CN1114698C - 嘌呤核苷化合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制备嘌呤核苷化合物的方法以及产生尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶或者二氢尿嘧啶脱氢酶的微生物，包括通过在含有磷酸离子的水溶液中使嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用下进行碱基交换反应，生成的嘧啶碱基在微生物和由该微生物产生的酶的作用下转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶或者嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物。

Description

嘌呤核苷化合物的制备方法
本发明涉及利用通过酶作用的核酸碱基的交换反应以高产率制备嘌呤核苷化合物的方法，以及产生能用于该制备的酶的微生物。
一直以来，虽然提出了利用通过酶作用的核酸碱基的交换反应制备核苷化合物的方法，但是原料体系和生成物体系之间形成反应的平衡状态，这就是无法提高产率的原因。作为解决方法，在特开平4-197193号公报中公开了使是核苷的肌苷或者2’-脱氧肌苷(下面称为脱氧肌苷)和嘧啶碱基在磷酸盐水溶液中通过嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)以及嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)的作用进行碱基的交换反应，通过将该交换反应生成的次黄嘌呤通过黄嘌呤氧化酶的作用转变成尿酸，提高反应产率的方法。在这种情况下，由于尿酸不构成这些核苷磷酸化酶的底物，反应向生成嘧啶核苷的一方移动。
但是，该公报所公开的方法是原料采用肌苷或者脱氧肌苷以及嘧啶碱基，具有较好效率的制备嘧啶核苷的方法，但不是以价格更便宜更容易得到的嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基为原料制备嘌呤核苷化合物的方法。在以嘧啶核苷化合物为原料的情况下，为了提高反应效率必须向反应体系中加入分解由碱基交换反应生成的嘧啶碱基的酶使平衡失衡，也可从天然物质在高活性状态下制备这种酶，离析的事例至今还没有报告。就是说，没有以嘧啶核苷化合物为原料的嘌呤核苷化合物的高产率的制备方法。因此，迫切需要稳定的高产率的嘌呤核苷化合物的制备方法。
本发明的发明者们应该解决上述问题，努力研究生产将在嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基进行交换反应时生成的嘧啶碱基转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物的酶的微生物，结果发现属于节杆菌属、杆菌属、假单胞属或者红球菌属的微生物可生产这种酶，从而完成本发明。
也就是说，本发明的第一个方面是高产率制备嘌呤核苷化合物的方法，其特征在于在含有磷酸离子的水溶液中使嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基通过嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的作用进行碱基的交换反应中，生成的嘧啶碱基通过微生物或者由该微生物产生的酶转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物。
本发明的第二个方面是产生尿嘧啶胸腺脱氢酶或者二氢尿嘧啶脱氢酶的微生物，它是选自节杆菌属YGK 222(FERM BP-5907)、巨大芽胞杆菌YGK 252(FERM BP-5908)以及假单胞细菌属YGK 443(FERMBP-5909)的微生物。
通过利用本发明的核酸碱基的交换反应制备嘌呤核苷化合物的方法，可以以价格便宜且容易得到的嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基为原料，以高产率并且稳定地制备嘌呤核苷化合物。
图1表示在实施例1中在加入尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液的反应溶液中的各个成分的浓度随时间的变化图。
图2表示在实施例1中在不加入尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液的反应溶液中的各个成分的浓度随时间的变化图。
下面详细说明本发明。
首先说明本发明的第一方面。
第一方面是嘌呤核苷化合物的制备方法，其特征在于在含有磷酸离子的水溶液中，在嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基通过嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用进行碱基交换的反应中，生成的嘧啶碱基通过微生物或者由该微生物形成的酶的作用下，转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物。<原料>
本发明的原料所采用的嘧啶核苷化合物如果受到嘧啶核苷磷酸化酶的作用，受到所使用生成的嘧啶碱基的分解酶的作用，对是否是天然型的或者非天然型的没有特别的限制。例如可以列举尿核苷、脱氧核苷、5-甲基核苷、脱氧胸腺嘧啶核苷，也可以包括其它非天然型的嘧啶核苷及非天然型的脱氧嘧啶核苷。
本发明所采用的嘌呤碱基如果是受到嘌呤核苷磷酸化酶作用的，没有特别的限定。例如可列举腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤等天然型嘌呤碱基，5-羟基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤等的氨基化嘌呤，2-氯嘌呤、6-氯嘌呤、2，6-二氯嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤等卤化嘌呤，以及6-巯基嘌呤、6-甲硫基嘌呤等硫化嘌呤等非天然型嘌呤碱基。<微生物以及酶>
用于本发明的嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶原则上说任何来源的都可以。
对于在本发明中所采用的由分解嘧啶碱基的微生物产生的酶可以是将碱基交换反应生成的嘧啶碱基转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物的酶，对其没有特别的限制。例如可列举尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶(EC1.2.99.1)、二氢嘧啶脱氢酶(EC1.3.1.1)等。特别是由后面描述的本发明的微生物产生的酶，以及由红球菌属JCM3132、或者红球菌属JCM3191产生的酶。
在本说明书中，通过微生物或者由微生物产生的酶是指采用含有微生物的悬浊液(菌体悬浊液)或者由这种微生物产生的酶进行嘧啶碱基的分解反应。因此，在本发明中，采用含有微生物的悬浊液(菌体悬浊液)或者由该微生物产生的酶可以进行嘧啶碱基的分解反应。也就是说，本发明可以直接采用含有微生物的菌体悬浊液来进行嘧啶碱基的分解反应，而且也可提取由微生物产生的酶进行该反应。<核糖-1-磷酸的稳定剂>
在本发明中，通过嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用形成的碱基的交换反应经过作为中间体的核糖-1-磷酸或者脱氧核糖-1-磷酸的糖衍生物。这些中间体本来是不稳定的，如果放置，经过一段时间会分解成核糖或者脱氧核糖类的糖，但是如果反应体系中存在磷酸酶，更加速了中间体的水解反应。作为中间体的分解产物的核糖或者脱氧核糖类的糖不构成这些核苷磷酸化酶的底物，因此，减少了嘌呤核苷或者脱氧嘌呤核苷的生成量。在此，为了提高这些嘌呤核苷化合物的生成效率，在努力寻找使核糖-1-磷酸或者脱氧核糖-1-磷酸类的糖衍生物稳定化，阻止磷酸酶活性的物质。其结果是发现结合一种形成络合物的化合物是有效的。
也就是说发现与选自氨基乙酸、亚氨二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(简称EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(简称EGTA)以及它们的盐的至少一种以上的化合物和硼酸或者盐的结合是有效的。特别是硼酸和乙二胺四乙酸的结合具有显著效果。<反应条件和分离·精制>
下面描述反应条件。在本发明中，原料嘧啶核苷化合物的初始浓度是5～300mM，较好地是10～50mM。嘌呤碱基一般是难溶性的，但是如果假定初始添加量全部溶解来计，初始浓度为5～300mM，较好地是10～50mM。磷酸离子的初始浓度为1～20mM就足够了。而且，核苷和嘌呤碱基通常采用相同的初始浓度。一般来说，相对于磷酸离子核苷的浓度比增大，目的产物的嘌呤核苷化合物的产率增大。
在作为稳定剂使用的形成配合物的化合物中，硼酸或者其盐的用量为5～200mM，较好地是50～100mM，结合的另一方面是EDTA或者其盐等的用量为2～12mM，较好地是4～6mM。
反应溶液的pH为6.5～10.5，较好地是7.0～8.0。反应温度为35～60℃，较好地是35～45℃。
从反应溶液中提取生成物可以使用结晶和色谱分离法等。
下面说明本发明制备方法的原理。<本发明的原理和理论>
(1)在本发明的第一个阶段，在磷酸离子存在情况下，通过嘧啶核苷磷酸化酶的作用，由嘧啶核苷化合物和磷酸离子生成嘧啶碱基和在如核糖-1-磷酸或者2-脱氧核糖-1-磷酸这样的糖的1位上结合磷酸离子的糖衍生物(下面简单地称为糖衍生物)。
(2)下面，作为第二个阶段，生成的糖衍生物通过嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤碱基的作用进行置换反应。由此，由糖衍生物和嘌呤碱基的反应生成嘌呤核苷化合物和磷酸离子。
整理(1)和(2)的反应，采用嘧啶核苷和嘌呤碱基，通过嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的作用，进行碱基的置换反应，生成嘧啶碱基和嘌呤核苷化合物。
(3)下面，在本发明中，反应体系含有将嘧啶碱基转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物的酶或者产生这些酶的微生物。在本发明中，可以采用尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶或者二氢尿嘧啶脱氢酶这样的酶或者产生这些酶的微生物，但是并不限于此。在本发明的制备方法中，通过上述酶或者产生这些酶的微生物和电子受体共存，嘧啶碱基被转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物。即，在反应体系中采用菌体悬浊液时，由于菌体内含有电子受体，反应体系中可不必加入电子受体。转变的嘧啶碱基由于不构成嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的底物，与底物的交换反应无关，从反应体系中排除。由此，反应的平衡向生成目的产物的嘌呤核苷化合物一侧移动，可高产率地得到目的产物。
(4)进而，根据需要，为了通过下面的优选方案进行具体地说明，也可含有进一步分解转变的化合物的酶。
下面，以具体的实施例说明本发明的制备方法。
本发明的优选方案原料嘧啶核苷化合物采用尿嘧啶核苷或者2’-脱氧尿核苷(下面称为脱氧尿嘧啶核苷)，核酸碱基采用嘌呤碱基，酶采用嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶以及尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶(EC1.2.99.1)。
(1)首先，在第一阶段，在磷酸离子存在情况下，通过嘧啶核苷磷酸化酶的作用，由尿嘧啶核苷或者脱氧嘧啶尿核苷和磷酸离子生成尿嘧啶和核糖-1-磷酸或者2-脱氧核糖-1-磷酸(下面称为脱氧核糖-1-磷酸)。
(2)接着，在第二阶段，生成的核糖-1-磷酸或者脱氧核糖-1-磷酸通过嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤碱基的作用进行置换反应。由此，由核糖-1-磷酸和嘌呤碱基的反应生成嘌呤核苷化合物和磷酸离子，由脱氧核糖-1-磷酸和嘌呤碱基的反应生成2’-脱氧嘌呤核苷(下面称为脱氧嘌呤核苷)和磷酸离子。
整理(1)和(2)的反应，采用尿嘧啶核苷或者脱氧尿嘧啶核苷和嘌呤碱基，通过嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的作用，进行碱基交换反应，生成尿嘧啶和嘌呤核苷或者脱氧嘌呤核苷。
(3)通过在反应体系中尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶或者尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶和NAD等电子受体(氧化型)的共存，通过尿嘧啶核苷或者脱氧尿嘧啶核苷的分解生成的尿嘧啶不可逆地生成巴比土酸。由于生成的巴比土酸不构成嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的底物，与底物的交换反应无关，排除在反应体系之外。由此，反应平衡向生成目的产物的嘌呤核苷化合物的一侧移动，以高产率地得到目的产物。
(4)进而，通过在反应体系中存在巴比土酶(バルビツラ-ゼ)(EC3.5.2.1)，巴比土酸分解成尿素和丙二酸。从而通过尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶促进了转换反应。
例如，初始原料的嘧啶核苷化合物采用脱氧尿嘧啶核苷，嘌呤碱基采用鸟嘌呤，作为目的产物的嘌呤核苷化合物得到2’-脱氧鸟嘌呤核苷(下面称为脱氧鸟嘌呤核苷)的情况如下。
Figure C9811713500081
                        2-脱氧核糖-1-磷酸
        2’-脱氧尿嘧啶核苷                           尿嘧啶
        鸟嘌呤      2-脱氧核糖-1-磷酸     2′-脱氧鸟嘌呤核苷
其中，PYNP表示嘧啶核苷磷酸化酶，PUNP表示嘌呤核苷磷酸化酶，Pi表示磷酸。由(1)和(2)组成下面的式子。
Figure C9811713500083
2’-脱氧尿嘧啶核苷       鸟嘌呤
Figure C9811713500091
        2′-脱氧鸟嘌呤核苷      尿嘧啶
PYNPH和PUNP如前面所定义。
Figure C9811713500092
                                巴比土酸
        巴比土酸                         尿素                  丙二酸
本发明其它的优选方案是嘧啶核苷化合物采用尿嘧啶核苷或者脱氧尿嘧啶核苷，核酸碱基采用嘌呤碱基，酶采用嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶以及二氢尿嘧啶脱氢酶(EC1.3.1.1)。
(1)通过嘧啶核苷磷酸化酶的作用，由尿嘧啶核苷或者脱氧尿嘧啶核苷和磷酸离子生成尿嘧啶和核糖-1-磷酸或者脱氧核糖-1-磷酸。
(2)接着，生成的核糖-1-磷酸或者脱氧核糖-1-磷酸通过嘌呤核苷磷酸化酶的作用和嘌呤碱基进行置换反应。由此，由核糖-1-磷酸和嘌呤碱基的反应生成嘌呤核苷化合物和磷酸离子，由脱氧核糖-1-磷酸和嘌呤碱基的反应生成脱氧嘌呤核苷和磷酸离子。
整理(1)和(2)的反应，采用尿嘧啶核苷或者脱氧尿嘧啶核苷和嘌呤碱基，通过嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的作用，进行碱基的置换反应，生成嘌呤核苷或者脱氧嘌呤核苷和尿嘧啶。
(3)通过在反应体系中的二氢尿嘧啶脱氢酶或者二氢尿嘧啶脱氢酶和NADH等电子受体(还原型)共存，通过尿嘧啶核苷或者脱氧尿嘧啶核苷的分解生成的尿嘧啶不可逆地生成二氢尿嘧啶。由于生成的二氢尿嘧啶不构成嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的底物，与底物的交换反应无关，排除在反应体系之外。由此，反应的平衡向生成目的产物的嘌呤核苷化合物的一侧移动，定量得到目的产物。
(4)进而，通过在反应体系中存在二氢嘧啶酶(ピリミジナ-ゼ)(EC3.5.2.2)，二氢尿嘧啶分解成N-氨基甲酰-β-氨基丙酸。由此，促进了二氢尿嘧啶脱氢酶的反应。
例如初始原料的嘧啶核苷化合物采用脱氧尿嘧啶核苷，嘌呤碱基采用腺嘌呤，得到目的产物为2’-脱氧腺嘌呤核苷(下面称为腺嘌呤核苷)的情况如下。
2，-脱氧尿嘧啶核苷                     2’-脱氧核糖-1-磷酸     尿嘧啶
Figure C9811713500102
  腺嘌呤              2-脱氧核糖-1-磷酸   2’-脱氧腺嘌呤核苷
其中，PYNP、PUNP以及Pi如前面所定义。由(1)和(2)得到下面的式子。
Figure C9811713500103
Figure C9811713500111
2’-脱氧尿嘧啶核苷              尿嘧啶但是，PYNP以及PUNP如前面所定义。尿嘧啶二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶N-氨基甲酰-β-氨基丙酸
下面，说明第二个本发明的第二方面。
第二方面是产生尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶或者二氢尿嘧啶脱氢酶的微生物，它是选自节杆菌属YGK 222(FERM BP-5907)、巨大芽胞杆菌YGK 252(FERM BP-5908)以及假单胞细菌属YGK 443(FERM BP-5909)的微生物。<生产酶的微生物以及其>
本发明的发明者发现下面的微生物可生产使嘧啶碱基转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶以及嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物的一系列酶中的一种或者一种以上。
即，这些微生物可产生选自(1)尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶、(2)二氢尿嘧啶脱氢酶、(3)尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶和巴比土酶(EC3.5.2.1)以及(4)二氢尿嘧啶脱氢酶和二氢嘧啶酶(EC3.5.2.2)中至少一种的酶。<培养条件和酶的制备>
这些微生物在普通的培养基上可良好地生长，生产这种酶，但是在培养基上添加嘧啶碱基，能有效地提高酶的活性。
可以直接利用培养出的菌体作为粗菌体，也可以采用通过常规方法得到的粗酶。
节杆菌属(Arthrobacter sp.)YGK 222(FERM BP-5907)
巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)YGK 252(FERM BP-5908)
假单胞菌属(Pseudomonas sp.)YGK 443(FERM BP-5909)
红球菌属(Rhodococcus erythropolis)JCM 3132
红球菌属(Rhodococcus erythropolis)JCM 3191
JCM记号表示所提供的菌株是理化研究所微生物系统保存机构保存的菌株。这些菌株可以通过上述保存机构得到。其它菌株(YGK222(FERM BP-5907)、YGK 252(FERM BP-5908)、YGK 443(FERMBP-5909))寄存在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所特许微生物寄存中心。这些微生物、YGK 222(FERM BP-5907)、YGK252(FERM BP-5908)以及YGK 443(FERM BP-5909)的寄存是根据专利程序上的微生物寄存国际认定的布达佩斯条约在1997年4月11日进行的。这些菌株分别以括号内的寄存编号来寄存。
这些寄存菌株的菌学性质按照バ-ジエイス·マニコアル·オブ·デタ-ミナテイブ·バクテリオロジ-第8版(1975年)、バ-ジエイス·マニコアル·オブ·デタ-ミナテイブ·バクテリオロジ-第1卷(1984年)以及第2卷(1986年)检测的结果如下。试验主要以长谷川武治编著的改订版「鉴定微生物的分类系统」(学会出版中心，1985年)记载的方法进行。这些文献构成参考文献作为本说明书的一部分。
节杆菌属YGK 222
1.形态的性质
(1)细胞的大小：0.5～0.7×1.0～5.0微米的杆菌
(2)革兰染色性：阴性
(3)细胞的多形性：发现在生活环境中伴随有球菌～杆菌的明显的多形性。
(4)运动性：
有(在酵母提取物加肉汁的液体培养基上培养5～24个小时可看见有运动性)
(5)鞭毛的着生状态：有，1～2个侧毛
(6)孢子的有无：无
(7)抗酸性：无
2.培养的性质
(1)肉汁琼脂的平板培养：
在30℃经过24小时的培养，形成乳白色半透明的表面呈不光滑的圆形的波纹状菌丛。
(2)肉汁琼脂的斜面培养
在整个培养基上呈淡黄色半透明状扩展，发育良好。
(3)肉汁液体培养：
生长迟缓。加入了酵母提取物，在振动培养基上生长良好。
(4)肉汁明胶穿刺培养：表面液化。
(5)石蕊乳：不变化
3.生理学的性质
(1)硝酸盐的还原      阴性
(2)脱氮反应          阴性
(3)MR测试            阴性
(4)VP测试            阴性
(5)吲哚的生成        阴性
(6)硫化氢的生成      阴性
(7)柠檬酸的利用
·克理斯蒂森培养基   阴性
·克萨培养基         阴性
(8)无机氮源的利用
·硝酸盐             阳性
·铵盐               阴性
(9)色素的生成        无
(10)尿素酶           阴性
(11)氧化酶           阴性
(12)过氧化氢酶       阴性
(13)生长的范围
·pH区域             5.5～9.5
·温度区域           19～38℃
(14)对氧的态度       需氧性
(15)O-F测试
·葡萄糖                 没有变化
·蔗糖                   没有变化
(16)各种碳源的利用
·L-阿拉伯糖             ±
·D-木糖                 +
·D-葡萄糖               +
·D-甘露糖               +
·D-果糖                 +
·D-半乳糖               +
·麦芽糖                 +
·蔗糖                   +
·乳糖                   -
·海藻糖                 +
·D-山梨醇               +
·D-甘露醇               +
·肌醇                   +
·甘油                   -
·淀粉                   -
4.GC含量(HPLC法测定)
G+C(摩尔％)＝69.6
根据以上的菌学性质，判断本菌株属于节杆菌属(Arthrobactersp.)。
巨大芽胞杆菌YGK 252
1.形态的性质
(1)细胞的大小：1.6×4.0～9.0微米的杆菌
(2)革兰染色性：阳性
(3)细胞的多形性：没有
(4)运动性：有
(5)鞭毛的着生状态：有，周毛
(6)孢子的有无：有，孢子囊不膨胀，孢子的形状为椭圆形
(7)抗酸性：无
2.培养的性质
(1)肉汁琼脂平板培养：
在30℃经过24小时的培养，形成乳白色半透明的表面呈不光滑的圆形波纹状菌丛。
(2)肉汁琼脂的斜面培养
呈淡黄色半透明的表面呈树皮气味，周边沿冲击呈锯齿状良好地生长。
(3)肉汁液体培养基：
生长迟缓。如果加入酵母提取物，生长良好。
(4)肉汁明胶穿刺培养：仅表面液化。
(5)石蕊乳：变成微酸性，看见有凝固
3.生理学的性质
(1)硝酸盐的还原      阳性
(2)脱氮反应          阳性
(3)MR测试            阳性
(4)VP测试            阴性
(5)吲哚的生成        阴性
(6)硫化氢的生成      阴性
(7)柠檬酸的利用
·克理斯蒂森培养基   阳性
·克萨培养基         阳性
(8)无机氮源的利用
·硝酸盐             阳性
·铵盐               阳性
(9)色素的生成        没有
(10)尿素酶           阳性
(11)氧化酶           阳性
(12)过氧化氢酶       阳性
(13)生长的范围
·pH区域             5.5～10.5
·温度区域           10～43℃
(14)对氧的态度       需氧性
(15)O-F测试
·葡萄糖             没有变化
·蔗糖               没有变化
(16)各种碳源的利用
·L-阿拉伯糖           -
·D-木糖               -
·D-葡萄糖             -
·D-甘露糖             -
·D-果糖               -
·D-半乳糖             -
·麦芽糖               -
·蔗糖                 -
·乳糖                 -
·海藻糖               -
·D-山梨醇             -
·D-甘露醇             -
·肌醇                 -
·甘油                 -
·淀粉                 +
4.GC含量(HPLC法测定)
G+C(摩尔％)＝34.7
根据以上的菌学性质，判断本菌株属于巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)。
假单胞菌属YGK 443
1.形态的性质
(1)细胞的大小：0.4～0.6×0.6～2.4微米的杆菌
(2)革兰染色性：阴性
(3)细胞的多形性：没有
(4)运动性：有
(5)鞭毛的着生状态：有，4～5个极小的鞭毛
(6)孢子的有无：无
(7)抗酸性：阴性
2.培养的性质
(1)肉汁琼脂平板培养：
在30℃经过24小时培养，形成乳白色半透明的表面呈光滑的圆形的波纹状菌丛。
(2)肉汁琼脂的斜面培养呈乳白色半透明的光泽，沿着冲击生长良好。(3)肉汁液体培养：可见在振动培养基上良好地生长。(4)肉汁明胶穿刺培养：没有变化(5)石蕊乳：碱性，不胨化。3.生理学的性质(1)硝酸盐的还原             阳性(2)脱氮反应                 阴性(3)MR测试                   阴性(4)VP测试                   阴性(5)吲哚的生成               阴性(6)硫化氢的生成             阴性(7)柠檬酸的利用
·克理斯蒂森培养基      阳性
·克萨培养基            阳性(8)无机氮源的利用
·硝酸盐                阳性
·铵盐                  阳性(9)色素的生成               没有(10)尿素酶                  阳性(11)氧化酶                  阳性(12)过氧化氢酶              阳性(13)生长的范围
·pH区域                4.2～10.5
·温度区域              17～43℃(14)对氧的态度              需氧性(15)O-F测试
·葡萄糖                O(氧化的)
·蔗糖                  没有变化(16)精酰胺的分解            阴性(17)各种碳源的利用
·L-阿拉伯糖             +
·D-木糖                 +
·D-葡萄糖               +
·D-甘露糖               +
·D-果糖              +
·D-半乳糖            +
·麦芽糖              +
·蔗糖                +
·乳糖                -
·海藻糖              +
·D-山梨醇            -
·D-甘露醇            +
·肌醇                +
·甘油                +
·淀粉                -
4.GC含量(HPLC法测定)
G+C(摩尔％)＝62.3
根据以上的菌学性质，判断本菌株属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)。
实施例
下面通过制造例、试验例和实施例更详细地说明本发明。
制造例1制备含有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的菌株悬浊液
按下面的顺序培养作为嘌呤核苷磷酸化酶(下面称为PYNP)和嘧啶核苷磷酸化酶(下面称为PYNP)的生产菌株的芽胞杆菌属脂肪嗜热杆菌(Bacillus stearothermopHilus)JTS 859(FERM P-9666)。
细菌培养采用由バクトトリプトン10克、酵母浸汁5克、葡萄糖3克、食盐3克、肌苷1克以及水1升构成的pH为6.2的培养基。在1.5升这种培养基中加入3×107个芽胞杆菌属脂肪嗜热杆菌JTS859(FERM P-9666)的孢子，采用带有搅拌叶片(直径70毫米，上下各一只)的3升容积的发酵缸，以500rpm的速度旋转搅拌叶片，在通气量1vvm，培养温度65℃，pH6.0～6.4条件下培养5个小时。
培养完成之后，通过离心分离菌体(10000G，4℃，15分)进行收集，将得到的20克湿菌体在30毫升10mM的磷酸钾溶液(pH7)中形成的悬浊液作为含有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的菌体的悬浊液(下面称为PUNP·PYNP酶溶液)。制备例2制备具有尿嘧啶和胸腺嘧啶分解活性的菌体悬浊液
按照下面的顺序制备具有尿嘧啶以及胸腺嘧啶分解活性的节杆菌属YGK222(FERM BP-5907)、巨大芽胞杆菌YGK 252(FERM BP-5908)、假单胞菌属YGK443(FERM BP-5909)、红球菌属JCM 3132、红球菌属JCM 3191的菌体悬浊液。
细菌培养采用由尿嘧啶2克、磷酸二氢钾1克、磷酸氢二钾3克、酵母提取物6克以及水1升制成的pH为7.0的培养基。在加入了500毫升上述各培养基的2升容积的三角烧瓶中分别加入上述微生物的菌体或者3×107个孢子，以200rpm的速度旋转，在35℃的温度下培养15个小时。
培养完成之后，通过离心分离菌体(10000G，4℃，15分)收集，将得到的湿菌体在6毫升10mM磷酸钾溶液(pH7)中悬浮，制成悬浊液(下面称为尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液)。实施例1由微生物生产尿嘧啶以及胸腺嘧啶分解酶
含有均为0.05毫升的50mM尿嘧啶或者50mM胸腺嘧啶中的任意一个、100mM磷酸缓冲溶液(pH7)以及由制备例2制备的各个菌株得来的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液中任意一个的总量为1毫升的反应溶液，在35℃反应15分钟，对反应溶液中的尿嘧啶以及胸腺嘧啶分解活性采用高速液体色谱分离法进行定量分析。结果列于表1。
在此分解活性U是在35℃每1分钟分解1微摩尔底物(尿嘧啶或者胸腺嘧啶)的酶活性的量。
                      表1
    菌株      分解活性(U/湿菌体g)
    尿嘧啶     胸腺嘧啶
    节杆菌属YGK222巨大芽胞杆菌YGK252假单胞菌属YGK443红球菌属JCM3132红球菌属JCM3191     36.45.82.210.67.8     14.52.11.44.23.2
实验例2尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶生产菌的生产酶
使含有均为0.05毫升的50mM尿嘧啶、100mM磷酸缓冲溶液(pH7)以及制备例2制备的由各菌株得来的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液中任意一个的总体为1毫升的反应溶液在35℃反应15～30分钟。对反应溶液中的尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶、巴比土酶、二氢尿嘧啶脱氢酶以及二氢嘧啶酶的存在、巴比土酸以及二氢尿嘧啶的生成和消失通过高速液体色谱分离法追踪进行检测。其结果列于表2。+表示检测有酶，-表示没有检测出酶。
在这种情况下，例如，如果二氢嘧啶酶的活性比二氢尿嘧啶脱氢酶的活性强，就检测不出生成物二氢尿嘧啶。但是，表2的-记号不表示该酶100％的不存在。
                              表2
菌株的编号                       各种酶的检测
尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶 巴比土酶 二氢尿嘧啶脱氢酶 二氢嘧啶酶
  YGK 222YGK 443YGK 252JCM 3132JCM 3191     +++++     -++++     -++-- -++--
实施例1通过PUNP·PYNP酶溶液和尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液的作用制备嘌呤核苷
使含有20mM脱氧胸腺嘧啶核苷、20mM鸟嘌呤、1.25mM磷酸钾、制备例1制备的PUNP·PYNP酶溶液2毫升、制备例2制备的由节杆菌属YGK 222制备的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液0.5毫升、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的总量为100毫升的水溶液(pH7)在35℃反应110小时，测定反应溶液中所含的底物以及生成物的浓度。其结果如图1所示。
而且除了不加入尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液之外，全部与上述在同一个条件下进行反应，测定反应溶液中所含的底物和生成物的浓度。其结果如图2所示。
在图1和图2中，白色四角形表示脱氧胸腺嘧啶核苷，涂黑的菱形表示脱氧鸟嘌呤核苷，涂黑的三角形表示胸腺嘧啶，白色三角形表示5-甲基巴比土酸。
在图1中，可见生成5-甲基巴比土酸，进一步说明由于该酸分解消失，在这种尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液中至少有尿嘧啶胸腺嘧啶脱氢酶以及巴比土酶存在。在这种(图1)情况下，可见稍有原料鸟嘌呤残存，脱氧胸腺嘧啶核苷基本上消失。生成14.9mM(产率为75％)脱氧鸟嘌呤核苷。与不存在尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液的情况(图2)相比，可见目的产物的脱氧鸟嘌呤核苷的产量非常高。实施例2～11采用各种原料核苷和各种原料嘌呤碱基制备嘌呤核苷
除了采用表3所示的嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基之外，在与实施例1相同的条件下在35℃反应90小时。在反应溶液中所含的底物和生成物的浓度的定量结果在表3表示。除了加入0.5毫升蒸馏水来代替尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液之外，在与上述相同的条件下进行反应来对照。通过加入尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液，提高了嘌呤核苷的产率，特别是其效果对鸟嘌呤核苷和脱氧鸟嘌呤核苷的生成有显著影响。
                                        表3
实施例     原料 生成的嘌呤核苷化合物     生成量(mM)
尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶
嘧啶核苷化合物   嘌呤碱基 存在时 不存在时
 234567891011 脱氧胸腺嘧啶核苷脱氧胸腺嘧啶核苷脱氧胸腺嘧啶核苷脱氧尿嘧啶核苷脱氧尿嘧啶核苷脱氧尿嘧啶核苷脱氧尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷   腺嘌呤次黄嘌呤5-羟基嘌呤腺嘌呤腺嘌呤次黄嘌呤5-羟基嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤5-羟基嘌呤   脱氧腺嘌呤核苷脱氧肌苷5-羟基嘌呤脱氧核糖苷脱氧腺嘌呤核苷脱氧鸟嘌呤核苷脱氧肌苷5-羟基嘌呤脱氧核糖苷腺嘌呤核苷鸟嘌呤核苷肌苷     17.716.417.716.615.415.917.212.913.416.2     8.812.415.78.82.211.713.93.72.211.2
实施例12  由各菌株得来的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液对生成嘌呤核苷化合物的效果
制备含有20mM脱氧胸腺嘧啶核苷、20mM鸟嘌呤、1.25mM磷酸钾、制备例1制备的PUNP·PYNP2毫升、制备例2制备的由各菌株得来的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液0.5毫升、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的总量为100毫升的溶液(pH7)。除了加入0.5毫升蒸馏水来代替尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液之外，在与上述相同的条件下反应进行对照。
将这些溶液在35℃下反应100小时，测定反应溶液中所含的菌株和生成物的浓度。结果列于表4。
可确定任何由菌株得来的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液都提高了脱氧鸟嘌呤核苷的生成效率。
                           表4
    菌株     脱氧鸟嘌呤核苷的生成量(mM)
    尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液
    存在时     不存在时
节杆菌属YGK222巨大芽胞杆菌YGK 252假单胞菌属YGK443红球菌属JCM 3132红球菌属JCM 3191     12.43.22.75.34.6      2.42.42.42.42.4
实施例13反应中间体(核糖-1-磷酸)的稳定化和抑制磷酸酶的分解
使含有5mM核糖-1-磷酸、表5所示的稳定剂(EDTA为4mM，其它以100mM的浓度使用)、制备例1制备的PUNP·PYNP酶溶液0.02毫升、制备例2制备的由节杆菌属YGK222得来的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液0.01毫升的总量为1毫升的水溶液(pH7)在35℃反应72小时，在反应溶液中所含的核糖-1-磷酸和分解生成物的核糖通过薄层色谱分离法测定的结果列于表5。测定法是Ishii的方法(Agric.Biol.Chem.，53(12)，3209-3218(1989))。该文献作为参考文献是本说明书的一部分。除了加入三(羟甲基)氨基甲盐酸(下面称为“三”)100mM，不加入两种酶溶液之外，将与上相同制备的溶液作为“三”(对照)。表中的+表示核糖-1-磷酸分解，-表示不分解。
在不添加酶溶液的“三”(对照)中，由于不进行到分解的程度，可见酶溶液中含有磷酸酶。由于认为在硼酸和EDTA的添加溶液中核糖-1-磷酸不分解，这些物质抑制了酶溶液中磷酸酶的活性，可见赋予了核糖-1-磷酸具有稳定性。
                      表5
    稳定剂     核糖-1-磷酸的有无分解
    三(对照)三硼酸氨基乙酸硼酸和氨基乙酸硼酸和三三和EDTA硼酸和EDTA氨基乙酸和EDTAEDTA              ++±±±±+-±+
实施例14  稳定剂对生成脱氧鸟嘌呤核苷的效果
使含有20mM脱氧胸腺嘧啶核苷、20mM鸟嘌呤、表6所示的稳定剂(表中的*表示4mM，其它为100mM的浓度)、1.25mM磷酸钾、制备例1制备的PUNP·PYNP酶溶液2毫升、制备例2制备的由节杆菌属YGK222得来的尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶溶液0.05毫升的总量为100毫升的水溶液(pH7)在35℃反应90小时。在反应溶液中所含的脱氧鸟嘌呤核苷的浓度的定量结果列于表6。
由这些结果可见，与实施例13所示的硼酸和EDTA类似的配位体形成化合物的结合，具有抑制核糖-1-磷酸的分解和稳定化的效果，并且证明提高了嘌呤核苷化合物的生成效率。
                      表6
    稳定剂   脱氧鸟嘌呤核苷的生成量(mM)
    三(对照)硼酸氨基乙酸亚氨基二乙酸*次氮基三乙酸*EDTA*EGTA*三和EDTA*氨基乙酸和EDTA*硼酸和三硼酸和亚氨基二乙酸*硼酸和次氮基三乙酸*硼酸和EDTA*硼酸和EGTA*             01.50000000.42.04.74.911.612.79.6

Claims (5)

1.嘌呤核苷化合物的制备方法，其特征在于嘧啶核苷化合物和嘌呤碱基在含有磷酸离子的水溶液中，通过嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用进行碱基交换反应，生成的嘧啶碱基通过微生物或者由该微生物生成的酶的作用，转变成不构成嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶底物的化合物，其中所述的微生物是选自节杆菌属、芽胞杆菌属、假单胞菌属、红球菌属的一种微生物，由所述微生物生成的酶是尿嘧啶·胸腺嘧啶分解酶或者二氢尿嘧啶脱氢酶。
2.权利要求1所述的嘌呤核苷化合物的制备方法，其特征在于作为在碱基交换反应时生成的反应中间体的核糖-1-磷酸或者脱氧核糖-1-磷酸的稳定剂是选自氨基乙酸、亚氨二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸以及它们的盐中的至少一种的化合物和硼酸或其盐。
3.权利要求1或2所述的嘌呤核苷化合物的制备方法，其中嘧啶核苷化合物是选自尿嘧啶核苷、脱氧尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷以及脱氧胸腺嘧啶核苷的一种化合物。
4.权利要求1或2所述的嘌呤核苷化合物的制备方法，其中嘌呤碱基是选自腺嘌呤、鸟嘌呤、5-羟基嘌呤、卤化嘌呤以及氨基化嘌呤的一种化合物。
5.权利要求1或2所述的嘌呤核苷化合物的制备方法，其中微生物是节杆菌属FERM BP-5907、巨大芽胞杆菌FERM BP-5908、假单胞菌属FERM BP-5909、红球菌属JCM 3132或者红球菌属JCM3191。
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