JP3786966B2 - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、その製造方法、及び該酵素を用いたアマドリ化合物の測定方法 - Google Patents
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- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
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Description
技術分野
本発明は、新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに関し、さらに詳しくは、アスペルギルス属（Aspergillus）の菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産方法、該酵素を用いたアマドリ化合物の分析法、及び該酵素を含有する試薬及びキットに関する。
本発明は、酵素を用いるアマドリ化合物の測定方法、さらに詳しくは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼによる新規なアマドリ化合物の測定方法、及び該方法に用いられる試薬及びキットに関する。
背景技術
アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数で表される。従って、その生成量から、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができると考えられている。アマドリ化合物を含有する物質としては、醤油等の食品、及び血液等の体液がある。
生体では、グルコースとアミノ酸が結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成している。例えば、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパクが糖化された誘導体の還元能はフルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の診断及び症状の管理の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を測定することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。このように、アマドリ化合物の分析は医学及び食品を含む広範な分野で有用である。
従来、アマドリ化合物の測定法としては、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法［Chromatogr.Sci.10:659(1979)］、ホウ酸を結合させた固体をつめたカラムを用いる方法［Clin.Chem.28:2088-2094(1982)］、電気泳動［Clin.Chem.26:1598-1602(1980)］、抗原−抗体反応を利用する方法［ＪＪＣＬＡ 18: 620(1993),機器・試薬16: 33-37(1993)］，フルクトサミンの測定法［Clin.Chim.Acta 127: 87-95 (1982)］，チオバルビツール酸を用いて酸化後比色定量する方法[Clin.Chim.Acta 112: 197-204 (1981)]などが知られているが、高価な機器が必要であったり、必ずしも正確で迅速な方法ではなかった。
近年、酵素の有する特性(基質、反応、構造、位置などの特異性)に起因して、選択的に目的物質を迅速かつ正確に分析することができることから酵素反応を利用する方法が臨床分析や食品分析の分野で普及してきた。
既に、アマドリ化合物に酸化還元酵素を作用させ、その反応における酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することにより、アマドリ化合物を測定する分析法が提案されている（例えば、特公平5-33997号公報、特公平6-65300号公報、特開平2-195900号公報、特開平3-155780号公報、特開平4-4874号公報、特開平5-192193号公報、特開平6-46846号公報）。さらに、糖尿病の診断のための糖化タンパクの測定法も開示されている（特開平2-195899号公報、特開平2-195900号公報、特開平5-192193号公報(EP 0 526 150 A)、特開平6-46846号公報（EP 0 576 838 A））。
アマドリ化合物の酸化還元酵素による反応は下記の一般式で表すことができる。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
上記の反応を触媒する酵素として以下のものが知られている。
１．フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（特公平5-33997号公報、特公平6-65300号公報）、アスペルギルス属（Aspergillus）（特開平3-155780号公報）。
２．フルクトシルアミンデグリカーゼ：カンジダ属（Candida）（特開平6-46846号公報）。
３．フルクトシルアミノ酸分解酵素：ペニシリウム属（Penicillium）（特開平4-4874号公報）。
４．ケトアミンオキシダーゼ：コリネバクテリウム属、フサリウム属、アクレモニウム属又はデブリオマイセス属（特開平5-192193号公報）
５．アルキルリジナーゼ：J.Biol.Chem.239巻、第3790−3796頁（1964年）記載の方法で調製。
しかしながらこれらの酵素による方法には、下記の問題点があった。
即ち、糖尿病の診断における指標となる、血中の糖化タンパクは糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン及びフルクトシルアミンである。糖化アルブミンはタンパク分子中のリジン残基のε位にグルコースが結合して生成される［Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. 261:13542-13545(1986)］。糖化ヘモグロビンは［Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. 254:3892-3898(1979)］、リジン残基の他にβ鎖のＮ末端バリンにもグルコースが結合している。従って糖尿病の指標となる糖化タンパクの測定には、フルクトシルバリンに比べてフルクトシルリジンに対する特異性の高い酵素を用いる必要があった。しかし、既存のコリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンには作用せず、特開平3-155780記載のアスペルギルス属由来の酵素は、フルクトシルリジンに対する活性が、フルクトシルバリンに対する活性より低く、糖化タンパク又はその加水分解物に対する作用については明らかにされていない。他方、特開平5-192193号公報記載のケトアミンオキシダーゼはフルクトシルバリンは分解し得るが、リジン残基に糖が結合している糖化タンパクを正確に測定することはできない。フルクトシルアミンデグリガーゼは、ジフルクトシルリジンに高い活性があるのでリジン残基のε位の糖化物を特異的に測定することができず、またバリン残基の糖化物を特異的に測定することもできない。さらにアルキルリジナーゼを用いる方法は糖類以外がリジンに結合した物質に対しても作用し、糖化物に対する特異性が低いという問題があり、正確な測定が期待できなかった。特開平4-4874号記載のペニシリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンとフルクトシルアラニンに作用する酵素である。
このように、従来の酵素は糖化タンパクの正確な定量には適さず、フルクトシルバリンに比べてフルクトシルリジンに対する特異性が高い酵素の開発が待たれていた。
一般的に、酵素を用いる分析法が正確かつ有用となるためには、分析の目的に最適な酵素を選択する必要がある。即ち、酵素の基質である被検物質の種類、測定試料の状態、測定条件など、種々の条件を考慮して適切な酵素を用いなければ、再現性のある正確な分析を行う事ができない恐れがある。そのような酵素を選択するためには、より多くのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産し、それらの特性を明らかにしておくことが望ましい。
発明の開示
本発明者らは、アマドリ化合物、特に糖化タンパクに特異的に作用する新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することを目的として鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス属（Aspergillus）の菌をフルクトシルリジン及び／又は、フルクトシルＮα−Ｚ−リジンの存在下で培養すると、目的の活性を有する酵素が誘導されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、フルクトシルリジン及びフルクトシルＮα−Ｚ−リジンの少なくとも一方を含有する選択培地によって選択的に生育されるアスペルギルス属（Aspergillus）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生能を有する菌の培養物から得られることを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供するものである。
本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ生産菌の培養に用いるフルクトシルリジン及び／又は、フルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地は、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを温度１００〜１５０℃において３〜６０分間、オートクレーブ処理することにより得られるフルクトシルリジン及び／又は、フルクトシルＮα−Ｚ−リジン（以下、ＦＺＬと略称することもある。）を含有する。
後述するように、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼはフルクトシルリジン及びフルクトシルバリンの両者に活性があるが、その活性は同等か、前者よりも後者に対する活性が高いという特徴を有する。なお、本明細書中では、本発明のアスペルギルス属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをＦＡＯＤ、又はＦＡＯＤ−Ａ、ＦＡＯＤ−Ｌと称することもある。
【図面の簡単な説明】
図１は、培養培地でのＦＡＯＤ−Ｌの生産量と培養時間との関係を示すグラフである。
図２は、ＦＡＯＤ−Ａの活性と至適pＨの関係を示すグラフである。
図３は、ＦＡＯＤ−Ｌの活性と至適ｐＨの関係を示すグラフである。
図４は、ＦＡＯＤ−Ａの活性と至適温度の関係を示すグラフである。
図５は、ＦＡＯＤ−Ｌの活性と至適温度との関係を示すグラフである。
図６は、スーパーデックス２００pgを用いたゲルろ過による、アスペルギルス・テレウスIFO 6365（FERM BP−5756）（Aspergillus terreus）由来の精製ＦＡＯＤ−Ａの分子量測定の結果を示すグラフである。
図７は、アスペルギルス・テレウスGP1（FERM BP-5684）（Aspergillus terreus GP1）由来の精製ＦＡＯＤ−ＬのＵＶ吸収スペクトルである。
図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）における、アスペルギルス・テレウスGP1（FERM BP-5684）（Aspergillus terreus GP1）由来の精製ＦＡＯＤ−Ｌの泳動パターンを示す写真の模写図。
図９は、スーパーデックス２００pgを用いたゲルろ過による、アスペルギルス・テレウスGP1（FERM BP-5684）（Aspergillus terreus GP1）由来の精製ＦＡＯＤ−Ｌの分子量測定の結果を示すグラフである。
図１０は、糖化ヒト血清アルブミンの濃度とＦＡＯＤ−Ｌの作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフである。
図１１は、ヒト血清アルブミンの糖化率と、ＦＡＯＤ−Ｌの作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフである。
図１２は、糖化ヘモグロビンの濃度とＦＡＯＤ−Ｌの作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の酵素は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ生産能を有するアスペルギルス属（Aspergillus）の菌をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地で培養することにより生産することができる。そのような菌として、アスペルギルス・テレウス（IFO 6365，FERM BP-5756）(Aspergillus terreus)、アスペルギルス・テレウスGP1(FERM BP-5684)(Aspergillus terreus GP1)、アスペルギルス・オリザ（IFO 4242，FERM BP-5757）(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・オリザ（IFO 5710）（Aspergillus oryzae）などの菌を挙げることができる。
本発明のＦＡＯＤの生産に用いるフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬは、グルコース０.０１〜５０重量％とリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％とを溶液中で、１００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処理する方法で製造される。具体的には、全量１０００ｍｌの溶液中にグルコース２００ｇ、Ｎα−Ｚ−リジン１０ｇを溶解させ、通常１２０℃、２０分間オートクレーブ処理することによって製造することができる。
また、本発明のＦＡＯＤの生産に用いるフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ含有培地（以下、ＦＺＬ培地と称する）は、上記の方法で得られたフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを通常の培地に添加するか、例えば、グルコース０.０１〜５０重量％、リジン及び／又はＮα−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％、Ｋ2ＨＰＯ4０.１重量％、ＮａＨ2ＰＯ4０.１重量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０.０５重量％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ０.０１重量％及び酵母エキス０.２重量％を含有する混合物（好ましくはｐＨ５.５−６.０）を１００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処理することによって得ることができる。
本発明のＦＡＯＤの生産に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養源を含有する通常の合成あるいは天然の培地であってよく、炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、グリセリン等、窒素源としては、ペプトン、カゼイン消化物、酵母エキス、等を用いることができる。さらに無機物としてはナトリウム、カリウム、カルシウム、マンガン、マグネシウム、コバルト等、通常の培地に含有されるものを用いることができる。
本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを含有する培地で培養したとき、最もよく誘導される。好ましい培地の例として、上記の方法で得られたＦＺＬを単一の窒素源とし、炭素源としてグルコースを用いるＦＺＬ培地（１.０％グルコース、０.５％ＦＺＬ、１.０％Ｋ2ＨＰＯ4、０.１％ＮａＨ2ＰＯ4、０.０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.０１％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ及び０.０１％ビタミン混合物）を挙げることができる。特に好ましい培地は、全量１，０００ml中にグルコース２０ｇ（２％）、ＦＺＬ １０ｇ（１％）、Ｋ2ＨＰＯ4１.０ｇ（０.１％）、ＮａＨ2ＰＯ4１.０ｇ（０.１％）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０ ０.５ｇ（０.０５％）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.１ｇ（０.０１％）及び酵母エキス２.０ｇ（０.２％）を含有する培地（ｐＨ５.５−６.０）である。ＦＺＬ培地は、通常の培地にＦＺＬを添加するか、グルコースとＮα−Ｚ−リジンとを含有する培地をオートクレーブ処理することによって調製することができる。いずれの方法によっても得られる培地はフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬの存在によって褐色を呈しており、ＦＺＬ褐変化培地又はＧＬ（グリケーテッドリジン及び／又はグリケーテッドＮα−Ｚ−リジン）褐変化培地と称する。
培養は、通常、２５〜３７℃、好ましくは２８℃で行われる。培地のｐＨは４.０〜８.０の範囲であり、好ましくは５.５〜６.０である。しかしながら、これらの条件はそれぞれの菌の状態に応じて適宜調製されるものであり上記に限定されない。この条件下、２０〜１００時間、好ましくは８０時間培養すると、ＦＡＯＤが培養培地に蓄積される（図１）。
このようにして得られた培養物は、常法に従い、核酸、細部壁断片等を除去し、酵素標品を得ることができる。
本発明のＦＡＯＤの酵素活性は菌体中に蓄積されるので、培養物中の菌体を破砕し、酵素生産に用いる。
細胞の破砕は、機械的手段又は溶媒を利用した自己消化、凍結、超音波処理、加圧などのいずれでもよい。
酵素の分離精製方法も既知であり、硫安などを用いる塩析、エタノール等の有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーやゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどを組み合わせて精製する。
例えば、培養物を、遠心又は吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、０.１Ｍトリス−塩酸（pＨ８.５）に懸濁し、Dyno-Millによって菌糸体を破砕する。次いで、遠心分離して得た上清を無細胞抽出液として、硫安分画、フェニル−セファロース疎水クロマトグラフィーで処理することにより精製する。
しかしながら、本発明の目的から、ＦＡＯＤは、その精製度にかかわらず、アマドリ化合物の酸化反応を触媒することができる限り、培養液をはじめとする、あらゆる精製段階の酵素含有物及び溶液を包含する。また、酵素分子の内、触媒活性に関与する部位のみでも、本発明目的を達成することができることから、任意の、アマドリ化合物酸化活性を有するフラグメントをも包含するものとする。このようにして得られたＦＡＯＤは、アマドリ化合物の定量、特に糖尿病の診断のための糖化タンパクの定量に有用である。
従って、本発明は、遊離又は保護基を有するアミノ酸の糖化物及び／又はタンパクの糖化物を含有する培地で、真菌類を培養することによって該真菌類にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産させることを特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供するものである。
さらに、本発明は、アスペルギルス属（Aspergillus）の、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産することができる菌株をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地で培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産方法を提供するものである。これらの属の菌株が生産するＦＡＯＤはいずれも本発明が解決すべき技術的な課題の解決に有用である。
本発明のＦＡＯＤ−Ｌ産生菌である、アスペルギルス・テレウスGP1は、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌株であり、その菌学的特性は以下の通りである。
（１）培地における生育状況
Czapek寒天培地、酵母ＭＹ培地における生育は、いずれの培地でも非常に良好である。２５℃の恒温器で１０日間培地するとビロード状、まれに羊毛状にペトリ皿に広がり、集落裏面は無色から褐色を呈する。
（２）分類学的性質
分離した菌の同定は、微生物をCzapek寒天培地で培養し、分生子、分生子柄や分生子頭などの顕微鏡下の形態観察から行った。分生子頭は長円筒型で褐色から赤褐色である。分生子柄は滑面で無色であり、多少の屈曲が見られ先端は肥大して頂のうとなっている。頂のうは半球形で上半部より無色のメトレを生じている。これらのことから、GP1株はアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）と同定された。本菌株は、茨城県つくば市東1丁目1丁目3号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5684の下で寄託されている（原寄託日：1996年5月31日；国際寄託への移管日：1996年9月30日）。
また、本発明のＦＡＯＤ−Ａ産生菌であるアスペルギルス・テレウスIFO 6365及びアスペルギルス・オリザIFO 4242は、財団法人発酵研究所（大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）より分譲されるものであり、上記住所の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれ、受託番号FERM BP-5756及びFERM BP-5757の下で寄託されている（寄託日：1996年11月25日）。なお、アスペルギルス・オリザIFO 5710は、上記住所の財団法人発酵研究所に寄託されて、第三者が請求により何時でも入手可能な状態で３０年以上登録され続けられる。
以下に本発明のＦＡＯＤの特性を詳細に説明する。
１．一般的な誘導特性
本発明のＦＡＯＤ-Ｌは、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬによって誘導される誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ培地で、例えば、アスペルギルス・テレウス ＧＰ１を培養することにより生産される。
本発明のＦＡＯＤ-Ａは、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬによって誘導される誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ培地で、例えば、アスペルギルス・テレウスIFO 6365又はアスペルギルス・オリザIFO 4242を培養することにより生産される。
ＦＡＯＤは、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを共にオートクレーブして得られるＧＬ褐変化培地で誘導されるが、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを別々にオートクレイブ処理して調製した培地では誘導されないことから、該酵素はアマドリ化合物に特異的に作用するものである。
以下に本発明のＦＡＯＤの特性を詳細に説明する。
１．一般的な誘導特性
本発明のＦＡＯＤはフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬによって誘導される誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ培地で、アスペルギルス属（Aspergillus）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ生産菌を培養することにより生産される。
ＦＡＯＤは、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを共にオートクレーブして得られるＧＬ褐変化培地で誘導されるが、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを別々にオートクレイブ処理して調製した培地では誘導されないことから、該酵素はアマドリ化合物に特異的に作用するものである。
２．反応特異性及び基質特異性
本発明のＦＡＯＤは、式：
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
で示される反応における触媒活性を有する。上記の反応式において、Ｒ1が−ＯＨ、−（ＣＨ2）n−又は−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ（式中、ｎは０−６の整数）であり、Ｒ2が−ＣＨＲ3−［ＣＯＮＨＲ3］mＣＯＯＨ（式中、Ｒ3はα−アミノ酸側鎖残基、ｍは１−４８０の整数を表す）で示されるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、Ｒ3がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなどから選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またｎが５〜６、ｍが５５以下である化合物が好ましい。
本発明のＦＡＯＤ生産能力を有する菌株を下記表１に例示する。
表１に示されているように、本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルリジンに対する活性がフルクトシルバリンに対する活性と同等か、より高い特徴を有しており、このことは該ＦＡＯＤが糖化タンパクの測定に有用であることを示唆するものである。
さらに、A. terreus IFO6365由来のＦＡＯＤ−Ａの各基質に対する活性を以下の表２に示す。
表２から、本発明のＦＡＯＤ−Ａはフルクトシルリジン及びフルクトシルバリンに対して活性を有し、又フルクトシルポリリジンにも活性を示すことが分かる。このことは、糖化ヘモグロビンの測定にも有用であることを示唆している。また、A. terreus GP1由来のＦＡＯＤ−Ｌの各基質に対する活性を以下の表３に示す。
表３から、本発明のＦＡＯＤ−Ｌはフルクトシルリジン及びフルクトシルバリンに対して活性を有し、又フルクトシルポリリジンにも活性を示すことが分かる。さらに、糖化タンパクのプロテアーゼ消化物に対する活性も認められており、このことは、糖化ヘモグロビンの測定に有用であることを示唆している。
３．力価の測定
酵素の力価測定は下記の方法で行った。
（１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方法。
Ａ.速度法
１００ｍＭ ＦＺＬ溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で３.０ｍｌとする。３０℃で２分間インキュベートした後、１００ｍＭ ＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位（ユニット：Ｕ）とする。
Ｂ.終末法
上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、３０分間３０℃でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を測定し、あらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作成した検量線から生成した過酸化水素量を算出することにより、酵素活性を測定する。
（２）酵素消費量を測定する方法
０.１Ｍトリス-塩酸緩衝液（pＨ８.０）1ｍｌと酵素溶液５０μｌを混合し、蒸留水で全量を３.０ｍｌとし、ランク ブラザーズ社の酸素電極のセルに入れる。３０℃で攪拌し、溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭ ＦＺＬ １００μｌを添加し、酸素消費量を記録計で連続的に計測し、初速度を得る。標準曲線から１分間に消費された酸素量を求め、これを酵素単位とする。
４．ｐＨ及び温度条件
ｐＨ条件の検討
至適pＨは、通常のＦＡＯＤ活性測定法（上記３．力価の測定法における（１）、Ａ法参照）で使用する緩衝液をｐＨ５〜１１の各種緩衝液（０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）、トリス−塩酸緩衝液及びグリシン−ＮａＯＨ緩衝液）に置き換えて酵素反応を行い検討した。
また、前記の各種緩衝液にＦＡＯＤを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした後、通常の条件（３０℃、ｐＨ８.０）で活性を測定する事によりpＨによる安定性を検討した。
温度条件の検討
至適温度を検討するために、反応温度を２０〜６０℃まで変化させて酵素活性を測定した。温度安定性については、０.１Ｍトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解したＦＡＯＤを２０〜６０℃の各温度で１０分間インキュベートし、その酵素液を用いて通常の条件で残存活性を測定した。上記方法で測定した結果、本発明のＦＡＯＤ−Ａの至適ｐＨは、７.５〜９.０、より好ましくは８.５であり（図２）、安定なｐＨ域は、７.０〜１０.０であった。また、ＦＡＯＤ−Ｌの至適ｐＨは、７.５〜９.０、より好ましくは８.０であり（図３）、安定なｐＨ域は、４.０〜１３.０であった。
また、ＦＡＯＤ−Ａの酵素反応は２０〜４０℃、より好ましくは３５℃で効率よく進行した（図４）。安定な温度領域は２０〜４０℃であった。ＦＡＯＤ−Ｌの酵素反応は２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃、より好ましくは３５℃で効率よく進行した（図５）。安定な温度領域は２０〜５０℃であった。
５．既知の酵素との比較
既存の菌由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、本発明のＦＡＯＤとを比較した。
表４から、本発明のＦＡＯＤと他の２種の菌株由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの間に、以下のような相違点が認められる。
すなわち、本発明によって製造し得るＦＡＯＤは、フルクトシルバリンよりもフルクトシルリジンに対する活性が高いが、コリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンには作用せず、特開平3-155780号記載のアスペルギルスｓｐ.由来の酵素はフルクトシルリジンに対する活性が、フルクトシルバリンに対する活性に比べて低い。
６．ＦＡＯＤ−Ａ及びＦＡＯＤ−Ｌの分子量
ＦＡＯＤ−Ａ及びＦＡＯＤ−Ｌの分子量をスーパーデックス200pgゲルを用いたゲルろ過で調べた。結果を表５に示す。
表５から明らかなように、本発明のＦＡＯＤ−Ａ及びＦＡＯＤ−Ｌは分子量が異なっており、異なる酵素であることが分かる。
７．酵素の阻害、活性化及び安定化
（１）金属の影響
０.１Ｍトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）に、各種金属イオンを終濃度１mＭとなるように添加し、３０℃で５分間インキュベートした後、活性を測定した。結果を下記の表６、７に示す。
表６から明らかなように、本発明のＦＡＯＤ−Ａの酵素活性に対し、亜鉛イオン及び水銀イオンが阻害的であり、マンガンイオン及びコバルトイオンも阻害した。
表７から明らかなように、本発明のＦＡＯＤ−Ｌの酵素活性に対し、銅イオン、亜鉛イオンが阻害的であり、銀イオン及び水銀イオンは完全に阻害した。
（２）各種阻害物質の影響
上記（１）の金属イオンの影響に関する試験と同様の方法で試験した。ただし、パラクロロ安息香酸第二水銀は終濃度０.１mＭ、それ以外は１mＭとした。結果を表８、９に示す。
表８から明らかに、ＦＡＯＤ−Ａ活性はＰＣＭＢ、ＤＴＮＢ、フェニルヒドラジンにより完全に阻害された。
表９から明らかに、ＦＡＯＤ−Ｌ活性はＰＣＭＢ、ＤＴＮＢ、ヒドラジンにより強く阻害された。
これより、ＦＡＯＤの酵素反応にはＳＨ基及びカルボニル基が重要な働きをしていることが予想される。このため、ＦＡＯＤの保存に適した緩衝液は１〜２ｍＭのジチオスレイトール含有のpＨ７.５〜９.０の緩衝液であると考えられる。
スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過［カラム：Superdex 200 pg HR16/60；バッファー：0.2Mリン酸カリウム(pH7.0)；流速１ml/min；試料：各タンパク0.5mgをサンプルバッファー0.2mlに溶解］では、ＦＡＯＤ−Ａは分子量は約５０,０００（５０ｋＤａ）と推定された（図６）。また、同様の方法でＦＡＯＤ−Ｌのゲルろ過を行ったところ、分子量は約９４，０００（９４ｋＤａ）と推定された（図９）。
即述のごとく、本発明の酵素ＦＡＯＤは、アマドリ化合物の定量に有用である。従って、本発明は、アマドリ化合物を含有する試料と、本発明のＦＡＯＤとを接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法を提供するものである。本発明の分析法は、生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、又はフルクトシルアミンの定量に基づいて行われる。
ＦＡＯＤの酵素活性は下記の反応に基づいて測定される。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
被検液としては、アマドリ化合物を含有する任意の試料溶液を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿又は血清）、尿等の生体由来の試料の外、醤油等の食品が挙げられる。
本発明のＦＡＯＤをアマドリ化合物含有溶液に、適当な緩衝液中で作用させる。反応溶液のｐＨは、ＦＡＯＤ−ＡでｐＨ６.０〜１０.０、好ましくは８.５、温度は２０〜５０℃、好ましくは３５℃である。また、ＦＡＯＤ−ＬでｐＨ７.０〜９.０、好ましくは８.５、温度は２５〜４０℃、好ましくは３５℃である。緩衝液としてはトリス-塩酸等を用いる。ＦＡＯＤの使用量は、終点分析法においては通常、０.１ユニット／ml以上、好ましくは１〜１００ユニット／mlである。
本発明の分析法では、下記のいずれかのアマドリ化合物の定量法を用いる。
（１）過酸化水素発生量に基づく方法
当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化水素及びアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、上記３の力価の測定に準じる。ただし、ＦＡＯＤ量は１ユニット／ｍｌとし適当に希釈した試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。過酸化水素の発色系としては、パーオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により発色する系を用いることができる。
色原体として、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等があり、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン、２,４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン等が挙げられる。又パーオキシダーゼの存在下で酸化発色を示すロイコ型発色試薬も用いることができ、そのようなロイコ型発色試薬は、当業者に既知であり、ｏ−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３,３−ジアミノベンジジン、３,３,５,５−テトラメチルベンジジン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４,４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３,７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられる。
（２）酸素の消費量に基づく方法
反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引いた値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、上記３の力価の測定に準じて行う。ただし、用いるＦＡＯＤ量は１ユニット／mlとし、適当に希釈した試料を添加し、消費される酸素量を求める。
本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行うこともできるが、対象となる糖化タンパクによっては、あらかじめ糖が結合したリジン及び／又はバリン残基を遊離させてから行うことが好ましい。
そのような目的には、タンパク質分解酵素を用いる場合(酵素法)と、塩酸等の化学物質を用いる場合(化学法)がある。酵素法の場合、本発明方法には当業者に既知である、エンド型及びエキソ型のタンパク質分解酵素(プロテアーゼ)を用いることができる。エンド型のプロテアーゼには、例えばトリプシン、α−キモトリプシン、ズブチリシン、プロティナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ブロメライン、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＩＶ、リジルエンドペプチダーゼ、プロレザー、ブロメラインＦ等がある。一方、エキソ型のプロテアーゼにはアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる。酵素処理の方法も既知である。
上記のごとく、本発明のＦＡＯＤは、糖化タンパクに含まれるフルクトシルリジンに高い基質特異性を有するものであることから、血液試料中の糖化タンパクを測定することを含む、糖尿病の診断などに有用である。また、フルクトシルバリンにも特異性を有することから、糖化ヘモグロビンの測定にも有用である。
なお、検体として血液試料（全血、血漿又は血清）を用いる場合、採血した試料をそのまま、あるいは透析等の処理をした後用いる。
さらに、本発明方法に用いるＦＡＯＤ、パーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いてもよいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例えば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の点でも好ましい。
さらには、酵素と発色色素とを適宜組み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なアマドリ化合物の分析のためのキットを得ることができる。
酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン酸、カラギーナン、などがある。結合は共有結合、イオン結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既知の方法で行う。
固定化酵素を用いる場合、分析はフロー又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、固定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分析（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診断を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化タンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度に対する糖化タンパク質の濃度の比率（糖化率）又はフルクトサミン値で表す。全タンパク質濃度は、通常の方法（２８０nmの吸光度、ブラッドフォード法、Lowry法、ビュレット法、アルブミンの自然蛍光、ヘモグロビンの吸光度など）で測定することができる。
本発明はまた、本発明のＦＡＯＤを含有するアマドリ化合物の分析試薬又はキットを提供するものである。
本発明のアマドリ化合物の定量のための試薬は、本発明のＦＡＯＤと好ましくはｐＨ７.０〜９.０、より好ましくはｐＨ８．０〜８.５の緩衝液からなる。該ＦＡＯＤが固定化されている場合、固体支持体は高分子ゲルなどから選択され、好ましくはアルギン酸である。
試薬中のＦＡＯＤの量は、終点分析を行う場合、試料あたり、通常、１〜１００ユニット／ml、緩衝液はトリス-塩酸（ｐＨ８．０及び８.５）が好ましい。
過酸化水素の生成量に基づいてアマドリ化合物を定量する場合、発色系としては、先述の「(1)過酸化水素発生量に基づく方法」に記載の酸化縮合により発色する系、並びにロイコ型発色試薬等を用いることができる。
本発明のアマドリ化合物の分析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための色基準あるいは標準物質を組み合わせてキットとすることもできる。そのようなキットは、予備的な診断、検査に有用であると考えられる。
上記の分析試薬及びキットは生体成分中の糖化タンパク量及び／又は糖化率の測定、又は、フルクトシルアミンを定量するために、用いられるものである。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１ アスペルギルス・テレウスの培養とＦＡＯＤ−Ａの精製
１）培養
アスペルギルス・テレウスIFO6365（FERM BP-5756）；A.terreus）をＦＺＬ ０.５％、グルコース１.０％、リン酸二カリウム０.１％、リン酸一ナトリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、塩化カルシウム０.０１％、イーストエキス０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０）７Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて２８℃、８０時間振とう培養した。培養物は瀘過して集めた。
２）粗酵素液の調製
菌糸体１００ｇ（湿重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）２００mlに懸濁し、１／２容のジルコニウムビーズを加え、ビードビーターを用いて１分間破砕、１分氷冷を２回、合計３分間行うことにより菌糸体を破砕した。破砕液を４℃で、９,５００ｒｐｍ，１０分間遠心分離し、得られた上清（無細胞抽出液）を粗酵素液として、以下の方法で精製した。
３）精製
ステップ１：硫安分画
粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、遠心分離（４℃，１２,０００ｒｐｍ）して余分なタンパクを除去した。さらに、上清に硫安を８０％飽和になるように添加して沈殿を回収した。
ステップ２：イオン交換クロマトグラフィー
ステップ１で得られた沈殿を、２ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、緩衝液Ａと略す）に溶解し、同緩衝液で一晩透析した後、緩衝液Ａで平衡化したDEAE-トヨパール（DEAE-TOYOPEARL）カラムに透析内液を吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜０.５Ｍ塩化カリウムの直線濃度勾配で溶出した。これを回収して硫安で濃縮してから次のステップに用いた。
ステップ３：疎水クロマトグラフィー
回収した活性画分をフェニルトヨパールカラム（４０％硫安を含む緩衝液Ａで平衡化）に用いた。濃縮液を吸着させ、同緩衝液で洗浄した。活性画分は４０〜０％硫安の直線勾配で得られた。
ステップ４：ゲル濾過
最後にスーパーデックス200pg（２ｍＭ ＤＴＴを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）で平衡化）により、ゲルろ過を行った。これにより、約１０ユニットの酵素標品を得た。精製酵素の力価の測定は、上記「３．力価の測定」における（１），Ａ法により行った。
分子量の測定
スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過［カラム：Superdex 200 pg HR16/60］；バッファー：0.2Mリン酸カリウム(pH7.0)；流速１ml/min；試料：各タンパク0.5mgをサンプルバッファー0.2mlに溶解］では、分子量は約５０,０００（５０ｋＤａ）と推定された（図６）。
実施例２ アスペルギルス・テレウスＧＰ１の培養とＦＡＯＤ−Ｌ精製
１）培養
アスペルギルス・テレウスＧＰ１（FERM BP-5684）；Aspergillus terreus GP1）をＦＺＬ ０.５％、グルコース１.０％、リン酸二カリウム０.１％、リン酸一ナトリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、塩化カルシウム０.０１％、イーストエキス０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０）１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて通気量２Ｌ／分、攪拌速度４００ｒｐｍの条件で２８℃、８０時間攪拌培養した。培養物は瀘過して集めた。
２）粗酵素液の調製
菌糸体２７０ｇ（湿重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）８００mlに懸濁し、Ｄino−Ｍillにより菌糸体を破砕した。破砕液を９,５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清（無細胞抽出液）を粗酵素液として、以下の方法で精製した。
３）精製
ステップ１：硫安分画
粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、遠心分離（４℃，１２,０００ｒｐｍ）して余分なタンパクを除去した。さらに、上清に硫安を７５％飽和になるように添加して沈殿を回収した。
ステップ２：疎水クロマトグラフィー（バッチ法）
ステップ１で得られた沈殿を、２ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）（以下、緩衝液Ａと略す）に溶解し、等量の硫安４０％を含む緩衝液Ａを添加した。同粗酵素液にブチルトヨパール（butyl-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）樹脂２００mlを加えて、バッチ法による吸着を行った。溶出も、緩衝液Ａを用いたバッチ法で行い、活性画分は硫安沈殿により濃縮した。
ステップ３：疎水クロマトグラフィー
２５％硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したフェニルトヨパール（phenyl-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラムに濃縮した活性画分を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、２５〜０％硫安の直線勾配で溶出した。回収した活性画分は硫安沈殿により濃縮し、次のステップに用いた。
ステップ４：疎水クロマトグラフィー（カラム法）
回収した活性画分をブチルトヨパールカラム（４０％硫安を含む緩衝液Ａで平衡化）に用いた。濃縮液を吸着させ、同緩衝液で洗浄した。活性画分は４０〜０％硫安の直線勾配で得られた。
ステップ５：イオン交換クロマトグラフィー
次に、ＤＥＡＥ−トヨパール（ＤＥＡＥ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラムクロマトグラフィーを行った（緩衝液Ａで平衡化）。洗浄画分にＦＡＯＤ活性が認められたため、これを回収して硫安で濃縮してから、次のステップに用いた。
ステップ６：ゲル濾過
最後にセファクリル−３００によるゲル瀘過をおこなった（０.１Ｍ ＮａＣl，２mＭ ＤＴＴを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）で平衡化）。これにより、７０〜１００ユニットの酵素標品を得た。
精製酵素のＵＶ吸収スペクトルを図７に示す。図７は、本酵素がフラビン酵素であることを示している。
またＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動）及びスーパーデックス２００pgを用いたゲル濾過により得られた精製酵素の標品の分子量の決定を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、デービスの方法に従い、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで３時間泳動し、タンパク染色はクマシーブリリアントブルーＧ−２５０でおこなった。標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを同様に泳動して分子量マーカーを作成した。その結果、精製酵素のサブユニット分子量は約４８,０００（４８ｋＤａ）であった（図８）。
一方、ゲルろ過は０.１Ｍ ＮａＣl含有０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）を用いて行った結果、図９に示すように、約９４,０００（９４ｋＤａ）であった。
実施例３ 糖化ヒト血清アルブミン濃度の測定
糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）を０.９％塩化ナトリウム水溶液で溶解させ、０〜１０％の範囲で濃度の異なる糖化ヒト血清アルブミン溶液を調製した。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化アルブミン溶液 ６０μｌ
１２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液 ６０μｌ
この混合液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、約９０℃で５分間、加熱して反応を停止させた。
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ３０μｌ
６０mＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液 ３０μｌ
６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 ５０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化アルブミンの濃度と吸光度との関係を図１０に示す。図中の縦軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化アルブミンの濃度を表す。図は、糖化アルブミンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
実施例４ ヒト血清アルブミンの糖化率の測定
０.９％塩化ナトリウム水溶液３mlに、糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）１５０mg、ヒト血清アルブミン（シグマ社）１５０mgをそれぞれ溶解した。これらの溶液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作製し、自動グリコアルブミン測定装置（京都第一科学）を用いて検定したところ、その糖化率は、２４.６％〜６１.１％であった。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化アルブミン溶液 ６０μｌ
１２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液 ６０μｌ
この溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、約９０℃で５分間加熱して反応を停止させた。
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ３０μｌ
６０mＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液 ３０μｌ
６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 ５０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られるアルブミンの糖化率と吸光度との関係を図１１に示す。図中の縦軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸はアルブミンの糖化率を表す。図は、アルブミンの糖化率と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
実施例５ 糖化ヘモグロビン濃度の測定
グリコヘモグロビンコントロール（シグマ社）を蒸留水で溶解させ、０〜３０％の範囲で濃度の異なる糖化ヘモグロビン溶液を調製した。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化ヘモグロビン溶液 ２５μｌ
５００ユニット／ml アミノペプチダーゼ溶液
５μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ２０μｌ
この混合液を３０℃で３０分間インキュベートした。その後、１０％トリクロロ酢酸を５０μl加えて撹拌し、０℃で３０分間静置した後１２０００rpmで１０分間遠心分離を行った。得られた上清に２Ｍ ＮaＯＨを約５０μl加え中性溶液にした。
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
３ｍＭ Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−
４,４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン溶液 ３０μｌ
６０ユニット/ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ
４ユニット/ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 １０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
４ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを４ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を８０μl加え、３０分後の７２７nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロビンの濃度と吸光度との関係を図１２に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化ヘモグロビンの濃度を表す。図は、糖化ヘモグロビンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
産業上の有用性
本発明のＦＡＯＤは、従来の同種の酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと異なり、フルクトシルリジン及びフルクトシルバリンのいずれにも特異的に作用し、また、前者に対する特異性がより高い。従って、新たな臨床分析及び食品分析法の開発に有用であり、糖尿病の診断や食品の品質管理の面で寄与するところが大きい。特に、血中の糖化タンパク量及び／又は糖化率あるいはフルクトシルアミン量を指標として、糖尿病の病状の診断に役立つと考えられる。また、本発明のＦＡＯＤを用いるアマドリ化合物の分析試薬及び分析方法によって、正確に糖化タンパクを定量することができ、糖尿病の診断、症状管理に貢献することができる。
本発明は、新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに関し、さらに詳しくは、アスペルギルス属（Aspergillus）の菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産方法、該酵素を用いたアマドリ化合物の分析法、及び該酵素を含有する試薬及びキットに関する。
本発明は、酵素を用いるアマドリ化合物の測定方法、さらに詳しくは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼによる新規なアマドリ化合物の測定方法、及び該方法に用いられる試薬及びキットに関する。
背景技術
アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数で表される。従って、その生成量から、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができると考えられている。アマドリ化合物を含有する物質としては、醤油等の食品、及び血液等の体液がある。
生体では、グルコースとアミノ酸が結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成している。例えば、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパクが糖化された誘導体の還元能はフルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の診断及び症状の管理の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を測定することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。このように、アマドリ化合物の分析は医学及び食品を含む広範な分野で有用である。
従来、アマドリ化合物の測定法としては、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法［Chromatogr.Sci.10:659(1979)］、ホウ酸を結合させた固体をつめたカラムを用いる方法［Clin.Chem.28:2088-2094(1982)］、電気泳動［Clin.Chem.26:1598-1602(1980)］、抗原−抗体反応を利用する方法［ＪＪＣＬＡ 18: 620(1993),機器・試薬16: 33-37(1993)］，フルクトサミンの測定法［Clin.Chim.Acta 127: 87-95 (1982)］，チオバルビツール酸を用いて酸化後比色定量する方法[Clin.Chim.Acta 112: 197-204 (1981)]などが知られているが、高価な機器が必要であったり、必ずしも正確で迅速な方法ではなかった。
近年、酵素の有する特性(基質、反応、構造、位置などの特異性)に起因して、選択的に目的物質を迅速かつ正確に分析することができることから酵素反応を利用する方法が臨床分析や食品分析の分野で普及してきた。
既に、アマドリ化合物に酸化還元酵素を作用させ、その反応における酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することにより、アマドリ化合物を測定する分析法が提案されている（例えば、特公平5-33997号公報、特公平6-65300号公報、特開平2-195900号公報、特開平3-155780号公報、特開平4-4874号公報、特開平5-192193号公報、特開平6-46846号公報）。さらに、糖尿病の診断のための糖化タンパクの測定法も開示されている（特開平2-195899号公報、特開平2-195900号公報、特開平5-192193号公報(EP 0 526 150 A)、特開平6-46846号公報（EP 0 576 838 A））。
アマドリ化合物の酸化還元酵素による反応は下記の一般式で表すことができる。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
上記の反応を触媒する酵素として以下のものが知られている。
１．フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（特公平5-33997号公報、特公平6-65300号公報）、アスペルギルス属（Aspergillus）（特開平3-155780号公報）。
２．フルクトシルアミンデグリカーゼ：カンジダ属（Candida）（特開平6-46846号公報）。
３．フルクトシルアミノ酸分解酵素：ペニシリウム属（Penicillium）（特開平4-4874号公報）。
４．ケトアミンオキシダーゼ：コリネバクテリウム属、フサリウム属、アクレモニウム属又はデブリオマイセス属（特開平5-192193号公報）
５．アルキルリジナーゼ：J.Biol.Chem.239巻、第3790−3796頁（1964年）記載の方法で調製。
しかしながらこれらの酵素による方法には、下記の問題点があった。
即ち、糖尿病の診断における指標となる、血中の糖化タンパクは糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン及びフルクトシルアミンである。糖化アルブミンはタンパク分子中のリジン残基のε位にグルコースが結合して生成される［Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. 261:13542-13545(1986)］。糖化ヘモグロビンは［Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. 254:3892-3898(1979)］、リジン残基の他にβ鎖のＮ末端バリンにもグルコースが結合している。従って糖尿病の指標となる糖化タンパクの測定には、フルクトシルバリンに比べてフルクトシルリジンに対する特異性の高い酵素を用いる必要があった。しかし、既存のコリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンには作用せず、特開平3-155780記載のアスペルギルス属由来の酵素は、フルクトシルリジンに対する活性が、フルクトシルバリンに対する活性より低く、糖化タンパク又はその加水分解物に対する作用については明らかにされていない。他方、特開平5-192193号公報記載のケトアミンオキシダーゼはフルクトシルバリンは分解し得るが、リジン残基に糖が結合している糖化タンパクを正確に測定することはできない。フルクトシルアミンデグリガーゼは、ジフルクトシルリジンに高い活性があるのでリジン残基のε位の糖化物を特異的に測定することができず、またバリン残基の糖化物を特異的に測定することもできない。さらにアルキルリジナーゼを用いる方法は糖類以外がリジンに結合した物質に対しても作用し、糖化物に対する特異性が低いという問題があり、正確な測定が期待できなかった。特開平4-4874号記載のペニシリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンとフルクトシルアラニンに作用する酵素である。
このように、従来の酵素は糖化タンパクの正確な定量には適さず、フルクトシルバリンに比べてフルクトシルリジンに対する特異性が高い酵素の開発が待たれていた。
一般的に、酵素を用いる分析法が正確かつ有用となるためには、分析の目的に最適な酵素を選択する必要がある。即ち、酵素の基質である被検物質の種類、測定試料の状態、測定条件など、種々の条件を考慮して適切な酵素を用いなければ、再現性のある正確な分析を行う事ができない恐れがある。そのような酵素を選択するためには、より多くのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産し、それらの特性を明らかにしておくことが望ましい。
発明の開示
本発明者らは、アマドリ化合物、特に糖化タンパクに特異的に作用する新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することを目的として鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス属（Aspergillus）の菌をフルクトシルリジン及び／又は、フルクトシルＮα−Ｚ−リジンの存在下で培養すると、目的の活性を有する酵素が誘導されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、フルクトシルリジン及びフルクトシルＮα−Ｚ−リジンの少なくとも一方を含有する選択培地によって選択的に生育されるアスペルギルス属（Aspergillus）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生能を有する菌の培養物から得られることを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供するものである。
本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ生産菌の培養に用いるフルクトシルリジン及び／又は、フルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地は、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを温度１００〜１５０℃において３〜６０分間、オートクレーブ処理することにより得られるフルクトシルリジン及び／又は、フルクトシルＮα−Ｚ−リジン（以下、ＦＺＬと略称することもある。）を含有する。
後述するように、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼはフルクトシルリジン及びフルクトシルバリンの両者に活性があるが、その活性は同等か、前者よりも後者に対する活性が高いという特徴を有する。なお、本明細書中では、本発明のアスペルギルス属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをＦＡＯＤ、又はＦＡＯＤ−Ａ、ＦＡＯＤ−Ｌと称することもある。
【図面の簡単な説明】
図１は、培養培地でのＦＡＯＤ−Ｌの生産量と培養時間との関係を示すグラフである。
図２は、ＦＡＯＤ−Ａの活性と至適pＨの関係を示すグラフである。
図３は、ＦＡＯＤ−Ｌの活性と至適ｐＨの関係を示すグラフである。
図４は、ＦＡＯＤ−Ａの活性と至適温度の関係を示すグラフである。
図５は、ＦＡＯＤ−Ｌの活性と至適温度との関係を示すグラフである。
図６は、スーパーデックス２００pgを用いたゲルろ過による、アスペルギルス・テレウスIFO 6365（FERM BP−5756）（Aspergillus terreus）由来の精製ＦＡＯＤ−Ａの分子量測定の結果を示すグラフである。
図７は、アスペルギルス・テレウスGP1（FERM BP-5684）（Aspergillus terreus GP1）由来の精製ＦＡＯＤ−ＬのＵＶ吸収スペクトルである。
図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）における、アスペルギルス・テレウスGP1（FERM BP-5684）（Aspergillus terreus GP1）由来の精製ＦＡＯＤ−Ｌの泳動パターンを示す写真の模写図。
図９は、スーパーデックス２００pgを用いたゲルろ過による、アスペルギルス・テレウスGP1（FERM BP-5684）（Aspergillus terreus GP1）由来の精製ＦＡＯＤ−Ｌの分子量測定の結果を示すグラフである。
図１０は、糖化ヒト血清アルブミンの濃度とＦＡＯＤ−Ｌの作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフである。
図１１は、ヒト血清アルブミンの糖化率と、ＦＡＯＤ−Ｌの作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフである。
図１２は、糖化ヘモグロビンの濃度とＦＡＯＤ−Ｌの作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の酵素は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ生産能を有するアスペルギルス属（Aspergillus）の菌をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地で培養することにより生産することができる。そのような菌として、アスペルギルス・テレウス（IFO 6365，FERM BP-5756）(Aspergillus terreus)、アスペルギルス・テレウスGP1(FERM BP-5684)(Aspergillus terreus GP1)、アスペルギルス・オリザ（IFO 4242，FERM BP-5757）(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・オリザ（IFO 5710）（Aspergillus oryzae）などの菌を挙げることができる。
本発明のＦＡＯＤの生産に用いるフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬは、グルコース０.０１〜５０重量％とリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％とを溶液中で、１００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処理する方法で製造される。具体的には、全量１０００ｍｌの溶液中にグルコース２００ｇ、Ｎα−Ｚ−リジン１０ｇを溶解させ、通常１２０℃、２０分間オートクレーブ処理することによって製造することができる。
また、本発明のＦＡＯＤの生産に用いるフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ含有培地（以下、ＦＺＬ培地と称する）は、上記の方法で得られたフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを通常の培地に添加するか、例えば、グルコース０.０１〜５０重量％、リジン及び／又はＮα−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％、Ｋ2ＨＰＯ4０.１重量％、ＮａＨ2ＰＯ4０.１重量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０.０５重量％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ０.０１重量％及び酵母エキス０.２重量％を含有する混合物（好ましくはｐＨ５.５−６.０）を１００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処理することによって得ることができる。
本発明のＦＡＯＤの生産に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養源を含有する通常の合成あるいは天然の培地であってよく、炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、グリセリン等、窒素源としては、ペプトン、カゼイン消化物、酵母エキス、等を用いることができる。さらに無機物としてはナトリウム、カリウム、カルシウム、マンガン、マグネシウム、コバルト等、通常の培地に含有されるものを用いることができる。
本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを含有する培地で培養したとき、最もよく誘導される。好ましい培地の例として、上記の方法で得られたＦＺＬを単一の窒素源とし、炭素源としてグルコースを用いるＦＺＬ培地（１.０％グルコース、０.５％ＦＺＬ、１.０％Ｋ2ＨＰＯ4、０.１％ＮａＨ2ＰＯ4、０.０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.０１％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ及び０.０１％ビタミン混合物）を挙げることができる。特に好ましい培地は、全量１，０００ml中にグルコース２０ｇ（２％）、ＦＺＬ １０ｇ（１％）、Ｋ2ＨＰＯ4１.０ｇ（０.１％）、ＮａＨ2ＰＯ4１.０ｇ（０.１％）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０ ０.５ｇ（０.０５％）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.１ｇ（０.０１％）及び酵母エキス２.０ｇ（０.２％）を含有する培地（ｐＨ５.５−６.０）である。ＦＺＬ培地は、通常の培地にＦＺＬを添加するか、グルコースとＮα−Ｚ−リジンとを含有する培地をオートクレーブ処理することによって調製することができる。いずれの方法によっても得られる培地はフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬの存在によって褐色を呈しており、ＦＺＬ褐変化培地又はＧＬ（グリケーテッドリジン及び／又はグリケーテッドＮα−Ｚ−リジン）褐変化培地と称する。
培養は、通常、２５〜３７℃、好ましくは２８℃で行われる。培地のｐＨは４.０〜８.０の範囲であり、好ましくは５.５〜６.０である。しかしながら、これらの条件はそれぞれの菌の状態に応じて適宜調製されるものであり上記に限定されない。この条件下、２０〜１００時間、好ましくは８０時間培養すると、ＦＡＯＤが培養培地に蓄積される（図１）。
このようにして得られた培養物は、常法に従い、核酸、細部壁断片等を除去し、酵素標品を得ることができる。
本発明のＦＡＯＤの酵素活性は菌体中に蓄積されるので、培養物中の菌体を破砕し、酵素生産に用いる。
細胞の破砕は、機械的手段又は溶媒を利用した自己消化、凍結、超音波処理、加圧などのいずれでもよい。
酵素の分離精製方法も既知であり、硫安などを用いる塩析、エタノール等の有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーやゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどを組み合わせて精製する。
例えば、培養物を、遠心又は吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、０.１Ｍトリス−塩酸（pＨ８.５）に懸濁し、Dyno-Millによって菌糸体を破砕する。次いで、遠心分離して得た上清を無細胞抽出液として、硫安分画、フェニル−セファロース疎水クロマトグラフィーで処理することにより精製する。
しかしながら、本発明の目的から、ＦＡＯＤは、その精製度にかかわらず、アマドリ化合物の酸化反応を触媒することができる限り、培養液をはじめとする、あらゆる精製段階の酵素含有物及び溶液を包含する。また、酵素分子の内、触媒活性に関与する部位のみでも、本発明目的を達成することができることから、任意の、アマドリ化合物酸化活性を有するフラグメントをも包含するものとする。このようにして得られたＦＡＯＤは、アマドリ化合物の定量、特に糖尿病の診断のための糖化タンパクの定量に有用である。
従って、本発明は、遊離又は保護基を有するアミノ酸の糖化物及び／又はタンパクの糖化物を含有する培地で、真菌類を培養することによって該真菌類にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産させることを特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供するものである。
さらに、本発明は、アスペルギルス属（Aspergillus）の、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産することができる菌株をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮα−Ｚ−リジン含有培地で培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産方法を提供するものである。これらの属の菌株が生産するＦＡＯＤはいずれも本発明が解決すべき技術的な課題の解決に有用である。
本発明のＦＡＯＤ−Ｌ産生菌である、アスペルギルス・テレウスGP1は、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌株であり、その菌学的特性は以下の通りである。
（１）培地における生育状況
Czapek寒天培地、酵母ＭＹ培地における生育は、いずれの培地でも非常に良好である。２５℃の恒温器で１０日間培地するとビロード状、まれに羊毛状にペトリ皿に広がり、集落裏面は無色から褐色を呈する。
（２）分類学的性質
分離した菌の同定は、微生物をCzapek寒天培地で培養し、分生子、分生子柄や分生子頭などの顕微鏡下の形態観察から行った。分生子頭は長円筒型で褐色から赤褐色である。分生子柄は滑面で無色であり、多少の屈曲が見られ先端は肥大して頂のうとなっている。頂のうは半球形で上半部より無色のメトレを生じている。これらのことから、GP1株はアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）と同定された。本菌株は、茨城県つくば市東1丁目1丁目3号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5684の下で寄託されている（原寄託日：1996年5月31日；国際寄託への移管日：1996年9月30日）。
また、本発明のＦＡＯＤ−Ａ産生菌であるアスペルギルス・テレウスIFO 6365及びアスペルギルス・オリザIFO 4242は、財団法人発酵研究所（大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）より分譲されるものであり、上記住所の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれ、受託番号FERM BP-5756及びFERM BP-5757の下で寄託されている（寄託日：1996年11月25日）。なお、アスペルギルス・オリザIFO 5710は、上記住所の財団法人発酵研究所に寄託されて、第三者が請求により何時でも入手可能な状態で３０年以上登録され続けられる。
以下に本発明のＦＡＯＤの特性を詳細に説明する。
１．一般的な誘導特性
本発明のＦＡＯＤ-Ｌは、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬによって誘導される誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ培地で、例えば、アスペルギルス・テレウス ＧＰ１を培養することにより生産される。
本発明のＦＡＯＤ-Ａは、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬによって誘導される誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ培地で、例えば、アスペルギルス・テレウスIFO 6365又はアスペルギルス・オリザIFO 4242を培養することにより生産される。
ＦＡＯＤは、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを共にオートクレーブして得られるＧＬ褐変化培地で誘導されるが、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを別々にオートクレイブ処理して調製した培地では誘導されないことから、該酵素はアマドリ化合物に特異的に作用するものである。
以下に本発明のＦＡＯＤの特性を詳細に説明する。
１．一般的な誘導特性
本発明のＦＡＯＤはフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬによって誘導される誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ培地で、アスペルギルス属（Aspergillus）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ生産菌を培養することにより生産される。
ＦＡＯＤは、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを共にオートクレーブして得られるＧＬ褐変化培地で誘導されるが、グルコースとリジン及び／又はＮα−Ｚ−リジンを別々にオートクレイブ処理して調製した培地では誘導されないことから、該酵素はアマドリ化合物に特異的に作用するものである。
２．反応特異性及び基質特異性
本発明のＦＡＯＤは、式：
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
で示される反応における触媒活性を有する。上記の反応式において、Ｒ1が−ＯＨ、−（ＣＨ2）n−又は−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ（式中、ｎは０−６の整数）であり、Ｒ2が−ＣＨＲ3−［ＣＯＮＨＲ3］mＣＯＯＨ（式中、Ｒ3はα−アミノ酸側鎖残基、ｍは１−４８０の整数を表す）で示されるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、Ｒ3がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなどから選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またｎが５〜６、ｍが５５以下である化合物が好ましい。
本発明のＦＡＯＤ生産能力を有する菌株を下記表１に例示する。
さらに、A. terreus IFO6365由来のＦＡＯＤ−Ａの各基質に対する活性を以下の表２に示す。
３．力価の測定
酵素の力価測定は下記の方法で行った。
（１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方法。
Ａ.速度法
１００ｍＭ ＦＺＬ溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で３.０ｍｌとする。３０℃で２分間インキュベートした後、１００ｍＭ ＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位（ユニット：Ｕ）とする。
Ｂ.終末法
上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、３０分間３０℃でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を測定し、あらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作成した検量線から生成した過酸化水素量を算出することにより、酵素活性を測定する。
（２）酵素消費量を測定する方法
０.１Ｍトリス-塩酸緩衝液（pＨ８.０）1ｍｌと酵素溶液５０μｌを混合し、蒸留水で全量を３.０ｍｌとし、ランク ブラザーズ社の酸素電極のセルに入れる。３０℃で攪拌し、溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭ ＦＺＬ １００μｌを添加し、酸素消費量を記録計で連続的に計測し、初速度を得る。標準曲線から１分間に消費された酸素量を求め、これを酵素単位とする。
４．ｐＨ及び温度条件
ｐＨ条件の検討
至適pＨは、通常のＦＡＯＤ活性測定法（上記３．力価の測定法における（１）、Ａ法参照）で使用する緩衝液をｐＨ５〜１１の各種緩衝液（０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）、トリス−塩酸緩衝液及びグリシン−ＮａＯＨ緩衝液）に置き換えて酵素反応を行い検討した。
また、前記の各種緩衝液にＦＡＯＤを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした後、通常の条件（３０℃、ｐＨ８.０）で活性を測定する事によりpＨによる安定性を検討した。
温度条件の検討
至適温度を検討するために、反応温度を２０〜６０℃まで変化させて酵素活性を測定した。温度安定性については、０.１Ｍトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解したＦＡＯＤを２０〜６０℃の各温度で１０分間インキュベートし、その酵素液を用いて通常の条件で残存活性を測定した。上記方法で測定した結果、本発明のＦＡＯＤ−Ａの至適ｐＨは、７.５〜９.０、より好ましくは８.５であり（図２）、安定なｐＨ域は、７.０〜１０.０であった。また、ＦＡＯＤ−Ｌの至適ｐＨは、７.５〜９.０、より好ましくは８.０であり（図３）、安定なｐＨ域は、４.０〜１３.０であった。
また、ＦＡＯＤ−Ａの酵素反応は２０〜４０℃、より好ましくは３５℃で効率よく進行した（図４）。安定な温度領域は２０〜４０℃であった。ＦＡＯＤ−Ｌの酵素反応は２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃、より好ましくは３５℃で効率よく進行した（図５）。安定な温度領域は２０〜５０℃であった。
５．既知の酵素との比較
既存の菌由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、本発明のＦＡＯＤとを比較した。
すなわち、本発明によって製造し得るＦＡＯＤは、フルクトシルバリンよりもフルクトシルリジンに対する活性が高いが、コリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンには作用せず、特開平3-155780号記載のアスペルギルスｓｐ.由来の酵素はフルクトシルリジンに対する活性が、フルクトシルバリンに対する活性に比べて低い。
６．ＦＡＯＤ−Ａ及びＦＡＯＤ−Ｌの分子量
ＦＡＯＤ−Ａ及びＦＡＯＤ−Ｌの分子量をスーパーデックス200pgゲルを用いたゲルろ過で調べた。結果を表５に示す。
７．酵素の阻害、活性化及び安定化
（１）金属の影響
０.１Ｍトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）に、各種金属イオンを終濃度１mＭとなるように添加し、３０℃で５分間インキュベートした後、活性を測定した。結果を下記の表６、７に示す。
（２）各種阻害物質の影響
上記（１）の金属イオンの影響に関する試験と同様の方法で試験した。ただし、パラクロロ安息香酸第二水銀は終濃度０.１mＭ、それ以外は１mＭとした。結果を表８、９に示す。
これより、ＦＡＯＤの酵素反応にはＳＨ基及びカルボニル基が重要な働きをしていることが予想される。このため、ＦＡＯＤの保存に適した緩衝液は１〜２ｍＭのジチオスレイトール含有のpＨ７.５〜９.０の緩衝液であると考えられる。
スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過［カラム：Superdex 200 pg HR16/60；バッファー：0.2Mリン酸カリウム(pH7.0)；流速１ml/min；試料：各タンパク0.5mgをサンプルバッファー0.2mlに溶解］では、ＦＡＯＤ−Ａは分子量は約５０,０００（５０ｋＤａ）と推定された（図６）。また、同様の方法でＦＡＯＤ−Ｌのゲルろ過を行ったところ、分子量は約９４，０００（９４ｋＤａ）と推定された（図９）。
即述のごとく、本発明の酵素ＦＡＯＤは、アマドリ化合物の定量に有用である。従って、本発明は、アマドリ化合物を含有する試料と、本発明のＦＡＯＤとを接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法を提供するものである。本発明の分析法は、生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、又はフルクトシルアミンの定量に基づいて行われる。
ＦＡＯＤの酵素活性は下記の反応に基づいて測定される。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
被検液としては、アマドリ化合物を含有する任意の試料溶液を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿又は血清）、尿等の生体由来の試料の外、醤油等の食品が挙げられる。
本発明のＦＡＯＤをアマドリ化合物含有溶液に、適当な緩衝液中で作用させる。反応溶液のｐＨは、ＦＡＯＤ−ＡでｐＨ６.０〜１０.０、好ましくは８.５、温度は２０〜５０℃、好ましくは３５℃である。また、ＦＡＯＤ−ＬでｐＨ７.０〜９.０、好ましくは８.５、温度は２５〜４０℃、好ましくは３５℃である。緩衝液としてはトリス-塩酸等を用いる。ＦＡＯＤの使用量は、終点分析法においては通常、０.１ユニット／ml以上、好ましくは１〜１００ユニット／mlである。
本発明の分析法では、下記のいずれかのアマドリ化合物の定量法を用いる。
（１）過酸化水素発生量に基づく方法
当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化水素及びアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、上記３の力価の測定に準じる。ただし、ＦＡＯＤ量は１ユニット／ｍｌとし適当に希釈した試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。過酸化水素の発色系としては、パーオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により発色する系を用いることができる。
色原体として、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等があり、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン、２,４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン等が挙げられる。又パーオキシダーゼの存在下で酸化発色を示すロイコ型発色試薬も用いることができ、そのようなロイコ型発色試薬は、当業者に既知であり、ｏ−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３,３−ジアミノベンジジン、３,３,５,５−テトラメチルベンジジン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４,４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３,７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられる。
（２）酸素の消費量に基づく方法
反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引いた値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、上記３の力価の測定に準じて行う。ただし、用いるＦＡＯＤ量は１ユニット／mlとし、適当に希釈した試料を添加し、消費される酸素量を求める。
本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行うこともできるが、対象となる糖化タンパクによっては、あらかじめ糖が結合したリジン及び／又はバリン残基を遊離させてから行うことが好ましい。
そのような目的には、タンパク質分解酵素を用いる場合(酵素法)と、塩酸等の化学物質を用いる場合(化学法)がある。酵素法の場合、本発明方法には当業者に既知である、エンド型及びエキソ型のタンパク質分解酵素(プロテアーゼ)を用いることができる。エンド型のプロテアーゼには、例えばトリプシン、α−キモトリプシン、ズブチリシン、プロティナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ブロメライン、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＩＶ、リジルエンドペプチダーゼ、プロレザー、ブロメラインＦ等がある。一方、エキソ型のプロテアーゼにはアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる。酵素処理の方法も既知である。
上記のごとく、本発明のＦＡＯＤは、糖化タンパクに含まれるフルクトシルリジンに高い基質特異性を有するものであることから、血液試料中の糖化タンパクを測定することを含む、糖尿病の診断などに有用である。また、フルクトシルバリンにも特異性を有することから、糖化ヘモグロビンの測定にも有用である。
なお、検体として血液試料（全血、血漿又は血清）を用いる場合、採血した試料をそのまま、あるいは透析等の処理をした後用いる。
さらに、本発明方法に用いるＦＡＯＤ、パーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いてもよいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例えば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の点でも好ましい。
さらには、酵素と発色色素とを適宜組み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なアマドリ化合物の分析のためのキットを得ることができる。
酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン酸、カラギーナン、などがある。結合は共有結合、イオン結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既知の方法で行う。
固定化酵素を用いる場合、分析はフロー又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、固定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分析（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診断を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化タンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度に対する糖化タンパク質の濃度の比率（糖化率）又はフルクトサミン値で表す。全タンパク質濃度は、通常の方法（２８０nmの吸光度、ブラッドフォード法、Lowry法、ビュレット法、アルブミンの自然蛍光、ヘモグロビンの吸光度など）で測定することができる。
本発明はまた、本発明のＦＡＯＤを含有するアマドリ化合物の分析試薬又はキットを提供するものである。
本発明のアマドリ化合物の定量のための試薬は、本発明のＦＡＯＤと好ましくはｐＨ７.０〜９.０、より好ましくはｐＨ８．０〜８.５の緩衝液からなる。該ＦＡＯＤが固定化されている場合、固体支持体は高分子ゲルなどから選択され、好ましくはアルギン酸である。
試薬中のＦＡＯＤの量は、終点分析を行う場合、試料あたり、通常、１〜１００ユニット／ml、緩衝液はトリス-塩酸（ｐＨ８．０及び８.５）が好ましい。
過酸化水素の生成量に基づいてアマドリ化合物を定量する場合、発色系としては、先述の「(1)過酸化水素発生量に基づく方法」に記載の酸化縮合により発色する系、並びにロイコ型発色試薬等を用いることができる。
本発明のアマドリ化合物の分析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための色基準あるいは標準物質を組み合わせてキットとすることもできる。そのようなキットは、予備的な診断、検査に有用であると考えられる。
上記の分析試薬及びキットは生体成分中の糖化タンパク量及び／又は糖化率の測定、又は、フルクトシルアミンを定量するために、用いられるものである。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１ アスペルギルス・テレウスの培養とＦＡＯＤ−Ａの精製
１）培養
アスペルギルス・テレウスIFO6365（FERM BP-5756）；A.terreus）をＦＺＬ ０.５％、グルコース１.０％、リン酸二カリウム０.１％、リン酸一ナトリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、塩化カルシウム０.０１％、イーストエキス０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０）７Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて２８℃、８０時間振とう培養した。培養物は瀘過して集めた。
２）粗酵素液の調製
菌糸体１００ｇ（湿重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）２００mlに懸濁し、１／２容のジルコニウムビーズを加え、ビードビーターを用いて１分間破砕、１分氷冷を２回、合計３分間行うことにより菌糸体を破砕した。破砕液を４℃で、９,５００ｒｐｍ，１０分間遠心分離し、得られた上清（無細胞抽出液）を粗酵素液として、以下の方法で精製した。
３）精製
ステップ１：硫安分画
粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、遠心分離（４℃，１２,０００ｒｐｍ）して余分なタンパクを除去した。さらに、上清に硫安を８０％飽和になるように添加して沈殿を回収した。
ステップ２：イオン交換クロマトグラフィー
ステップ１で得られた沈殿を、２ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、緩衝液Ａと略す）に溶解し、同緩衝液で一晩透析した後、緩衝液Ａで平衡化したDEAE-トヨパール（DEAE-TOYOPEARL）カラムに透析内液を吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜０.５Ｍ塩化カリウムの直線濃度勾配で溶出した。これを回収して硫安で濃縮してから次のステップに用いた。
ステップ３：疎水クロマトグラフィー
回収した活性画分をフェニルトヨパールカラム（４０％硫安を含む緩衝液Ａで平衡化）に用いた。濃縮液を吸着させ、同緩衝液で洗浄した。活性画分は４０〜０％硫安の直線勾配で得られた。
ステップ４：ゲル濾過
最後にスーパーデックス200pg（２ｍＭ ＤＴＴを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）で平衡化）により、ゲルろ過を行った。これにより、約１０ユニットの酵素標品を得た。精製酵素の力価の測定は、上記「３．力価の測定」における（１），Ａ法により行った。
分子量の測定
スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過［カラム：Superdex 200 pg HR16/60］；バッファー：0.2Mリン酸カリウム(pH7.0)；流速１ml/min；試料：各タンパク0.5mgをサンプルバッファー0.2mlに溶解］では、分子量は約５０,０００（５０ｋＤａ）と推定された（図６）。
実施例２ アスペルギルス・テレウスＧＰ１の培養とＦＡＯＤ−Ｌ精製
１）培養
アスペルギルス・テレウスＧＰ１（FERM BP-5684）；Aspergillus terreus GP1）をＦＺＬ ０.５％、グルコース１.０％、リン酸二カリウム０.１％、リン酸一ナトリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、塩化カルシウム０.０１％、イーストエキス０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０）１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて通気量２Ｌ／分、攪拌速度４００ｒｐｍの条件で２８℃、８０時間攪拌培養した。培養物は瀘過して集めた。
２）粗酵素液の調製
菌糸体２７０ｇ（湿重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）８００mlに懸濁し、Ｄino−Ｍillにより菌糸体を破砕した。破砕液を９,５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清（無細胞抽出液）を粗酵素液として、以下の方法で精製した。
３）精製
ステップ１：硫安分画
粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、遠心分離（４℃，１２,０００ｒｐｍ）して余分なタンパクを除去した。さらに、上清に硫安を７５％飽和になるように添加して沈殿を回収した。
ステップ２：疎水クロマトグラフィー（バッチ法）
ステップ１で得られた沈殿を、２ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）（以下、緩衝液Ａと略す）に溶解し、等量の硫安４０％を含む緩衝液Ａを添加した。同粗酵素液にブチルトヨパール（butyl-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）樹脂２００mlを加えて、バッチ法による吸着を行った。溶出も、緩衝液Ａを用いたバッチ法で行い、活性画分は硫安沈殿により濃縮した。
ステップ３：疎水クロマトグラフィー
２５％硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したフェニルトヨパール（phenyl-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラムに濃縮した活性画分を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、２５〜０％硫安の直線勾配で溶出した。回収した活性画分は硫安沈殿により濃縮し、次のステップに用いた。
ステップ４：疎水クロマトグラフィー（カラム法）
回収した活性画分をブチルトヨパールカラム（４０％硫安を含む緩衝液Ａで平衡化）に用いた。濃縮液を吸着させ、同緩衝液で洗浄した。活性画分は４０〜０％硫安の直線勾配で得られた。
ステップ５：イオン交換クロマトグラフィー
次に、ＤＥＡＥ−トヨパール（ＤＥＡＥ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラムクロマトグラフィーを行った（緩衝液Ａで平衡化）。洗浄画分にＦＡＯＤ活性が認められたため、これを回収して硫安で濃縮してから、次のステップに用いた。
ステップ６：ゲル濾過
最後にセファクリル−３００によるゲル瀘過をおこなった（０.１Ｍ ＮａＣl，２mＭ ＤＴＴを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）で平衡化）。これにより、７０〜１００ユニットの酵素標品を得た。
精製酵素のＵＶ吸収スペクトルを図７に示す。図７は、本酵素がフラビン酵素であることを示している。
またＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動）及びスーパーデックス２００pgを用いたゲル濾過により得られた精製酵素の標品の分子量の決定を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、デービスの方法に従い、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで３時間泳動し、タンパク染色はクマシーブリリアントブルーＧ−２５０でおこなった。標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを同様に泳動して分子量マーカーを作成した。その結果、精製酵素のサブユニット分子量は約４８,０００（４８ｋＤａ）であった（図８）。
一方、ゲルろ過は０.１Ｍ ＮａＣl含有０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）を用いて行った結果、図９に示すように、約９４,０００（９４ｋＤａ）であった。
実施例３ 糖化ヒト血清アルブミン濃度の測定
糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）を０.９％塩化ナトリウム水溶液で溶解させ、０〜１０％の範囲で濃度の異なる糖化ヒト血清アルブミン溶液を調製した。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化アルブミン溶液 ６０μｌ
１２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液 ６０μｌ
この混合液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、約９０℃で５分間、加熱して反応を停止させた。
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ３０μｌ
６０mＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液 ３０μｌ
６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 ５０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化アルブミンの濃度と吸光度との関係を図１０に示す。図中の縦軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化アルブミンの濃度を表す。図は、糖化アルブミンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
実施例４ ヒト血清アルブミンの糖化率の測定
０.９％塩化ナトリウム水溶液３mlに、糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）１５０mg、ヒト血清アルブミン（シグマ社）１５０mgをそれぞれ溶解した。これらの溶液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作製し、自動グリコアルブミン測定装置（京都第一科学）を用いて検定したところ、その糖化率は、２４.６％〜６１.１％であった。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化アルブミン溶液 ６０μｌ
１２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液 ６０μｌ
この溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、約９０℃で５分間加熱して反応を停止させた。
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ３０μｌ
６０mＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液 ３０μｌ
６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 ５０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られるアルブミンの糖化率と吸光度との関係を図１１に示す。図中の縦軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸はアルブミンの糖化率を表す。図は、アルブミンの糖化率と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
実施例５ 糖化ヘモグロビン濃度の測定
グリコヘモグロビンコントロール（シグマ社）を蒸留水で溶解させ、０〜３０％の範囲で濃度の異なる糖化ヘモグロビン溶液を調製した。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化ヘモグロビン溶液 ２５μｌ
５００ユニット／ml アミノペプチダーゼ溶液
５μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ２０μｌ
この混合液を３０℃で３０分間インキュベートした。その後、１０％トリクロロ酢酸を５０μl加えて撹拌し、０℃で３０分間静置した後１２０００rpmで１０分間遠心分離を行った。得られた上清に２Ｍ ＮaＯＨを約５０μl加え中性溶液にした。
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
３ｍＭ Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−
４,４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン溶液 ３０μｌ
６０ユニット/ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ
４ユニット/ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 １０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
４ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを４ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を８０μl加え、３０分後の７２７nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロビンの濃度と吸光度との関係を図１２に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化ヘモグロビンの濃度を表す。図は、糖化ヘモグロビンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
産業上の有用性
本発明のＦＡＯＤは、従来の同種の酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと異なり、フルクトシルリジン及びフルクトシルバリンのいずれにも特異的に作用し、また、前者に対する特異性がより高い。従って、新たな臨床分析及び食品分析法の開発に有用であり、糖尿病の診断や食品の品質管理の面で寄与するところが大きい。特に、血中の糖化タンパク量及び／又は糖化率あるいはフルクトシルアミン量を指標として、糖尿病の病状の診断に役立つと考えられる。また、本発明のＦＡＯＤを用いるアマドリ化合物の分析試薬及び分析方法によって、正確に糖化タンパクを定量することができ、糖尿病の診断、症状管理に貢献することができる。
Claims (7)
- アスペルギルス属（Aspergillus）の菌を培養することにより産生されるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであって、下記の理化学的特性を有する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：
１）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケトアルデヒド、アミン誘導体および過酸化水素を生成する反応を触媒し；
２）至適ｐＨは８.５であり；
３）至適温度は３５℃であり；
４）スーパーデックス２００ｐｇを用いたゲルろ過法で測定した場合、分子量は約５０,０００（５０ｋＤａ）であり、
５）フルクトシルリジンおよびフルクトシルバリンに対して活性であり、フルクトシルリジンに対する活性がフルクトシルバリンに対する活性より高い。 - アスペルギルス属（Aspergillus）の菌を培養することにより産生されるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであって、下記の理化学的特性を有する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：
１）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケトアルデヒド、アミン誘導体および過酸化水素を生成する反応を触媒し；
２）至適ｐＨは８.０であり；
３）至適温度は３５℃であり；
４）スーパーデックス２００ｐｇを用いたゲルろ過法で測定した場合、分子量は約９４,０００（９４ｋＤａ）であり、
５）フルクトシルリジンおよびフルクトシルバリンに対して活性であり、フルクトシルリジンに対する活性がフルクトシルバリンに対する活性より高い。 - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ生産能を有するアスペルギルス属（Aspergillus）に属する菌をフルクトシルリジン及びフルクトシルＮα−Ｚ−リジンの少なくとも一方を含有する培地で培養し、その培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを入手することを特徴とする、請求項１又は２記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法。
- アマドリ化合物を含有する試料と、請求項１又は２に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法。
- 試料が生体成分であり、アマドリ化合物の分析が該生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンの定量によってなされることを特徴とする請求項４記載の方法。
- 請求項１又は２に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有するアマドリ化合物の分析試薬又はキット。
- 生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンの定量に用いられることを特徴とする請求項６記載の分析試薬又はキット。
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