CN1214106C - 释放a氨基糖化的氨基酸的酶，产生该酶的菌体以及该酶的应用 - Google Patents

释放a氨基糖化的氨基酸的酶，产生该酶的菌体以及该酶的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新型的酶(α-GARE)及生产该酶的新菌体，该酶能从糖蛋白中释放出α-氨基糖化了的氨基酸残基(α-GA)。该酶的生产菌包括解脲棒杆菌KDK1002(FERM P-17135)和产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)。该菌的培养液上清中包含α-GARE，应用它可象附图中所示的那样从糖化的肽中释放出α-GA。

Description

释放α氨基糖化的氨基酸的酶，产生该酶的菌体以及该酶的应用
技术领域
本发明涉及新型的酶。
技术背景
蛋白酶可被用于多种多样的产业领域。例如，在测定血清中的糖化白蛋白等糖化蛋白时，要使用这种酶，血清中的糖化白蛋白是诊断和治疗糖尿病的重要指标。
应用蛋白酶测定糖化蛋白的方法可如下进行。例如，用蛋白酶水解糖化蛋白，让水解产物与果糖基氨基酸氧化酶(以下称作“FAOD”)反应，通过测定所生成的过氧化氢量或消耗的氧量可知道糖化蛋白质的量。蛋白酶可使用特开平5-192193号公报、特开平7-289253号公报中公开的。
如此，因为预先用蛋白酶处理了糖化蛋白质，上面所讲的FAOD就很容易作用于糖化氨基酸和糖化肽，而对糖化蛋白质自身很难产生作用。尤其是糖化的血红蛋白(以下，计作“HbAlc”)，由于其糖化部分是β链N末端的氨基酸残基，FAOD对这部分的作用很容易，所以要寻求能处理HbAlc的蛋白酶。
发明的公开
本发明的目的是提供上述能处理糖化蛋白质，使FAOD对糖化蛋白质和糖化肽的作用容易的酶。
首先，本发明者们研究了各种FAOD中，对α-氨基键合了糖的糖化蛋白质、糖化肽及糖化氨基酸等起作用的FAOD的作用机制。结果发现，上述FAOD对α-氨基键合了糖的糖化氨基酸作用良好，但对上述糖化蛋白质和糖化肽的作用很难。基于此，本发明者们分离培养了自然界的各种菌，检测了它们产生的酶，结果成功地分离出能从α-氨基(N末端氨基)键合了糖的糖化蛋白质、糖化肽中释放出α-氨基糖化了的氨基酸(α-GlycatedAmino acid，以下称作α-GA)的新型酶的生产菌，完成了本发明。因为应用本发明的新型酶(α-Glycated Amino acid Releasing Enzyme，以下称作α-GARE)可以从上述糖化蛋白质和糖化肽中释放出α-GA，所以应用对α-GA发挥优良作用的FAOD进行HbAlc的临床检验等可实用化。除用于HbAlc的测定外，也可在其它糖化蛋白质的测定等不同领域应用。除本发明的促进α-GARE和α-GA释放的机能外，还有其它的催化机能，例如切断其它肽键合的机能。本发明者们分离出的菌体有棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)等菌体。本发明的α-GARE不限于来源于这些菌体。
本发明的α-GARE释放的糖化氨基酸，并不特别限定于其α-氨基发生糖化，但如前所述，由于HbAlc的N末端缬氨酸残基发生糖化，所以优选释放的α-GA为糖化的缬氨酸(以下称作α-GV)。
本发明的α-GARE是如下所示的两种类的α-GARE。
首先，一种α-GARE(以下叫做α-GARE-1)是来源于棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌体，特别优选来自解脲棒状杆菌KDK1002(Corynebacterium ureolyticum KDK 1002)。该解脲棒状杆菌KDK1002(Corynebacterium ureolyticum KDK 1002)是本发明者们从土壤中分离出的新型菌体，保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国305-0046茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏号为FERM P-17135(保藏日：平成11年1月11日)，后来该保藏于2000年2月21日转为国际保藏FERM BP-7040。
本菌体的菌学特征如下。
(形态特征)
本菌体的现状是大小0.8×1.2μm的杆菌，非运动性。
(培养性质)
让该菌体在普通琼脂培养基上生育时，其菌落的形态是低凸起的圆形，其菌落的颜色为乳白色。
(生理学特性)
革兰氏染色：阳性
氧要求性：厌氧
硝酸盐还原：-
吡嗪酰胺酶：+
吡咯烷基烯丙基酰胺酶：-
碱性磷酸酶：-
β-葡萄糖醛酸酶：-
β-半乳糖苷酶：-
α-葡萄糖苷酶：-
N-乙酰-β-葡萄糖胺酶：-
七叶苷(葡萄糖苷酶)：-
脲酶：+
液化明胶：-
β-溶血性：-
碳水化合物的发酵性：-
葡萄糖：-
核糖：-
木糖：-
甘露醇：-
麦芽糖：-
乳糖：-
白糖：-
糖原：-
第二种α-GARE(以下叫做α-GARE-2)是来源于假单胞菌属(Pseudomonas)的菌体，特别优选来自产碱假单胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenes KDK 1001)。该产碱假单胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenes KDK 1001)是本发明者们从土壤中分离出的新型菌体，保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国305-0046茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏号为FERM P-17133(保藏日：平成11年1月11日)。后来该保藏于2000年2月21日转为国际保藏FERM BP-7039。
本菌体的菌学特征如下。
(形态特征)
本菌体的现状是大小0.3×1.0-1.5μm的杆菌，通过鞭毛进行运动。
(培养性质)
让该菌体在普通琼脂培养基上生育时，其菌落的形态是低凸起的圆形，表面光滑。其菌落的颜色由半透明变化为淡黄色。用Mac Conkey培养基(Mac Conkey，下同〕也可看到生育，但很难说良好。另外，培养温度为40℃是不生育。
(生理学特性)
革兰氏染色：阴性
氧要求性：需氧
硝酸盐还原：+
吲哚生产：-
葡萄糖酸性化：-
精氨酸二氢酶：-
脲酶：-
七叶苷水解：+
明胶水解：-
β-半乳糖苷酶：+
葡萄糖生产的气体：-
底物利用能力
葡萄糖：+
L-阿拉伯糖：+
D-甘露糖：+
D-甘露醇：+
N-乙酰-D-葡萄糖胺：-
麦芽糖：+
葡萄糖酸钾：+
n-癸酸：+
肥酸：-
DL-苹果酸：+
柠檬酸钠：-
乙酸苯：-
前面所讲的糖化蛋白质或糖化肽的测定方法是：用酶消化糖化蛋白质或糖化肽以后，让消化产物与FAOD反应，通过测定这种氧化还原反应进行。本发明的糖化蛋白质或糖化肽测定方法的特征是上述方法中的酶应用本发明的新型酶(α-GARE)。本发明的测定方法中所使用的α-GARE要根据测定的糖化蛋白质和糖化肽的种类、它们的浓度适当选择，使用一种也可，两种以上并用也可。另外，为了使上述α-GARE的作用容易发挥，可预先用其它酶对糖化蛋白质(例如，蛋白酶等)进行消化。
本发明的测定方法中，上述氧化还原反应的测定，优选进行由氧化还原反应产生的过氧化氢量的测定或所消耗氧量的测定，进行过氧化氢量的测定时，优选应用被过氧化物酶氧化而生色的底物(以下叫做生色性底物)进行测定。除应用上述过氧化物酶等酶学方法外，还可用其它方法测定过氧化氢含量，如通过电的方法。
上面所讲的生色性底物包括N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺钠盐(例如，商品名DA-64，和光纯药社制等)、邻苯二胺(OPD)、特林达试剂与4-氨基安替比林组合的底物等。特林达试剂包括，如酚，酚的衍生物，苯胺衍生物，萘酚，萘酚衍生物，萘胺，萘胺衍生物等。另外，上述氨基安替比林之外，也可使用氨基安替比林衍生物，香草醛基二氨基磺酸，甲基苯基噻唑啉腙(MBTH)，磺基化的MBTH(SMBTH)等。这些生色底物中特别优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’二(二甲基氨)二苯基胺钠盐。
如前所述，测定血细胞中的HbAlc有利于糖尿病的诊断，因此，本发明的测定方法中，测定对象的样品优选血细胞。但是，由于其它成分，如血细胞以外的血液成分(全血、血浆、血清等)，尿液和骨髓液等活体样品，果汁等饮料，酱油、调味汁等食品中也包含糖化蛋白质，所以测定的目标样品不限于血细胞。另外，测定目标物并不限于上述HbAlc，还包括明胶、酪蛋白等其它糖化蛋白质和糖化肽。
本发明的糖化蛋白质或糖化肽的测定试剂盒是备有蛋白酶、FAOD、过氧化酶以及与过氧化酶反应而被氧化的底物的测定试剂盒，其特征在于，上述蛋白酶包括本发明的α-GARE。通过应用该试剂盒，可快速、简便地进行本发明的测定方法。与前面一样，α-GARE可以是一种，也可是两种以上并用。
本发明的试剂盒中，被氧化的底物优选上述的生色性底物，测定目标物以及测定目标样品与前面相同。
本发明的α-GARE的制备方法，包括培养本发明新菌体的工序。照此可容易地制备本发明的α-GARE。
本发明的α-GARE制备方法，优选还包括以下(a)-(c)所示的纯化过程。
(a)从培养液中除去菌体，制备上清的工序。
(b)用乙醇沉淀上述上清中的蛋白质的工序。
(c)用色谱分离上述蛋白质的工序。
对上述纯化过程没有特殊限制，也可合用其它的纯化步骤。例如，可只进行(a)步，进行2个以上的工序，再反复进行同一工序。
如前所述，从菌体培养而得到的本发明α-GARE，可以是包含在培养液中的状态，也可是纯化状态，只要是能从糖化蛋白质中释放出α-GA，不必拘泥于其纯度。但是，若进行纯化，由于去除了培养液中α-GARE以外的成分，所以α-GARE的比活性增高。这样在实际使用的时候，其使用量少，称取简便。另外，用于各种反应的时候，可避免α-GARE以外成分的影响。
对经过如上纯化工序而纯化出的α-GARE进行氨基酸序列的确定及基因序列的确定，制备出编码本发明α-GARE的基因。该基因并不限定于表达上述α-GARE的必要基因，也包含，例如作为探针和引物使用的DNA片段和RNA等，还包括以α-GARE的基因序列为基础化学合成的片段。应用这些基因可制作重组体，从而进行α-GARE的制备。本发明α-GARE基因的获得如下所示。
首先，纯化本发明的α-GARE，如按照后述的纯化工序进行纯化，用埃德曼试剂等常规方法进行氨基酸序列的测定，在此基础上推测其基因序列。在此基础上用常规的化学合成等方法制作DNA片段和RNA片段，作为引物和探针使用。克隆编码来自本发明新型菌体的α-GARE的基因，得到本发明的基因。
附图简述
图1是本发明的一实施例中，应用棒状杆菌属菌体的培养液上清，分解糖化肽，用TLC分析其分解产物的色谱图。
图2是上述一实施例中，应用棒状杆菌属菌体的培养液上清，分解糖化肽，用TLC分析其分解产物的其它色谱图。
图3是本发明的其它实施例中，应用假单胞菌属菌体的培养液上清，分解糖化肽，用TLC分析其分解产物的色谱图。
图4是本发明的其它实施例中，应用棒状杆菌属菌体的培养液上清，分解糖化肽，用LC-MS分析其分解产物的全部离子色谱图。
图5是上述实施例中，应用棒状杆菌属菌体的培养液上清，分解糖化肽，用LC-MS分析其分解产物的MS质谱图。
图6是本发明的其它实施例中，棒状杆菌属菌体来源的α-GARE量与吸光度间的关系图。
图7是本发明的其它实施例中，假单胞菌属菌体来源的α-GARE量与吸光度间的关系图。
图8表示本发明的其它实施例中，棒状杆菌属菌体来源的α-GARE的热稳定性。
图9表示本发明的其它实施例中，假单胞菌属菌体来源的α-GARE的热稳定性。
图10表示本发明的其它实施例中，棒状杆菌属菌体来源的α-GARE的最适温度。
本发明的最佳实施状态
产生本发明α-GARE的菌体的筛选可这样进行，例如，如下所示，分离培养土壤中的菌体，用其培养液进行糖化肽的分解反应，通过薄层层析(TLC)对所得分解产物进行分析。以下的筛选方法是本发明者们为分离出α-GARE产生菌进行反复详尽的研究而发现的。由于建立了该筛选方法而能成功地进行本发明α-GARE产生菌的分离，这麽说一点也不为过。
(1)培养方法
预先用高压蒸气灭菌器对如下所示的营养液体培养基进行高压灭菌，121℃灭菌20分钟。然后，将土壤样悬浮于灭菌水中，将之添加到已灭菌的营养液体培养基中，30℃振荡培养48小时(111rpm)。将所得培养液离心(12000G，15分钟，4℃)，回收上清。
(营养液体培养基)
麦芽提取物(商品名Malt extract：DIFCO公司)    2.0g
D-葡萄糖(ナカライテスク公司)                 2.0g
蛋白胨(商品名Becto peptone：DIFCO)           0.1g
蒸馏水                                        100ml
(2)糖化肽的分解反应
(糖化肽及糖化氨基酸的制备方法)
应用以下肽及缬氨酸、葡萄糖，常规制备其氨基酸序列与HbAlcβ链N末端氨基酸序列相同的α-氨基糖化了的肽及α-岩藻糖基缬氨酸(以下称作FV)。
(肽)
Val-His(肽研究所公司，以下将该糖化物称作F2P)
Val-His-Leu(肽研究所公司，以下将该糖化物称作F3P)
Val-His-Leu-Thr(バイオリンク公司，以下将该糖化物称作F4P)
Val-His-Leu-Thr-Pro(SIGMA公司，以下将该糖化物称作F5P)
Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser(バイオリンク公司，以下将该糖化物称作F9P)。
(L-氨基酸)
Val、Leu和His(和光纯药工业)
(分解方法)
预先将上述各糖化肽溶解到蒸馏水中，浓度为0.01M，分别制备糖化肽溶液。然后，分别将各糖化肽溶液50μl与上述培养液上清100μl混合，37℃反应一晚后，将该反应液冷冻干燥。
(3)TLC分析
用TLC对前面糖化肽的分解产物进行分析，确认其有无α-GARE活性。所使用的试剂及方法如下。
(薄层板)
商品名Pre-Coated TLC plate SILICA GEL 60(メルク公司)
(检测试剂)
用75％(体积)的乙醇溶解浓度为0.5％(体积)的茚三酮(フナコシ公司)。
(展开溶剂)
丁醇(ナカライテスク公司)、醋酸(ナカライテスク公司)和蒸馏水以2∶1∶1的体积比混合。
(分析方法)
预先准备展开距离为8cm的上述薄层板，距离板下端1cm的位置作为样品点的基线。然后在进行TLC分析前，分别将前述冷冻干燥的各反应液溶解到15μl分50％乙醇中，用注射器(体积25μl)将它们点到基线上。将前述的FV和各种氨基酸同样点到板上，作为对照。然后将该板放到预先用展开剂饱和了的展开槽中，让展开剂展开到距离基线约8cm的位置。放置薄层板时，展开剂浸没其下端约0.5cm。
展开剂展开后，在通风厨内风干，然后将检测试剂(茚三酮溶液)喷雾到薄层板上，用预热的热搅拌器(100℃)加热，进行显色试验。结果，与对照FV的移动度一样的样品α-GARE活性阳性，其培养液的菌体是α-GARE生产菌。
TLC分析中并不限定于前述的茚三酮法检测，也可应用其它方法，例如应用荧光胺、乙二胺硫酸盐等试剂的荧光检测方法。
另外，作为对照，优选使用，如糖化蛋白质或糖化肽底物的α-GA.
应用这种筛选方法，本发明者们分离出的新菌体有，如上述解脲棒状杆菌KDK1002(Corynebacterium ureolyticum KDK 1002)(FERMP-17135)和产碱假单胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenesKDK1001)(FERM P-17133)等。
本发明α-GARE的检测和活性测定中使用的底物并不限定于上述糖化肽，也包括，如N末端α-氨基糖化了的糖化蛋白质及糖化肽。应用这样的底物时，通过应用后述的FAOD进行氧化还原反应(例如显色反应)，释放出α-GA，而进行α-GARE的检测、测定。
前述的糖化蛋白质包括，如HbAlc，糖化珠蛋白等。这样的糖化蛋白质可以是天然产物，也可是通过糖与蛋白质进行阿马多尔转位反应而合成的。前述糖化珠蛋白的制备是，如用Teale的方法(Teale，FW，J.Biochem.Biophys.Acta.，35，543，1959)，对用HPLC纯化的HbAlc进行珠蛋白化。对合成的各种蛋白质进行糖化的时候，所使用的糖没有特别限制，可应用，如葡萄糖等醛糖和酮糖等。
前述的糖化肽的制备可如前所述，通过蛋白酶水解糖化蛋白质而得到，也可通过糖与合成肽的阿马多尔转位反应而合成。糖化肽的长度无特殊限制，但氨基酸残基可为2-20的范围，优选为2-8。
与糖进行阿马多尔转位反应的肽可以是天然产物，也可是合成的。其氨基酸组成无特殊限制，但优选不包含精氨酸和赖氨酸的肽。因为对这样的肽进行糖化时，可制备出只有肽的α-氨基被糖化了的糖化肽，用该糖化肽可仅检测出α-GARE活性。
具体而言，利用α-GARE进行HbAlc测定时，糖化肽优选，如与HbAlcβ链N末端氨基酸序列相同的糖化肽，例如前面的“糖化肽的分解反应”中讲到的N末端Val的α-氨基被糖化了的糖化肽。另外，用胰蛋白酶消化HbAlc时，可得到N末端Val的α-氨基被糖化了的氨基酸残基数为8的糖化肽。
用N末端的α-氨基被糖化了的糖化肽作为α-GARE的底物时，可检测释放出的α-GA，也可通过检测α-GA释放后的残存肽而检测、测定α-GARE。
这样的糖化肽无特殊限制，包括有，如FV-Leu(以下计作FVL)，FV-Gln(以下计作FVQ)、FV-Ala(以下计作FVA)、FV-Asn(以下计作FVN)等二肽。通过α-GARE的作用，FV游离，同时分别生成Leu、Gln、Ala、Asn。让生成的Leu与亮氨酸脱氢酶、Gln与谷氨酰胺脱氢酶、Ala与丙氨酸氨基转移酶和α-酮戊二酸和乳酸脱氢酶、Asn与门冬酰胺氨基转移酶和α-酮戊二酸和马来酸脱氢酶等反应，通过进行NADH生成或NAD生成的吸光度测定(波长340nm)而进行检测。
另外糖化包括，例如FV-Leu-Ser(以下计作FVLS)等。通过α-GARE可释放出FV，同时生成Leu-Ser。用氨基肽酶、糜蛋白酶、蛋白酶K等水解酶进行水解，可如前那样测定生成的亮氨酸。前述肽的长度无特殊限制。
α-GARE的底物可以是这样的底物，它包含氨基酸和检测基团，该氨基酸的α-氨基被糖化，且该检测基团与该氨基酸的α-羧基键合成酰胺或酯，该检测基团在键合状态下检测不到，游离后可检测得到。
α-GARE若与上述底物反应，可切断α-GA与上述检测基团形成的酰胺键或酯键，游离α-GA和检测基团。由于通过切断而释放出的检测基团能生色、发光，所以由此可检测、测定α-GARE。
上述检测基团没有特殊限制，但优选如前所述能通过生色和荧光进行检测的。通过生色而能进行检测的检测基团有，对硝基苯胺(以下计作p-NA)、对硝基苯酚、吲哚、β-萘酰胺、4-甲氧基-β-萘酰胺(4MβNA)等。通过荧光而能进行检测的检测基团有，如4-甲基-香豆素-7-酰胺等。具体而言，p-NA和对硝基酚用分光光度计测定波长405nm-410nm的吸光度为宜，4-甲基-香豆素-7-酰胺用380nm的激发波长，在波长460nm处进行测定。
上述的检测基团与α-羧基键合无论形成酰胺还是酯，α-GARE均能释放α-GA，所以推测α-GARE能识别α-氨基的糖化部分，释放出α-GA。
这样的检测基团与α-羧基键合的α-GARE的底物可进行制备，如应用市售检测基团键合的氨基酸和糖通过常规方法进行制备。
本发明的α-GARE可通过按照前述的培养方法培养本发明的α-GARE生产菌体而制备。应用解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)时，其培养条件为，如培养温度为20-37℃，培养时间为18-72小时，培养基的pH为7.0-8.0。使用产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)时，其培养条件为，如培养温度为20-40℃，培养时间为18-72小时，培养基的pH为5.0-10.0。
上述培养液中包含的α-GARE可通过常规方法进行分离纯化，得到α-GARE的酶标准品。α-GARE的纯化方法有，例如用硫酸铵盐等进行盐析方法、等电点沉淀法、乙醇沉淀法、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、疏水性色谱等已知方法，它们可联合应用。以下是纯化来自解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的一个例子。
首先，将上述培养液离心(12000G，15分钟，4℃)，除去菌体，得到上清。向上清中添加冷乙醇，使之体积达50％，搅拌，4℃放置20分钟，然后离心(12000G，15分钟，4℃)。再向所得上清中添加冷乙醇，使之体积达85％，搅拌后，与前面同样，放置、离心，回收沉淀。然后将沉淀溶解到纯水中。
将该溶液过柱，柱的商品名为ポロスHQ/M(ピ一イ一バイオシステムズ公司)，用10mM Tris-Hcl(pH7.5)缓冲液洗脱非吸附部分，回收。然后，将非吸附部分过商品名为バイオスケ一ルCHT-1(BioRad)的柱子，用1mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)洗脱非吸附部分，回收，得到部分纯化的本发明α-GARE酶溶液。本发明的其它菌体来源的α-GARE的纯化相同。
另外，培养本发明的新型菌体所使用的培养基并不限定于前面所讲的营养液体培养基，也可应用其它的培养基，如以下所示的血红蛋白(Hb)培养基。Hb溶液可按以下所示的方法进行制备。
(Hb培养基，pH6.0)
Hb溶液                    0.2％(重量)
K2HPO4                  0.2％(重量)
MgSO4·7H2O             0.02％(重量)
微量金属盐溶液            1.0％(重量)
微量维生素类溶液          0.2％(重量)
(Hb溶液)
将新鲜血液离心(2000G，10分钟，室温)，回收红细胞，向其中加入等体积的蒸馏水，溶血。将溶血了的溶液离心(2000G，10分钟，室温)，去除红细胞膜等，将该溶液作为Hb溶液。
(微量金属盐溶液)
CaCl2·2H2O                200mg
H3BO3                      50mg
CuSO4·5H2O                20mg
KI                            50mg
FeSO4·7H2O                100mg
MnSO4·5H2O                200mg
ZnSO4·7H2O                200mg
Na2MoO4·2H2O             50mg
其余                          水(总量500ml)
(微量维生素类溶液)
Ca-泛酸                       40mg
肌醇                          20mg
烟酸                          40mg
ρ-氨基安息香酸               20mg
吡多辛盐酸盐                  40mg
硫胺烟酸盐                    40mg
生物素                        0.2mg
维生素B12                 0.05mg
其余                      水(总量100ml)
用血细胞作样品，用α-GARE和FAOD测定血细胞中的糖化蛋白质(例如，HbAlc)，以此为例来说明本发明的糖化蛋白质或糖化肽的测定方法。
首先，用离心等常规方法从全血中分离出血细胞，将之溶血。溶血方法无特别限制，例如可以用表面活性剂的方法、超声波的方法、利用渗透压差的方法等。其中，考虑到操作简便性，优选应用表面活性剂。
上述表面活性剂可使用，例如商品名为TritonX-100等的聚氧乙烯-p-t-辛烷基苯醚类，商品名为Tween-20等的聚氧乙烯山梨聚糖烷基酯类，商品名为Brij35等的聚氧乙烯烷基醚类等。表面活性剂的处理条件为，例如当处理溶液中的血细胞浓度为1-10％体积的时候，向该处理溶液中添加浓度达0.1-1％重量的表面活性剂，室温，搅拌5秒-1分钟。
然后用本发明的α-GARE对上述溶血样品进行酶处理。这样，能从溶血样品中的糖化蛋白质中释放出α-GA。用α-GARE进行酶处理的条件是，例如在缓冲液中进行时，其处理条件要根据所使用的α-GARE种类(例如来源不同)和糖化蛋白质及糖化肽的种类及其浓度进行适当选择。
例如，测定对象物为HbAlc，使用来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE时，其处理条件为，反应液中α-GARE浓度为0.01U-1KU/L，温度为15-60℃，反应时间为3分-6小时，pH5.0-10.0。优选的是温度为30-37℃，反应时间为5-60分，pH6-8。此时，缓冲液可使用Tris-盐酸缓冲液，硫酸缓冲液，Good缓冲液(EPPS缓冲液，PIPES缓冲液等)等。本发明的其它菌体来源的α-GARE也同样适用。
然后，用FAOD处理上面经α-GARE处理而得到的分解物(α-GA)。FAOD催化的α-GA分解反应如下式(1)所示。
(式1)
如式1所示，用FAOD处理上面经α-GARE处理而得到的分解物(α-GA：R1-CO-CH2-NH-R2)生成糖(R1-CO-CHO)、氨基酸(NH2-R2)和过氧化氢(H2O2)。
上面式1中，R1是指糖化反应前产生糖的残基(糖残基)。反应前糖为醛糖时，糖残基(R1)为醛糖残基，反应前的糖为酮糖时，它为酮糖残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，经阿马多尔转位反应后的结构为果糖结构，此时，糖残基(R1)为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)可用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n是0-6的整数。
上面式1中，R2是α-氨基发生糖化了的氨基酸残基，可用下面式(2)表示。下面式(2)中，R3表示氨基酸侧链基团。
(式2)
-CHR3-CO-OH
前面所讲的FAOD没有特别限制，只要能催化上述反应即可，例如它还可有其它催化功能。FAOD处理，优选与上述α-GARE进行酶处理时同样的缓冲液。上述缓冲液无特殊限制，例如可用Tris盐酸缓冲液，EPPS缓冲液，PIPES缓冲液等。
FAOD的处理条件为，如反应液中FAOD浓度为0.1-10KU/L，温度15-50℃，反应时间1-60分钟，pH6-9，优选FAOD浓度为0.5-2KU/L，温度30-37℃，反应时间5-20分钟，pH7-8。
然后，应用POD和经氧化生色的底物，利用氧化还原反应测定经FAOD处理而产生的过氧化氢。
上述氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件要根据反应液中过氧化氢的浓度等适当选择。例如，反应液中POD浓度为10U-400KU/L，反应温度15-40℃，反应时间0.1-5分钟，pH5-10，更优选POD浓度为50U-20KU/L，反应温度30-37℃，反应时间0.1-1分钟，pH5-8。缓冲液没有特殊限制，可使用与FAOD处理时同样的缓冲液。
应用生色底物作为底物时，通过用分光光度计测定其显色(反应液的吸光度)，可测定过氧化氢的浓度，由此可知道样品中糖化蛋白质的浓度。
该测定过程中，各处理工序可如前所述分别进行，也可几个工序同时进行，或全部同时进行。例如，通过向样品中同时添加α-GARE和FAOD使之进行反应，可同时进行α-GARE处理过程和FAOD处理过程。另外，通过向α-GARE分解物中同时添加FAOD、POD和生色底物，可同时进行FAOD处理过程和POD生色过程。此外，还可同时进行用表面活性剂进行溶血处理过程和α-GARE处理过程。
(实施例)
(实施例1)
该实施例是让生产本发明α-GARE的新菌体培养液上清与具有α-GA的糖化肽进行反应，从该糖化肽中释放出α-GA的例子。若无特殊说明，与前述的筛选方法进行同样的菌体培养、糖化肽分解及TLC分析。
首先，将解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)接种到200ml前述营养液体培养基中，30℃振荡培养48小时。将所得培养液离心，去除菌体，其上清作为酶的粗提液。
将上述酶的粗提液100μl分别与0.01M糖化肽(F2P、F3P、F5P)溶液50μl混合，37℃反应一晚，然后，用TLC对该反应液进行分析。TLC分析结果如图1和图2所示。图1中，泳道1是对照(FV)，泳道2为对照(Leu，Val，His)，泳道3为F2P分解物，泳道4为F3P分解物；图2中泳道1为F2P分解物，泳道2为F5P分解物。图中用箭头表示的点的移动度如下面表1所示。
(实施例2)
将产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)接种到前述营养液体培养基中，与实施例1同样进行菌体培养，糖化肽的分解及TLC分析。其TLC分析结果如图3所示。图中泳道1是对照(FV)，泳道2为对照(Leu，Val，His)，泳道3为F2P分解物，泳道4为F3P分解物。另外，图中用箭头表示的点的移动度如下面表1所示。
(表1)
图序号      样品名           移动度
图1         对照FV           0.43
            F2P分解物        0.43
            F3P分解物        0.43
图2         F2P分解物        0.44
            F5P分解物        0.44
图3         对照FV           0.46
            F2P分解物        0.46
            F3P分解物        0.46
如图1、图2、图3及表1所示，经前述各种粗酶液处理的糖化肽分解物中，可确认与对照FV移动度相同的点(用箭头表示的点)。另外，实施例2中也可确认F5P分解物与FV的移动度相同(移动度0.46：图中未显示)。由以上可知，应用本发明的α-GARE可从糖化肽中释放出α-GA。并且，由于上述分解物的点与Val的移动度不同，所以可知糖未游离通过α-GARE释放出的FV。如图1、图2和图3所示，F2P分解物可看到FV和His的点。F3P分解物和F5P分解物中，除FV以外未看到分解物(二肽和四肽)的点，由此可以推测，用TLC方法很难检测得到的缘故。
(实施例3)
该实施例是用来源于本发明新型菌体的粗酶液处理糖化肽，确认α-GA(FV)释放的例子。
用上述Hb培养基(pH6.0)培养解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)，28℃培养5天。然后，将培养液离心(12000G，15分，4℃)，得到的上清作为粗酶液。
将该粗酶液与0.01M F4P溶液50μl混合，37℃反应一晚。用滤膜过滤该反应液，除去高分子量物质，将所得溶液冷冻干燥。
将上面的各冷冻干燥品溶解到下述溶液A中，在下述条件下，将该溶液进行逆相色谱，从分析开始每15秒为一级分〔250μl/级分)。相同条件下洗脱对照FV，确认其洗脱时间。
(逆相色谱)
柱：商品名Hypercarb(ジ一エルサイエニス公司，p26)
大小：100mm×4.6mm
环：1000μl
溶液A：三氟醋酸∶蒸馏水＝0.1∶100(体积比)
溶液B：丙酮∶蒸馏水∶三氟醋酸＝80∶20∶0.1(体积比)
梯度条件：0-25分，0-20％溶液B；25分以后，20％溶液B
流速：1ml/min
柱温度：37℃
检测波长：210nm，230nm
通过逆相色谱而得到的各分离级分，用以下方法进行FV的检测。
(FV的检测方法)
向各分离级分溶液20μl中添加过氧化氢溶液20μl，然后添加下述氧化还原反应液A60μl，37℃进行反应。然后，用生化学自动分析装置-商品名JCA-BM8(日本电子公司，下同)，在主波长694nm及副波长884nm处测定该反应液的吸光度。
(氧化还原反应液A的组成)
商品名DA64 20umol/l(和光纯药工业公司，下同)
POD(：东洋纺织公司，下同)20KU/l
FAOD(旭化成公司)0.5KU/l
磷酸钾缓冲液(pH8.0)0.1mol/l
结果，逆相色谱中洗脱时间为5-6分的级分中见到显色。该洗脱时间与对照FV的洗脱时间相同，这提示F4P分解物中存在FV。
接着对显色的级分进行如下条件的液相色谱(LC)/质谱(MS)分析。结果如图4和图5所示。图4为总的离子色谱图，图5是洗脱时间为1.84时流穿物的MS图谱。
(LC条件)
柱：商品名イナ一トシルODS3(ジ一エルサイエンンス公司)P28
大小：长150mm，内径2.1mm，ODS载体的粒径5μm
流洗液：乙氰∶01％体积的蚁酸水溶液＝10∶90(体积比〕
流速：0.2ml/min
柱温：40℃
(MS条件)
型号：商品名LC1100MSD(アジレントテクノロジ一公司)
质量范围：100-500am
电离化：
喷雾器：N2
Drying gas：N2(10L/min，350℃)
电压：60V
结果如图4和图5所示，检测出3个峰。详细地讲，洗脱时间1.84分时检测出表示FV的质量数280峰和质量数261的FV类似分子峰。大部分为质量数280的峰，因为该峰表示FV，所以可以确认F4P分解物生成了FV。
(实施例4)
该实施例是变化α-GARE的浓度，确认各浓度的α-GARE活性的
实施例。
(1)制备部分纯化的酶
与实施例3同样分别培养解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)和产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)。然后，回收各培养液上清，作为粗酶液。用截流分子量为5kDa的滤膜(商品名Ultrafree-MC filter：ミリポア公司〕分别对这些粗酶液进行浓缩，然后按以下所示的条件进行凝胶色谱，进行部分纯化。
(凝胶色谱)
柱：商品名HiLoad 26/60 Superdex 200pg(BioRad)
柱大小：内径260mm，长度600mm
流速：5.2ml/min
检测波长：280nm、230nm
流洗液：20磷酸钾缓冲液(pH7.5)
1级分：7ml
(2)α-GARE活性测定
应用下述HbAlc消化物溶液作为解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)来源的α-GARE的底物，应用10mM F3P(50mM/L磷酸钾缓冲液：pH8.0)作为产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)来源的α-GARE的底物。向上述各底物50μl中添加一定量(25、50、75、100、125、140μl)的各部分纯化α-GARE，37℃反应一晚。取该反应液20μl，与实施例3同样，用FAOD进行氧化还原反应，测定吸光度。以未添加α-GARE的作空白，求出每5分钟吸光度的增加量，作为α-GARE的活性。其结果如图6和图7所示。图6表示解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)来源的α-GARE酶量与显色量(吸光度)的关系。图7表示产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)来源的α-GARE酶量与显色量(吸光度)的关系。
(HbAlc消化物溶液)
用生理盐水(0.85％NaCl)洗涤人的全血，回收血细胞。向该血细胞中加入10倍体积的纯水，使之完全溶血，然后离心(10000G，30分)，分离血细胞膜，得到溶血液。用大小为0.94cm×20cm、商品名为Poly CAT的柱(poly LC)，根据Bisse和Wieland的方法(J.Chromatogr，(1988)，Vol 434，p95-110，Bisse and Wieland)从溶血液中分离出各7.5mg的Hb，回收HbAlc。将回收的HbAlc(血红蛋白浓度17g/l)20ml与0.2M醋酸钠缓冲液(pH3.0)5ml混合，用醋酸调整pH为3.0后，添加胃蛋白酶(Sigma公司)0.35ml。将该溶液在28℃孵育一晚后，用超滤膜(商品名Ultrafree-MC filter：ミリポア公司)去除胃蛋白酶等高分子量物质，所得溶液作为HbAlc消化物溶液。
如图6所示，来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE，在酶量大约50-100μl的范围内其活性以酶量依赖的方式增加。如图7所示，来源于产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE，在酶量添加到大约70μl以上时，其活性保持直线性增加。
(实施例5)
该实施例是验证本发明的α-GARE热稳定性的例子。
与实施例4同样制备部分纯化的来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE酶，和来源于产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE酶。预先，将两种部分纯化的酶在各温度(30、37、50、60、70、80℃)孵育15分钟，热处理后，取100μl部分纯化的酶，与50μl底物混合，37℃反应一晚。各α-GARE对应的底物与实施例4的相同。与实施例3同样，用FAOD对该反应液20μl进行氧化还原反应，测定吸光度。然后，以每5分钟吸光度的增加量作为α-GARE活性，以未处理的α-GARE活性作为100％，求出残存的活性。其结果如图8和图9所示。图8表示来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的热稳定性。图9表示来源于产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE的热稳定性。
如图8所示，来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE即使经过30-60℃的热处理仍显示100％的残存活性，但是经过80℃的热处理残存活性减到50％。如图9所示，来源于产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE即使经过30-60℃的热处理仍显示100％的残存活性，但是经过70℃的热处理残存活性减到60％。
(实施例6)
该实施例是确认本发明的α-GARE最适温度的例子。
与实施例4同样制备部分纯化的来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE酶。将该部分纯化的酶100μl添加到与实施例5同样的HbAlc消化物溶液90μl与磷酸钾缓冲液(pH8.0)10μl的混合液中，各温度(10、30、37、50、60、70℃)反应一晚。与实施例3同样，用FAOD对该反应液20μl进行氧化还原反应，测定吸光度。然后，以每5分钟吸光度的增加量作为α-GARE活性。其结果如图10所示。图10表示来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的最适温度。
如图10所示，来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的最适温度为大约40-50℃。
(实施例7)
该实施例是确认本发明的α-GARE分子量的例子。
与实施例3同样培养解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)，和产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)，回收其上清，作为粗酶液。然后将这些粗酶液，以与实施例4相同的条件进行凝胶色谱，进行分离。将各级分150μl添加到50μl底物与50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)的混合液中，37℃反应一晚。各α-GARE对应的底物与实施例4的相同。与实施例3同样，用FAOD对该反应液20μl进行氧化还原反应，测定吸光度。然后，以每5分钟吸光度的增加量作为α-GARE活性。分子量标记物使用商品名MW标记物(HPLC)(オリエンタル酵母公司)。
结果，两种粗酶液均在相当于分子量约40000-50000的级分中发现α-GARE活性，由此推测来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE，和来源于产碱假单胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE的分子量分别在40000-50000左右。
(实施例8及比较例1)
该实施例是用与实施例1和实施例2相同的α-GARE粗酶液处理糖化肽，通过用FAOD对其处理物进行氧化还原反应，测定粗酶液α-GARE活性的例子。所使用的时间、组分及方法如下。
(50mM糖化肽溶液)
将前述的F2P溶解到蒸馏水中，使其浓度达50mM。
(缓冲液A)
80mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)
(氧化还原反应液B的组成〕
商品名DA64 0.1mmol/L
POD 50KU/L
FAOD(キッコ一マン公司)10KU/L
缓冲液A 80mmol/L
将与实施例1和实施例2相同制备的粗酶液490μl与前述的糖化肽溶液10μl混合，30℃反应一晚，分解糖化肽。将该分解液25μl添加到上述缓冲液A 55μl中，然后与前述的氧化还原反应液B20μl混合，开始反应，用生化学自动分析装置-商品名JCA-BM8(日本电子社)测定该反应液在主波长694nm、副波长884nm的吸光度。预先用标准物FV进行FAOD反应，制作标准曲线，从吸光度求出α-GARE活性。结果如表2所示。另外，将胰蛋白酶(Sigma公司)、木瓜蛋白酶(Sigma公司)和氨基肽酶(Sigma公司)溶解到纯水中，使其浓度达1g/L，除应用各自的酶液以外，与前述同样测定α-GARE活性，作为比较例1。
(表2)
菌体名 α-GARE活性(U/L)
解脲棒状杆菌KDK1002 1.43
产碱假单胞菌KDK1001 0.26
如表2所示，应用来源于前面所讲两种新菌体的粗酶液时，可见到α-GARE活性，但在分别应用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和氨基肽酶的比较例1中，未检测到α-GARE活性。
(实施例9)
该实施例是用来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE酶溶液处理糖化珠蛋白，通过用FAOD对其处理物进行氧化还原反应而测定α-GARE活性的例子。所使用的试剂、其组成和方法如下。
(α-GARE酶溶液的制备方法〕
将解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)种植到200ml前述的营养液体培养基中，30℃振荡培养48小时，将所得培养液离心，去除菌体，回收上清。然后将上清过与前面同样的柱子，柱子的商品名为ポロスHO/M(ピ一イ一バイオシステムズ公司)和バイオスケ一ルCHT-1(BioRad)，进行α-GARE的部分纯化，所得活性级分作为α-GARE酶溶液。
(糖化珠蛋白的制备方法)
按照前面所讲的テ一ル方法，从人血细胞中纯化出珠蛋白。然后向该珠蛋白中添加葡萄糖，使其重量比达10％，40℃放置一周，由此制备出糖化珠蛋白。
预先将上述糖化珠蛋白溶解到蒸馏水中，使浓度达2g/L，制备出糖化珠蛋白溶液。将前述的α-GARE酶溶液100μl与糖化珠蛋白溶液50μl和100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)350μl混合，37℃反应3小时，分解糖化珠蛋白。用该分解液与实施例8同样求出α-GARE活性。由于FAOD(キッコ一マン公司)对α-GA具有特异作用，来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE，除α-GA以外，也可释放ε-氨基发生糖化的氨基酸残基，可只测定α-GARE活性。结果，α-GARE活性为2.1U/L。
(实施例10)
该实施例是用FV-pNA作底物测定α-GARE活性的例子。
与实施例1同样制备来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERM P-17135)的粗酶液。取400μl粗酶液与下面的反应试剂C 100μl混合，37℃进行反应，将通过α-GARE而释放出的pNA的生色作为在波长410nm处的吸光度变化而进行测定。以每1分钟吸光度的变化作为α-GARE活性。其结果如下面表3所示。
(FV-pNA的制备)
用常规方法，从Val-pNA(Sigma)和葡萄糖制备FV-pNA。
(反应试剂C)
FV-pNA 1ml
50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)20ml
(表3)
   样品   α-GARE活性(每1分钟吸光度的增加量)
    实施例1对照     0.00300.0005
如表3所示，本发明的α-GARE活性可糖化氨基酸的α位氨基，而且可通过与α位羧基酰胺键合的检测基团键合的氨基酸底物进行测定。
如上所述，因为本发明的α-GARE可释放α-GA，使FAOD的作用变得容易，所以它能精确测定糖化蛋白质和糖化肽。
产业上利用的可能性
本发明的新型酶α-GARE可从糖化蛋白质释放出α-氨基发生糖化了的氨基酸残基。若用FAOD进行糖化蛋白质测定的方法中使用该α-GARE，可准确且简便地测定糖尿病诊断的指标-HbAlc，因此，它可使HbAlc测定的临床检查实用化。

Claims (8)

1.一种新型酶，它可从糖化蛋白质或糖化肽中释放出α-氨基糖化了的氨基酸，其中所述酶来源于解脲棒状杆菌KDK1002(FERMBP-7040)。
2.权利要求1的酶，其释放出的糖化氨基酸为α-氨基糖化了的缬氨酸。
3.一种测定方法，它是用酶分解糖化蛋白质或糖化肤，然后让该分解产物与果糖基氨基酸氧化酶反应，通过测定氧化还原反应而测定糖化蛋白质或糖化肽的量的测定方法，其中的酶使用了权利要求1或2的酶。
4.权利要求3的测定方法，其中作为测定对象物的糖化蛋白质是糖化的血红蛋白。
5.一种测定试剂盒，它是糖化蛋白质或糖化肽的测定试剂盒，备有蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、过氧化物酶以及与它们反应而被氧化的底物，其中的蛋白醇包含权利要求1或2的酶。
6.一种菌体，它是解脲棒状杆菌KDK1002(FERM BP-7040)。
7.一种用于检测权利要求1或2的酶或测定其活性的底物，它包含氨基酸和检测基团，该氨基酸的α-氨基发生糖化，且该检测基团与氨基酸的α-羧基形成酰胺键或酯键，该检测基团在键合状态检测不到，游离状态时可检测到。
8.权利要求7的底物，其检测基团选自对硝基苯胺、对硝基苯酚、β-萘酰胺、4-甲氧基-β-萘酰胺及4-甲基-香豆素-7酰胺中的至少一种。
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