CN1180378A - 用于定量测定1,5－失水葡糖醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于定量测定样品中1,5－失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法,该方法包括使样品与活性以浓度—依赖性方式受1,5－失水葡糖醇抑制的酶共存,然后测定该酶的活性;本发明也涉及定量测定1,5－失水葡糖醇的试剂,该试剂包括活性以浓度－依赖性方式受1,5－失水葡糖醇抑制的酶、所说酶的底物以及定量测定由所说酶活性形成的物质的试剂。本发明还涉及对1,5－失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值的新海藻糖酶以及产生具有上述理化性质的新海藻糖酶的方法,该方法包括在培养基中培养属于诺卡氏菌属并具有产生所说海藻糖酶能力的微生物,并从培养物回收所说海藻糖酶。

Description

用于定量测定1，5-失水葡糖醇的方法

发明所属技术领域

本发明涉及用于酶促测定1，5-失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法、在这种方法中所用的试剂、适宜用于1，5-失水葡糖醇酶促测定方法的新海藻糖酶以及产生新海藻糖酶的方法。1，5-失水葡糖醇浓度的测定在糖尿病的诊断中是有用的。

背景技术

已知1，5-失水葡糖醇存在于人脑脊髓液和血浆中，在患某些疾病(尤其是糖尿病)的患者中1，5-失水葡糖醇的水平有变化，因此它作为糖尿病的一个诊断标志是重要的。先前用于1，5-失水葡糖醇定量测定的方法是包括使用特定的分析仪器(如气相色谱)的方法、使用特异性地氧化1，5-失水葡糖醇的酶的方法(日本出版的未审查的专利申请79780/87)以及一种包括下列步骤的方法：通过使用各种酶把在样品中的物质(如葡萄糖)转化成为其它物质，然后通过使用吡喃糖氧化酶或L-山梨糖氧化酶测定留在样品中1，5-失水葡糖醇的量(日本出版的未审查的专利申请185397/88)。

通常，仪器分析(如液相色谱和气相色谱)要对样品进行复杂的预处理，并需要昂贵的特定仪器，同时是非常耗时的；因此，这种方法不适合于大量样品的分析。在使用特异性地作用于1，5-失水葡糖醇的酶的方法中，不易于制备酶并将其用于适当的检测系统。使用吡喃糖氧化酶的方法的缺陷在于：吡喃糖氧化酶的底物特异性较低。

发明描述

本发明涉及下列方面：一种用于定量测定样品中1，5-失水葡糖醇的方法，该方法包括使样品与活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然后测定所说酶的活性；定量测定1，5-失水葡糖醇的试剂，该试剂包括活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所说酶的底物以及定量测定由所说酶活性形成的物质的试剂；对1，5-失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值的新海藻糖酶，该海藻糖酶具有下列理化性质：

(1)作用：它催化如通式(I)所示的反应，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖：

海藻糖+水—————→2D-葡萄糖                 (I)

(2)底物特异性：它特异性地作用于海藻糖，

(3)底物亲和：对海藻糖的Km值是6.7mM，

(4)最适pH和稳定pH值：酶的最适pH是5-6，在50℃处理30分钟时，酶在5-10的pH范围中是稳定的，

(5)最适温度和耐热性：最适温度在45℃左右，在pH5.0下处理30分钟时，酶在达到50℃时是稳定的，

(6)抑制剂：可被金属螯合剂(如，1，10-菲绕啉、乙二胺四乙酸(下文中称为EDTA)和2，2-二吡啶)、SH封闭剂(如p-汞苯甲酸和碘乙酰胺、羟胺、硫酸镍等)抑制，

(7)分子量：通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的酶的亚单位的分子量是大约90,000，通过凝胶过滤方法测得的酶的分子量是大约400,000；和

一种产生具有上述理化性质的新海藻糖酶的方法，该方法包括在培养基中培养属于诺卡氏菌属并具有产生所说海藻糖酶能力的微生物，并从培养物回收所说海藻糖酶。

本发明可用于测定任何包含1，5-失水葡糖醇的样品，例如，生物样品如脑脊髓液、血清、血浆和尿样以及这些样品的处理液体。

作为活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶，任何来源于昆虫、动物、植物、微生物等的酶都可使用，只要其活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制。优选的实例是催化作为底物的海藻糖的酶，如海藻糖酶和海藻糖磷酸化酶。这些酶可作为商业产品获得，或可通过培养微生物制备。

产生海藻糖酶的微生物包括属于链霉菌属、诺卡氏菌属或红球菌属的微生物。

属于链霉菌属的微生物的例子是金霉素链霉菌ATCC 10762和色褐链霉菌ATCC 23896。属于诺卡氏菌属是微生物的例子是南非诺卡氏菌ATCC6865。属于红球菌属的微生物的例子是圆红球菌ATCC 14898、圆红球菌ATCC 15076和玫瑰色红球菌ATCC 17895。

产生海藻糖磷酸化酶的微生物包括属于链孢菌属或动孢囊菌属的微生物。

属于链孢菌属的微生物的例子是锈色链孢菌FERM BP-4329。属于动孢囊菌属的微生物的例子是桔橙动孢囊菌ATCC 29727。

在下列文献中描述了以上微生物所属的种的菌学性质。金霉素链霉菌：

Bergeys细菌系统分类学手册，

vol.4，P.2478(1989)色褐链霉菌：

Bergey s细菌系统分类学手册，

vol.4，P.2472(1989)南非诺卡氏菌：

Bergey s细菌系统分类学手册，

vol.2，P.1469(1986)和vol.4，P.2359(1989)圆红球菌：

Bergeys细菌系统分类学手册，

vol.2，P.1479(1986)和vol.4，P.2369(1989)玫瑰色红球菌：

Bergeys细菌系统分类学手册，

vol.4，P.2365-2367(1989)锈色链孢菌：

Int.J.Sys t.Bacteriol.，36，512-517(1986)桔橙动孢囊菌：

Bergeys细菌系统分类学手册，

vol.4，P.2504-2506(1989)

用于培养上述微生物的方法和纯化由它们产生的酶的方法描述如下。

对于产生海藻糖酶的微生物(例如，属于链霉菌属、诺卡氏菌属或红球菌属的微生物)和产生海藻糖磷酸化酶的微生物(例如，属于链孢菌属或动孢囊菌属的微生物)的培养，使用培养放线菌、细菌等的常规方法。

作为培养基，可以使用天然或合成培养基，只要它包含碳源、氮源、无机盐等。

作为碳源，可以使用碳水化合物、糖醇、有机酸等。碳水化物的例子是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、淀粉和糖蜜。糖醇的例子是甘油、山梨醇和甘露醇。有机酸的例子是醋酸、乳酸、乙酰甲酸和柠檬酸。

作为氮源，可以使用无机或有机铵盐、含氮有机物质等。无机或有机铵盐的例子是氨、氯化铵、碳酸铵、磷酸铵和乙酸铵。含氮有机物质的例子是尿素、氨基酸、胨、NZ-胺、肉膏、玉米浆、酪蛋白水解产物和酵母抽提物。

作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁等。

作为培养方法，优选地使用液体培养，具体来说是浸没搅拌培养。培养通过静态培养或充气和搅拌在pH值6.0至8.0于25至37℃的温度下进行1至7天。

通过按照上述的方式培养微生物，形成了主要在微生物细胞中的海藻糖酶或海藻糖磷酸化酶。从培养物中回收海藻糖酶或海藻糖磷酸化酶可以，例如，按下列方式进行。

在完成培养之后，通过离心或过滤从培养物中收集微生物细胞，然后通过超声处理或类似的方法破坏细胞以获得粗制酶提取物。按照通常用于酶纯化的方法(如盐析、用有机溶剂沉淀、透析、离子交换色谱法、凝胶过滤和冻干法)处理粗制酶提取物，由此可获得纯化的海藻糖酶或纯化的海藻糖磷酸化酶。

本发明的新海藻糖酶的理化性质如下。

(1)作用：本发明的酶催化如通式(I)所示的反应，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖

海藻糖+水—————→2D-葡萄糖                 (I)

(2)底物特异性和抑制特异性：

对100mM磷酸缓冲液(pH5.5)中的1.75mM的底物浓度测定了酶对各种底物的活性。结果作为相对活性在表1中显示，把对海藻糖的活性定义为100。

                       表1

              糖                 相对活性(％)

            海藻糖                   100

           海藻糖胺                  0.5

            曲二糖                    0

           Nigerose                   0

            麦芽糖                    0

             乳糖                     0

             蔗糖                     0

从表1中可明显地看出，所述酶特异性地作用于海藻糖。本发明也使用海藻糖作为底物测定了所述酶对1.75mM各种糖的抑制特异性。结果在表2中显示。

                      表2

               糖                 抑制率(％)

         1，5-失水葡糖醇            80.7

             曲二糖                  0

            Nigerose                 0

             麦芽糖                  0

              乳糖                   0

              蔗糖                   0

(3)底物亲和性

在pH5.5时通过Lineweaver-Burk图[J.Am.Chem.、Sec.，56，658(1934)]测定的所述酶对海藻糖的Km值是6.7mM。

(4)抑制亲和性

在pH5.5时通过Lineweaver-Burk图测定的所述酶对1，5-失水葡糖醇的Ki值是0.33mM。

(5)最适pH

使用pH5.0-8.0的磷酸缓冲液测定酶活性以确定最适pH值。获得了如图1所示的pH-活性曲线。酶的最适pH是5-6。

(6)pH稳定性

在50℃下于pH2.6-12.0的通用缓冲液中(Johnson-Lindsay缓冲液，生物化学基本方法，vol.6，Maruzen)处理30分钟之后，测定了残留的酶活性。如图2所示，酶在5-10的pH值范围内是稳定的。

(7)耐热性

通过把酶于不同的温度下在pH5.0的磷酸缓冲液中保持30分钟并测定剩余的活性来研究酶的耐热性。如图3所示，酶在达50℃时是稳定的。

(8)最适温度

使用pH5.5的磷酸缓冲液测定酶的最适温度。如图4所示，最适温度在45℃左右。

(9)抑制剂和金属离子的影响

在1mM的浓度下研究各种金属螯合剂、酶抑制剂和金属离子对酶的影响。结果如表3中所示。

                          表3

              化合物                   抑制率(％)

       二乙基二硫代氨基甲酸              51.0

           2，2-二吡啶                   60.0

               EDTA                      67.6

          1，10-菲绕啉                   88.5

           p-汞苯甲酸                    94.7

         N-乙基马来酰亚胺                21.9

             碘乙酰胺                    83.6

         N-溴代琥珀酰亚胺                23.4

               羟胺                      81.2

             叠氮化钠                    22.8

              CoCl₂                     20.4

              NiSO₄                     62.1

          ZnSO₄                 53.4

          BaCl₂                 40.7

酶可被金属螯合剂(如，1，10-菲绕啉、乙二胺四乙酸和2，2-二吡啶)、SH封闭剂(如p-汞苯甲酸和碘乙酰胺、羟胺、硫酸镍等)抑制。

(10)分子量

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的酶的亚单位的分子量是大约90,000，通过使用高效液相色谱的凝胶过滤方法测得的酶的分子量是大约400,000。

(11)均一性

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳酶作为单一的带分离。也就是说，蛋白质的单一带通过在Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)中电泳60分钟、其后通过以考马斯染色液染色观察到。

(12)酶活性的测定方式

酶活性以下列方式测定。

1)试剂

(i)底物溶液

把海藻糖溶解在100mM磷酸缓冲液(pH5.5)中以形成12.5mM的浓度。

(ii)生色剂

把葡糖氧化酶(Toyobo有限公司，等级II)、过氧物酶(Toyobo有限公司，等级III)、4-氨安替比林和酚溶解在水中以形成分别为0.04mg/ml、1.2mM和21mM的最终浓度。

2)步骤

向1ml的底物溶液添加0.02ml的酶溶液，反应在37℃下进行30分钟。反应通过在100℃下加热3分钟停止。向反应混合物添加1ml生色剂，反应在37℃下进行20分钟，其后测定在500nm的吸光度。通过在上述步骤中使用水代替酶溶波制备对照溶液。

3)活性计算

海藻糖酶活性以单位表达，一个单位定义为在37℃下1分钟内水解1μmol海藻糖的酶的量。可按照下列等式从吸光度净差(酶溶液-对照溶液)计算每毫升酶溶液的活性(U/ml)。

产生本发明的新海藻糖酶的方法描述如下。在该方法中，使用以上所述的属于诺卡氏菌属并具有产生新海藻糖酶能力的微生物。适合的菌株典型的例子是Nocardia sp.NK-2067，这是由本发明的发明者从土壤中分离的菌株。菌株的菌学性质如下所示。研究菌学性质的实验主要按照TakejiHasegawa：微生物的分类和鉴定，东京大学出版社(1975)中的说明进行。菌株的分类和鉴定参考Bergeys细菌分类学手册，vol.1-4(1986-1989)等进行。

本发明的发明者发现：新从土壤中分离的属于诺卡氏菌属的放线菌NK-2067能产生对1，5-失水葡糖醇高度敏感的海藻糖酶。

上述放线菌NK-2067的形态、培养和生理学特征描述如下。1.形态特征1)菌丝

气生菌丝的形成：单分枝

气生菌丝的裂殖：可观察到

底部菌丝的裂殖：可观察到2)孢子

孢子的形成和位置：

在气生菌丝上的形成

孢子囊的形成和定位：未观察到

在孢梗的末端形成的链状孢子数目：10或10个以上

孢子的特征

表面结构：光滑

形状和大小：

杆状，ca.0.7^-1.0μm×0.7^-2.0μm

孢子的游动性和鞭毛的存在：未观察到3)其它

厚垣孢子：未观察到

菌丝束：未观察到

假孢子囊：未观察到

菌丝分枝方式：单分枝2.培养特征

NK-2067菌株在通常使用的合成培养基和天然培养基上显示出适中或良好的生长。底物菌丝的颜色是白到浅粉红色。可溶性棕色色素的形成可在一些培养基上观察到。

培养特征(如在28℃培养14天之后在各种培养基上观察到的NK-2067菌株的生长和颜色)如下所示。颜色名字按照颜色调和手册[美国Container公司，第4版(1958)]给定。1)蔗糖-硝酸盐琼脂培养基

生长：不良

底部菌丝的颜色：白(a)

气生菌丝的形成和颜色；不形成

可溶性色素：无2)葡萄糖-天冬酰胺琼脂培养基

生长：良好

底部菌丝的颜色：

肉粉红色(4ca)-类桃色(dusty peach)(5ec)

气生菌丝的形成和颜色：

适中，白色(a)

可溶性色素：无3)甘油-天冬酰胺琼脂培养基

生长：良好

底部菌丝的颜色：

肉粉红色(5ca)-浅玫瑰褐色(4ec)

气生菌丝的形成和颜色：

浅白色(a)

可溶性色素：无4)淀粉-无机盐琼脂培养基

生长：不良

底部菌丝的颜色：燕麦色(2ec)

气生菌丝的形成和颜色：不形成

可溶性色素：无5)酪氨酸琼脂培养基

生长：良好

底部菌丝的颜色：

nude茶色(4gc)-木栓茶色(4ie)

气生菌丝的形成和颜色：浅白色(a)

可溶性色素；形成(微红的棕色)6)琼脂培养基

生长：良好

底部菌丝的颜色：浅芥茶色(2ie)

气生菌丝的形成和颜色：不形成

可溶性色素：无7)琼脂培养基

生长：良好

底部菌丝的颜色：樟色(31e)

气生菌丝的形成和颜色：不形成

可溶性色素：少量形成(ocher)8)燕麦琼脂培养基

生长：不良

底部菌丝的颜色：燕麦色(2ec)

气生菌丝的形成和颜色：不形成

可溶性色素：无3.生理特征

NK-2067菌株的生理特征如下所示。在28℃下培养14天之后测定生长温度范围，培养2至3周后获得其它结果。1)生长温度范围：6-36℃2)明胶液化：阳性3)淀粉水解：阴性4)脱脂奶粉的聚沉和胨化：阴性5)类黑色素的色素的产生(i)胨-酵母-铁琼脂培养基：阳性(ii)酪氨酸琼脂培养基：阳性6)碳源的可同化性

作为基本培养基，使用了Pridham Gottlieb琼脂培养基在下面，+表明菌株可使用该碳源，-表明菌株不使用该碳源。

L-阿拉伯糖：-

D-木糖：-

D-葡萄糖：+

蔗糖：+

棉子糖：-

D-果糖：+

鼠李糖：-

肌醇：+

D-甘露醇：-7)降解能力

作为基本培养基，使用了琼脂培养基。在下面，+表明菌株降解该物质，-表明菌株不降解该物质。

酪氨酸：-

腺嘌呤：-

黄嘌呤：+

次黄嘌呤：+

尿素：+8)酸的可产生性

作为基本培养基，使用胨液体培养基(使用溴麝香草酚蓝作为指示剂)。在下面，+表明菌株产生酸，-表明菌株不产生酸。

葡萄糖：+

半乳糖：-

肌醇：-

甘露糖：-

鼠李糖：-

山梨醇：-

阿拉伯糖：-

福寿草醇：-9)NaCl抗性

作为基本培养基，使用了琼脂培养基。在下面，+表明菌株生长，-表明菌株不生长。

0％NaCl：+

1％NaCl：+

2％NaCl：+

4％NaCl：-

6％NaCl：-

10％NaCl：-4.化学分类学特征1)菌株中的二氨基庚二酸的旋光异构体：内消旋形式2)细胞脂类的主要的醌组分：MK(甲基萘醌类)-8(II，III-H4，ω-环)3)细胞脂类中的霉菌酸：包含4)整个细胞的主要糖组分：阿拉伯糖和半乳糖

通过形态特征(这些特征是可观察到底部菌丝的裂殖，在气生菌丝上形成孢子链)和化学分类学特征(可在细胞壁中检测到内消旋的二氨基庚二酸、阿拉伯糖和半乳糖，不能检测到甘氨酸，主要的醌组分是四氢化甲萘醌-8，ω环[MK-8(II，III-H4，ω-环)]，而且在其中包含霉菌酸)确认所述菌株属于放线菌中的诺卡氏菌属。

该菌株命名为Nocardia sp.NK-2067，在1996年1月11日保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305日本)，保藏号为FERM BP-5359。

为了使用上述的诺卡氏菌属的微生物产生新海藻糖酶，使用类似于以前所述的方法的方法培养微生物并纯化所形成的酶。

用于定量测定样品中1，5-失水葡糖醇的方法(该方法包括使样品与活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然后测定所说酶的活性)描述如下。

通过使用预先从在已知浓度的1，5～失水葡糖醇存在下测得的所说酶的活性和1，5-失水葡糖醇浓度所制备的校准曲线，可以从活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶的活性确定在样品中1，5-失水葡糖醇的浓度。

另外，在无1，5-失水葡糖醇存在时(A)和有1，5-失水葡糖醇存在时(B)所说酶的活性之间的差别或按照下列等式计算的抑制率用于校准曲线，替代在1，5-失水葡糖醇存在时测定的所说酶的活性。

抑制率(％)＝[(A-B)/A×100]

A：在无1，5-失水葡糖醇存在时的酶活性

B：在1，5-失水葡糖醇存在时的酶活性

可通过测定酶活性的通常方法测定活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶活性。酶反应在通过把酶、酶的底物和酶活性慢化剂(如果需要)添加到含水的培养基中制备的反应混合物中于10-50℃下进行1-60分钟，优选地是1-20分钟，更优选地是在25-40℃下进行5-15分钟。通过测定在一定的条件下形成的产物或作为酶反应的结果留下的底物的浓度进行酶活性的测定；或通过转化形成的产物或留在其它物质中的底物，然后测定其浓度进行酶活性的测定。

作为含水的培养基，可以使用含水液体如缓冲液和生理盐水。优选地使用缓冲液。

缓冲液的例子是乳酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、二乙醇胺缓冲液、赖氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、咪唑缓冲液、苹果酸缓冲液、草酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液以及Good s缓冲液。

酶活性慢化剂的例子是金属螯合剂，如EDTA和1，10-菲绕啉、糖醇(如甘露醇和甘油)、金属离子(如锌和铜)以及甾类激素封闭剂(如碘乙酸和碘乙酰胺)。

测定1，5～失水葡糖醇的方法(其中海藻糖酶用作活性受1，5-失水葡糖醇抑制的酶)描述如下。

海藻糖酶催化由式(I)代表的反应，其中2分子D-葡萄糖从1分子海藻糖和1分子水形成。

海藻糖酶+H₂O—————→2D-葡萄糖             (I)

酶反应在通过把海藻糖、海藻糖酶和酶活性慢化剂(如果需要)添加到上述的含水的培养基中所制备的反应混合物中于10-50℃下进行1-20分钟，优选地是在25-40℃下进行5-15分钟。

可通过用于D-葡萄糖测定的化学或生物化学方法测定酶活性。所增加的D-葡萄糖的量可通过直接方法(通过化学方法测定还原力的增加等)或其中D-葡萄糖转化为另一种测定物质的方法测定。尤其优选的是使用对D-葡萄糖具有高度特异性和可用于广泛使用的自动生化分析仪的酶的方法。

这样的方法的例子是：1)其中D-葡萄糖由葡萄糖氧化酶氧化，反应形成的过氧化氢由比色测定的方法；2)其中D-葡萄糖由吡喃糖氧化酶氧化，反应形成的过氧化氢由比色测定的方法；3)一种这样的方法，其中D-葡萄糖通过在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文中作为NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文作为NADP)存在下使用葡萄糖脱氢酶脱氢，反应形成的还原型的两种辅酶(NADH或NADPH)的吸光度通过分光光度计测定；4)一种这样的方法，其中D-葡萄糖通过在腺苷三磷酸存在下使用己糖激酶或葡糖激酶磷酸化，所形成的D-葡萄糖-6-磷酸通过在辅酶NADP存在下使用6-磷酸脱氢酶脱氢，反应形成的NADPH的吸光度以分光光度计测定。

如上所述，可通过把D-葡萄糖酶促转化成易于测定的中间体，如过氧化氢和辅酶(例如，上述的NADH和NADPH)并测定中间体的量进行D-葡萄糖的测定。可通过方法如比色、X线测量法、化学发光分析和电极方法测定过氧化氢，可通过，例如，比色测定NADP和NADPH。

可通过在酶(如过氧物酶)的存在下过氧化氢与生色剂反应以显色进行比色，其后用分光光度计测定。作为生色剂，可以使用Trinder s试剂和leuco试剂。

Trinder s试剂的例子是4-氨基安替比林和酚化合物(如酚)以及3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸的组合、4-氨基安替比林和苯胺化合物(如N-乙基-N-(2-羟基-3-硫代丙基)-间甲苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-硫代丙基)-3，5-甲氧苯胺，N-(2-羟基-3-硫代丙基)-3，5-甲氧苯胺钠，N-乙基-N-(3-甲苯基)-N-琥珀酰次乙基二胺(下文作为EMSE)的组合。

leuco试剂的例子是10-N-羰甲基氨基甲酰基-3，7-二(二甲胺)-10N-吩噻嗪，10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-3，7-二(二甲胺)-10N-吩噻嗪，N-(羰甲基氨基氨基甲酰基)-4，4-(二甲氨基)二苯胺、4，4-二(二甲氨基)二苯胺以2及二[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨苯基]胺。

可通过在酶(如过氧物酶)的存在下过氧化氢和荧光试剂反应以形成荧光物质，其后用荧光光度分析测定进行X线测量法。作为荧光试剂，可以使用p-羟苯乙酸、p-羟苯丙酸、香豆素等。

可通过在酶(如过氧物酶)的存在下过氧化氢和发光试剂反应以显色，其后用发光计测定进行化学发光分析法。作为发光试剂，可以使用鲁米诺、异构鲁米诺、lucigenin、吖啶酸酯等。

可通过吸光度直接测定辅酶如NADH和HADPH。另外，它们可在转化为其它物质之后测定。例如，可通过使NADPH和四唑盐反应并通过使用分光光度计测定反应所形成的甲惚(formazan)色素的量测定NADPH。

按照上述方法1)测定酶活性的步骤如下所述。通过进行式(II)所示的反应以形成醌亚胺色素并用分光光度计测定色素的浓度测定海藻糖酶的酶活性。

                                                    (II)

按照这种方法通过把海藻糖酶、葡糖氧化酶、过氧物酶、海藻糖、4-氨基安替比林、EMSE等添加到缓冲液(如磷酸缓冲液)中制备用于测定的反应混合物。磷酸缓冲液的pH值优选地是5.0-8.0，更优选地是6.0-7.0，其浓度优选地是10-500mM，更优选地是50-250mM。

添加至缓冲液中的物质的浓度如下：海藻糖酶，优选地是0.001-10U/ml，更优选地是0.01-1U/ml；葡糖氧化酶，优选地是1-100U/ml，更优选地是10-50U/ml；过氧物酶，优选地是1-50U/ml，更优选地5-20U/ml；海藻糖，优选地是1-100mM，更优选地是10-50mM；4-氨基安替比林，优选地是0.5-50mM，更优选地是1-10mM；EMSE，优选地是0.5-50mM，更优选地是1-10mM。

向上述反应混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的样品，反应在10-50℃下进行1-20分钟，优选地是在25-40℃下进行5-15分钟。可通过反应所形成的醌亚胺色素的浓度测定酶活性，而在550nm下测定吸光度来测定醌亚胺色素的浓度。

在D-葡萄糖存在于样品中的情况下，优选地是以下列方式提前除去样品中的D-葡萄糖。包含D-葡萄糖的样品的例子是血液、血清和血浆。

可通过物理方法(其中吸附D-葡萄糖并使用层析柱等除去)和化学或生物化学方法(其中把D-葡萄糖转化成另一种物质)进行样品中D-葡萄糖的除去。使用酶的生物化学转化方法优选地用于使用自动生物化学分析仪的测定中。

D-葡萄糖可通过上述的用于D-葡萄糖测定的转化方法转化成另一种物质。这样的方法的例子是：1)一种其中使用葡糖氧化酶把D-葡萄糖转化成D-葡糖酸-δ-内酯的方法；2)一种其中使用吡喃糖氧化酶把D-葡萄糖转化成2-脱氢-D-葡萄糖的方法；3)一种其中使用葡萄糖脱氢酶把D-葡萄糖转化成D-葡糖酸-δ-内酯的方法；4)一种其中使用己糖激酶或葡糖激酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶把D-葡萄糖转化成D-葡糖酸-δ-内酯-6-磷酸的方法。

包含D-葡萄糖的样品的测定可以按照下列方式进行。例如，通过上述1)或2)的方法把样品中的D-葡萄糖转化成另一种物质，通过在日本出版的未审查的专利申请83287/82中描述的方法除去所形成的过氧化氢，进行使用海藻糖酶作用的反应，测定通过反应形成的D-葡萄糖的量。另外，通过上述3)或4)的方法把样品中的D-葡萄糖转化成另一种物质，通过使用NADH氧化酶、NADPH氧化酶等把形成的NADH或NADPH转化成另一种物质。在使用方法4的情况下，通过使用心肌黄酶、腺苷三磷酸酶等把留在反应混合物中的腺苷三磷酸转化成另一种物质。然后，进行使用海藻糖酶作用的反应，通过，例如，上述1或2的方法测定由反应形成的D-葡萄糖的量。

测定作用于除去样品中D-葡萄糖的1，5-失水葡糖醇的代表性的方法包括以下步骤：通过使用葡糖氧化酶把D-葡萄糖转化成D-葡糖酸-δ-内脂和过氧化氢；通过在过氧物酶的存在下和除过氧化氢化合物(如EMSE)反应除去形成的过氧化氢；按照上述式(II)所示的方法测定海藻糖酶活性。

在这个方法中，使通过把葡糖氧化酶、过氧物酶、EMSE等添加到缓冲液(如磷酸缓冲液)中制备的反应混合物和样品在10-50℃下反应1-20分钟，优选地是在25-40℃下反应5-15分钟以除去样品中的D-葡萄糖。向反应混合物中添加包含海藻糖、海藻糖酶、4-氨基安替比林等的试剂，通过上述方法测定海藻糖酶活性。试剂的组分浓度同上。

另一个代表性的方法包括以下步骤：在腺苷三磷酸存在下使用葡糖激酶把D-葡萄糖转化成D-葡萄糖-6-磷酸；使用6-磷酸脱氢酶把D-葡萄糖-6-磷酸盐和NADP转化成D-葡糖酸-δ-内酯-6-磷酸和NADPH；使用腺苷三磷酸酶分解腺苷三磷酸；按照上述式(II)所示的方法测定海藻糖酶活性。

在这个方法中，使通过把葡糖激酶、ATP、6-磷酸脱氢酶和NADH添加到缓冲液(如磷酸缓冲液)中制备的反应混合物和样品在10-50℃下反应1-20分钟，优选地是在25-40℃下反应5-15分钟以除去样品中的D-葡萄糖。在留在反应混合物中的腺苷三磷酸通过添加腺苷三磷酸酶分解后，向反应混合物中添加包含海藻糖、海藻糖酶、过氧物酶、4-氨基安替比林、EMSE等的试剂，通过上述的方法测定海藻糖酶活性。包含在反应混合物中的物质的浓度如下：葡糖激酶，优选地是0.1-100U/ml，更优选地是1-10U/ml；6-磷酸盐脱氢酶，优选地是0.1-100U/ml，更优选地是1-10U/ml；腺苷三磷酸酶，优选地是0.1-100U/ml，更优选地是1-10U/ml；NADP，优选地是1-100mM，更优选地是10-50mM；腺苷三磷酸，优选地是1-100mM，更优选地是10-50mM。其它化合物与酶以与上述浓度相同的浓度使用。

接着，关于海藻糖磷酸化酶描述如下。海藻糖磷酸化酶催化式(III)所示的可逆反应。

海藻糖+磷酸_D-葡萄糖+β-D-葡萄糖-1-磷酸      (III)

可通过直接方法(其中通过已知方法测定D-葡萄糖、β-D-葡萄糖-1-磷酸、海藻糖或磷酸的浓度变化)或通过其中物质转化成可测定的其它物质的方法测定海藻糖磷酸化酶的酶活性。例如，在式(III)的反应中向右的酶活性可通过进行式(IV)的反应并选择性地测定反应形成的NADPH浓度测定。 D-葡糖酸-δ-内酯-6-磷酸+NADPH

                                                      (IV)

通过把海藻糖脱氢酶、海藻糖、NADP等添加至缓冲液(如磷酸缓冲液)中制备用于测定这种酶活性的反应混合物。磷酸缓冲液的pH值优选地是5.0-8.0，更优选地是6.0-7.0，其浓度优选地是10-500mM，更优选地是50-250mM。

添加至缓冲液的物质的浓度如下：海藻糖磷酸化酶，优选地是0.001-10U/ml，更优选地是0.01-1U/ml；磷酸葡糖变位酶，优选地是0.1-50U/ml，更优选地是1-10U/ml；6-磷酸盐脱氢酶，优选地是0.1-50U/ml，更优选地是1-10U/ml；海藻糖，优选地是1-100mM，更优选地是10-50mM；NADP，优选地是1-50mM，更优选地是5-20mM。

向上述反应混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的样品，反应在10-50℃下进行1-20分钟，优选地是在25-40℃下进行5-15分钟。可通过反应所形成的NADPH的浓度测定酶活性，而在340nm下测定吸光度来测定NADPH的浓度。

可通过，例如，进行式(V)的反应并选择性地测定反应形成的醌亚胺色素浓度测定在式(III)的反应中向左的酶活性。

                                                       (V)

通过把嘌呤-核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧物酶、葡萄糖、β-葡萄糖-1-磷酸、次黄苷、4-氨基安替比林、EMSE等添加至缓冲液(如咪唑缓冲液)中制备用于测定这种酶活性的反应混合物。咪唑缓冲液的pH值优选地是5.0-8.0，更优选地是6.0-7.0，其浓度优选地是10-200mM，更优选地是50-100mM。

添加至缓冲液中的物质的浓度如下：嘌呤-核苷磷酸化酶，优选地是0.1-10U/ml，更优选地是1-5U/ml；黄嘌呤氧化酶，优选地是1-50U/ml，更优选地是5-20U/ml；过氧物酶，优选地是U/ml，更优选地是1-50U/ml；葡萄糖，优选地5-200mM，更优选地是20-100mM；葡萄糖-1-磷酸，优选地是5-200mM，更优选地是20-100mM；次黄苷，优选地是0.5-50mM，更优选地是1-10mM；4-氨基安替比林，优选地是0.5-50mM，更优选地是1-10mM；EMSE，优选地是0.5-50mM，更优选地是1-10mM。

向上述反应混合物中添加包含1，5-失水葡糖醇的样品，反应在10-50℃下进行1-20分钟，优选地是在25-40℃下进行5-15分钟。可通过反应所形成的醌亚胺色素的浓度测定酶活性，而在550nm下测定吸光度来测定醌亚胺色素的浓度。

定量测定本发明的1，5-失水葡糖醇的试剂(包括活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所说酶的底物以及定量测定通过酶活性形成的物质的试剂)描述如下。

当海藻糖酶用作活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶时，底物是海藻糖，用于测定形成的物质的试剂是测定D-葡萄糖的试剂。

当海藻糖磷酸化酶用作活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶时，底物是海藻糖和磷酸，或D-葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸。在每个反应中形成的物质分别是D-葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸，或海藻糖和磷酸。也就是说，测定形成的物质的试剂是测定海藻糖、磷酸、D-葡萄糖或β-葡萄糖-1-磷酸的试剂。

用于海藻糖酶活性测定的试剂包括海藻糖和测定D-葡萄糖的试剂。它还可包含缓冲液、其它酶、其底物和辅酶(如果需要)。用于海藻糖磷酸化酶活性测定的试剂包括海藻糖、磷酸和测定D-葡萄糖的试剂或测定β-葡萄糖-1-磷酸的试剂；或D-葡萄糖，β-葡萄糖-1-磷酸和测定海藻糖的试剂或测定磷酸的试剂。它还可包含缓冲液、其它酶、其底物和辅酶(如果需要)。

分别测定D-葡萄糖、β-葡萄糖-1-磷酸、海藻糖和磷酸的试剂包括例如那些用于测定这些物质的上述方法的物质。

用于除去D-葡萄糖的试剂包括例如那些用于通过使用酶把D-葡萄糖转化成为其它物质的上述方法的物质。

例如，按照上述方法1)除去D-葡萄糖的试剂可包括葡糖氧化酶、过氧物酶、EMSE，如果需要，还包括上述缓冲液、其它酶、其底物和辅酶。按照上述方法4)除去D-葡萄糖的试剂可包括葡糖激酶、6-磷酸脱氢酶、腺苷三磷酸酶、腺苷三磷酸、NADP，如果需要，还包括上述缓冲液、其它酶、其底物和辅酶。用于除去D-葡萄糖的试剂可与上述测定1，5-失水葡糖醇的试剂混合以形成试剂盒。

要使用的酶(如葡糖氧化酶、葡糖脱氢酶、吡喃糖氧化酶、葡糖激酶、己糖激酶、β-磷酸葡糖变位酶、嘌呤-核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧物酶和腺苷三磷酸酶)可作为商业产物获得，或可以通过培养能产生这些酶的微生物制备。就缓冲液、底物、辅酶、酶的底物、生色剂、荧光剂和发光剂而言，都可以使用市售的试剂。

下列试验实施例通过使用得自圆红球菌ATCC 14898的海藻糖酶显示了1，5-失水葡糖醇对酶活性抑制的例子。

试验实施例1(由1，5-失水葡糖醇抑制的特异性)

通过把在参考实施例3制备的10mU/ml海藻糖酶、0.81mg/ml4-氨基安替比林、1mg/ml EMSE、30U/ml葡糖氧化酶、10U/ml过氧物酶和表4中所示的1mM试验糖添加到100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中制备反应混合物。在向反应混合物中添加10mg/ml海藻糖并搅拌之后，用分光光度计测定在550nm时的吸光度变化。

在反应开始之后测定10分钟的吸光度的增加，按照下列等式从无试验糖(A)和1mM试验糖存在下(B)的吸光度增量计算抑制率(％)：[(A-B)/A×100]。结果如表4所示。

                            表4

           试验糖(1mM)                  抑制率(％)

         1，5-失水葡糖醇                   45.0

            D-葡糖胺                         0

         N-乙酰-D-葡糖胺                     0

            D-甘露糖                        0.5

            D-半乳糖                        0.2

             D-果糖                          0

           D-墨角藻糖                        0

           L-墨角藻糖                        0

             D-木糖                          0

             麦芽糖                          0

              蔗糖                           0

得自圆红球菌ATCC 14898的海藻糖酶活性特异性地受1，5-失水葡糖醇抑制。

附图简述

图1显示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的pH-活性曲线。

图2显示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的pH稳定性曲线。

图3显示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的热稳定性曲线。

图4显示了得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶的温度-活性曲线。

图5显示了由使用作为指示(index)的得自锈色链孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶的分解活性获得的校准曲线。纵坐标的数表示酶活性抑制率(％)，横坐标上是数表示1，5-失水葡糖醇浓度(mM)。

图6显示了由使用作为指示的得自锈色链孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶的合成活性获得的校准曲线。纵坐标的数表示酶活性抑制率(％)，横坐标上是数表示1，5-失水葡糖醇浓度(mM)。

图7显示了由使用作为试验酶的得自金霉素链霉菌ATCC 10762的海藻糖酶获得的校准曲线。纵坐标的数表示酶活性抑制率(％)，横坐标上是数表示1，5-失水葡糖醇浓度(mM)。

图8显示了由使用作为试验酶的得自圆红球菌ATCC 14898的海藻糖酶获得的校准曲线。纵坐标的数表示酶活性抑制率(％)，横坐标上是数表示1，5-失水葡糖醇浓度(mM)。

图9显示了由使用作为试验酶的得自Nocardia sp.NK-2 067的海藻糖酶获得的校准曲线。纵坐标的数表示酶活性抑制率(％)，横坐标上是数表示1，5-失水葡糖醇浓度(mM)。

图10显示了由使用作为指示的抗得自Nocardia sp.NK-2067海藻糖酶的抑制率获得的在葡萄糖存在下的1，5-失水葡糖醇的校准曲线。在纵坐标上的数表示在无1，5-失水葡糖醇和1，5-失水葡糖醇存在的情况下吸光度之间的差，在横坐标上的数表示1，5-失水葡糖醇浓度(μg/ml)。

在下列的实施例中说明了本发明的某些实施方案。

实施本发明的最佳方式

实施例1

使用得自锈色链孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶测定1，5-失水葡糖醇

通过把10mU/ml在参考实施例1中制备的得自锈色链孢菌的海藻糖磷酸化酶、2.5U/ml β-磷酸葡糖变位酶(Beekman仪器公司)、5U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Sigma化学公司)、10mM NADP以及包含不同浓度的1，5-失水葡糖醇样品添加到100mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中制备反应混合物，在把10mg/ml海藻糖添加至反应混合物中并搅拌之后，以分光光度计测定在340nm下的吸光度增量。

在反应开始之后测定10分钟的吸光度增量，按照下列等式从在每种浓度的无1，5-失水葡糖醇(A)和1，5-失水葡糖醇存在下(B)的吸光度增量计算抑制率(％)：[(A-B)/A×100]。如图5所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇浓度之间有很好的线形相关关系，由此获得1，5-失水葡糖醇的校准曲线。

实施例2

使用得自锈色链孢菌FERM BP-4329的海藻糖磷酸化酶测定1，5-失水葡糖醇

通过把10mU/ml在参考实施例1中制备的海藻糖磷酸化酶、50mM葡萄糖、2ml测定无机磷的试剂盒(Kyowa Medex有限公司)、包含不同浓度的1，5-失水葡糖醇1，5-失水葡糖醇样品添加到50mM的咪唑缓冲液(pH7.0)中。在把50mM的β-葡萄糖-1-磷酸添加至反应混合物中并搅拌之后，以分光光度计测定在550nm下的吸光度增量。

在反应开始之后测定10分钟的吸光度增量，按照与实施例1的方法相同的方法计算抑制率(％)。如图6所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇浓度之间有很好的线形相关关系，由此获得1，5-失水葡糖醇的校准曲线。

实施例3

使用得自金霉素链霉菌ATCC 10762的海藻糖酶测定1，5-失水葡糖醇

通过把10mU/ml参考实施例2制备的海藻糖酶、0.81mg/ml 4-氨基安替比林、1mg/ml EMSE、30U/ml葡糖氧化酶、10U/ml过氧物酶以及包含不同浓度的1，5-失水葡糖醇样品添加到100mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中制备反应混合物，在把10mg/ml海藻糖添加至反应混合物中并搅拌之后，以分光光度计测定在550nm下的吸光度增量。

在反应开始之后测定10分钟的吸光度增量，按照与实施例1的方法相同的方法计算抑制率(％)。如图7所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇浓度之间有很好的线形相关关系，由此获得1，5-失水葡糖醇的校准曲线。

实施例4

使用得自圆红球菌ATCC 14898的海藻糖酶测定1，5-失水葡糖醇

除了使用参考实施例3中制备的得自圆红球菌的海藻糖酶之外，重复与实施例3相同的步骤。如图8所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇浓度之间有很好的线形相关关系，由此获得1，5-失水葡糖醇的校准曲线。

实施例5

使用Nocardia sp.NK-2067产生海藻糖酶

把Nocardia sp.NK-2067接种进在1-1锥形培养瓶中的包含1g/dl蔗糖、0.5g/dl NZ-胺、0.2g/dl胨，0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的125ml培养基(pH7.2)中并在30℃下振荡培养48小时。把形成的培养物接种在5-1的发酵罐中的具有与上述相同组合物的2375ml培养基中并在通气和搅拌的同时在30℃下培养2天。

离心(12,000×g，20分钟)形成的培养物(2.51)以收集细胞。把细胞悬浮在包含10％甘油的500ml 50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)(在下文作为GP缓冲液)中并使用Dynomill(W.A.Bachofen)破坏，然后再离心(12,000×g，20分钟)。向获得的上清液添加硫酸铵，收集通过70％饱和硫酸铵沉淀的组份并将其溶解在少量的GP缓冲液(大约100ml)中。形成的溶液对5lGP缓冲液透析24小时。将透析的溶液通过用GP缓冲液预平衡的DEAE-Cellulofine柱(Seikagaku Kogyo有限公司)中(1L，直径：5cm)，由此把海藻糖酶吸附在柱上。在用相同的缓冲液洗脱柱以除去沾染的蛋白质后，使用包含0-1M氯化钠的GP缓冲液用氯化钠的浓度梯度进行洗脱。合并用ca.0.4-0.6M氯化钠洗脱的活性组份，向其中添加硫酸铵。通过离心(12,000×g，20分钟)收集用70％硫酸铵饱和液沉淀的组份并溶解在50ml的GP缓冲液中。形成的溶液对21GP缓冲液透析24小时以获得纯化的海藻糖酶制剂。

酶制剂的比活是21mU/mg。

实施例6

使用得自Nocardia sp.NK-2067的海藻糖酶测定1，5-失水葡糖醇

除了使用实施例5制备的得自Nocardia sp.的海藻糖酶之外，重复与实施例3相同的步骤。如图9所示，在抑制率和1，5-失水葡糖醇浓度之间有很好的线形相关关系，由此获得1，5-失水葡糖醇的校准曲线。

实施例7

制备了由下列试剂1、2和3组成的测定1，5-失水葡糖醇的试剂盒。

试剂1：

葡糖氧化酶                         30U/ml

    (得自黑曲霉，Toyobo有限公司)

过氧物酶                           10U/ml

    (得自辣根，Toyobo有限公司)

EMSE                               1mg/ml

磷酸缓冲液(pH5.5)                  100mM

试剂2：

海藻糖酶(在实施例5中制备)          1U/ml

4-氨基安替比林                     0.8mg/ml

磷酸缓冲液(pH5.5)                  100mM

试剂3：

海藻糖                             2mM

实施例8

制备包含从0到500μg/ml浓度的1，5-失水葡糖醇和1mg/ml浓度的D-葡萄糖的样品。向10ml的每个样品添加300μl在实施例7中制备的试剂1，把混合物在30℃下温育10分钟以把D-葡萄糖转化成D-葡糖酸-δ-内脂并同时除去形成的过氧化氢。然后，添加100μl在实施例7中制备的试剂2，然后添加10μl在实施例7中制备的试剂3。以自动分析仪(Hitachi 7070)测定吸光度增量。

从无1，5-失水葡糖醇时的吸光度减去在每种浓度的1，5-失水葡糖醇存在下的吸光度。如图10所示，在获得的绝对值(吸光度差)和1，5-失水葡糖醇浓度之间有很好的相关关系。这说明：可以测定在包含葡萄糖的样品中1，5-失水葡糖醇的浓度。

实施例9

制备了由下列试剂4、5、6和7组成的测定1，5-失水葡糖醇的试剂盒。试剂4：葡糖激酶                                           5U/ml

(得自嗜热脂肪芽孢杆菌，Sigma化学公司)腺苷三磷酸                                       10mMMgCl₂                                           20mM葡萄糖-6-磷酸脱氢酶                              10U/ml

(得自面包酵母，Sigma化学公司)NADP                                             10mM磷酸缓冲液(pH7.0)                                100mM试剂5：腺苷三磷酸酶                                     3U/ml

(得自猪脑，Sigma化学公司)试剂6：海藻糖酶                                         1U/ml葡糖氧化酶                                       30U/ml过氧物酶                                         10U/ml4-氨基安替比林                                   0.8mg/mlEMSE                                             1mg/ml磷酸缓冲液(pH7.0)                                100mM试剂7：海藻糖                                           2mM

实施例10

制备包含500μg/ml浓度的1，5-失水葡糖醇和从1到10mg/ml浓度的D-葡萄糖的样品。向10ml的每个样品添加300μl在实施例9中制备的试剂4，把混合物在30℃下温育10分钟。然后，添加100μl在实施例9中制备的试剂5，温育混合物5分钟以分解腺苷三磷酸。由此停止葡糖激酶反应。通过这些步骤经葡萄糖6-磷酸把葡萄糖转化成D-葡糖酸-δ-内酯-6-磷酸。

向反应混合物添加100μl在实施例9中制备的试剂6。然后添加10μl在实施例9中制备的试剂7，反应在30℃下进行10分钟，以自动分析仪(Hitachi 7070)测定吸光度增量。

以与实施例8中的方式相同的方式计算吸光度差，研究获得的值和在样品中1，5-失水葡糖醇的浓度之间的关系。如表5所示，无论样品中葡萄糖浓度的大小，吸光度的差是常量。这说明，可以测定在葡萄糖存在下的1，5-失水葡糖醇浓度。

                           表5

添加的葡萄糖的浓度(mg/ml)                吸光度差(mAbs)

             0                               55

            1.0                              55

            2.5                              56

            5.0                              55

            7.5                              54

            10.0                             56

实施例11

使用正常的人血清和通过把从0至500μg/ml浓度的1，5-失水葡糖醇添加至正常血清中制备的添加1，5-失水葡糖醇的血清作为样品。向20μl的每个样品添加300μl在实施例9中制备的试剂4，把混合物在30℃下温育10分钟。然后，添加10μl在实施例9中制备的试剂5，然后温育5分钟。向形成的溶液添加100μl在实施例9中制备的试剂6。然后添加10μl在实施例9中制备的试剂7，反应在30℃下进行10分钟，以自动分析仪(Hitachi7070)测定吸光度增量。对上述包含0-500mg/ml 1，5-失水葡糖醇的样品进行如上所述的相同步骤以制备校准曲线。在血清样品中1，5-失水葡糖醇浓度基于校准曲线计算。结果如表6所示。

                         表6添加的1，5-失水葡糖醇    实测值(μg/ml)       回收率(％)

 (μg/ml)

      0                    25                -

     100                   124               96

     200                   224               96

     300                   325               100

     400                   426               104

            500             526               104

所测定的正常人血清中的1，5-失水葡糖醇浓度和文献中的值十分一致。测得的添加1，5-失水葡糖醇的血清的值显示出回收率和理论值很接近。这说明，在血清中的1，5-失水葡糖醇浓度可通过按照本发明的方法测定。

参考实施例1

使用锈色链孢菌FERM BP-4329产生海藻糖磷酸化酶

把锈色链孢菌接种于在2-1锥形培养瓶中的包含3g/dl蔗糖、0.5g/dlNZ-胺、0.2g/dl胨、0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的300ml培养基(pH7.0)中并在30℃下振荡培养48小时。把形成的培养物(600ml)接种于在30-1发酵罐中的具有与上述相同组合物的151培养基中并在通气和搅拌的同时在30℃下培养3天。

离心(12,000×g，20分钟)形成的培养物(151)以收集细胞。把细胞悬浮在1000ml 200mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中并使用Dynomill(W.A.Bachofen)破坏，然后再离心(12,000×g，20分钟)。向获得的上清液添加硫酸铵至50％饱和度，收集形成的沉淀并将其溶解在少量的200mM的磷酸缓冲液(大约200ml)中。形成的溶液对5l相同的缓冲液透析24小时。透析的溶液在65℃下加热15分钟，然后离心(12,000×g，20分钟)。将获得的上清液通过用同样缓冲液预平衡的凝胶过滤介质的柱(Toyopearl HW65F，Tosoh公司)中(1L，直径：5cm)。合并洗脱的活性组份，向其中添加50％饱和度的硫酸铵。通过离心(12,000r.p.m.，20分钟)收集形成的沉淀并将其溶解在20ml 200mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中。形成的溶液对21相同缓冲液透析24小时以获得海藻糖磷酸化酶制剂。

酶制剂的比活是100mU/mg。

参考实施例2

使用金霉素链霉菌ATCC 10762产生海藻糖酶

把金霉素链霉菌ATCC 10762接种于在1-1锥形培养瓶中的包含1g/dl蔗糖、0.5g/dl NZ-胺、0.2g/dl胨、0.1g/dl酵母抽提物以及0.1g/dl肉膏的125ml培养基(pH7.0)中并在30℃下振荡培养48小时。把形成的培养物(600ml)接种于在5-1发酵罐中的具有与上述相同组合物的2375ml培养基中并在通气和搅拌的同时在30℃下培养2天。

离心(12,000×g，20分钟)形成的培养物(151)以收集细胞。把细胞悬浮在包含10％甘油的500ml 50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)(在下文作为GP缓冲液)中并使用Dynomill(W.A.Bachofen)破坏，然后再离心(12,000×g，20分钟)。向获得的上清液添加硫酸铵，收集通过70％饱和硫酸铵沉淀的组份并将其溶解在少量的GP缓冲液(大约100ml)中。形成的溶液对51 GP缓冲液透析24小时。将透析的溶液通过用GP缓冲液预平衡的DEAE-Cellulofine柱(Seikagaku Kogyo有限公司)中(1L，直径：5cm)，由此把海藻糖酶吸附在柱上。在用相同的缓冲液洗脱柱以除去沾染的蛋白质后，使用包含0-1M氯化钠的GP缓冲液用氯化钠的浓度梯度进行洗脱。合并用ca.0.4-0.6M氯化钠洗脱的活性组份，向其中添加硫酸铵。通过离心(12,000×g，20分钟)收集用70％硫酸铵饱和液沉淀的组份并溶解在50ml的GP缓冲液中。形成的溶液对21 GP缓冲液透析24小时以获得纯化的海藻糖酶制剂。

酶制剂的比活是21mU/mg。

参考实施例3

使用圆红球菌ATCC 14898产生海藻糖酶

除了使用圆红球菌ATCC 14898之外，重复在参考实施例2中相同的步骤，由此获得纯化的海藻糖酶制剂。

酶制剂的比活是15mU/mg。

工业应用

本发明提供了酶促测定1，5-失水葡糖醇的方法、该方法所用的试剂、适用于酶促测定1，5-失水葡糖醇之方法的新海藻糖酶以及产生新海藻糖酶的方法。测定1，5-失水葡糖醇浓度在糖尿病诊断中是有用的。按照本发明，可快速而精确地测定1，5-失水葡糖醇。

Claims (12)

1.一种用于定量测定样品中1，5-失水葡糖醇(anhydroglucitol)的方法，该方法包括使样品与活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶共存，然后测定所说酶的活性。

2.按照权利要求1的方法，其中所说的活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖酶。

3.按照权利要求1的方法，其中所说的活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖磷酸化酶。

4.对1，5-失水葡糖醇具有0.33mM或更小的Ki值并具有下列理化性质的海藻糖酶：

(1)作用：它催化如通式(I)所示的反应，其中在水的存在下1分子的海藻糖被水解成2分子的D-葡萄糖：

海藻糖+水—————→2D-葡萄糖                  (I)

(2)底物特异性：它特异性地作用于海藻糖，

(3)底物亲和性：对海藻糖的Km值是6.7mM，

(4)最适pH和稳定pH4值：酶的最适pH是5-6，在50℃处理30分钟时，酶在5-10的pH范围中是稳定的，

(5)最适温度和耐热性：最适温度在45℃左右，在pH5.0下处理30分钟时，酶在达到50℃时是稳定的，

(6)抑制剂：可被金属螯合剂如，1，10-菲绕啉、乙二胺四乙酸和2，2-二吡啶；SH封闭剂如p-汞苯甲酸和碘乙酰胺、羟胺、硫酸镍等抑制，

(7)分子量：通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的酶的亚单位的分子量是大约90,000，通过凝胶过滤方法测得的酶的分子量是大约400,000。

5.一种产生按照权利要求4的海藻糖酶的方法，该方法包括在培养基中培养属于诺卡氏菌属并具有产生所说海藻糖酶能力的微生物，并从培养物回收所说海藻糖酶。

6.一种定量测定1，5-失水葡糖醇的试剂，该试剂包括其活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶、所说酶的底物以及定量测定由所说酶活性形成的物质的试剂。

7.按照权利要求1的方法，其中所说的活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是按照权利要求4的酶。

8.按照权利要求6的试剂，其中所说的活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖酶。

9.按照权利要求6的试剂，其中所说的活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是海藻糖磷酸化酶。

10.按照权利要求6的试剂，其中所说的活性以浓度-依赖性方式受1，5-失水葡糖醇抑制的酶是按照权利要求4的酶。

11.按照权利要求2或7的方法，其中所说的样品是包含D-葡萄糖和1，5-失水葡糖醇的样品，该样品已进行过除去D-葡萄糖的预处理。

12.按照权利要求8或10的试剂，该试剂还包含除去D-葡萄糖的试剂。

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