発現させるための形質転換体の作成は、遺伝子工学の分野で通常用いられる方法によって行われ、例えば、塩化ルビジウム法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７，１９８３）が挙げられる。このようにして得られたＤｄｌもしくはＤｓｄ発現能力が高められた大腸菌の形質転換体を培養して、ＤｄｌもしくはＤｓｄを得ることができる。
以上のようにして得られたＤｄｌもしくはＤｓｄは、必要に応じて単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
Ｄｄｌをホモシステイン測定試薬に応用した場合には、生成するＤ−アラニル−Ｄ−アラニンはＤ−アミノ酸オキシダーゼの基質とならないため、試料に含まれるＤ−アラニンを除くことが可能である。使用酵素量は、サンプル中のＤ−アラニンを除去できる濃度であれば特に制限はなく、例えば０．０１〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍＬである。なお、本発明において、Ｄｄｌの１Ｕｎｉｔは、Ｄ−アラニンを基質として３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを生成する酵素量として定義する。また活性発現のために必要なＡＴＰおよびＭｇイオンの使用量も、Ｄ−アラニンの除去が達成できる濃度であれば特に制限はなく、例えばＡＴＰは０．１〜１０ｍＭ、Ｍｇイオンは０．１〜２０ｍＭである。この酵素による試料の処理は単独で行うこともでき、以下の（ｂ）および（ｃ）工程と同時に行うこともできる。
Ｄｓｄをホモシステイン測定試薬に応用した場合には、試料に含まれるＤ−セリンをピルビン酸に変換することによってＤ−セリンを反応系外に除くことができる。使用酵素量は、サンプル中のＤ−セリンを除去できる濃度であれば特に制限はなく、例えば０．００１〜１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０１〜１Ｕ／ｍＬで使用できる。なお、本発明において、Ｄｓｄの１Ｕｎｉｔは、３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−セリンを分解する酵素量として定義する。この酵素による試料の処理は単独で行うこともでき、以下の（ｂ）および（ｃ）工程と同時に行うこともできる。
（ｂ）工程：
本発明の方法における（ｂ）工程は、試料中の種々の形態のホモシステインをチオール化合物で還元して還元型ホモシステインとする工程である。
本発明の方法で用いられるチオール化合物は特に限定されず、例えば、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸などが挙げられる。チオール化合物の濃度は、酸化型ホモシステインを還元型ホモシステインに変換できる範囲であればいずれでもよく、好ましくはチオール基として０．１ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上の濃度であればよい。
（ｃ）工程：
本発明の方法の（ｃ）工程は、上記（ｂ）工程で還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程である。本発明においては、メチル転移酵素およびメチル供与体として、それぞれ、ホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素およびメチル供与体のＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いることが好ましい。すなわち、試料中の還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを作用させて、Ｄ−メチオニンを生成させる。
メチル転移酵素としては、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムに作用し、Ｄ−メチオニンの生成を触媒するものであればどのようなものでもよく、例えば、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］、５−メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステイン Ｓ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１３］、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステイン Ｓ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１４］が挙げられる。好ましくは、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］が使用される。この酵素は、Ｇ．Ｇｒｕｅ−Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １０９１−７（１９８４））により報告されているように、特異性は低いもののＤ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とし、Ｄ−メチオニンを生成する。使用するホモシステインメチルトランスフェラーゼは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とするものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、細菌、酵母、ラットなどに由来する酵素が使用できる。なお、本発明において、ホモシステインメチルトランスフェラーゼの１Ｕｎｉｔは、ホモシステインおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを基質として３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−メチオニンを生成する酵素量として定義する。
（ｄ）工程：
本発明の方法の（ｄ）工程は、上記（ｃ）工程により生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、この生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程である。
Ｄ−アミノ酸に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ［ＥＣ １．４．３．３］を作用させることにより、過酸化水素が生成する。これをＳＨ試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、どのような由来のものを使用してもよい。例えば、動物の臓器、細菌類、および真菌類由来のものを用いることができる。好適には、ブタ腎臓由来のものが使用され得る。なお、本発明において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの１Ｕｎｉｔは、３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−アラニンをピルビン酸に変換する酵素量として定義する。
Ｄ−アミノ酸に、Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３６］を作用させた場合には、生成するコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシンセターゼ［ＥＣ ６．２．１．３］およびアシルコエンザイムＡ酸化酵素［ＥＣ １．３．３．６］を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼは、どのような由来のものを使用してもよい。例えば、酵母由来のものを用いることができる。
ＳＨ試薬としては、生化学辞典（第３版、ｐ．１８２、東京化学同人、１９９８年）にも記載されるとおり、エルマン試薬などの酸化剤、ｐ−メリクル安息香酸などのメルカプト形成剤、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミドなどのアルキル化剤が挙げられる。好ましくはアルキル化剤を、さらに好ましくはマレイミド化合物を、もっとも好ましくはＮ−エチルマレイミドを使用することができる。
発生した過酸化水素は、パーオキシダーゼにより通常の酸化系発色剤を発色させることができる。酸化系発色剤としては、種々のトリンダー試薬をカップラー試薬と組み合わせて利用できる。この方法はトリンダー法とも呼ばれ、臨床化学分析の分野では一般に用いられており、ここでは詳細に説明しないが、好ましくはカップラー試薬として４−アミノアンチピリンを用い、そしてトリンダー試薬としてＡＤＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン］、ＤＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＨＤＡＯＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＭＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン］、ＴＯＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン］などが用いられる。また、カップラー試薬を必要としない、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、ＤＡ−６７［１０−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業（株）製］、ＴＰＭ−ＰＳ［Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム塩、同仁化学研究所］などのロイコ型発色試薬も同様に用いることができる。特に、ＤＡ−６７およびＴＰＭ−ＰＳは、上記トリンダー試薬と比べてモル吸光係数が大きいため、より感度よく測定することができる。
ホモシステイン測定用試薬キット：
本発明では、上記の各工程で必要とされる（ａ）Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼおよび／またはＤ−セリンデヒドラターゼ、（ｂ）チオール化合物、（ｃ）メチル転移酵素およびメチル供与体、ならびに（ｄ）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ＋アシルコエンザイムＡシンセターゼ＋アシルコエンザイムＡ酸化酵素、ＳＨ試薬、および酸化系発色剤を含む、ホモシステイン測定用試薬キットが提供される。これらの（ａ）〜（ｄ）は、通常は別々に提供されるが、（ａ）〜（ｃ）は予め緩衝液中に混合して調製された測定試薬として提供されてもよい。
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］大腸菌由来の組換えＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（Ａ）（ＤｄｌＡ）の調製
（１−１）プローブの合成およびｄｄｌＡ遺伝子の取得
ＤｄｌＡ活性を有する酵素をコードする大腸菌のｄｄｌＡ遺伝子の塩基配列情報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１６７３−１６８２（１９９１）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０５３１９）をもとに、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ含む配列番号１および２に示す合成プライマーを作成した。これらのプライマー各３ｎｍｏｌ（１００ｐｍｏｌ／μｌ、３０μｌ）を用い、２μｌの大腸菌ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、緩衝液（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製；以下、ＫＯＤという）２μｌ、１０×ＫＯＤ緩衝液１０μｌ、ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、ＤＭＳＯ５μｌ、および蒸留水５μｌ）中でＰＣＲを行って、ｄｄｌＡ構造遺伝子を含む１．０９ｋｂのＤＮＡを得た。
（１−２）ｄｄｌＡ遺伝子を含むプラスミドの調製
上記のようにして得られたｄｄｌＡ遺伝子を、大腸菌ＣｏｌＥ１のＤＮＡ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ切断物に連結し、塩化ルビジウム法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７，１９８３）によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入して、ｄｄｌＡ遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質転換体を得た。なお、実施例で用いた制限酵素は、いずれもタカラバイオ社より入手した。
上記形質転換体中の組換えプラスミドを用いて、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法による３７７ Ａｕｔｏｍａｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー社製）によって塩基配列を決定した。ｄｄｌＡは、１０９５塩基の構造遺伝子領域を有し、３６４個のアミノ酸をコードし、これは上記ｄｄｌＡ遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
（１−３）ｄｄｌＡ遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作成
上記の組換えプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片を切り出し、ｄｄｌＡのＤＮＡを含む１．０９ｋｂのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。アンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌発現ベクターｐＫＫ２３３−３（アマシャム・ファルマシア社製）を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、得られた１．０９ｋｂのＤＮＡ断片を連結して、発現ベクターｐＫｄｌＡを得た（図２を参照のこと）。この発現ベクターｐＫｄｌＡは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧ）によりＤｄｌＡの発現が誘導される。
得られた発現ベクターｐＫｄｌＡを、塩化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入し、ＤｄｌＡを発現するものを選択して、形質転換体ＪＭ１０９−ｄｄｌＡ−３を得た。
（１−４）発現したＤｄｌＡの活性の確認
得られた形質転換体ＪＭ１０９−ｄｄｌＡ−３を、アンピシリンを含むＬＢ液体培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース）３ｍｌ中、３７℃にて約４時間振盪培養した。このうちの０．３ｍｌを、１０ｍｌのＬＢ液体培地に添加して、３７℃にて３時間振盪培養し、ＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を最終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに４時間培養した。培養液を、８０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離して菌体を回収し、１００ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌにて１回洗浄した後、菌体の１０倍量の可溶化液（１００ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精工社製、ＵＤ−２００型）を用いて、目盛１にて１０秒間処理を２回行うことによって、菌体を破砕した。１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上清を得、これをＤｄｌ活性測定の試料とした。なお、対照として、組換えられていないｐＫＫ２２３−３による大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換体を、同様に処理したものを用いた。
酵素活性の測定を、次のように行った。まず、菌体破砕液（５０μｌ）に、活性測定試薬（２０ｍＭ Ｄ−アラニン１００μｌ、２０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ ５０μｌ）を加え、３７℃にて１時間反応させた。シリカゲル薄層に、反応液の２μｌをスポットした後、展開溶媒としてエタノール：２５％アンモニア水＝７４：２６（ｗ／ｗ）を用いて、密閉容器中で展開した。展開終了後、ニンヒドリン液（０．２％ニンヒドリンを含むｎ−ブタノール飽和０．１Ｍクエン酸緩衝液）を噴霧して、生成したＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。組換え体の菌体破砕液によるＤ−アラニル−Ｄ−アラニンの生成は、対照の菌体破砕液と比較して著量であった。
（１−５）ＤｄｌＡの調製
上記（１−３）で得られたＤｄｌＡ高生産組換え大腸菌を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース）２００ｍｌに植菌し、３７℃にて１５時間予備培養した。培養液を、アンピシリンを含むＬＢ培地１．８Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、３７℃にて１００分間通気攪拌培養した。培養液にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに４時間培養した。培養液を、８０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して菌体を回収し、菌体の９倍容の緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に菌体を懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精工社製、ＵＤ−２００型）を用いて超音波処理を行うことによって、菌体を破砕した。破砕後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液に対して５％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上清に、４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に対して１晩透析した。
次いで、透析した粗酵素液を、Ｑ−セファロースＦＦ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（吸着：緩衝液Ａ（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、溶出：緩衝液Ａ−０．０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムグラジエント）により精製した。Ｄｄｌ活性画分を集め、さらにセファクリルＳ−１００（アマシャム・ファルマシア社製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。得られた活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色することによって、ＤｄｌＡがほぼ単一バンドにまで精製されたことを確認した。
［実施例２］大腸菌由来の組換えＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（Ｂ）（ＤｄｌＢ）の調製
（２−１）プローブの合成およびｄｄｌＢ遺伝子の取得
ＤｄｌＢ活性を有する酵素をコードする大腸菌のｄｄｌＢ遺伝子の塩基配列情報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６３：８０９−８１７（１９８６）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００１１８ ＲＥＧＩＯＮ：１８６８８．．１９６０８）をもとに、配列番号３および４に示す合成プライマーを作成した。これらのプライマー各３ｎｍｏｌ（１００ｐｍｏｌ／μｌ、３０μｌ）を用い、２μｌの大腸菌ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、緩衝液（ＫＯＤ２μｌ、１０×ＫＯＤ緩衝液１０μｌ、ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、ＤＭＳＯ５μｌ、および蒸留水５μｌ）中でＰＣＲを行って、ｄｄｌＢ構造遺伝子を含む０．９２ｋｂのＤＮＡを得た。
（２−２）ｄｄｌＢ遺伝子を含むプラスミドの調製
上記のようにして得られたｄｄｌＢ遺伝子を、大腸菌ＣｏｌＥ１のＤＮＡ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ切断物に連結し、塩化ルビジウム法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７，１９８３）によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入して、ｄｄｌＢ遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質転換体を得た。
上記形質転換体中の組換えプラスミドを用いて、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法による３７７ Ａｕｔｏｍａｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー社製）によって塩基配列を決定した。ｄｄｌＢは、９２１塩基の構造遺伝子領域を有し、３０６個のアミノ酸をコードし、これは上記ｄｄｌＢ遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
（２−３）ｄｄｌＢ遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作製
大腸菌発現ベクターｐＫＫ２３３−３（アマシャム・ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、さらにアルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化し、（２−１）のｄｄｌＢ構造遺伝子断片を連結して、発現ベクターｐＫｄｌＢを得た（図３を参照のこと）。この発現ベクターｐＫｄｌＢは、ＩＰＴＧにより、ＤｄｌＢの発現が誘導される。
得られた発現ベクターｐＫｄｌＢを、塩化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入し、ＤｄｌＢを発現するものを選択して、形質転換体ＪＭ１０９−ｄｄｌＢ−１を得た。
（２−４）ＤｄｌＢの調製
上記（２−３）で得られたＤｄｌＢ高生産組換え大腸菌を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース）２００ｍｌに植菌し、３７℃にて１５時間予備培養した。培養液を、アンピシリンを含むＬＢ培地１．８Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、３７℃にて１００分間通気攪拌培養した。培養液にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに４時間培養した。培養液を、８０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して菌体を回収し、菌体の９倍容の緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に菌体を懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精工社製、ＵＤ−２００型）を用いて超音波処理を行うことによって、菌体を破砕した。破砕後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液に対して２５％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上清に、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に対して１晩透析した。
次いで、透析した粗酵素液を、Ｑ−セファロースＦＦ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（吸着：緩衝液Ａ（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、溶出：緩衝液Ａ−０．０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムグラジエント）により精製した。Ｄｄｌ活性画分を集め、さらにセファクリルＳ−１００（アマシャム・ファルマシア社製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。得られた活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色することによって、ＤｄｌＢがほぼ単一バンドにまで精製されたことを確認した。
［実施例３］大腸菌由来の組換えＤ−セリンデヒドラターゼ（Ｄｓｄ）の調製
（３−１）ｄｓｄ遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作製
Ｄｓｄ活性を有する酵素をコードする大腸菌のｄｓｄ遺伝子の塩基配列情報をもとに、次の２種類の合成プライマー（配列番号５および６）を作成した。
これらのプライマーを用いて大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、同じ制限酵素で処理したベクターＰＵＣ１１８に連結した。これを塩化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入して、ｄｓｄ遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質転換体を得た。
（３−２）Ｄｓｄの調製
上記で得られたＤｓｄ発現株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地約１０Ｌ中で培養した。酵素精製はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１６９２６−１６９３３，１９８８に記載の方法に準じて実施した。菌体ペーストをほぼ同容のＳＰＥ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０％ ショ糖、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ リン酸カリウム、０．５ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、ｐＨ７．８）に懸濁し、インキュベート後、プロテアーゼ阻害剤およびピリドキサル５’−リン酸（ＰＬＰ）を含む水を加えて溶菌させた。氷冷し、さらにほぼ同容の緩衝液Ｂ（１Ｍ リン酸カリウム、８００μＭ ＰＬＰ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）を加え、１８０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離により細胞残渣を除いた。得られた上清液をｐＨ７．３に調整後、１％ Ｐｏｌｙｍｉｎ Ｐにより核酸を沈殿させ遠心分離により上清液を得た。７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して溶解後、４０分間撹拌し、その後１８０００ｒｐｍにて２時間遠心分離した。得られた沈殿は少量の緩衝液Ｃ（１０ｍＭ リン酸カリウム、８０μＭ ＰＬＰ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．２）に懸濁し、同緩衝液に対して１晩透析した。
次いで、透析した粗酵素液を、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。吸着は緩衝液Ｃを用い、溶出は同緩衝液をベースにＫＣｌを０から２００ｍＭに増加させて行った。Ｄｓｄ活性画分を集め、７０％飽和硫酸アンモニウムにて沈殿させ回収した。少量の緩衝液Ｃに溶解し、同緩衝液に対して１晩透析し、硫酸アンモニウムを除去した。さらに、緩衝液Ｄ（１ｍＭ リン酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０）に対して３〜４時間透析した。
透析した部分精製酵素液を、さらにハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（ギガパイト、東亜合成化学社製、生化学工業販売）により精製した。緩衝液Ｄで平衡化させたカラムに同酵素液をアプライし、カラム容量の３倍量の同緩衝液にて洗浄し、緩衝液Ｅ（１０ｍＭ リン酸カリウム、８０μＭ ＰＬＰ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）にて溶出させた。溶出各画分に１／１０容量の緩衝液イを加え、Ｄｓｄ活性画分を集め、７０％飽和硫酸アンモニウムにて沈殿させ回収した。得られた沈殿は少量の緩衝液Ｆ（１００ｍＭ リン酸カリウム、８０μＭ ＰＬＰ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．８）に懸濁し、同緩衝液に対して透析し精製酵素を得た。
（３−３）Ｄｓｄの活性の測定
Ｄｓｄの活性の測定は、Ｄ−セリンから生成するピルビン酸を、ＮＡＤＨの存在下での乳酸脱水素酵素とのカップリングを測定することにより実施した。すなわち、３７℃において１００ｍＭ Ｄ−セリン、０．５ｍＭ ＮＡＤＨ、および５Ｕ 乳酸脱水素酵素に、０．０１〜０．１Ｕ Ｄｓｄを加えて反応を開始し、３４０ｎｍの吸光度の減少を追跡した。
［実施例４］ＤｄｌＡ、ＤｄｌＢおよびＤｓｄによるＤ−アラニンの影響回避
試料（１〜５）を次のように調製した：
試料１：正常コントロール血清セラクリアＨＥ（アズウェル社製）
試料２：試料１にホモシスチンを２５μＭ（ホモシステイン換算値５０μＭ）添加
試料３：試料２にＤ−アラニンを１００μＭ添加
試料４：試料２にＤ−セリンを５００μＭ添加
試料５：試料２にＤ−アラニンを１００μＭおよびＤ−セリンを５００μＭ添加。
第一試薬（Ｉ〜Ｖ）および第二試薬を次のように調製した：
第一試薬：
試薬Ｉ：５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）、１２３Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、５．６ｍＭ ジチオスレイトール、０．０６ｍＭ Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、１ｍＭ 臭化亜鉛、０．３ｍＭ ＤＡ−６７、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ 塩化マグネシウム
試薬ＩＩ：試薬ＩにＤｄｌＢを０．２２８５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ添加
試薬ＩＩＩ：試薬ＩにＤｄｌＡを２．０８７５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ添加
試薬ＩＶ：試薬ＩにＤｓｄを１Ｕ／ｍＬ添加
試薬Ｖ：試薬ＩにＤｄｌＢを０．２２８５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬおよびＤｓｄを１Ｕ／ｍＬ同時に添加。
第二試薬：
５０ｍＭ クエン酸（ｐＨ５．６）、２３ｍＭ ＮＥＭ、６．４Ｕ／ｍＬ ブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、５．５Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼを含む試薬。
測定は日立７１７０を使用して次のように行った。各試料１〜５ １５μＬにいずれかの第一試薬１８０μＬを添加して混合し、３７℃で５分間反応させた。次に第二試薬１２０μＬを添加混合し、さらに３７℃で５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍ）変化を測定した。
まず、試料１および２を、試薬Ｉ〜Ｖを用いてそれぞれ測定し、その場合の試料に添加したホモシステインに対する測定感度をそれぞれ１００％とした。次いで、試料３〜５を試薬Ｉ〜Ｖを用いてそれぞれ測定した場合、試料３〜５の測定感度は、以下の表１のとおりであった。
これらの結果から明らかなように、コントロールでは、Ｄ−アラニンおよびＤ−セリンの影響のため、測定値が高く出たが、測定試薬中にＤｄｌＢまたはＤｄｌＡを含有させることによってサンプル中のＤ−アラニンの影響を軽減し、そしてＤｓｄを含有させることによってＤ−セリンの影響を軽減した。また、両者を同時に使用することによって、Ｄ−アラニンおよびＤ−セリンの影響を同時に軽減できることも明らかである。
［実施例５］ＤｄｌおよびＤｓｄによるＤ−アラニンおよびＤ−セリンの消去
試料（４種類）を次のように調製した：
試料１：正常コントロール血清セラクリアＨＥ（アズウェル社製）
試料２：試料１にホモシスチンを２５μＭ（ホモシステイン換算値５０μＭ）添加
試料６：試料２にＤ−アラニンを２００μＭ添加
試料７：試料２にＤ−セリンを１０００μＭ添加。
第一試薬および第二試薬を次のように調製した：
第一試薬：
５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）、１２３Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、５．６ｍＭ ジチオスレイトール、０．０６ｍＭ Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、１ｍＭ 臭化亜鉛、０．３ｍＭ ＤＡ−６７、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む試薬に、ＤｄｌＢを０、０．０７３、０．１４５、０．２９および０．５８Ｕ／ｍＬ添加した試薬およびＤｓｄを０、０．１２５、０．２５および０．５Ｕ／ｍＬ添加した試薬。
第二試薬：
５０ｍＭ クエン酸（ｐＨ５．６）、２３ｍＭ ＮＥＭ、６．４Ｕ／ｍＬ ブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、５．５Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼを含む試薬。
測定は日立７１７０を使用して次のように行った。試料１５μＬに第一試薬１８０μＬを添加して混合し、３７℃で５分間反応させた。次に第二試薬１２０μＬを添加して混合し、さらに３７℃で５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍ）変化を測定した。
結果を図４および図５に示す。
図４は、横軸にＤｄｌＢの濃度、および縦軸にホモシステイン測定時の相対感度を示した。約０．５Ｕ／ｍＬのＤｄｌＢを用いることにより、２００ｍＭ Ｄ−アラニンの影響はほぼ回避できることがわかった。
図５は、横軸にＤｓｄの濃度、および縦軸にホモシステイン測定時の相対感度を示した。約０．２Ｕ／ｍＬのＤｓｄを用いることにより１０００ｍＭ Ｄ−セリンの影響をほぼ回避することができた。
［実施例６］ＤｄｌおよびＤｓｄによる試料中のＤ−アミノ酸の影響回避
試料は、ＥＤＴＡ血漿１２検体を用いた。スタンダードとしては、コントロール血清に５０μＭ Ｄ−メチオニンを添加したものを用いた。
第一試薬３種類（ｉ〜ｉｉｉ）および第二試薬１種類（共通）を次のように調製した。
第一試薬：
試薬ｉ：５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）、１２６Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、５．６ｍＭ ジチオスレイトール、０．０６ｍＭ Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、１ｍＭ 臭化亜鉛、０．３ｍＭ ＤＡ−６７
試薬ｉｉ：試薬ｉからホモシステインメチルトランスフェラーゼを除く
試薬ｉｉｉ：試薬ｉに５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．５８Ｕ／ｍＬ ＤｄｌＢ、１Ｕ／ｍＬ Ｄｓｄを添加。
第二試薬：
５０ｍＭ クエン酸（ｐＨ５．６）、２３ｍＭ ＮＥＭ、６．４Ｕ／ｍＬ ブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、５．５Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼを含む。
測定は日立７１７０を使用して次のように行った。試料１５μＬにいずれかの第一試薬１８０μＬを添加して混合し、３７℃で５分間反応させた。次に第二試薬１２０μＬを添加して混合し、さらに３７℃で５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍ）変化を測定した。スタンダードの吸光度変化から試料中のホモシステイン濃度を算出した。試薬Ａのみを用いて測定した値を従来１チャンネル法とし、試薬ｉと試薬ｉｉとの差をとって測定した値を従来２チャンネル法とし、そして試薬ｉｉｉを用いて測定した値を本発明法とした。それぞれの値をＨＰＬＣ法による測定値と比較した。
図６からわかるように、従来１チャンネル法に比較して、本発明法は、ＨＰＬＣ法との相関性が改善され、そして従来２チャンネル法に劣らない相関性を示した。
本発明のホモシステインの測定方法は、試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理し、メチル供与体存在下でメチル転移酵素を作用させた（第一工程）後、生成するＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸誘導体を測定する（第二工程）という原理に基づく。例えば、図１に示すように、第一工程で生成したＤ−メチオニンに、第二工程においてＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させた場合には、過酸化水素が生成するため、これをＳＨ試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。また、Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させた場合には、生成するコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシンセターゼ［ＥＣ ６．２．１．３］およびアシルコエンザイムＡ酸化酵素［ＥＣ １．３．３．６］を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。
本発明のホモシステインを検出または測定する方法は、Ｄ−アミノ酸を測定するにおいて内因性のＤ−アミノ酸の影響を排除するために、まず最初に、試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換することを特徴とする。
具体的には、本発明のホモシステインの検出または測定方法は、
（ａ）試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質にならない物質に変換する工程；
（ｂ）試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程；
（ｃ）該還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程；および
（ｄ）該生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、を含む。
本発明の方法によって検出または測定され得る試料としては、ホモシステインを含むと考えられる試料であればいずれでもよい。また、ホモシステインの存在様式としては、還元型ホモシステインのみならず、蛋白結合型、ホモシステイン２量体、ホモシステイン−システイン２量体などジスルフィド結合で他の分子に結合した酸化型ホモシステインのいずれでもよい。例えば、血清、血漿、血液、尿、およびそれらの希釈物などが挙げられる。
（ａ）工程：
本発明の方法において使用されるＤ−アミノ酸変換酵素としては、Ｄ−アミノ酸に作用して、Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質にならない物質に変換してホモシステイン測定原理の反応系外に導くことのできるものであればよい。本発明においては、Ｄ−アラニンおよび／またはＤ−セリンに作用するものが好ましい。Ｄ−アラニンに作用する酵素としては、例えばＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ［ＥＣ ６．３．２．４］、Ｄ−アラニンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．２．７］、Ｄ−アラニン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．２．１４］などを使用することができる。Ｄ−セリンに作用する酵素としては、例えば、Ｄ−セリンデヒドラターゼ［ＥＣ ４．３．１．１８］、ジアミノプロピオネートアンモニア−リアーゼ［ＥＣ ４．３．１．１８］などを使用することができる。これらの酵素は必要に応じて単独または組み合わせて用いることができる。Ｄ−アラニンに作用する酵素としてＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼを、Ｄ−セリンに作用する酵素としてＤ−セリンデヒドラターゼを使用することが好適である。
本発明の方法で使用されるＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（Ｄｄｌ）は、２分子のＤ−アラニンを縮合しＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを生成するものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、ほとんどすべての細菌が有しているＤｄｌを利用することができる。好ましくは、大腸菌由来の酵素である。本明細書でいう大腸菌とは、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８版（Ｒ．Ｅ．Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｎ．Ｅ．Ｇｉｂｂｏｎｓ編，Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，２９５〜２９６頁，１９７４年）に記載されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉならびにその変異株および改変体である。
本発明の方法で用いられるＤｄｌとしては、好ましくは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１６７３−１６８２（１９９１）に記載のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０５３１９またはＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６３：８０９−８１７（１９８６）に記載のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００１１８ ＲＥＧＩＯＮ：１８６８８．．１９６０８の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を有する大腸菌由来の酵素が用いられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属などの微生物に由来する酵素も使用され得る。そしてＤｄｌ活性が消失しない限りは、いくつかのアミノ酸の改変（例えば、１または２以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換）があってもよい。Ｄｄｌは、例えば、大腸菌（例えば、細菌などから取得したｄｄｌ遺伝子を導入して形質転換した大腸菌株）の培養菌体内容物から、粗酵素を調製し次いで各種クロマトグラフィーによって精製する方法など、当業者によく知られている方法によって得られ得る。
本発明の方法で使用されるＤ−セリンデヒドラターゼ（Ｄｓｄ）は、Ｄ−セリンアンモニア−リアーゼ、Ｄ−セリンデハイドラーゼ、Ｄ−ハイドロキシアミノ酸デヒドラターゼ、Ｄ−セリンヒドラーゼ、Ｄ−セリンデアミナーゼなどとも呼ばれる酵素であり、Ｄ−セリンを脱アミノ化しピルビン酸を生成するものであればどのような由来のものでも使用できる。好ましくは、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（３），１５０８−１５１２（１９８３）に記載のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０１６０３の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を有する大腸菌由来の酵素が用いられる。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属などの微生物に由来するＤｓｄを使用できる。そしてＤｓｄ活性が消失しない限りは、いくつかのアミノ酸の改変（例えば、１または２以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換）があってもよい。Ｄｓｄは、例えば、大腸菌（例えば、細菌などから取得したｄｓｄ遺伝子を導入して形質転換した大腸菌株）の培養菌体内容物から、粗酵素を調製し次いで各種クロマトグラフィーによって精製する方法など、当業者によく知られている方法によって得られ得る。
上記ｄｄｌ遺伝子およびｄｓｄ遺伝子は、上記推定アミノ酸配列に基づいて当業者が通常用いる方法で得られる。例えば、ＤｄｌもしくはＤｓｄをコードする遺伝子またはこれらを含む遺伝子の一部またはすべてをプローブとして使用し、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどの手段を行う方法が挙げられる。また、ＤｄｌもしくはＤｓｄの遺伝子源は、大腸菌に限らず、他の細菌種であってもよい。
本明細書において、ｄｄｌ遺伝子とは、Ｄｄｌの特徴を示すＤｄｌ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖またはＤＮＡ配列をいい、そしてｄｓｄ遺伝子とは、Ｄｓｄの特徴を示すＤｓｄ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖またはＤＮＡ配列をいう。いずれも、上述のように生理活性が変化しない程度のアミノ酸の改変（例えば、付加、欠失、または置換）を有するポリペプチドをコードしていてもよい。また、縮重などにより、同じポリペプチドをコードする配列は複数種あり得る。さらに、ｄｄｌ遺伝子もしくはｄｓｄ遺伝子は、天然物由来であっても、全合成または半合成のものであってもよい。
得られたｄｄｌ遺伝子もしくはｄｓｄ遺伝子は、例えば、大腸菌などの宿主において増殖可能な発現ベクターに連結され、宿主に導入される。ここで用いられる発現ベクターは、大腸菌に対して通常用いられるものであればどのようなものでもよく、例えば、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９などが好適に用いられる。
ＤｄｌもしくはＤｓｄをコードするＤＮＡを大腸菌内で大量に発現させるために、あるいは発現量を増加させるために、転写および翻訳を制御するプロモーターをベクターのＤＮＡ鎖の５’上流域におよび／またはターミネーターを３’下流域に組み込んでもよい。このようなプロモーターおよび／またはターミネーターとしては、ｄｄｌ遺伝子もしくはｄｓｄ遺伝子自体に由来するもの、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの既に知られている遺伝子に由来するもの、またはそれらを人工的に改良したものが挙げられる。そのため、発現ベクターとしては、このような制御配列が組み込まれているものが好適に用いられ、例えば、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３（以上、アマシャム・ファルマシア社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１（以上、ストラタジーン社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
ＤｄｌもしくはＤｓｄを発現させるための宿主となり得る微生物としては、どのような微生物でもよいが、好ましくは細菌、さらに好ましくは大腸菌である。ＤｄｌもしくはＤｓｄを発現させるための形質転換体の作成は、遺伝子工学の分野で通常用いられる方法によって行われ、例えば、塩化ルビジウム法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７，１９８３）が挙げられる。このようにして得られたＤｄｌもしくはＤｓｄ発現能力が高められた大腸菌の形質転換体を培養して、ＤｄｌもしくはＤｓｄを得ることができる。
以上のようにして得られたＤｄｌもしくはＤｓｄは、必要に応じて単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
Ｄｄｌをホモシステイン測定試薬に応用した場合には、生成するＤ−アラニル−Ｄ−アラニンはＤ−アミノ酸オキシダーゼの基質とならないため、試料に含まれるＤ−アラニンを除くことが可能である。使用酵素量は、サンプル中のＤ−アラニンを除去できる濃度であれば特に制限はなく、例えば０．０１〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍＬである。なお、本発明において、Ｄｄｌの１Ｕｎｉｔは、Ｄ−アラニンを基質として３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを生成する酵素量として定義する。また活性発現のために必要なＡＴＰおよびＭｇイオンの使用量も、Ｄ−アラニンの除去が達成できる濃度であれば特に制限はなく、例えばＡＴＰは０．１〜１０ｍＭ、Ｍｇイオンは０．１〜２０ｍＭである。この酵素による試料の処理は単独で行うこともでき、以下の（ｂ）および（ｃ）工程と同時に行うこともできる。
Ｄｓｄをホモシステイン測定試薬に応用した場合には、試料に含まれるＤ−セリンをピルビン酸に変換することによってＤ−セリンを反応系外に除くことができる。使用酵素量は、サンプル中のＤ−セリンを除去できる濃度であれば特に制限はなく、例えば０．００１〜１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０１〜１Ｕ／ｍＬで使用できる。なお、本発明において、Ｄｓｄの１Ｕｎｉｔは、３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−セリンを分解する酵素量として定義する。この酵素による試料の処理は単独で行うこともでき、以下の（ｂ）および（ｃ）工程と同時に行うこともできる。
（ｂ）工程：
本発明の方法における（ｂ）工程は、試料中の種々の形態のホモシステインをチオール化合物で還元して還元型ホモシステインとする工程である。
本発明の方法で用いられるチオール化合物は特に限定されず、例えば、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸などが挙げられる。チオール化合物の濃度は、酸化型ホモシステインを還元型ホモシステインに変換できる範囲であればいずれでもよく、好ましくはチオール基として０．１ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上の濃度であればよい。
（ｃ）工程：
本発明の方法の（ｃ）工程は、上記（ｂ）工程で還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程である。本発明においては、メチル転移酵素およびメチル供与体として、それぞれ、ホモシステインをメチル受容体とするメチル転移酵素およびメチル供与体のＤ−メチオニンメチルスルホニウムを用いることが好ましい。すなわち、試料中の還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを作用させて、Ｄ−メチオニンを生成させる。
メチル転移酵素としては、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムに作用し、Ｄ−メチオニンの生成を触媒するものであればどのようなものでもよく、例えば、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］、５−メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステイン Ｓ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１３］、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステイン Ｓ−メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１４］が挙げられる。好ましくは、ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］が使用される。この酵素は、Ｇ．Ｇｒｕｅ−Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １０９１−７（１９８４））により報告されているように、特異性は低いもののＤ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とし、Ｄ−メチオニンを生成する。使用するホモシステインメチルトランスフェラーゼは、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムをメチル供与体とするものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、細菌、酵母、ラットなどに由来する酵素が使用できる。なお、本発明において、ホモシステインメチルトランスフェラーゼの１Ｕｎｉｔは、ホモシステインおよびＤ−メチオニンメチルスルホニウムを基質として３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−メチオニンを生成する酵素量として定義する。
（ｄ）工程：
本発明の方法の（ｄ）工程は、上記（ｃ）工程により生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、この生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程である。
Ｄ−アミノ酸に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ［ＥＣ １．４．３．３］を作用させることにより、過酸化水素が生成する。これをＳＨ試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、どのような由来のものを使用してもよい。例えば、動物の臓器、細菌類、および真菌類由来のものを用いることができる。好適には、ブタ腎臓由来のものが使用され得る。なお、本発明において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの１Ｕｎｉｔは、３７℃において１分間に１μｍｏｌのＤ−アラニンをピルビン酸に変換する酵素量として定義する。
Ｄ−アミノ酸に、Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３６］を作用させた場合には、生成するコエンザイムＡをアシルコエンザイムＡシンセターゼ［ＥＣ ６．２．１．３］およびアシルコエンザイムＡ酸化酵素［ＥＣ １．３．３．６］を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。Ｄ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼは、どのような由来のものを使用してもよい。例えば、酵母由来のものを用いることができる。
ＳＨ試薬としては、生化学辞典（第３版、ｐ．１８２、東京化学同人、１９９８年）にも記載されるとおり、エルマン試薬などの酸化剤、ｐ−メリクル安息香酸などのメルカプト形成剤、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミドなどのアルキル化剤が挙げられる。好ましくはアルキル化剤を、さらに好ましくはマレイミド化合物を、もっとも好ましくはＮ−エチルマレイミドを使用することができる。
発生した過酸化水素は、パーオキシダーゼにより通常の酸化系発色剤を発色させることができる。酸化系発色剤としては、種々のトリンダー試薬をカップラー試薬と組み合わせて利用できる。この方法はトリンダー法とも呼ばれ、臨床化学分析の分野では一般に用いられており、ここでは詳細に説明しないが、好ましくはカップラー試薬として４−アミノアンチピリンを用い、そしてトリンダー試薬としてＡＤＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン］、ＤＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＨＤＡＯＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン］、ＭＡＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン］、ＴＯＯＳ［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン］などが用いられる。また、カップラー試薬を必要としない、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、ＤＡ−６７［１０−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業（株）製］、ＴＰＭ−ＰＳ［Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム塩、同仁化学研究所］などのロイコ型発色試薬も同様に用いることができる。特に、ＤＡ−６７およびＴＰＭ−ＰＳは、上記トリンダー試薬と比べてモル吸光係数が大きいため、より感度よく測定することができる。
ホモシステイン測定用試薬キット：
本発明では、上記の各工程で必要とされる（ａ）Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼおよび／またはＤ−セリンデヒドラターゼ、（ｂ）チオール化合物、（ｃ）メチル転移酵素およびメチル供与体、ならびに（ｄ）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ＋アシルコエンザイムＡシンセターゼ＋アシルコエンザイムＡ酸化酵素、ＳＨ試薬、および酸化系発色剤を含む、ホモシステイン測定用試薬キットが提供される。これらの（ａ）〜（ｄ）は、通常は別々に提供されるが、（ａ）〜（ｃ）は予め緩衝液中に混合して調製された測定試薬として提供されてもよい。
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］大腸菌由来の組換えＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（Ａ）（ＤｄｌＡ）の調製
（１−１）プローブの合成およびｄｄｌＡ遺伝子の取得
ＤｄｌＡ活性を有する酵素をコードする大腸菌のｄｄｌＡ遺伝子の塩基配列情報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１６７３−１６８２（１９９１）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０５３１９）をもとに、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ含む配列番号１および２に示す合成プライマーを作成した。これらのプライマー各３ｎｍｏｌ（１００ｐｍｏｌ／μｌ、３０μｌ）を用い、２μｌの大腸菌ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、緩衝液（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製；以下、ＫＯＤという）２μｌ、１０×ＫＯＤ緩衝液１０μｌ、ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、ＤＭＳＯ５μｌ、および蒸留水５μｌ）中でＰＣＲを行って、ｄｄｌＡ構造遺伝子を含む１．０９ｋｂのＤＮＡを得た。
（１−２）ｄｄｌＡ遺伝子を含むプラスミドの調製
上記のようにして得られたｄｄｌＡ遺伝子を、大腸菌ＣｏｌＥ１のＤＮＡ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ切断物に連結し、塩化ルビジウム法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７，１９８３）によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入して、ｄｄｌＡ遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質転換体を得た。なお、実施例で用いた制限酵素は、いずれもタカラバイオ社より入手した。
上記形質転換体中の組換えプラスミドを用いて、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法による３７７ Ａｕｔｏｍａｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー社製）によって塩基配列を決定した。ｄｄｌＡは、１０９５塩基の構造遺伝子領域を有し、３６４個のアミノ酸をコードし、これは上記ｄｄｌＡ遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
（１−３）ｄｄｌＡ遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作成
上記の組換えプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片を切り出し、ｄｄｌＡのＤＮＡを含む１．０９ｋｂのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。アンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌発現ベクターｐＫＫ２３３−３（アマシャム・ファルマシア社製）を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、得られた１．０９ｋｂのＤＮＡ断片を連結して、発現ベクターｐＫｄｌＡを得た（図２を参照のこと）。この発現ベクターｐＫｄｌＡは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧ）によりＤｄｌＡの発現が誘導される。
得られた発現ベクターｐＫｄｌＡを、塩化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入し、ＤｄｌＡを発現するものを選択して、形質転換体ＪＭ１０９−ｄｄｌＡ−３を得た。
（１−４）発現したＤｄｌＡの活性の確認
得られた形質転換体ＪＭ１０９−ｄｄｌＡ−３を、アンピシリンを含むＬＢ液体培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース）３ｍｌ中、３７℃にて約４時間振盪培養した。このうちの０．３ｍｌを、１０ｍｌのＬＢ液体培地に添加して、３７℃にて３時間振盪培養し、ＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を最終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに４時間培養した。培養液を、８０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離して菌体を回収し、１００ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌにて１回洗浄した後、菌体の１０倍量の可溶化液（１００ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精工社製、ＵＤ−２００型）を用いて、目盛１にて１０秒間処理を２回行うことによって、菌体を破砕した。１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上清を得、これをＤｄｌ活性測定の試料とした。なお、対照として、組換えられていないｐＫＫ２２３−３による大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換体を、同様に処理したものを用いた。
酵素活性の測定を、次のように行った。まず、菌体破砕液（５０μｌ）に、活性測定試薬（２０ｍＭ Ｄ−アラニン１００μｌ、２０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ ５０μｌ）を加え、３７℃にて１時間反応させた。シリカゲル薄層に、反応液の２μｌをスポットした後、展開溶媒としてエタノール：２５％アンモニア水＝７４：２６（ｗ／ｗ）を用いて、密閉容器中で展開した。展開終了後、ニンヒドリン液（０．２％ニンヒドリンを含むｎ−ブタノール飽和０．１Ｍクエン酸緩衝液）を噴霧して、生成したＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを検出した。組換え体の菌体破砕液によるＤ−アラニル−Ｄ−アラニンの生成は、対照の菌体破砕液と比較して著量であった。
（１−５）ＤｄｌＡの調製
上記（１−３）で得られたＤｄｌＡ高生産組換え大腸菌を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース）２００ｍｌに植菌し、３７℃にて１５時間予備培養した。培養液を、アンピシリンを含むＬＢ培地１．８Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、３７℃にて１００分間通気攪拌培養した。培養液にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに４時間培養した。培養液を、８０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して菌体を回収し、菌体の９倍容の緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に菌体を懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精工社製、ＵＤ−２００型）を用いて超音波処理を行うことによって、菌体を破砕した。破砕後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液に対して５％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上清に、４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に対して１晩透析した。
次いで、透析した粗酵素液を、Ｑ−セファロースＦＦ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（吸着：緩衝液Ａ（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、溶出：緩衝液Ａ−０．０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムグラジエント）により精製した。Ｄｄｌ活性画分を集め、さらにセファクリルＳ−１００（アマシャム・ファルマシア社製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。得られた活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色することによって、ＤｄｌＡがほぼ単一バンドにまで精製されたことを確認した。
［実施例２］大腸菌由来の組換えＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ（Ｂ）（ＤｄｌＢ）の調製
（２−１）プローブの合成およびｄｄｌＢ遺伝子の取得
ＤｄｌＢ活性を有する酵素をコードする大腸菌のｄｄｌＢ遺伝子の塩基配列情報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６３：８０９−８１７（１９８６）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００１１８ ＲＥＧＩＯＮ：１８６８８．．１９６０８）をもとに、配列番号３および４に示す合成プライマーを作成した。これらのプライマー各３ｎｍｏｌ（１００ｐｍｏｌ／μｌ、３０μｌ）を用い、２μｌの大腸菌ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、緩衝液（ＫＯＤ２μｌ、１０×ＫＯＤ緩衝液１０μｌ、ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、ＤＭＳＯ５μｌ、および蒸留水５μｌ）中でＰＣＲを行って、ｄｄｌＢ構造遺伝子を含む０．９２ｋｂのＤＮＡを得た。
（２−２）ｄｄｌＢ遺伝子を含むプラスミドの調製
上記のようにして得られたｄｄｌＢ遺伝子を、大腸菌ＣｏｌＥ１のＤＮＡ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌ベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ切断物に連結し、塩化ルビジウム法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７，１９８３）によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入して、ｄｄｌＢ遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質転換体を得た。
上記形質転換体中の組換えプラスミドを用いて、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法による３７７ Ａｕｔｏｍａｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー社製）によって塩基配列を決定した。ｄｄｌＢは、９２１塩基の構造遺伝子領域を有し、３０６個のアミノ酸をコードし、これは上記ｄｄｌＢ遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
（２−３）ｄｄｌＢ遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作製
大腸菌発現ベクターｐＫＫ２３３−３（アマシャム・ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、さらにアルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化し、（２−１）のｄｄｌＢ構造遺伝子断片を連結して、発現ベクターｐＫｄｌＢを得た（図３を参照のこと）。この発現ベクターｐＫｄｌＢは、ＩＰＴＧにより、ＤｄｌＢの発現が誘導される。
得られた発現ベクターｐＫｄｌＢを、塩化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入し、ＤｄｌＢを発現するものを選択して、形質転換体ＪＭ１０９−ｄｄｌＢ−１を得た。
（２−４）ＤｄｌＢの調製
上記（２−３）で得られたＤｄｌＢ高生産組換え大腸菌を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコース）２００ｍｌに植菌し、３７℃にて１５時間予備培養した。培養液を、アンピシリンを含むＬＢ培地１．８Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、３７℃にて１００分間通気攪拌培養した。培養液にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに４時間培養した。培養液を、８０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して菌体を回収し、菌体の９倍容の緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に菌体を懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精工社製、ＵＤ−２００型）を用いて超音波処理を行うことによって、菌体を破砕した。破砕後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液に対して２５％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた上清に、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを氷冷下攪拌しながら添加した後、３０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝液（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に対して１晩透析した。
次いで、透析した粗酵素液を、Ｑ−セファロースＦＦ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（吸着：緩衝液Ａ（２０ｍＭビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、溶出：緩衝液Ａ−０．０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムグラジエント）により精製した。Ｄｄｌ活性画分を集め、さらにセファクリルＳ−１００（アマシャム・ファルマシア社製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。得られた活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色することによって、ＤｄｌＢがほぼ単一バンドにまで精製されたことを確認した。
［実施例３］大腸菌由来の組換えＤ−セリンデヒドラターゼ（Ｄｓｄ）の調製
（３−１）ｄｓｄ遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作製
Ｄｓｄ活性を有する酵素をコードする大腸菌のｄｓｄ遺伝子の塩基配列情報をもとに、次の２種類の合成プライマー（配列番号５および６）を作成した。
これらのプライマーを用いて大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、同じ制限酵素で処理したベクターＰＵＣ１１８に連結した。これを塩化ルビジウム法によって大腸菌ＪＭ１０９中に導入して、ｄｓｄ遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質転換体を得た。
（３−２）Ｄｓｄの調製
上記で得られたＤｓｄ発現株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地約１０Ｌ中で培養した。酵素精製はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１６９２６−１６９３３，１９８８に記載の方法に準じて実施した。菌体ペーストをほぼ同容のＳＰＥ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０％ ショ糖、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ リン酸カリウム、０．５ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、ｐＨ７．８）に懸濁し、インキュベート後、プロテアーゼ阻害剤およびピリドキサル５’−リン酸（ＰＬＰ）を含む水を加えて溶菌させた。氷冷し、さらにほぼ同容の緩衝液Ｂ（１Ｍ リン酸カリウム、８００μＭ ＰＬＰ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）を加え、１８０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離により細胞残渣を除いた。得られた上清液をｐＨ７．３に調整後、１％ Ｐｏｌｙｍｉｎ Ｐにより核酸を沈殿させ遠心分離により上清液を得た。７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して溶解後、４０分間撹拌し、その後１８０００ｒｐｍにて２時間遠心分離した。得られた沈殿は少量の緩衝液Ｃ（１０ｍＭ リン酸カリウム、８０μＭ ＰＬＰ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．２）に懸濁し、同緩衝液に対して１晩透析した。
次いで、透析した粗酵素液を、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。吸着は緩衝液Ｃを用い、溶出は同緩衝液をベースにＫＣｌを０から２００ｍＭに増加させて行った。Ｄｓｄ活性画分を集め、７０％飽和硫酸アンモニウムにて沈殿させ回収した。少量の緩衝液Ｃに溶解し、同緩衝液に対して１晩透析し、硫酸アンモニウムを除去した。さらに、緩衝液Ｄ（１ｍＭ リン酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０）に対して３〜４時間透析した。
透析した部分精製酵素液を、さらにハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（ギガパイト、東亜合成化学社製、生化学工業販売）により精製した。緩衝液Ｄで平衡化させたカラムに同酵素液をアプライし、カラム容量の３倍量の同緩衝液にて洗浄し、緩衝液Ｅ（１０ｍＭ リン酸カリウム、８０μＭ ＰＬＰ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）にて溶出させた。溶出各画分に１／１０容量の緩衝液イを加え、Ｄｓｄ活性画分を集め、７０％飽和硫酸アンモニウムにて沈殿させ回収した。得られた沈殿は少量の緩衝液Ｆ（１００ｍＭ リン酸カリウム、８０μＭ ＰＬＰ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．８）に懸濁し、同緩衝液に対して透析し精製酵素を得た。
（３−３）Ｄｓｄの活性の測定
Ｄｓｄの活性の測定は、Ｄ−セリンから生成するピルビン酸を、ＮＡＤＨの存在下での乳酸脱水素酵素とのカップリングを測定することにより実施した。すなわち、３７℃において１００ｍＭ Ｄ−セリン、０．５ｍＭ ＮＡＤＨ、および５Ｕ 乳酸脱水素酵素に、０．０１〜０．１Ｕ Ｄｓｄを加えて反応を開始し、３４０ｎｍの吸光度の減少を追跡した。
［実施例４］ＤｄｌＡ、ＤｄｌＢおよびＤｓｄによるＤ−アラニンの影響回避
試料（１〜５）を次のように調製した：
試料１：正常コントロール血清セラクリアＨＥ（アズウェル社製）
試料２：試料１にホモシスチンを２５μＭ（ホモシステイン換算値５０μＭ）添加
試料３：試料２にＤ−アラニンを１００μＭ添加
試料４：試料２にＤ−セリンを５００μＭ添加
試料５：試料２にＤ−アラニンを１００μＭおよびＤ−セリンを５００μＭ添加。
第一試薬（Ｉ〜Ｖ）および第二試薬を次のように調製した：
第一試薬：
試薬Ｉ：５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）、１２３Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、５．６ｍＭ ジチオスレイトール、０．０６ｍＭ Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、１ｍＭ 臭化亜鉛、０．３ｍＭ ＤＡ−６７、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ 塩化マグネシウム
試薬ＩＩ：試薬ＩにＤｄｌＢを０．２２８５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ添加
試薬ＩＩＩ：試薬ＩにＤｄｌＡを２．０８７５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ添加
試薬ＩＶ：試薬ＩにＤｓｄを１Ｕ／ｍＬ添加
試薬Ｖ：試薬ＩにＤｄｌＢを０．２２８５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬおよびＤｓｄを１Ｕ／ｍＬ同時に添加。
第二試薬：
５０ｍＭ クエン酸（ｐＨ５．６）、２３ｍＭ ＮＥＭ、６．４Ｕ／ｍＬ ブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、５．５Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼを含む試薬。
測定は日立７１７０を使用して次のように行った。各試料１〜５ １５μＬにいずれかの第一試薬１８０μＬを添加して混合し、３７℃で５分間反応させた。次に第二試薬１２０μＬを添加混合し、さらに３７℃で５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍ）変化を測定した。
まず、試料１および２を、試薬Ｉ〜Ｖを用いてそれぞれ測定し、その場合の試料に添加したホモシステインに対する測定感度をそれぞれ１００％とした。次いで、試料３〜５を試薬Ｉ〜Ｖを用いてそれぞれ測定した場合、試料３〜５の測定感度は、以下の表１のとおりであった。
［実施例５］ＤｄｌおよびＤｓｄによるＤ−アラニンおよびＤ−セリンの消去
試料（４種類）を次のように調製した：
試料１：正常コントロール血清セラクリアＨＥ（アズウェル社製）
試料２：試料１にホモシスチンを２５μＭ（ホモシステイン換算値５０μＭ）添加
試料６：試料２にＤ−アラニンを２００μＭ添加
試料７：試料２にＤ−セリンを１０００μＭ添加。
第一試薬および第二試薬を次のように調製した：
第一試薬：
５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）、１２３Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、５．６ｍＭ ジチオスレイトール、０．０６ｍＭ Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、１ｍＭ 臭化亜鉛、０．３ｍＭ ＤＡ−６７、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む試薬に、ＤｄｌＢを０、０．０７３、０．１４５、０．２９および０．５８Ｕ／ｍＬ添加した試薬およびＤｓｄを０、０．１２５、０．２５および０．５Ｕ／ｍＬ添加した試薬。
第二試薬：
５０ｍＭ クエン酸（ｐＨ５．６）、２３ｍＭ ＮＥＭ、６．４Ｕ／ｍＬ ブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、５．５Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼを含む試薬。
測定は日立７１７０を使用して次のように行った。試料１５μＬに第一試薬１８０μＬを添加して混合し、３７℃で５分間反応させた。次に第二試薬１２０μＬを添加して混合し、さらに３７℃で５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍ）変化を測定した。
結果を図４および図５に示す。
図４は、横軸にＤｄｌＢの濃度、および縦軸にホモシステイン測定時の相対感度を示した。約０．５Ｕ／ｍＬのＤｄｌＢを用いることにより、２００ｍＭ Ｄ−アラニンの影響はほぼ回避できることがわかった。
図５は、横軸にＤｓｄの濃度、および縦軸にホモシステイン測定時の相対感度を示した。約０．２Ｕ／ｍＬのＤｓｄを用いることにより１０００ｍＭ Ｄ−セリンの影響をほぼ回避することができた。
［実施例６］ＤｄｌおよびＤｓｄによる試料中のＤ−アミノ酸の影響回避
試料は、ＥＤＴＡ血漿１２検体を用いた。スタンダードとしては、コントロール血清に５０μＭ Ｄ−メチオニンを添加したものを用いた。
第一試薬３種類（ｉ〜ｉｉｉ）および第二試薬１種類（共通）を次のように調製した。
第一試薬：
試薬ｉ：５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）、１２６Ｕ／Ｌホモシステインメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、５．６ｍＭ ジチオスレイトール、０．０６ｍＭ Ｄ−メチオニンメチルスルホニウム、１ｍＭ 臭化亜鉛、０．３ｍＭ ＤＡ−６７
試薬ｉｉ：試薬ｉからホモシステインメチルトランスフェラーゼを除く
試薬ｉｉｉ：試薬ｉに５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．５８Ｕ／ｍＬ ＤｄｌＢ、１Ｕ／ｍＬ Ｄｓｄを添加。
第二試薬：
５０ｍＭ クエン酸（ｐＨ５．６）、２３ｍＭ ＮＥＭ、６．４Ｕ／ｍＬ ブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、５．５Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼを含む。
測定は日立７１７０を使用して次のように行った。試料１５μＬにいずれかの第一試薬１８０μＬを添加して混合し、３７℃で５分間反応させた。次に第二試薬１２０μＬを添加して混合し、さらに３７℃で５分間反応させた。測定ポイント１６から３４における吸光度（主波長６６０ｎｍ、副波長７５０ｎｍ）変化を測定した。スタンダードの吸光度変化から試料中のホモシステイン濃度を算出した。試薬Ａのみを用いて測定した値を従来１チャンネル法とし、試薬ｉと試薬ｉｉとの差をとって測定した値を従来２チャンネル法とし、そして試薬ｉｉｉを用いて測定した値を本発明法とした。それぞれの値をＨＰＬＣ法による測定値と比較した。
図６からわかるように、従来１チャンネル法に比較して、本発明法は、ＨＰＬＣ法との相関性が改善され、そして従来２チャンネル法に劣らない相関性を示した。
本発明の方法によれば、内因性Ｄ−アミノ酸の影響を受けず、かつ検体ブランクをとる必要なく、ホモシステインを測定することができる。すなわち、操作が簡便でありかつ正確なホモシステインの測定が可能となる。
Claims (6)
- 試料中のホモシステインを検出または測定する方法であって、
（ａ）試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程；
（ｂ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程；
（ｃ）該還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程；および
（ｄ）該生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、
を含む、方法。 - 前記工程（ａ）が、試料中に存在するＤ−アラニンに、アデノシン三リン酸の存在下でＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼを作用させてＤ−アラニル−Ｄ−アラニンに変換する工程および／または試料中に存在するＤ−セリンに、Ｄ−セリンデヒドラターゼを作用させてピルビン酸に変換する工程である、請求項１に記載の方法。
- 前記メチル転移酵素が、ホモシステインメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体が、Ｄ−メチオニンメチルスルホニウムである、請求項２に記載の方法。
- 前記工程（ｄ）において、前記生成した過酸化水素を、パーオキシダーゼおよび酸化系発色剤により発色させて検出または測定する、請求項２または３に記載の方法。
- Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼおよび／またはＤ−セリンデヒドラターゼ；チオール化合物；メチル転移酵素；メチル供与体；Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ；ＳＨ試薬；および酸化系発色剤を含む、ホモシステイン測定用試薬キット。
- 試料中のホモシステインを検出または測定する方法であって、試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程を含むことを特徴とする、方法。
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