JP3416540B2 - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼに関し、さらに詳しくは、フサリウ
ム属（Fusarium）又はジベレラ属（Gibberella）の菌由
来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、該酵素の製造
方法、該酵素を用いたアマドリ化合物の分析法、及び該
酵素を含有する試薬及びキットに関する。また本発明
は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生菌のスクリ
ーニング及び／又は培養のために有用な、該酵素の基質
としてのフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル
Ｎ^α−Ｚ−リジンの製造方法、並びにフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ産生菌のスクリーニング及び／又は培
養のためのフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル
Ｎ^α−Ｚ−リジン含有培地を提供するものである。

【０００２】

【従来技術】アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド
及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルド
ースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とア
ルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ
転移することにより生成される。アマドリ化合物の生成
速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数
で表される。従って、その生成量から、それら反応性物
質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができ
ると考えられている。アマドリ化合物を含有する物質と
しては、醤油等の食品、及び血液等の体液がある。生体
では、グルコースとアミノ酸が結合したアマドリ化合物
であるフルクトシルアミン誘導体が生成している。例え
ば、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルア
ミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化さ
れた誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパクが糖
化された誘導体はフルクトサミンと呼ばれる。これらの
血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映してお
り、その測定値は、糖尿病の病状の診断及び症状の管理
の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床
上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物
を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や
期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられ
る。このように、アマドリ化合物の定量分析は医学及び
食品を含む広範な分野で有用である。

【０００３】従来、アマドリ化合物の定量法としては、
高速液体クロマトグラフィを利用する方法［Chromatog
r.Sci.10:659(1979)］、ホウ酸を結合させた固体をつめ
たカラムを用いる方法［Clin.Chem.28:2088(1982)］、
電気泳動［Clin.Chem.26:1598(1980)]、抗原−抗体反応
を利用する方法［ＪＪＣＬＡ 18: 620(1993),機器・試薬
16: 33-37(1993)], フルクトサミンの測定法 [Clin.Ch
em.Acta 127: 87-95 (1982)], チオバルビツール酸を用
いて酸化後比色定量する方法[Clin.Chem.Acta112: 179-
204 (1981)]などが知られているが、高価な機器が必要
であったり、必ずしも正確で迅速な方法ではなかった。

【０００４】近年、酵素の有する特性（基質、反応、構
造、位置などの特異性）に起因して、選択的に目的物質
を迅速かつ正確に分析することができることから、酵素
反応を利用する方法が臨床分析や食品分析の分野で普及
してきた。既に、アマドリ化合物に酸化還元酵素を作用
させ、その反応における酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、アマドリ化合物を定量す
る分析法が提案されている（例えば、特公平５−３３９
９７号公報、特公平６−６５３００号公報、特開平２−
１９５９００号公報、特開平３−１５５７８０号公報、
特開平４−４８７４号公報、特開平５−１９２１９３号
公報、特開平６−４６８４６号公報）。さらに、糖尿病
の診断のための糖化タンパクの定量法も開示されている
（特開平２−１９５８９９公報、特開平２−１９５９０
０号公報、特開平５−１９２１９３公報、特開平６−４
６８４６号公報）。

【０００５】アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解
反応は下記の一般式で表すことができる。 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ²＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ→Ｒ¹−
ＣＯ−ＣＨＯ ＋Ｒ²−ＮＨ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す） 上記の反応を触媒する酵素として、例えば、菌由来のフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼ［コリネバクテリウム
（Corynebacterium）属の菌（特公平６−６５３００号
広報、特公平５−３３９９７号公報)、アスペルギルス
属（Aspergillus）の菌（特開平３−１５５７８０号公
報)］、菌由来のケトアミンオキシダーゼ［コリネバク
テリウム属、フサリウム属、アクレモニウム属又はデブ
リオマイセス属（特開平５−１９２１９３号公報)］カ
ンジダ（Candida）属の菌由来のフルクトシルアミンデ
グリガーゼ（特開平６−４６８４６号公報）、及びアル
キルリジナーゼ［Ｊ.Biol.Chem.239巻、第 3790ー3796
頁 (1964年）記載の方法で調製可能］等を挙げることが
できる。

【０００６】

【発明が解決すべき課題】しかしながら、これらの酵素
による方法には、下記の問題点があった。即ち、糖尿病
の診断における指標となる、血中のアマドリ化合物は糖
化タンパクであるが、これは、通常、タンパク分子中の
リジン残基のε位にグルコースが結合して生成される
［J. Biol. Chem. 26:13542-13545(1986)]。従って、糖
化タンパクの測定には、フルクトシルリジンに対する特
異性の高い酵素を用いる必要があった。しかし、既存の
コリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリジン
には作用せず、アスペルギルス属由来の酵素はフルクト
シルリジンに作用するものの、他のアマドリ化合物に対
する活性に比べて、フルクトシルリジンに対する活性が
低く（後述の表５参照）、糖化タンパク又はその加水分
解物に対する作用については明らかにされていない。他
方、特開平５−１９２１９３号公報記載のケトアミンオ
キシダーゼはフルクトシルバリンのα−アミン基の糖化
に対して特異的に作用する酵素であり、リジン残基に糖
が結合している糖化タンパクを正確に測定することはで
きない。フルクトシルアミンデグリガーゼは、ジフルク
トシルリジンに高い活性があるのでリジン残基のε位の
糖化物を特異的に測定することができない。さらに、ア
ルキルリジナーゼを用いる方法は糖類以外がリジンに結
合した物質に対しても作用し、糖化物に対する特異性が
低いという問題があり、正確な測定が期待できなかっ
た。このように、従来の酵素は糖化タンパクの正確な定
量には適さず、フルクトシルリジンに対する特異性が高
い酵素の開発が待たれていた。一般的に、酵素を用いる
分析法が正確かつ有用となるためには、分析の目的に最
適な酵素を選択する必要がある。即ち、酵素の基質であ
る被検物質の種類、測定試料の状態、測定条件など、種
々の条件を考慮して適切な酵素を用いなければ、再現性
のある正確な分析を行う事ができない恐れがある。その
ような酵素を選択するためには、予め様々な酵素につい
て、活性、基質特異性、温度安定性、ｐＨ安定性などが
特定されていなければならない。従って、より多くのフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼを製造し、それらの特
性を明らかにしておくことが望ましい。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アマドリ
化合物、特に糖化タンパクに特異的に作用する新規なフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することを目的
として鋭意研究を重ねた結果、フサリウム属（Fusariu
m）又はジベレラ属（Gibberella）の菌をフルクトシル
リジン及び／又はフルクトシル Ｎ^α−Ｚ−リジンの存
在下で培養すると、目的の酵素が産生されることを見出
し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、フサ
リウム属（Fusarium）又はジベレラ属（Gibberella）の
菌を、フルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎ
^α−Ｚ−リジン含有培地で培養することにより産生され
るフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供するもので
ある。本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生
菌の培養に用いるフルクトシルリジン及び／又はフルク
トシル Ｎ^α−Ｚ−リジン含有培地は、グルコースと、
リジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジンとを温度１００〜１
５０℃において３〜６０分間、オートクレーブ処理する
ことにより得られるフルクトシルリジン及び／又はフル
クトシル Ｎ^α−Ｚ−リジン（以下、ＦＺＬと略称する
こともある）を含有する。従って、本発明のフルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼはフルクトシルリジン及び／又
はＦＺＬに特異的に作用する酵素である。なお、本明細
書中では、本発明のフルクトシルリジン及び／又はＦＺ
Ｌに特異的なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをフル
クトシルリジン・オキシダーゼ(fructosyl lysine oxida
se)と同意義に用いることとし、以下、ＦＬＯＤと略称
することもある。本発明の酵素は、フルクトシルアミノ
酸オキシダーゼ産生能を有するフサリウム属又はジベレ
ラ属の菌をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル
Ｎ^α−Ｚ−リジン含有培地で培養することにより製造す
ることができる。

【０００８】そのようなフサリウム属の菌として、フサ
リウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４（Fusarium oxyspor
um Ｓ−１Ｆ４）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０１０）を挙げ
ることができる。また、ジベレラ属の菌として、ジベレ
ラ・フジクロイ（ＩＦＯ ＮＯ．６３５６）(Gibberella
fujikuroi)又はジベレラ・フジクロイ（ＩＦＯ ＮＯ．
６６０５）(Gibberella fujikuroi)などの種を挙げるこ
とができる

【０００９】本発明はまた、フルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼ産生菌のスクリーニング及び／又は培養のため
に有用な、該酵素の基質としてのフルクトシルリジン及
び／又はフルクトシル Ｎ^α−Ｚ−リジンの製造方法、
並びにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生菌の培養
のためのフルクトシルリジン及び／又はフルクトシルＮ
^α−Ｚ−リジン含有培地を提供するものである。従来、
糖化タンパクは特開平２−６９６６４記載の方法で化学
合成されているが、合成には８日間以上を要し、操作が
複雑で実用的でなかった。本発明者らは、単糖類と、遊
離あるいは保護基を有するアミノ酸とを溶液中で共存さ
せ、１００〜１５０℃でオートクレーブ処理することに
より、糖化アミノ酸を容易に製造することができること
を見出した。例えば、グルコースと、リジン及び／又は
Ｎ^α−Ｚ−リジンとを溶液中でオートクレーブ処理する
ことにより、目的のフルクトシルリジン及び／又はＦＺ
Ｌが容易に得られる。本発明の目的から、Ｎ^α−Ｚ−リ
ジンがより好ましい。従って、本発明は、単糖類と、遊
離あるいは保護基を有するアミノ酸とを溶液中で共存さ
せ、１００〜１５０℃でオートクレーブ処理することを
特徴とする、糖化アミノ酸の製造方法を提供するもので
ある。また、本発明は、グルコース０.０１〜５０重量
％とＮ^α−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％とを溶液中
で、１００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレ
ーブ処理することを特徴とするフルクトシル Ｎ^α−Ｚ
−リジンの製造方法を提供するものである。

【００１０】上記のごとく、フルクトシルリジン及び／
又はＦＺＬはグルコース０.０１〜５０重量％とリジン
及び／又はＮ^α−Ｚ−リジン０.０１〜２０重量％とを
含む水溶液を、１００〜１５０℃において３〜６０分間
オートクレーブ処理することにより、０.０１〜０.５％
のフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎ^α−
Ｚ−リジン水溶液として得ることができる（図１）。好
ましくは、全量１０００mlの溶液中にグルコース２００
g、Ｎ^α−Ｚ−リジン１０gを溶解させ、通常、１２０
℃、２０分間オートクレーブ処理する。精製フルクトシ
ル Ｎ^α−Ｚ−リジンは、上記の本発明の方法で得られ
たＦＺＬ水溶液を逆相クロマトグラフィ又はイオン交換
クロマトグラフィで精製することにより、得ることがで
きる。フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ含有培地
は、上記の本発明の方法で得られたフルクトシルリジン
及び／又はＦＺＬを通常の培地に添加することによって
も調製できるが、適当な混合物、即ち、グルコース０.
０１〜５０重量％、リジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジン
０.０１〜２０重量％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.１重量％、Ｎａ
Ｈ₂ＰＯ₄ ０.１重量％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０５重
量％、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０.０１重量％及び酵母エキ
ス０.２重量％を含有する混合物（好ましくはｐＨ５.６
−６.０）を１００〜１５０℃において３〜６０分間オ
ートクレーブ処理することによっても得られる。該培地
は新規であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを
基質とするＦＬＯＤ産生菌のスクリーニング及び／又は
培養に有用であり、ＦＬＯＤの開発及び研究に貢献する
ものである。本発明の培地は、該培地で増殖可能なあら
ゆる種類の菌のスクリーニングに使用することができ、
そのような菌として、真菌類、例えば、フサリウム属
（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ペニシリウ
ム属（Penicillium）、アスペルギルス属（Aspergillu
s）等、細菌類、例えばコリネバクテリウム属（Coryneb
acterium）等の菌を挙げることができるが、これらに限
定されない。従って、本発明はまた、上記の培地を提供
するものである。

【００１１】本発明のＦＬＯＤの製造に用いる培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養源を含有
する通常の合成あるいは天然の培地を用いることができ
る。炭素源としては、例えば、グルコース、キシロー
ス、グリセリン等、窒素源としては、ペプトン、カゼイ
ン消化物、酵母エキス、等を用いることができる。さら
に無機物としてはナトリウム、カリウム、カルシウム、
マンガン、マグネシウム、コバルト等、通常の培地に含
有されるものを用いることができる。本発明のＦＬＯＤ
は、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ含有培地で培
養したとき、最もよく誘導される。好ましい培地の例と
して、本発明方法で得られるフルクトシル Ｎ^α−Ｚ−
リジン（ＦＺＬ）を単一の窒素源とし、炭素源としてグ
ルコースを用いるＦＺＬ培地（１.０％グルコース、０.
５％ＦＺＬ、１.０％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０.１％ＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄、０.０５％ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０.０１％ＣaＣl₂
・２Ｈ₂Ｏ及び０.０１％ビタミン混合物)を挙げること
ができる。特に好ましい培地は、全量１，０００ml中に
グルコース２０ｇ、ＦＺＬ １０ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １.０
ｇ、ＮａＨ₂ＰＯ₄１.０ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂０ ０.５
ｇ、ＣaＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ及び酵母エキス２.０ｇ
を含有する培地（pＨ５.６−６.０）である。ＦＺＬ含
有培地は、通常の培地にＦＺＬを添加するか、グルコー
スとＮ^α−Ｚ−リジンとを含有する培地をオートクレー
ブ処理することによって調製することができる。いずれ
の方法によっても得られる培地はフルクトシルリジン及
び／又はＦＺＬの存在によって褐色を呈していることか
ら、ＦＺＬ褐変化培地又はＧＬ（グリケーテッドリジン
及び／又はグリケーテッドＮ^α−Ｚ−リジン）褐変化培
地と呼称される。

【００１２】培養は、通常、２５〜３７℃、好ましくは
２８℃で行われる。培地のpＨは４.０〜８.０の範囲で
あり、好ましくは５.５〜６.０である。しかしながら、
これらの条件は、それぞれの菌の状態に応じて適宜調整
されものであり、上記に限定されない。例えば、フサリ
ウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４をこのような条件下、
２０〜４０時間、好ましくは２４時間培養すると、ＦＬ
ＯＤが培養培地に蓄積されるが、上記の好適な培地で２
４時間培養したとき、ＦＬＯＤの産生は最大になった
(図２参照)。このようにして得られた培養物は、常法に
従い、核酸、細胞壁断片等を除去し、酵素標品を得るこ
とができる。通常、酵素活性は菌体中に蓄積されるの
で、培養物中の菌を磨砕し、酵素を抽出する。細胞の磨
砕は、機械的手段又は溶媒を利用した自己消化、凍結、
超音波処理、加圧などのいずれでもよい。酵素の分離精
製法も既知であり、硫安などを用いる塩析、エタノール
等の有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィ
やゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィなどを、
適宜組み合わせて行う。例えば、培養物を、遠心又は吸
引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、０.１Ｍ Ｔris−Ｈ
Ｃl緩衝液（pＨ８.５）に懸濁し、ダイノミルによって
菌糸体を破砕する。次いで、遠心分離した上清を無細胞
抽出液として、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファセルイオン
交換クロマトグラフィで処理することにより精製する。

【００１３】しかしながら、本発明の目的から、ＦＬＯ
Ｄは、その精製度にかかわらず、アマドリ化合物の酸化
反応を触媒することができる限り、培養液をはじめとす
る、あらゆる精製段階の酵素含有液を包含する。また、
酵素分子の内、触媒活性に関与する部位のみでも、本発
明目的を達成することができることから、任意の、アマ
ドリ化合物酸化活性を有するフラグメントをも包含する
ものとする。このようにして得られたＦＬＯＤは、アマ
ドリ化合物の定量、特に糖尿病の診断のための糖化タン
パクの定量に有用である。従って、本発明は、遊離又は
保護基を有するアミノ酸の糖化物及び/又はタンパクの
糖化物を含有する培地で、真菌類を培養することによっ
て該真菌類にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生
させることを特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼの製造方法を提供するものである。さらに、本発
明は、フサリウム属又はジベレラ属に属し、フルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼを産生することができる菌株を
フルクトシルリジン及び／又はフルクトシル Ｎ^α−Ｚ
−リジン含有培地に培養し、培養物からフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする、フル
クトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供するも
のである。これらの属の菌株が産生するＦＬＯＤはいず
れも本発明が解決すべき技術的な課題の解決に有用であ
る。しかしながら、その理化学的な性質がやや異なって
おり、本明細書では、適宜、必要に応じてフサリウム・
オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来のＦＬＯＤをＦＬＯＤ−
Ｓ、ジベレラ・フジクロイ由来のＦＬＯＤをＦＬＯＤ−
Ｇと呼称する。以下、本発明を詳しく説明する。

【００１４】（Ｉ）フサリウム・オキシスポルムＳ−１
Ｆ４によって産生されるＦＬＯＤ類該ＦＬＯＤ類は一般
に、下記の理化学的特性を有する。 １）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケト
アルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成する反
応を触媒し； ２）安定ｐＨは約４.０〜１２.０、至適ｐＨは８.０で
あり； ３）安定温度は約２０〜５５℃、至適温度は４５℃であ
り； ４）セファクリルＳ−２００カラムを用いたゲルろ過法
で測定した場合、分子量は約４５,０００（４５ｋＤ
ａ）である。

【００１５】本発明のＦＬＯＤ−Ｓを産生する菌であ
る、フサリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４（Fusarium
oxysporum Ｓ−１Ｆ４）（以下、Ｓ−１Ｆ４株と称す
る）は本発明者らが土壌中より新規に単離した菌株であ
り、その菌学的特性は以下の通りである。菌の分類は、
おおむねブース(C. Booth)著の「ザ・ジーナス・フサリウ
ム(The Genus Fusarium)」 (CMI. 1971)の記述に準拠し
た。 (１) 培地における生育状況 ＰＤＡ培地、ポテト・スクロース寒天培地、オートミー
ル培地における生育はいずれの培地でも非常に良好であ
る。２５℃の恒温器で７日間培養すると、フェルト状に
ペトリ皿全体に広がり、白〜薄い紫色を呈する。 (２)分類学的性質 分離した菌の同定は、微生物をオートミール培地で培養
し、分生子(conidia)や分生子柄(conidiophor)などの顕
微鏡下の形態観察から行った。その結果、Ｓ−１Ｆ４株
のコロニーの色は白色から薄い紫色であり、ミクロコニ
ディア(microconidia)とマクロコニディア(macroconidi
a)及び厚膜胞子を多数形成する。マクロコニディアの形
状が三日月型であり、３〜５の隔壁を有していること、
ミクロコニディアの形状が卵〜長円形であり、小型分生
胞子を擬頭状に形成することから、フサリウム・オキシ
スポルム（Fusarium oxysporum)と同定された。本菌株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５０１０（寄託日：平成６年２月２４
日）の下で寄託されている。

【００１６】Ｓ−１Ｆ４株により、本発明方法に従って
産生されたＦＬＯＤ−Ｓの特性を詳細に説明する。 １. 一般的な誘導特性 ＦＬＯＤ−Ｓはフルクトシルリジン及び／又はフルクト
シル Ｎ^α−Ｚ−リジン(ＦＺＬ)によって誘導される誘
導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを
窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリ
ジン及び／又はＦＺＬ含有培地で、フサリウム・オキシ
スポルムＳ−１Ｆ４を培養することにより産生される。
ＦＬＯＤ−Ｓは、グルコースとリジン及び／又はＮ^α−
Ｚ−リジンを共にオートクレーブして得られるＧＬ褐変
化培地で誘導されるが、グルコースとリジン及び／又は
Ｎ^α−Ｚ−リジンを別々にオートクレーブ処理して調製
した培地では誘導されないことから、該酵素はアマドリ
化合物に特異的に作用するものである。また、ＦＬＯＤ
−Ｓはリジン、アルギニンを用いたときに高い誘導が見
られ、グリシンとリジンを比較すると、リジンを用いた
場合により誘導効果が高いことから、フルクトシルリジ
ンにより高い基質活性を有するものである。

【００１７】２.反応特異性及び基質特異性 ＦＬＯＤ−Ｓは、式： Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ²＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ→Ｒ¹−
ＣＯ−ＣＨＯ ＋Ｒ²−ＮＨ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はタンパク残基を表
す）で示される反応における触媒活性を有する。上記の
反応式において、Ｒ¹が−ＯＨ、−（ＣＨ₂）ｎ−、又は
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ₂ＯＨ（式中、ｎは０−６
の整数）であり、Ｒ²が−ＣＨＲ³−［ＣＯＮＨＲ³］ｍ
ＣＯＯＨ（式中、Ｒ³はα−アミノ酸側鎖残基、ｍは１
−４８０の整数を表す）で示されるアマドリ化合物が基
質として好ましい。中でも、Ｒ³がリジン、ポリリジ
ン、バリン、アスパラギンなどから選択されるアミノ酸
の側鎖残基であり、またｎが５〜６、ｍが５５以下であ
る化合物が好ましい。

【００１８】ＦＬＯＤ−Ｓは、部分精製酵素及び精製酵
素のいずれも、ＦＺＬに対して高い特異性を示した。部
分精製酵素は、ＧＬ褐変化培地で菌株を２４時間培養し
た後、吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、０.１Ｍ Ｔ
ris−ＨＣl緩衝液（pＨ８.５）に懸濁し、ダイノミルに
て菌糸体を破砕し、遠心分離した上清を硫安分画、ＤＥ
ＡＥ−セファセルイオン交換クロマトグラフィで精製す
ることにより調製した。また、精製酵素は、後述する実
施例１記載の方法に準じて調製した。結果を下記の表１
及び２に示す。表１ 部分精製されたＳ−１Ｆ４由来のＦＬＯＤ−Ｓの
基質特異性

【表１】

【００１９】表２ 精製されたＳ−１Ｆ４由来のＦＬＯ
Ｄ−Ｓの基質特異性

【表２】 表１及び２から、本発明のＦＬＯＤ−Ｓは、フルクトシ
ル Ｎ^α−Ｚリジン（ＦＺＬ）に対してより高い活性を
有すると共に、フルクトシルポリリジンに対しても活性
があり、コリネバクテリウム属又はアスペルギルス属由
来の既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとは基質
特異性が異なることが分かる。

【００２０】３.ｐＨ及び温度の条件ｐＨ条件の測定 ０.１Ｍ酢酸、リン酸カリウム（Ｋ−Ｐ）、Ｔris-ＨＣl
及びグリシン（Gly）−ＮaＯＨ緩衝液（ｐＨ４.０〜１
２.０）にＦＬＯＤ−Ｓを加え、３０℃、１０分間イン
キュベートした後、 通常の条件（３０℃、ｐＨ８.０）
で活性を測定した。温度条件の測定 ０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ８.０）中で２５〜６
０℃の温度条件にＦＬＯＤ−Ｓを加え、１０分間インキ
ュベートした後、通常の条件で活性を測定した。上記方
法で測定したとき、Ｓ−１Ｆ４由来のＦＬＯＤ−Ｓの安
定なｐＨ域は、ｐＨ４.０〜１２.０、好ましくはｐＨ
７.０〜８.５であり、至適ｐＨは７.０〜９.０、好まし
くは７.５〜８.５、最も好ましくは８.０である（図３
参照）。また、Ｓ−１Ｆ４由来のＦＬＯＤ−Ｓの安定な
温度領域は２０〜５５℃であり、３０℃以上で徐々に失
活し、６０℃以上で完全に失活する。また、酵素反応は
３０〜５０℃、好ましくは４０〜５０℃、より好ましく
は４５℃で効率良く進行する（図４参照）。

【００２１】４.力価の測定 酵素の力価測定は下記の方法で行った。 （１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。 Ａ.速度法 ５０ｍＭ ＦＺＬ溶液はあらかじめ調製したＦＺＬを蒸
留水に溶解することによって調製した。４５ｍＭ ４−
アミノアンチピリン、６０ユニット／mlパーオキシダー
ゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液それぞれ１００
μｌと、０.１ＭＴris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ８.０）１m
l、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で２.
９mlとする。３０℃で平衡化した後、５０ｍＭ ＦＺＬ
溶液１００μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を
経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数
（５.１６×１０³Ｍ^-1cm^-1）から、１分間に生成する過
酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性
単位（ユニット：Ｕ）とする。

【００２２】Ｂ.終末法 上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、３０分間、３０
℃でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度
を測定し、あらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作成
しておいた検量線から、生成した過酸化水素量を算出す
ることにより、酵素活性を測定する。 （２）酵素反応による酸素吸収を測定する方法 ０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液(pＨ８.０）１mlと酵素溶液
５０μｌを混合し、蒸留水で全量を２.９mlとし、ラン
ク ブラザーズ社の酸素電極のセルに入れる。３０℃で
攪拌し、溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭ Ｆ
ＺＬ １００μｌを添加し、酸素吸収を記録計で連続的
に計測し、初速度を得る。標準曲線から１分間に吸収さ
れた酸素量を求め、これを酵素単位とした。

【００２３】５. 酵素の阻害、活性化及び安定化 （１）金属の影響 ０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ８.０）の条件で、終
濃度１ｍＭの各種金属イオンを添加し、５分間、３０℃
でプレインキュベートした後、活性を測定した。結果を
下記の表３に示す。表３ 金属イオンのＳ−１Ｆ４由来ＦＬＯＤ−Ｓ活性へ
の影響

【表３】 表３から明らかに、ＦＬＯＤ−Ｓの活性は、二価の金属
イオンによって若干阻害され、銀イオン、水銀イオン、
銅イオン、及び亜鉛イオンにより、完全に阻害される。

【００２４】（２）各種阻害物質の影響 上記（１）の金属イオンの影響に関する試験と同様の方
法で試験した。但し、ＰＣＭＢ（パラクロロ安息香酸第
二水銀）は終濃度０.１ｍＭ、それ以外は１ｍＭとし
た。結果を下記の表４に示す。また、安定化の検討は、
５０ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液(ｐＨ８.５)に２ｍＭジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）を添加したものに対して一晩
透析を行った後、活性を測定することにより行った。結
果を下記の表４に示す。表４ 各種物質のＳ−１Ｆ４由来ＦＬＯＤ−Ｓ活性への
影響

【表４】 ＊：０.１ｍＭ 表４から明らかに、ＦＬＯＤ−Ｓ活性はＰＣＭＢ（パラ
クロロ安息香酸第二水銀）により、完全に阻害される。
また、フェニルヒドラジン、ヒドラジンによっても阻害
される。これら阻害物質の影響は、酵素活性の発現にＳ
Ｈ基、カルボニル基が関与していることを示唆してい
る。他方、ジチオスレイトールによって安定化され、保
存に適した溶媒はジチオスレイトール（ＤＴＴ）２ｍＭ
を添加した５０mＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液（pＨ８.５）で
ある。

【００２５】６.分子量 分子量はセファクリルＳ−２００を用いるカラムゲルろ
過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム
・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で測定した。カラ
ムクロマトグラフィは０.１Ｍ ＮａＣｌ含有０.１Ｍ Ｔ
ris-ＨＣl緩衝液(ｐＨ８.５)を用いて行った。分子量既
知の数種のタンパクについても同様に行い、溶出位置か
ら本酵素の分子量を求めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはデービ
スの方法に従い、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで、３
時間泳動し、タンパク染色は、クマシーブリリアントブ
ルーＧ−２５０で行った。標準タンパクとしてホスホリ
ラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボ
ニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターに
ついても同様に泳動し、検量線から、分子量を求めた。
測定の結果、Ｓ−１Ｆ４由来のＦＬＯＤ−Ｓは、セファ
クリルＳ−２００を用いるカラムゲルろ過法で測定した
場合、分子量約４５,０００（４５ｋＤａ）であり、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動）で測定した場合、約５０,００
０（５０ｋＤａ）であった（図５，６参照）。

【００２６】７.等電点 ディスク焦点電気泳動法によって測定した結果、Ｓ−１
Ｆ４由来のＦＬＯＤ−Ｓの場合、ｐＩ＝４.８であっ
た。

【００２７】８.既知の酵素との比較 既存の菌由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、本
発明のＳ−１Ｆ４由来ＦＬＯＤ−Ｓとを比較した。表５ 種々の微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼの比較

【表５】 1): ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric. Biol. Ch
em., 53(1), 103-110(1989) 2): ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric. Biol. Ch
em., 55(2), 333-338(1991) 3): フルクトシル−Ｎ^α−Ｚ−リジンに対する比活性 4): Ｎ−ｏ−フルクトシルーＮ^α−ホルミルリジンに対
する比活性 表５から、本発明のＦＬＯＤ−Ｓと他の２種の菌株由来
のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの間に、下記の
相違点が認められる。 （１）分子量の相違：本発明のＦＬＯＤ−Ｓが菌体内
で、単量体として産生されているのに対し、他の２種の
酵素は、菌体内で２量体として産生されている （２）補酵素：ＦＬＯＤ−Ｓは補酵素として共有結合的
に結合したＦＡＤを有するのに対し、他の酵素はいずれ
も非共有結合的に結合したＦＡＤを有する。 （３）基質特異性：基質であるフルクトシルリジンに対
する特異性の相違を示している。即ち、ＦＬＯＤ−Ｓは
フルクトシルリジンに対して高い特異性を有する。一
方、コリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリ
ジンには作用せず、アスペルギルス属由来の酵素はフル
クトシルリジンに作用するものの、フルクトシルバリン
に対する活性に比べて、その活性が低い。（４）ミハエ
リス定数：ＦＬＯＤ−Ｓの基質ＦＺＬに対する親和性
は、他の酵 素のそれよりも高いことを示している。 （５）至適ｐＨ、至適温度、等電点、及びＳＨ試薬によ
る阻害：ＦＬＯＤ−Ｓと他の２酵素との相違を示してい
る。

【００２８】（ＩＩ）ジベレラ属によって産生されるＦ
ＬＯＤ類 該ＦＬＯＤ−Ｇ類は一般に、下記の理化学的特性を有す
る。 １）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケト
アルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成する反
応を触媒し； ２）至適ｐＨは８.０であり； ３）安定温度は２０〜５０℃、至適温度は３５℃であ
り； ４）スーパーデックス２００ｐｇを用いたゲルろ過法で
測定した場合、分子量は約４７,０００（４７ｋＤａ）
である。

【００２９】該ＦＬＯＤ−Ｇの特性を詳細に説明する。 １．一般的な誘導特性 ＦＬＯＤ−Ｇはフルクトシルリジン及び／又はフルクト
シル Ｎ^α−Ｚ−リジン(ＦＺＬ)によって誘導される誘
導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを
窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシルリ
ジン及び／又はＦＺＬ含有培地で、ジベレラ属のフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ産生性菌株を培養すること
により産生される。ＦＬＯＤ−Ｇは、グルコースとリジ
ン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジンを共にオートクレーブし
て得られるＧＬ褐変化培地で誘導されるが、グルコース
とリジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジンを別々にオートク
レーブ処理して調製した培地では誘導されないことか
ら、該酵素はアマドリ化合物に特異的に作用するもので
ある。

【００３０】２．反応特異性及び基質特異性 本発明のＦＬＯＤ−Ｇは、式： Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ →
Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ²−ＮＨ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はタンパク残基を表
す）で示される反応における触媒活性を有する。上記の
反応式において、Ｒ¹が−ＯＨ、−（ＣＨ₂）ｎ−、又は
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ₂ＯＨ（式中、ｎは０−６
の整数）であり、Ｒ²が−ＣＨＲ³−［ＣＯＮＨＲ³］ｍ
ＣＯＯＨ（式中、Ｒ³はα−アミノ酸側鎖残基、ｍは１
−４８０の整数を表す）で示されるアマドリ化合物が基
質として好ましい。中でも、Ｒ³がリジン、ポリリジ
ン、バリン、アスパラギンなどから選択されるアミノ酸
の側鎖残基であり、またｎが５〜６、ｍが５５以下であ
る化合物が好ましい。

【００３１】本発明のＦＬＯＤ−Ｇは、以下の表６に示
すように、フルクトシルＮ^α−Ｚ−リジンに対して高い
特異性を有する。表６ 精製されたＧ.フジクロイ（ＩＦＯ ＮＯ．６３５
６）由来のＦＬＯＤ−Ｇの基質特異性

【表６】 ＊１：検出されず ＊２：フルクトシル牛血清アルブミン ＊３：フルクトシルヒト血清アルブミン 表６から、本発明のＦＬＯＤ−Ｇはフルクトシルポリリ
ジンに対する活性を有し、糖化タンパクのプロテアーゼ
消化物に対する活性もある。 ３．ｐＨ及び温度の条件 （Ｉ）の３と同様にｐＨ条件の測定を行った結果、至適
ｐＨは８.０である（図７）。また、０.１Ｍ Ｔris-Ｈ
Ｃl緩衝液（ｐＨ８.０）中で２０〜６０℃の温度条件に
ＦＬＯＤ−Ｇを加え、１０分インキュベートした後、通
常の条件で活性を測定した。上記方法で測定したとき、
本発明のＦＬＯＤ−Ｇの安定な温度領域は２０〜５０
℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは２０℃で
あり、酵素反応は、２０〜５０℃、好ましくは２０〜４
０℃、より好ましくは３５℃で効率良く進行する（図
８）。

【００３２】４．力価の測定 酵素の力価測定は下記の方法で行った。 （１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。 Ａ.速度法 １００ｍＭ ＦＺＬ溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを
蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−
アミノアンチピリン、６０ユニット／mlパーオキシダー
ゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液それぞれ１００
μｌと、０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ８.０）１m
l、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で２.
９５mlとする。３０℃で平衡化した後、１００ｍＭ Ｆ
ＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度
を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係
数（５.１６×１０³Ｍ^-1cm^-1）から、１分間に生成する
過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活
性単位（ユニット：Ｕ）とする。

【００３３】Ｂ.終末法 上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、３０分間３０℃
でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を
測定し、あらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作成し
ておいた検量線から、生成した過酸化水素量を算出する
ことにより、酵素活性を測定する。 （２）酵素反応による酸素吸収を測定する方法 ０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液(pＨ８.０）１mlと酵素溶液
５０μｌを混合し、蒸留水で全量を３.０mlとし、ラン
ク ブラザーズ社の酸素電極のセルに入れる。３０℃で
攪拌し、溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭ Ｆ
ＺＬ １００μｌを添加し、酸素吸収を記録計で連続的
に計測し、初速度を得る。標準曲線から１分間に吸収さ
れた酸素量を求め、これを酵素単位とした。

【００３４】５．酵素の阻害、活性化及び安定化 （１）金属の影響 ０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ８.０）の条件で、終
濃度１ｍＭの各、金属イオンを添加し、５分間３０℃で
プレインキュベートした後、活性を測定した。結果を下
記の表７に示す。表７ 金属イオンの、Ｇ.フジクロイ（ＩＦＯ ＮＯ．６
３５６）由来ＦＬＯＤ−Ｇの活性への影響

【表７】 表７から明らかに、本発明のＦＬＯＤ−Ｇの活性に対
し、コバルトイオン、銅イオン、亜鉛イオン、水銀イオ
ン及び鉄（III）イオンが阻害的であり、銀イオンは完
全に阻害する。

【００３５】（２）各種阻害物質の影響 上記（１）の金属イオンの影響に関する試験と同様の方
法で試験した。結果を表８に示す。安定化の検討は、５
０mＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液（pＨ８.５）に２ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）を添加したものに対して一晩透
析を行った後、活性を測定することにより行った。表８ 各種物質のＦＬＯＤ−Ｇ活性への影響

【表８】 ＊１：０.１ｍＭ 表８から明らかに、ＦＬＯＤ−Ｇ活性はパラクロロ安息
香酸第二水銀、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、ヒド
ロキシルアミン及びアミノグアニンにより、強く阻害さ
れ、酵素反応にはＳＨ基及びカルボニル基が重要な働き
をしていることが予想される。他方、ジチオスレイトー
ルによって安定化され、保存に適した溶媒はジチオスレ
イトール２ｍＭを添加した５０mＭ Ｔris−ＨＣl緩衝液
（pＨ８.５）である。

【００３６】６．分子量 スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過法で求めた
結果、分子量は約４７,０００（４７ｋＤａ）であった
（図９)。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、（Ｉ）
の６と同様の方法で行い、分子量を求めた結果、分子量
は約５２,０００（５２ｋＤａ）であることが示された
（図１０)。従って、本発明のＦＬＯＤ−Ｇは単量体で
あることが明らかである。

【００３７】７．既知の酵素との比較 既存の菌由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、本
発明のＦＬＯＤ−Ｇとを比較した。表９ 種々の微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼの比較

【表９】 1): ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric.Biol.Che
m., 53(1), 103-110 (1989) 2): ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric.Biol.Che
m., 55(2), 333-338 (1991) 3): フルクトシル Ｎ^α−Ｚ−リジンに対する比活性 4): Ｎ−ｏ−フルクトシル Ｎ^α−ホルミルリジンに対
する比活性 表９から、本発明のＦＬＯＤ−Ｇと他の２種の菌株由来
のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの間に、下記の
相違点が認められる。 （１）分子量の相違：本発明のＦＬＯＤ−Ｇは、単量体
として産生されているのに対し、他の２種の酵素は二量
体として産生されている。 （２）補酵素：ＦＬＯＤ−Ｇは補酵素として共有結合的
に結合したＦＡＤを有するのに対し、他の酵素はいずれ
も非共有結合的に結合したＦＡＤを有する。 （３）基質特異性：ＦＬＯＤ−Ｇは、フルクトシルバリ
ンには作用せず、フルクトシルリジンに特異的である
が、コリネバクテリウム属由来の酵素はフルクトシルリ
ジンには作用せず、アスペルギルス属由来の酵素はフル
クトシルリジンに作用するものの、フルクトシルバリン
に対する活性に比べて、その活性が低い。 （４）ミハエリス定数：ＦＬＯＤ−Ｇの基質フルクトシ
ルリジンに対する親和性が、他の酵素のそれよりも高い
ことを示している。 （５）至適ｐＨ、至適温度、及びＳＨ試薬による阻害等
の差異はＦＬＯＤ−Ｇと他の２酵素との相違を示してい
る。

【００３８】既述のごとく、フサリウム属及びジベレラ
属由来の菌により、本発明方法に従って産生されたＦＬ
ＯＤは、アマドリ化合物の定量に有用である。従って、
本発明はまた、アマドリ化合物を含有する試料と、本発
明のＦＬＯＤとを接触させ、酸素の消費量又は過酸化水
素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマ
ドリ化合物の分析法を提供するものである。本発明の分
析法は、生体成分中の、糖化タンパクの量及び／又は糖
化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量に基づいて
行われる。ＦＬＯＤの酵素活性は下記の反応に基づいて
測定される。 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ²＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ→Ｒ¹−
ＣＯ−ＣＨＯ ＋Ｒ²−ＮＨ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す） 被検液としては、アマドリ化合物を含有する任意の試料
溶液を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿又
は血清）、尿等の生体由来の試料の外、醤油等の食品が
挙げられる。

【００３９】本発明のＦＬＯＤをアマドリ化合物含有溶
液に、適当な緩衝液中で作用させる。反応溶液のpＨ及
び温度は、それぞれ、使用する酵素に適した条件とす
る。即ち、ＦＬＯＤ−Ｓの場合、ｐＨ４.０〜１２.０、
好ましくはｐＨ８.０、温度２０〜５５℃、好ましくは
３０〜４５℃、より好ましくは４５℃で行う。また、Ｆ
ＬＯＤ−Ｇの場合、ｐＨ４.０〜１２.０、好ましくは
８.０、温度は２０〜５０℃、好ましくは３５℃であ
る。ＦＬＯＤの使用量は、終点分析法においては通常、
０.１ユニット／ml以上、好ましくは１〜１００ユニッ
ト／mlである。緩衝液としてはＴris-ＨＣl等を用い
る。

【００４０】本発明の分析法では、下記のいずれかのア
マドリ化合物の定量法を用いる。 （１）過酸化水素発生量に基づく方法 当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発
色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化
水素及びアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線
と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量
する。具体的には、上記（Ｉ）,４又は（ＩＩ）,４に記
載の力価測定法に準じる。ただし、ＦＬＯＤ量は１ユニ
ット／mlとし適当に希釈した試料を添加し、生成する過
酸化水素量を測定する。過酸化水素発色系としては、４
−アミノアンチピリン／フェノール系のかわりに４−ア
ミノアンチピリン／Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン，４−アミノ
アンチピリン／Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン，４−アミノ
アンチピリン／Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン，ＭＢＴＨ／
Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン，４−アミノアンチピリン／
２，４−ジクロロフェノール等の組み合わせが可能であ
る。 （２）酸素の消費量に基づく方法 反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引い
た値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化
合物の量に関して作成した標準曲線と比較することによ
り、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、
上記（Ｉ），４又は（ＩＩ），４の力価の測定に準じて
行う。但し用いるＦＬＯＤ量は１ユニット／ｍｌとし、
適当に希釈した試料を添加し吸収される酸素量を求め
る。

【００４１】本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行
うこともできるが、対象となる糖化タンパクによって
は、あらかじめ糖が結合したリジン残基を遊離させてか
ら行うことが好ましい。そのような目的には、タンパク
質分解酵素を用いる場合（酵素法）と、塩酸等の化学物
質を用いる場合（化学法）があるが、前者が好ましい。
本発明方法に用いることができるタンパク質分解酵素
は、当業者に既知であり、トリプシン、カルボキシペプ
チダーゼＢ、パパイン、アミノペプチダーゼ、キモトリ
プシン、サーモリシン、ズブシリシン、プロティナーゼ
Ｋ、プロナーゼ等を挙げることができる。酵素処理の方
法も既知であり、例えばトリプシン処理は、下記実施例
に記載の方法で行うことができる。

【００４２】上記のごとく、本発明のＦＬＯＤは、糖化
タンパクに含まれるフルクトシルリジンに高い基質特異
性を有するものであることから、血液試料中の糖化タン
パクを測定することを含む、糖尿病の診断などに有用で
ある。このように、検体として血液試料（全血、血漿又
は血清）を用いる場合、採血した試料をそのまま、ある
いは透折等の処理をした後、用いる。さらに、本発明方
法に用いるＦＬＯＤ、パーオキシダーゼ等の酵素は、溶
液状態で用いてもよいが、適当な固体支持体に固定化し
てもよい。例えば、ビーズに固定化した酵素をカラムに
充填し、自動化装置に組み込むことにより、臨床検査な
ど、多数の検体の日常的な分析を効率的に行うことがで
きる。しかも、固定化酵素は再使用が可能であることか
ら、経済効率の点でも好ましい。さらには、酵素と発色
色素とを適宜組み合わせ、臨床分析のみならず、食品分
析にも有用なアマドリ化合物の分析のためのキットを得
ることができる。

【００４３】酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法
により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化
法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高
分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン
酸、カラギーナン、などがある。結合は共有結合、イオ
ン結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者
既知の方法で行う。固定化酵素を用いる場合、分析はフ
ロー又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、
固定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分
析（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診
断を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化
タンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度
に対する糖化タンパク質の濃度の比率（糖化率）又はフ
ルクトサミン値で表される。全タンパク質濃度は、通常
の方法（２８０ｎｍの吸光度、Ｌowry法あるいは、アル
ブミンの自然蛍光など)で測定することができる。

【００４４】本発明はまた本発明のＦＬＯＤを含有する
アマドリ化合物の分析試薬又はキットを提供するもので
ある。本発明のアマドリ化合物の定量のための試薬は、
本発明のＦＬＯＤ、好ましくはｐＨ７.５〜８.５、より
好ましくはｐＨ８.０の緩衝液からなる。該ＦＬＯＤが
固定化されている場合、固体支持体は高分子ゲルなどか
ら選択され、好ましくはアルギン酸である。試薬中のＦ
ＬＯＤの量は、終点分析を行う場合、試料あたり、通常
１〜１００ユニット／ml、緩衝液はＴris-ＨＣl（ｐＨ
８.０）が好ましい。過酸化水素の生成量に基づいてア
マドリ化合物を定量する場合、発色系としては、上記と
同様、４−アミノアンチピリン／フェノール系のかわり
に４−アミノアンチピリン／Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン，４
−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン，４
−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン，Ｍ
ＢＴＨ／Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン，４−アミノアンチ
ピリン／２，４−ジクロロフェノール等の組み合わせが
可能である。本発明のアマドリ化合物の分析試薬と、適
当な発色剤並びに比較のための色基準あるいは標準物質
を組み合わせて、予備的な診断、検査に有用なキットす
ることができる。上記の分析試薬およびキットは、生体
成分中の、糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、
あるいはフルクトサミンを定量するために用いられるも
のである。以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。

【００４５】

【実施例】実施例１ Ｆ.オキシスポルムＳ−１Ｆ４由
来のＦＬＯＤ−Ｓの製造及び精製Ｆ .オキシスポルムＳ−１Ｆ４（Fusarium oxysporum Ｓ
−１Ｆ４：ＦＥＲＭＢＰ−５０１０）をＦＺＬ 0.5％、
グルコース 1.0％、リン酸二カリウム0.1％、リン酸一
ナトリウム 0.1％、硫酸マグネシウム 0.05％、塩化カ
ルシウム 0.01％, イーストエキス0.2％を含有する培地
（ｐＨ６.０)１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを
用いて通気量２Ｌ／分、攪拌速度４００rpmの条件で２
８℃、２４時間攪拌培養した。培養物はろ過して集め
た。菌糸体の一部（２００ｇ）を、２mＭのＤＴＴを含
む、０.１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８.５)１
Ｌに懸濁し、ダイノミルにより菌糸体を破砕した。破砕
液を１０,０００rpmで１５分間遠心分離し、得られた液
を粗酵素液（無細胞抽出液）とした。粗酵素液に４０％
飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略
す）を加え、攪拌し、１２,０００rpmで１０分間遠心分
離した。得られた上清に７５％飽和になるように硫安を
加え、撹拌し、１２,０００rpmで１０分間遠心分離し
た。沈殿を２mＭのＤＴＴを含有する５０mＭ Ｔris−Ｈ
Ｃｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）（以下、緩衝液Ａと略
す）に溶解し、緩衝液Ａにて一晩透析した。透析物を緩
衝液Ａにて平衡化したＤＥＡＥ−セファセルカラムに吸
着した。同緩衝液Ａにて洗浄した後、０−０.５Ｍの塩
化カリウム直線濃度勾配で溶出した。活性画分を集め、
５５％から７５％の硫安分画に供し、緩衝液Ａにて一晩
透析した。透析物に２５％飽和になるように硫安を加
え、２５％飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したフェニ
ル−トヨパールカラムに吸着した。同緩衝液にて洗浄し
た後、硫安濃度２５−０％飽和の直線勾配で溶出した。
活性画分を集め、４０％飽和になるように硫安を添加
し、４０％飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したブチル
−トヨパールカラムに吸着した。同緩衝液にて洗浄した
後、硫安濃度４０−０％飽和の直線濃度勾配にて溶出し
た。活性画分を集め、８０％飽和となるように硫安を添
加し、攪拌後、１２,０００rpm、１０分間遠心分離し、
得られた沈殿を０.１Ｍの緩衝液Ａに溶解した。その酵
素溶液を０.１Ｍ塩化カリウムを含有する、０.１Ｍ緩衝
液Ａで平衡化したセファクリルＳ−２００ゲルろ過クロ
マトクラフィに供した。活性画分を集め、限外瀘過で濃
縮した。濃縮物をファルマシアＦＰＬＣシステムでＭon
o Ｑカラムを用いて処理すること（緩衝液Ａを用いた塩
化カリウムの０−０.５Ｍ直線濃度勾配による溶出）に
より、３０〜６０ユニットの精製酵素を得た。

【００４６】精製酵素のＵＶ吸収スペクトルを図１１に
示す。図１１は、本酵素がフラビン酵素であることを示
唆している。また、該精製酵素標品を用いて、セファク
リルＳ−２００を用いるカラムゲルろ過法、及びドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと称する）で分子量を測定し
た。カラムクロマトグラフィは０.１Ｍ ＮａＣｌ含有
０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液(ｐＨ８.５)を用いて行っ
た。分子量既知の数種のタンパクについても同様に行
い、溶出位置から本酵素の分子量を求めた。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥは標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、カルボニック
アンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを用い、
デービスの方法に従って分子量を測定した。即ち、１０
％ゲルを用いて、４０ｍＡで、３時間泳動し、タンパク
染色は、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０で行っ
た。検量線から、分子量を求めた。測定の結果、Ｓ−１
Ｆ４由来のＦＬＯＤ−Ｓは、セファクリルＳ−２００を
用いるカラムゲルろ過法で測定した場合、分子量約４
５,０００（４５ｋＤａ）であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
測定した場合、約５０，０００（５０ｋＤａ）であった
（図５，６参照）。さらに、本実施例で調製したＦＬＯ
Ｄ−Ｓの酵素活性、ｐＨ及び温度安定性、金属及び阻害
物質による影響などに関しては、前記（Ｉ）の各項に記
載の値又は性質を示した。

【００４７】リジン残基にグルコースが結合している
[J.Biol.Chem.26：13542-13545(1986)]糖化ヒト血清ア
ルブミン（glycated human serum albumin; シグマ社）
を糖化タンパク基質として用い、上記実施例で調製した
精製ＦＬＯＤ−Ｓを用いて定量した。実施例２ 糖化アルブミン濃度の定量 １）トリプシン処理 試薬の調製 Ａ：２％トリプシン溶液［０.１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ塩酸
緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解］ Ｂ：４５ mＭ ４−アミノアンチピリン水溶液 Ｃ：６０ mＭ Ｎ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル)−ｍ−トルイジン Ｄ：６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 Ｅ：１４ユニット／ml ＦＬＯＤ−Ｓ Ｅの１４ユニット／ml ＦＬＯＤ−Ｓ液は以下の方法で
調製した。即ち、実施例１で得たＦ.オキシスポルムＳ
−１Ｆ４由来の精製ＦＬＯＤ−Ｓを１４ユニット／mlに
なるように蒸留水で希釈した。ＦＬＯＤ反応液は０.１
Ｍ Ｔris−ＨＣｌ塩酸緩衝液(pＨ ８.０)１０mlにＢ〜
Ｅ液それぞれ１ml加え、蒸留水にて全量を３０mlとする
ことにより調製した。トリプシン処理は、種々の濃度
（０−１.０％）の糖化ヒト血清アルブミン（シグマ
社）３０μｌと同量のＡ液とを混合し、３７℃、６０分
間インキュベートすることにより行った。

【００４８】２）定量 トリプシン処理した反応液にＦＬＯＤ反応液１ml加え、
３０℃、３０分間インキュベートした後、５５５nmにお
ける吸光度を測定した。結果を図１２に示す。図中、縦
軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素量に対応）、横軸は
糖化アルブミンの濃度を表す。図は、糖化アルブミン濃
度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示してい
る。

【００４９】実施例３ ヒト血清アルブミンの糖化率の
測定 ０.９％塩化ナトリウム水溶液３mlに、糖化ヒト血清ア
ルブミン（シグマ社）１５０mg、ヒト血清アルブミン
（シグマ社）１５０mgをそれぞれ溶解した。これらの溶
液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作成
し、自動グリコアルブミン測定装置（京都第一科学）を
用いて検定したところ、その糖化率は、２４.１％〜５
１.９％であった。これらの溶液を用いて前処理混合物
を次のように調製した。 糖化アルブミン溶液 １９０μl ６mg／ml プロテイナーゼＫ（シグマ社） ２０μl ６mg／ml プロナーゼＥ（シグマ社） ２０μl １.２５％ ＳＤＳ ２０μl これらの混合物を５５℃で３０分間インキュベートし
た。その後、各前処理試料から１部をとり出し、以下の
ように調製された反応液に加えた。 ４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ７０μl ６０mＭ フェノール溶液 ７０μl ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ７０μl ０.１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）７００μl １１.５ユニット／ml ＦＬＯＤ−Ｓ溶液 ３０μl 蒸留水で全量を２mlとした。１１.５ユニット／mlＦＬ
ＯＤ−Ｓ溶液は、実施例１の方法で得たＦＬＯＤ−Ｓを
１１.５ユニット／mlになるよう、０.１Ｍ Ｔris−ＨＣ
ｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）で希釈して調製した。この
反応液を３０℃でインキュベートし、各処理試料を１０
０μl加え、３０分後の５０５nmにおける吸光度を測定
した。この方法で得られるアルブミンの糖化率と吸光度
との関係を図１３に示す。図中、縦軸は５０５nmの吸光
度（過酸化水素の量に対応）、横軸はアルブミンの糖化
率を表す。図は、アルブミンの糖化率と過酸化水素発生
量が相関関係にあることを示している。

【００５０】実施例４ 血液試料中の糖化タンパクの定
量 糖尿病患者血清を基質として用い、実施例１で精製した
ＦＬＯＤ−Ｓを用いて血中糖化タンパクを実施例２の方
法で定量した。従来、糖尿病患者の血糖管理指標として
は血清中のフルクトサミンや全血中のヘモグロビンＡ１
ｃ（ＨｂＡ１ｃ）値が用いられている。本実施例では、
外来糖尿病患者の血液試料を用いて、本発明のＦＬＯＤ
−Ｓを用いた酵素法による糖化タンパク（血清アルブミ
ン）測定と、従来から用いられている指標との相関の程
度を検討した。結果を図１４、１５に示す。図中の縦軸
は５５５nmの吸光度（過酸化水素量に対応）、横軸は試
料とした患者血清中のフルクトサミン値（図１４）、全
血中のヘモグロビンＡｌｃ値（図１５）を示す。それぞ
れの図はＦＬＯＤ−Ｓを用いた糖化タンパクの測定結果
と従来の糖尿病患者の血糖管理指標との間に相関関係が
あることを示している。即ち、本発明方法の指標として
の有用性が確認された。また、ＨｂＡ１ｃ、フルクトサ
ミン値の高い患者は糖化タンパク（血清アルブミン）値
も高くなるはずである。フルクトサミンは血清中のタン
パクが糖化されたものであるため、その主成分であるア
ルブミンの生体内での寿命とよく相関する。しかし、Ｈ
ｂＡ１ｃは、ヘモグロビンとアルブミンの生体内での寿
命が異なり、また糖化部位がバリン残基であることか
ら、糖化タンパクとの相関は、フルクトサミンと糖化タ
ンパクとの相関よりも劣ると予想される。図１４及び１
５から、このことを読み取ることができる。

【００５１】実施例５ Ｇ．フジクロイ（ＩＦＯ Ｎ
Ｏ．６３５６）由来のＦＬＯＤ−Ｇの製造及び精製Ｇ .フジクロイ（ＩＦＯ ＮＯ．６３５６；Gibberella f
ujikuroi）をＦＺＬ０.５％、グルコース １.０％、リ
ン酸二カリウム０.１％、リン酸一ナトリウム０.１％、
硫酸マグネシウム ０.０５％、塩化カルシウム ０.０１
％, イーストエキス ０.２％を含有した培地（ｐＨ６.
０)１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて通
気量２Ｌ／分、攪拌速度４００ｒｐｍの条件で２８℃、
２４時間攪拌培養した。培養物は瀘過して集めた。菌糸
体１７０ｇ（湿重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む、０.
１Ｍ ＴrisーＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.５)１Ｌに懸濁し、
ダイノミルにより菌糸体を破砕した。破砕液を１０,０
００rpmで１５分間遠心分離し得られた液を粗酵素液
（無細胞抽出液）とした。粗酵素液に４０％飽和になる
ように硫安を加え、攪拌し１２,０００rpmで１０分間遠
心分離した。得られた上清に７５％飽和になるように硫
安を加え、撹拌し、１２,０００rpmで１０分間遠心分離
した。沈殿を２mＭのＤＴＴを含有する５０mＭ Ｔrisー
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.５）（緩衝液Ａ）に溶解し、緩
衝液Ａにて一晩透析した。透析物を緩衝液Ａにて平衡化
したＤＥＡＥ−セファセルカラムに吸着した。緩衝液Ａ
にて洗浄した後、０−０.５Ｍの塩化カリウム直線濃度
勾配で溶出した。活性画分を集め、５５％から７５％の
硫安分画に供し、緩衝液Ａにて一晩透析した。透析物に
２５％飽和になるように硫安を加え、２５％飽和硫安を
含む緩衝液Ａで平衡化したフェニル−トヨパールカラム
に吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫安濃度２５−
０％飽和の直線勾配で溶出した。活性画分を集め、４０
％飽和になるように硫安を添加し、４０％飽和硫安を含
む緩衝液Ａで平衡化したブチル−トヨパールカラムに吸
着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫安濃度４０−０％
飽和の直線濃度勾配にて溶出した。活性画分を集め、８
０％飽和となるように硫安を添加し、攪拌後、１２,０
００rpm、１０分間遠心分離し、得られた沈殿を０.１Ｍ
の緩衝液Ａに溶解した。その酵素溶液を０.１Ｍ塩化カ
リウムを含有する、０.１Ｍ緩衝液Ａで平衡化したセフ
ァクリルＳ−２００ゲル瀘過クロマトクラフィーに供し
た。活性画分を集め、限外瀘過で濃縮した。濃縮物をフ
ァルマシアＦＰＬＣシステムでＭono Ｑカラムを用いて
処理すること（緩衝液Ａを用いた塩化カリウムの０−
０.５Ｍ直線濃度勾配による溶出）により、３０〜６０
ユニットの精製酵素を得た。

【００５２】得られた精製酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
において、標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、カルボニッ
クアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを用
い、デービスの方法に従って分子量を測定した。即ち、
１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで３時間泳動し、クマシ
ーブリリアントブルーＧ−２５０でタンパク染色を行っ
た。検量線から分子量を求めた結果、サブユニットの分
子量は約５２,０００（５２ｋＤａ）であることが示さ
れた（図１０）。また、スーパーデックス２００ｐｇに
よるゲルろ過による分子量測定では、図９の検量線図か
ら明らかなように、約４７,０００（４７ｋＤａ）であ
った。本実施例で調製したＦＬＯＤ−Ｇの酵素活性、ｐ
Ｈ及び温度安定性、金属及び阻害物質による影響などに
関しては、前記（II）の各項に記載の値又は性質を示し
た。

【００５３】実施例６ フルクトシルポリリジンの定量 ０.１％のフルクトシルポリリジン溶液をＢＭＹ・ＮＢ
Ｔ検定法を用いて検定したところ、７５０μmol／ｌの
フルクトサミンを含有することが分かった。この溶液を
蒸留水で希釈することにより、０〜７５０μmol／ｌの
範囲で変化する一連の試料を作成した。各希釈液につい
て、同量の０.０５％トリプシンと混合し、３７℃で１
時間インキュベートした。その後、各前処理試料から一
部をとり出し、以下のように調製された反応液に加え
た。 ４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ５０μl ６０mＭ フェノール溶液 ５０μl ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ５０μl ０.１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０） ５００μl ７.６ユニット／ml ＦＬＯＤ−Ｇ溶液 ３０μl 蒸留水で全量を１３００μlとした。７.６ユニット／ml
ＦＬＯＤ−Ｇ溶液は、実施例５の方法で得たジベレラ由
来のＦＬＯＤ−Ｇを７.６ユニット／mlになるよう、０.
１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）で希釈し
て調製した。この反応液を３０℃でインキュベートし、
各処理試料を２００μl加え、３０分後の５０５nmにお
ける吸光度を測定した。この方法で得られるフルクトサ
ミンと吸光度との関係を図１６に示す。図中、縦軸は５
０５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸はフル
クトサミン値を表す。図は、フルクトサミン値と過酸化
水素発生量が相関関係にあることを示している。

【００５４】実施例７ ヒト血清アルブミンの糖化率の
測定 ０.９％塩化ナトリウム水溶液３mlに、糖化ヒト血清ア
ルブミン（シグマ社）１５０mg、ヒト血清アルブミン
（シグマ社）１５０mgをそれぞれ溶解した。これらの溶
液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作成
し、自動グリコアルブミン測定装置（京都第一科学）を
用いて検定したところ、その糖化率は、２４.１％〜５
１.９％であった。これらの溶液を用いて前処理混合物
を次のように調製した。 糖化アルブミン溶液 １９０μl ６mg／ml プロテイナーゼＫ（シグマ社） ２０μl ６mg／ml プロナーゼＥ（シグマ社） ２０μl １.２５％ ＳＤＳ ２０μl これらの混合物を５５℃で３０分間インキュベートし
た。その後、各前処理試料から一部をとり出し、以下の
ように調製された反応液に加えた。 ４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ７０μl ６０mＭ フェノール溶液 ７０μl ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ７０μl ０.１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８.０） ７００μl ７.６ユニット／ml ＦＬＯＤ−Ｇ溶液 ３０μl 蒸留水で全量を２mlとした。この反応液を３０℃でイン
キュベートし、各処理試料を１００μl加え、３０分後
の５０５nmにおける吸光度を測定した。この方法で得ら
れるアルブミンの糖化率と吸光度との関係を図１７に示
す。図中、縦軸は５０５nmの吸光度（過酸化水素の量に
対応）、横軸はアルブミンの糖化率を表す。図は、アル
ブミンの糖化率と過酸化水素発生量が相関関係にあるこ
とを示している。

【００５５】

【発明の効果】本発明のＦＬＯＤは、従来の同種の酵素
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとは基質特異性にお
いて異なり、フルクトシルリジンに特異的に作用する。
従って、新たな臨床分析及び食品分析法の開発に有用で
あり、糖尿病の診断や食品の品質管理の面で寄与すると
ころが大きい。特に、血中の糖化タンパクの量及び／又
は糖化率を指標として、糖尿病の病状の診断に役立つと
考えられる。また、本発明のＦＬＯＤを用いるアマドリ
化合物の分析試薬及び分析方法によって、正確に糖化タ
ンパクを定量することができ、糖尿病の診断、症状管理
に貢献することができる。さらに、本発明のフルクトシ
ルリジン及び／又はＦＺＬ製造方法によりフルクトシル
アミノ酸オキシダーゼ産生菌のスクリーニング及び／又
は培養に有用なフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを
容易に得ることができる。また、このフルクトシルリジ
ン及び／又はＦＺＬを含有するＧＬ褐変化培地は、ＦＬ
ＯＤ産生菌の培養を効率良く行う上で有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】１％のＮ^α−Ｚ−リジンをオートクレーブ処理
することによるフルクトシルＮ^α−Ｚ−リジンの生成量
とグルコース濃度との関係を示すグラフ。

【図２】ＦＬＯＤの培養培地での産生量と培養時間の関
係を示すグラフ。

【図３】Ｓ−１Ｆ４由来ＦＬＯＤ−Ｓの溶媒中での活性
とｐＨの関係を示すグラフ。

【図４】Ｓ−１Ｆ４由来ＦＬＯＤ−Ｓの溶媒中での活性
と温度の関係を示すグラフ。

【図５】セファクリルＳ−２００を用いたゲルろ過によ
るＳ−１Ｆ４由来ＦＬＯＤ−Ｓの分子量測定の結果を示
すグラフ。

【図６】Ｓ−１Ｆ４由来精製ＦＬＯＤ−ＳをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけて得た電気泳動による移動パターンを示す
写真の模写図。

【図７】ジベレラ由来ＦＬＯＤ−Ｇの溶媒中での活性と
ｐＨの関係を示すグラフ。

【図８】ジベレラ由来ＦＬＯＤ−Ｇの溶媒中での活性と
温度の関係を示すグラフ。

【図９】ジベレラ由来精製ＦＬＯＤ−Ｇをスーパーデッ
クス２００pgを用いたゲルろ過により分子量測定した結
果を示すグラフ。

【図１０】 ジベレラ由来精製ＦＬＯＤ−ＧをＳＤＳ−
ＰＡＧＥにかけて得た電気泳動による移動パターンを示
す写真の模写図。

【図１１】精製Ｓ−１Ｆ４由来ＦＬＯＤ−Ｓの吸収スペ
クトル。

【図１２】基質として用いた糖化ヒト血清アルブミンの
濃度と、ＦＬＯＤ作用により生成された過酸化水素の量
との関係を示すグラフ。

【図１３】アルブミンの糖化率と、ＦＬＯＤ作用により
生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

【図１４】糖尿病患者の血清中のフルクトサミン値とＦ
ＬＯＤ−Ｓによる糖化タンパク濃度測定値との関係を示
すグラフ。

【図１５】糖尿病患者の全血中のヘモグロビンＡｌｃ値
とＦＬＯＤ−Ｓによる糖化タンパク濃度測定値との関係
を示すグラフ。

【図１６】フルクトサミン値と、ＦＬＯＤ作用により生
成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

【図１７】アルブミンの糖化率と、ＦＬＯＤ作用により
生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:77） (72)発明者 八木 雅之 京都府京都市右京区西京極三反田町１ 西京極団地４棟302号室 (72)発明者 船津 文代 大阪府枚方市茄子作４丁目40番２号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フサリウム属が生産する酵素であって、
   下記の理化学的特性を示すフルクトシルアミノ酸オキシ
   ダーゼ： １）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケト
   アルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成する反
   応を触媒し； ２）安定ｐＨは４〜１２、至適ｐＨは８であり； ３）安定温度は２０〜５５℃、至適温度は４５℃であ
   り； ４）ゲルろ過法で求めた分子量が約４５，０００であ
   る。
2. 【請求項２】 前記フサリウム属が、フサリウム・オキ
   シスポラム Ｓ−１Ｆ４であることを特徴とする請求項
   １に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。