CN1597942A - 新型葡萄糖酸脱水酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有生产上实用的热稳定性及保存稳定性，可以由醛糖酸高效生成相应的2－酮－3－脱氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脱水酶、和决定该葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因、以及用含有该葡萄糖酸脱水酶或该基因的转换细胞制造2－酮－3脱氧醛糖酸以及减少一个碳原子的2－脱氧醛糖酸或2－脱氧醛糖的方法。本发明提供一种源自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株的新型葡萄糖酸脱水酶、以及决定这一葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。提供使该葡萄糖酸脱水酶或含有该基因的转换细胞作用于醛糖酸中，制造相应的2－酮－3－脱氧醛糖酸。

Description

新型葡萄糖酸脱水酶

技术领域

本发明涉及一种能有效地从醛糖酸生成2-酮-3-脱氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脱水酶以及决定该葡萄糖酸脱水酶遗传密码的碱基序列，含有这些碱基序列的质粒以及通过质粒转化后的转换细胞。进一步说，本发明涉及一种使用该葡萄糖酸脱水酶或该转换细胞的2-酮-3-脱氧醛糖酸和减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖酸或2-脱氧醛糖的制造方法。

背景技术

作为药品原料2-酮-3-脱氧醛糖酸类是有用的化合物。例如，通过脱羧可获得碳原子数减少1个的2-脱氧醛糖酸类或2-脱氧醛糖类。这些作为抗生素、抗病毒药、反义药物(antisense)等的原料等被关注。

另一方面，已知催化醛糖酸类脱水生成2-酮-3-脱氧醛糖酸类反应的

酶的存在。例如，D-葡萄糖酸脱水合成2-酮-3脱氧-D-葡萄糖酸的酶，作为葡萄糖酸脱水酶(EC4.2.1.39)的起源，已知巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurian)(参照Analytical Biochemistry，(1974)，61，275)产碱菌属(Alcaligenes sp.)M250菌株(参照Methods in Enzymology，(1975)，41，99)，部分硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)(参照Biotechnol.Lett.，(1986)，8，497)等。但是，巴氏芽孢梭菌由来的葡萄糖酸脱水酶被报道了容易受空气氧化，在空气存在下迅速失活的特性。另外，产碱菌属M250菌株由来的萄萄糖酸脱水酶是热稳定性很低的酶，报道了在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的三(羟甲基)氨基甲烷(以下简记为tris)缓冲液(pH8.0～8.8)中，0℃、保存7天，萄萄糖酸脱水活性下降50％。因此，这些微生物菌种或该微生物菌种由来的酶在培养和反应的操作中反应性下降等，使用困难，很难适用于工业制造。另外，关于部分硫叶菌，它的萄萄糖酸脱水酶没有进行过酶的精制，对它的物理化学性质不十分清楚。使用该微生物菌株的2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸合成中，由于混杂分解生成物2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的活性，存在收率低的问题。

如上所述，还没有发现在工业上有实用价值的萄萄糖酸脱水酶，也还没有确立有良好效率的2-酮-3-脱氧醛糖酸类的工业制法。

发明内容

本发明的课题涉及作为药品原料有使用价值的2-酮-3-脱氧醛糖酸类，提供具有工业实用性的热稳定性和保存稳定性、能有效地生成由醛糖酸相对应的2-酮-3-脱氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脱水酶，以及使用这种酶的2-酮-3-脱氧醛糖酸的制造方法。

本发明的另一目的是提供在葡萄糖酸脱水酶的生产以及使用葡萄糖酸脱水酶的2-酮-3-脱氧醛糖酸的制造中，决定作为有用材料的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的碱基序列、引入这些碱基序列的质粒以及用该质粒使宿主细胞进行转化得到的转换细胞。

针对这个课题进行了尖锐讨论的结果，发现木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株具有高的葡萄糖酸脱水活性。

上述现有技术的产碱菌属M250菌株在其文献中有同ATCC9220菌株是同种的记载，相对于产碱菌属M250菌株由来的葡萄糖酸脱水酶正如上述所述的不稳定的报道，本发明者们发现将木糖氧化无色杆菌ATCC9220菌体在D-葡萄糖酸中发生作用，反应温度即使在50℃也能保持稳定的活性，能有效地生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。

在这里，利用各种精制技术分离由该菌体由来的葡萄糖酸脱水酶，发现该葡萄糖酸脱水酶在55℃保持2小时的情况下，是维持95％或其以上活性的耐热性酶。

进一步，相对于上述产碱菌属M250菌株由来的葡萄糖酸脱水酶在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的tris缓冲液(pH8.0～8.8)中，0℃、保存7天，萄萄糖酸脱水活性下降50％的报道，本发明的葡萄糖酸脱水酶在同样条件下，保持1个月稳定的活性，是保存稳定性相当优秀的酶。

另外，从上述现有技术的产碱菌属M250菌株精制的葡萄糖酸脱水酶的凝胶过滤层析柱的分子量有270,000±2,500的记载，但本发明的葡萄糖酸脱水酶的凝胶过滤层析柱的分子量是188,000±2,500，发现了在分子量上的不同。

进一步，成功地决定了如序列表中序列编号1所示的该萄萄糖酸脱水酶的氨基酸序列。

进一步，本发明者们由于获得了具有如序列表中序列编号1所示的碱基序列的DNA，通过将含有带有这些碱基序列的DNA片断的质粒获得了转换细胞，产生作为活性型的上述萄萄糖酸脱水酶，进一步通过使该转换细胞或该转换细胞处理物在醛糖酸中发生作用，成功高效地制造出相应的2-酮-3-脱氧醛糖酸，从而完成本发明。

即、本发明含有以下各形态。

[1]葡萄糖酸脱水酶，其特征在于，具有使D-葡萄糖酸脱水生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的功能，在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的30mM tris缓冲液(pH8.5)中，55℃、保持2小时的情况下，保持95％或其以上的活性。

[2][1]所述的葡萄糖酸脱水酶是由木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)由来的。

[3][1]所述的葡萄糖酸脱水酶是用序列表的序列编号1中记载的氨基酸序

列表示。

[4]用与序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列有70％或其以上相同性

的氨基酸序列表示[1]所述的葡萄糖酸脱水酶。

[5]决定[1]至[4]中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。

[6]决定用序列表的序列编号1中记载的碱基序列表示的[1]至[3]所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。

[7]在高严格条件下、与[5]或[6]所述的基因进行杂交的碱基序列表示的、决定[1]至[4]中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。

[8]含有决定[5]至[7]中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码基因的质粒。

[9]利用[8]所述的质粒使宿主细胞进行转化得到转换细胞。

[10]宿主细胞是大肠菌的[9]所述的转换细胞。

[11]用[1]至[4]中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶，[9]或[10]所述的转换细胞，或它们的处理物中的任意一种，在水介质中，转换成与醛糖酸对应的2-酮-3-脱氧醛糖酸的方法。

[12]2-脱氧醛糖酸的制造方法，其特征在于，由以下的工序组成，

A)在醛糖酸或醛糖酸盐中，使[1]至[4]任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶、或[9]或[10]所述的转换细胞、或它们的处理物的任意一种在水介质中发生作用，转换成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序。

B)工序A)中得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸在水介质中使氧化剂发生作用，进行脱羧反应，得到减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖酸的工序。

[13]2-脱氧醛糖的制造方法，其特征在于，由以下的工序组成，

A)在醛糖酸类或醛糖酸盐中，使[1]至[4]任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶、或[9]或[10]所述的转换细胞或它们的处理物的任意一种在水介质中发生作用，转换成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序。

B)工序A)中得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸在水介质中使还原剂发生作用，得到2-羟基-3-脱氧醛糖酸的工序，

C)在B)工序中得到的2-羟基-3-脱氧醛糖酸在水介质中使氧化剂发生作用，进行脱羧反应，得到减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖的工序。

[14][11]至[13]中任意一项所述的任意一项方法，其中，醛糖酸是D-葡萄糖酸、D-半乳糖酸(D-galactonic acid)、D-岩藻糖酸(D-Fuconicacid)、D-木糖酸(D-Xylonic acid)或L-阿拉伯糖酸(L-arabinonic acid)的任何一种。

本发明提供一种热稳定性和保存稳定性卓越的新型葡萄糖酸脱水酶。另外提供决定该葡萄糖酸脱水酶遗传密码的碱基序列，引入这些碱基序列的质粒以及用质粒进行转化的转换细胞。另外，通过利用该葡萄糖酸脱水酶或该转换细胞，能够制造收率良好的2-酮-3-脱氧醛糖酸和减少了1个碳原子数的2-脱氧醛糖酸或2-脱氧醛糖。

附图说明

图1是表示含有决定葡萄糖酸脱水酶基因的DNA的质粒构成图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

有关本发明的葡萄糖酸脱水酶，其是在D-葡萄糖酸中发生作用催化生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸反应的酶，耐热性是该酶的特征。关于耐热性，在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的30mM tris缓冲液(pH 8.5)中，55℃、保持2小时的情况下，能够规定为相对于保存前的酶活性保持大于等于95％的活性。

有关本发明的葡萄糖酸脱水酶只要是具有关于上述耐热性特性的葡萄糖酸脱水活性的酶，不论是从任何微生物由来的，或者是通过基因重组改变已知的葡萄糖酸脱水酶后的产物，都是包含在本发明中的。本发明的葡萄糖酸脱水酶包括由木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由来的。木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株是能由美国典型菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection)获得分售的菌种。这种菌种以前记载为木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)或粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，现在记载为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。

本发明的葡萄糖酸脱水酶活性表现为以D-葡萄糖酸为基质生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的活性，能够按下列方法确认。含有tris缓冲液(pH8.5)1mmole，D-葡萄糖酸钠40μmole，氯化镁1μmole和葡萄糖酸脱水酶的反应液1ml在37℃反应10分钟，通过添加1M的盐酸200μl停止反应。反应停止后，用高速液相层析法(层析柱：Shodex AsahipakNH2P-504E(昭和电工制)，层析柱温：40℃，移动相：50mM磷酸二氢钠，流速：1ml/min，检出：210nm)定量2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。1U定义为1分钟催化1μmole 2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸生成的酶量。另外，蛋白质的定量用蛋白质试验工具(プロテインアツセイキツト)(バイオラツド製)通过色素结合法等进行测定。

本发明的葡萄糖酸脱水酶的一个形态，具有序列表的序列编号1所述的氨基酸序列，或序列表的序列编号1所述的氨基酸序列中1个或2个或其以上，优选数个氨基酸，在能维持葡萄糖酸脱水酶活性的范围内，被置换，缺失或变异或插入或附加的氨基酸序列。另外，有关本发明的葡萄糖酸脱水酶含有具有同序列表的序列编号1表示的氨基酸序列至少70％或其以上，优选80％或其以上，更优选95％或其以上的同源性的蛋白质。蛋白质的同源性检索，例如有关SWISS-PROT、PIR等的蛋白质的氨基酸序列的数据库和有关DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-Bank等DNA数据库，以有关DNA序列为基础推定的氨基酸序列的数据库等为对象，用FASTA program或BLAST program等，例如可以在因特网上进行检索。本发明的70％或其以上的同源性是例如用BLASTprogram表示的正(Positive)同源性的值。

决定本发明的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的多核苷酸含有序列表的序列编号1记载的碱基序列。序列表的序列编号1表示的碱基序列编码表示在序列表的序列编号1的蛋白质。但是，决定序列表的序列编号1表示的氨基酸序列的碱基序列不仅仅是序列表的序列编号1记载的碱基序列，含有按照不同密码的所有碱基序列。进一步通过适当的导入置换，缺失，变异或插入或附加序列，得到多核苷酸的同源序列。本发明的多核苷酸的同源序列是相对序列表的序列编号1表示的碱基序列，用这些序列决定的葡萄糖酸脱水酶在能维持一定的酶活性范围内进行碱基的置换、缺失或附加而得到的多核苷酸的同源序列。在该同源序列中，可以例举出具有含有表示在序列表的序列编号1的碱基序列的互补序列的多肽，在高严格的条件下能够杂交的碱基序列的多核苷酸。

在高严格条件下的杂交，例如可通过Molecular Cloning：Cold SpringHarbor Laboratory Press，Current Protocols in Molecular Biology；WileyInterscience记载的方法进行，市售的装置可列举出Gene Image装置(アマルシヤム)。具体的可通过以下的操作进行杂交。转录有应进行试验的DNA或RNA分子的膜依照产品说明书，在说明书指定的杂交缓冲液(hybridazation buffer)中与标识的探针(probe)杂交。杂交缓冲液(hybridazation buffer)的组成是由0.1重量％的SDS、5重量％的硫酸萄聚糖、1/20溶的工具带的封闭液(Blocking solution)和2至7×SSC组成。作为封闭液试剂，例如、可以将100×Denhardt′s solution、2％(重量/容量)的Bovine serum albumin、2％(重量/容量)的Ficll^TM400、2％(重量/容量)的聚乙烯吡咯烷酮调制成5倍浓度的溶液后稀释至20分之1后使用。杂交的温度是40℃至80℃，优选50℃至70℃的范围，进行几个小时乃至1个晚上的杂交(incubate)后，用清洗液缓冲液(wash buffer)进行清洗。清洗的温度优选室温，更优选杂交时的温度。清洗缓冲液的组成是6×SSC+0.1重量％的SDS溶液，优选4×SSC+0.1重量％的SDS溶液，更优选1×SSC+0.1重量％的SDS溶液。用这样的清洗液洗膜，杂交了探针的DNA分子或RNA分子利用用于探针上的标记，可以进行识别。

决定本发明的新型葡萄糖酸脱水酶遗传密码的DNA，例如，可以通过以下的方法进行分离。从微生物中精制基因组DNA，通过超高速分离或电泳，根据DNA的长度，分画用限制性内切酶消化后得到的DNA。通过回收该分画试剂的DNA引入到质粒中，制成质粒文库，从中选出带有葡萄糖酸脱水酶活性的克隆，获取含有决定葡萄糖酸脱水酶基因的DNA质粒。通过分析该质粒的碱基序列，明确了决定目的的葡萄糖酸脱水酶基因的DNA的碱基序列，因此可以从DNA的碱基序列推定被决定的葡萄糖酸脱水酶的氨基酸序列。

把通过用上述方法分离的决定本发明葡萄糖酸脱水酶遗传密码的DNA编入到，例如，宿主是大肠杆菌的情形下，pUC 18、pKK223-3、pBR322、pMW119、Bluescript IISK(+)、pSC101等代表表达用的质粒中，提供葡萄糖酸脱水酶表达质粒。作为在转化中使用的宿主生物，只要重组载体能稳定并且自律增殖，并且外源性DNA的性质是能表达的就行。作为宿主生物的例子可以举出大肠杆菌(Escherichia coli)，但是不特别限制在大肠杆菌，也可以使用埃希氏菌(Escherichia)属细菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、假单胞菌(Pseudomonas)属细菌等细菌类、酵母(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属等酵母类、曲霉菌(Aspergillus)属等丝状菌类。

本发明可以根据公知的信息培养用该质粒进行转化后得到的转换细胞，可以令其生成本发明的葡萄糖酸脱水酶。作为培养基，只要是适量含有碳源、氮源、无机物和其他的营养元素的培养基，可以使用合成培养基或天然培养基中的任何一种。培养是在含有上述培养成分的液体培养基中，用振动培养、通气搅拌培养、连续式培养、流加式培养等通常的培养方法进行。培养条件可以根据培养基的种类，培养方法适当选择，只要是菌株生长能生成葡萄糖酸脱水酶的条件，就没有特殊地限制。

另外，在2-酮-3-脱氧醛糖酸的制造方法中，也可以从上述具有葡萄糖酸脱水酶活性的菌体培养液本身或通过离心分离分离回收该培养液而得到的转换细胞，该转换细胞的菌体处理物的形式来利用葡萄糖酸脱水酶。这里所说的菌体处理物包括该转换细胞的提取物或破碎物、分离、精制该提取物或破碎物的葡萄糖酸脱水酶活性画分而得到的分离物、用适当的载体固定该转换细胞或该转换细胞的提取物、破碎物、分离物的固定化物。

本发明使用的醛糖酸可以通过公知的制造方法得到，也可以使用市面上出售的醛糖酸。醛糖酸只要是通过本发明中的葡萄糖酸脱水酶的作用，能转换成相应的2-酮-3-脱氧醛糖酸，就没有特别地限制，D-葡萄糖酸、D-半乳糖酸、D-岩藻糖酸、D-木糖酸、L-阿拉伯糖酸等均适合使用。另外，醛糖酸的碱性金属盐、碱土金属盐、铵盐等也适合使用。

醛糖酸的浓度没有特别限制，通常使用1至500g/l范围的浓度。鉴于反应性和经济性，优选100g/l或其以上。

2-酮-3-脱氧醛糖酸生成反应的反应温度只要是在能维持葡萄糖酸脱水酶活性的温度范围就可以，优选50℃至60℃的范围。

另外，反应的pH只要是在能维持葡萄糖酸脱水酶活性的范围就行，优选pH7至9的范围。反应中pH变动的情况下，只要适当调整就可以。

作为用于反应的介质能够使用水或由各种缓冲液组成的水介质。作为缓冲液可以列举出从磷酸、tris、柠檬酸、乙酸、硼酸、甘氨酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、2-吗啉乙磺酸、3-环己基氨基丙磺酸、2-(环己基氨基)乙磺酸、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)等中适宜的选出一种或两种或两种以上的组成成分使其含有在水中的缓冲液。

另外，为了提高反应效率和回收率，可以根据需要使用各种添加剂。由于在例如镁离子，锰离子等金属离子的存在下，葡萄糖酸脱水酶中有被活化的物质，可以在反应液中添加这些二价金属。

本发明的2-脱氧醛糖酸的制造方法是由用上述方法生成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序及之后在得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸中使氧化剂发生作用进行脱羧反应，生成减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖酸的工序组成。

作为脱羧反应中使用的氧化剂可以列举出次氯酸或次氯酸盐或过氧化氢等，其中优选次氯酸或次氯酸盐。作为次氯酸盐可以列举出次氯酸钠、次氯酸钾、次氯酸钙、次氯酸锂等，也可以使用通过像氢氧化钠这样的金属氢氧化物和氯在反应体系内调整的物质。

在脱羧反应中使用的溶剂只要是使反应进行的就可以，没有特别地限定，优选溶解原料的溶剂，可举出水，乙酸等。

脱羧反应的反应温度大于等于溶剂不结冻的温度，小于等于溶剂的沸点，优选20℃至50℃。

作为脱羧反应的反应液pH是4～6，优选4.5～6。另外，在本发明中，在添加次氯酸盐水溶液的同时，为了调整反应液的pH到上述pH优选添加酸。作为酸没有特别限定，可以举出盐酸、硫酸、磷酸等的无机酸和乙酸、蚁酸等的低级脂肪族羧酸等。

另外，不用分离精制前工序中得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸，可以通过在同一反应器中逐步反应，制造2-脱氧醛糖酸。

本发明的2-脱氧醛糖的制造方法是由用上述的方法生成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序，在得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸中使还原剂发生作用生成2-羟基-3-脱氧醛糖酸的工序，使氧化剂在得到的2-羟基-3-脱氧醛糖酸中发生作用进行脱羧反应生成减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖的工序组成。

作为还原剂只要是使反应进行的就可以，没有特别地限定，优选氢化硼钠。另外，可以用在钯等金属催化剂存在下的催化氢化法进行还原反应。

还原反应中使用的溶剂只要是使反应进行的就可以，没有特别地限定，优选溶解原料的溶剂，可举出水等。

还原反应的反应温度大于等于溶剂不结冻的温度，低于等于溶剂的沸点，优选0℃至20℃。

脱羧反应可在与上述的2-脱氧醛糖酸的制造方法相同的条件下进行。

另外，不用分离精制各工序中得到的反应生成物，可以通过在同一反应器中逐步反应，制造2-脱氧醛糖。

从生成的2-酮-3-脱氧醛糖酸、2-脱氧醛糖酸和2-脱氧醛糖反应液中分离·回收，可以使用用金属盐的沉淀法或层析柱分离等通常使用的分离·回收方法。

实施例

以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

反应中使用的醛糖酸和生成的2-酮-3-脱氧醛糖酸用高速液体柱层析法(层析柱：ShodexAsahipakNH2P--50 4E(昭和电工制)、层析柱温：40℃、移动相：50mM磷酸二氢钠、流速：1ml/min、检出：210nm)定量。

[实施例1]木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株的培养

在由10g/l的D-葡萄糖酸钠、5g/l的酵母膏、5g/l的多聚蛋白胨、3g/l的氯化钠及0.2g/l的七水硫酸镁组成的液体培养基(调整pH值至7.0)中接种事先在肉汤培养基中培养好的木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌体，在30℃下进行20小时通气搅拌培养，通过离心分离回收菌体，获得具有葡萄糖酸脱水酶活性的菌体。

[实施例2]通过木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株进行2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的合成

将由实施例1中所示方法获得的木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株的湿菌体120g放入50mM Tris缓冲液(pH7.0、含1mM的D-葡萄糖酸钠及1mM的氯化镁)200ml中，悬浊后用超音波菌体破碎机将菌体破碎，获得粗酶液。将120.0g D-葡萄糖酸钠和1mmole的氯化镁溶解于600ml水中，然后将粗酶液加入到此水溶液中，用6M氢氧化钠调整pH值至8.5，在50℃下进行反应。在反应过程中通过适量添加2M氢氧化钠溶液体调整反应液的pH值在8.5。反应40小时后，反应液中已无D-葡萄糖酸残留，生成95g的2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。

反应结束后，通过离心分离从反应液中除去菌体由来的固形物，用超高倍过滤膜(バイオマツクス-10、ミリポア製)过滤上清液。将滤液通过使用ダウエツクス1×8(200-400目、OH型、ダウ·ケミカル製)的离子交换柱，用50mM的盐酸溶出。收集溶出画分，减压浓缩后用氢氧化钾中和。获得含有73.8g 2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸钾水溶液溶346.7g。

[实施例3]木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株由来的葡萄糖酸脱水酶的精制及N末端氨基酸序列的决定

将由实施例1中所示方法获得的菌体放入添加1mM D-葡萄糖酸钠及1mM氯化镁的50mM Tris缓冲液(pH7.0，以下记作缓冲液)中悬浮，用超音波菌体破碎机将菌体破碎后，通过冷却离心机回收上清液，获得无细胞提取液。在无细胞提取液中加入硫酸链霉素，使其浓度达到1％，搅拌30分钟通过离心分离除去生成的沉淀，在离心后的上清液里添加硫酸铵，收集20至60％的饱和画分。将硫酸铵画分通过超高倍过滤膜(ミリポア製ウルトラフリ一15、分子量断点(カツト)为10万)脱盐浓缩后，使其通过DEAE-SephAroseFF层析柱，(アマルシヤムバイオサイエンス製)，用缓冲液和含有1M Nacl的缓冲液的直线浓度斜率使其溶出。回收活性画分，添加硫酸铵至浓度为1M后，使其通过Phenyl-SephArose HP层析柱(アマルシヤムバイオサイエンス製)，用含有1M硫酸铵的缓冲液和缓冲液的直线浓度斜率使其溶出。回收活性画分，使其通过Superose12HR层析柱(アマルシヤムバイオサイエンス製)，用添加了0.15M NaCl的缓冲液将其溶出。回收活性画分，添加硫酸铵至0.5M后，使其通过Phenyl-Seph Arose HP层析柱，用含有0.5M硫酸铵的缓冲液和缓冲液的直线浓度斜率使其溶出。回收活性画分，添加硫酸铵至0.5M后，使其通过Phenyl-Seph Arose HP柱，用含有0.5M硫酸氨的缓冲液和缓冲液的直线浓度斜率使其溶出。回收活性画分，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在大约60kDa的位置上确认有一个单一带。对这一活性画分用添加了1mM D-葡萄糖酸钠及1mM氯化镁的30mM Tris缓冲液(pH8.5)进行透析，置换缓冲液。将此酶液作为精制葡萄糖酸脱水酶溶液。精制总结表如表1所示。

针对这一大约是60k DA的蛋白质进行N末端氨基酸序列的分析时，如序列表的序列编号2所示决定成Thr-Asp-Thr-Pro-Arg-Lys-Leu-Arg-Ser-Gln-Lys-Trp-Phe-Asp-Asp。

表1葡萄糖酸脱水酶的精制

	总蛋白mg	总活性unit	比活性unit/mg	精制度	收率％
						无细胞提取液硫酸铵分画(20-60％sat.)DEAE Sepharose FF1st Phenyl Sepharose HPSuperose 12 HR2nd Phenyl Sepharose HP3rd Phenyl Sepharose HP	1322814.1165.56.92.91.31.3	284.8160.243.117.120.920.317.0	0.220.200.262.497.2315.513.6	10.91.211.332.970.563.3	10056.315.16.07.37.16.0

[实施例4]木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株由来的葡萄糖酸脱水酶的热稳定性

将在实施例3中所示方法获得的溶解在添加了1mM D-葡萄糖酸钠及1mM氯化镁的30mM Tris缓冲液(pH8.5)中的精制葡萄糖酸脱水酶溶液分别在4、20、30、40、50、55、60、65和70℃下放置30分钟、2小时和12小时。另外，在4℃下放置7日及30日。接着将含有这些经过热处理的酶溶液和1mmole Tris缓冲液(pH8.5)、40μmole D-葡萄糖酸钠、1μmole氯化镁的反应液1ml在37℃条件下反应。10分钟后通过添加200μl的1M的盐酸停止反应。反应停止后，用高速液相层析法定量2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的生成量，计算反应速度。热处理前酶活性为100时的相对活性值如表2所示。55℃下放置2小时后保持了100％的活性。另外在4℃下放置30天活性保持稳定。

表2葡萄糖酸脱水酶的热稳定性

[实施例5]木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株由来的葡萄糖酸脱水酶的内部氨基酸序列的决定

将由实施例3中所示方法获得的精制葡萄糖酸脱水酶溶液(相当于124μg的蛋白质)冻结干燥后溶解于含6M盐酸胍的0.5M Tris缓冲液(pH8.4)100μl中，在37℃下保温15分钟。在此溶液中添加含有0.2M二硫苏糖醇及6M盐酸胍的0.5M Tris缓冲液(pH8.4)10μl，60℃下保温1小时。接着在此溶液中添加含有0.4M碘乙酸及6M盐酸胍的0.5M Tris缓冲液(pH8.4)10μl，在37℃下保温15分钟。把所得的溶液通过事先用含8M尿素的0.5M碳酸氢胺溶液(pH7.8)平衡化的充填了Sepha dex G-50的快速层析柱(ロシユ·ダイアグノステイツクス製)脱盐，得到400μl的溶液。接着在此溶液中添加2mg/ml的V8蛋白酶(和光纯药制)溶液1μl，在30℃下反应23小时。反应液供给用Vy dac 214TP54 PRO TEIN C4层析柱(アジレント製)的逆相高速液相层析，通过0.1％三氟醋酸水溶液和含0.1％三氟醋酸的90％乙腈水溶液的浓度斜率，分离生成的肽，分取其中的一种肽。对分取的肽的N末端氨基酸序列进行分析，如序列表中序列编号3所示决定为Ala-Arg-Ala-Ile-VAl-Phe-Glu-Gly-Pro-Glu-Asp-Tyr-His-Ala-Arg。

[实施例6]决定木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株的葡萄糖酸脱水酶遗传密码DNA的取得

根据“基础生化学实验法2抽出·分离·精制阿南功一他著丸善株式会社出版”中记载的微生物基因组DNA的分离方法调制由实施例1中所示方法获得的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌体由来的基因组DNA。将此基因组DNA作为模板，以实施例3中决定的N末端氨基酸序列为基础合成的序列表序列编号4中记载的寡糖核苷酸链以及以实施例5中决定的内部氨基酸序列为基础合成的序列表序列编号5中记载的寡糖核苷酸链为引物进行多聚酶链式反应(PCR)，获得约1.2kb的DNA断片。用代表性的限制性内切酶消化基因组DNA，把PCR法获得的1.2kb的DNA断片进行标记制成探针，进行Southern hybridization实验的结果为基因组DNA在被限制性内切酶PstI完全消化的情况下在约4kb的断片上发现了阳性信号。为了按长度分画用限制性内切酶PstI完全消化基因组DNA而得到的DNA断片，进行浓度斜率超离心分离，回收主要含有4kb的DNA断片的画分。把此画分和经限制性内切酶PstI消化的5’末端脱磷酸化的载体pUC118用于DNA连接反应，做成质粒文库。通过这一质粒文库把大肠菌DH5α转化后的产物涂抹到添加了50μg/ml氨苄西林的LB(Luria-Bertani)寒天培养基上静置培养，使其生成菌落。使用上述的约1.2kb DNA断片标记后的探针进行菌落杂交实验，分离出显示阳性信号的菌落。从阳性菌落中回收质粒，进行得到的质粒的碱基序列的解析。碱基序列的解析时使用AppliedBiosystems公司的BigDye Teminator Cycle Sequencing kit，在同一公司制的Genetic Analyzer 310上进行。以质粒的碱基序列情报为基础设计了两种引物、序列表序列编号6和序列编号7中所记载的寡糖核苷酸链。序列表序列编号6中记载的引物中加入限制性内切酶HindIII的部位，序列表序列编号7中记载的引物中加入限制性内切酶XbaI的部位。以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR反应，扩增含有决定葡萄糖酸脱水酶遗传密码的DNA的领域。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取作为目的的移动度的移动带，用快速试剂(キアクイツク)(キアゲン製)从凝胶中抽出DNA。把这一提取物和经限制性内切酶HindIII及XbaI消化的5’末端脱磷酸化的载体pMW119用于DNA的连结反应，获得含有决定葡萄糖脱水酶遗传密码的DNA的质粒。

[实施例7]决定葡萄糖酸脱水酶遗传密码的DNA的碱基序列的决定

在研究调查由实施例6所获得的质粒的物理图谱时，辨明其为图1所示。进而进行了碱基序列的解析。碱基序列的决定时使用AppliedBiosystems公司的BigDye Teminator Cycle Sequencing kit，在同一公司产的Genetic Analyzer 310上进行。结果获得了如序列表序列编号1中所示的决定葡萄糖脱水酶遗传密码的DNA的全部碱基序列。将该葡萄糖酸脱水酶基因的碱基序列翻译成氨基酸，如序列表的序列编号1所示。其N末端的氨基酸序列与实施例3中所示的N末端氨基酸序列相一致。

[实施例8]使用通过含有木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由来的葡萄糖酸脱水酶基因的DNA而转化后的大肠菌合成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸

把用实施例7图1中所示的质粒进行转化后的大肠菌K 12W3110接种于添加了50μg/ml氨苄西林的LB液体培养液中，在37℃下振荡培养一晚。培养后通过离心分离回收菌体。将含有所获湿菌体0.3g、D-葡萄糖酸钠6.0g、氯化镁50μmole、Tris缓冲液(pH8.5)2.5mmole的反应液50.0g于50℃条件下进行反应。反应24小时后，反应液中无D-葡萄糖酸的残留，生成4.8g的2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。

[实施例9]使用通过含有木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由来的葡萄糖酸脱水酶基因的DNA而转化后的大肠菌合成2-酮-3-脱氧-D-半乳糖酸

把用实施例7图1中所示的质粒进行转化后的大肠菌K 12W3110接种于添加了50μg/ml氨苄西林的LB液体培养液中，在37℃下振荡培养一晚。培养后通过离心分离回收菌体。将含有所获湿菌体0.6g、D-半乳糖酸钠6.0g、氯化镁50μmole、Tris缓冲液(pH8.5)2.5mmole的反应液50.0g于50℃下进行反应。反应24小时后，反应液中无D-半乳糖酸的残留，生成4.5g2-酮-3-脱氧-D-半乳糖酸。

[实施例10]使用通过含有木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由来的葡萄糖酸脱水酶基因的DNA而转化后的大肠菌合成2-酮-3-脱氧-D-木糖酸

把用实施例7图1中所示的质粒进行转化后的大肠菌K12W3110接种于添加了50μg/ml氨苄西林的LB液体培养液中，在37℃下振荡培养一晚。培养后通过离心分离回收菌体。将含有所获湿菌体0.7g、D-木糖酸铵盐13.0g、氯化镁50μmole、Tris缓冲液(pH8.5)5.5mmole的反应液110.0g于50℃下进行反应。反应24小时后，反应液中无D-木糖酸的残留，生成9.9g 2-酮-3-脱氧-D-木糖酸。

[实施例11]使用通过含有木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由来的葡萄糖酸脱水酶基因的DNA而转化后的大肠菌合成2-酮-3-脱氧-L-阿拉伯糖酸

把用实施例7图1中所示的质粒进行转化后的大肠菌K12W3110接种于添加了50μg/ml氨苄西林的LB液体培养液中，在37℃下振荡培养一晚。培养后通过离心分离回收菌体。将含有所获湿菌体0.7g、L-阿拉伯酸钠1.0g、氯化镁10μmole、Tris缓冲液(pH8.5)500μmole的反应液10.0g于50℃下进行反应。反应24小时后，反应液中无L-阿拉伯糖酸的残留，生成0.7g2-酮-3-脱氧-L-阿拉伯糖酸。

[实施例12]使用葡萄糖酸钠作为醛糖酸合成2-脱氧核糖

把用实施例7图1中所示的质粒进行转化后的大肠菌K12W3110接种于添加了50μg/ml氨苄西林的LB液体培养液中，在37℃下振荡培养一晚。培养后通过离心分离回收菌体。将所获湿菌体3.3g加入到含有D-葡萄糖酸钠130g、氯化镁10μmole、用氢氧化钠调整pH至8.5的反应液400g中，在40℃下进行反应。反应24小时后，反应液中无D-葡萄糖酸的残留，生成106g 2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。

持续搅拌含有2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的反应液使其冷却至10℃，在注意气泡的同时缓缓加入硼氢化钠6.0g。硼氢化钠添加结束后在10℃下继续反应2小时。此反应液中生成100g 2-羟基-3-脱氧-D-葡萄糖酸。

用35％的盐酸把含有2-羟基-3-脱氧-D-葡萄糖酸的反应液的pH值调整到5.0。将反应温度调至35℃，同时用1小时的时间把13％的次氯酸钠水溶液377g滴入反应液中进行脱羧反应。此时用醋酸把反应液的pH值控制在5至6之间。次氯酸钠水溶液滴加完了后，当反应进行到1小时时反应液中生成69g 2-脱氧-D-核糖。从D-葡萄糖酸钠中获得的收率为86.3％。

[实施例13]使用葡萄糖酸钠作为醛糖酸合成2-脱氧-D-核糖内酯和2-脱氧-D-核糖酸钠的混合物

把用实施例7图1中所示的质粒进行转化后的大肠菌K12W3 110接种于添加了50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养一晚。培养后通过离心分离回收菌体。将所获湿菌体3.3g加入到含有D-葡萄糖酸钠130g、氯化镁10μmole、用氢氧化钠调整pH至8.5的反应液530g中，在40℃下进行反应。反应24小时后，反应液中无D-葡萄糖酸的残留，生成106g 2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。

用30％氢氧化钠水溶液把2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸水溶液的pH值调至9.0，然后用浓盐酸把pH值调至5.0，在水冷下一边用浓盐酸把pH值调至4.5～5.0一边用1小时的时间把次氯酸钠水溶液(12.2重量％)473g滴入到反应液中。反应结束后添加碳酸氢钠调整pH值至8.0，将所得反应液在50℃下减压浓缩后，在残渣中加入甲醇，除去无机盐的结晶回收滤液。重复此操作两次后，浓缩除去滤液溶媒，获得2-脱氧-D-核糖内酯和2-脱氧-D-核糖酸钠的混合物106g。用27g水溶解获得的2.7g混合物，通过阳离子交换树脂(アンバ一ライトIR120 plus)脱盐后，用12NHCL把pH调至0.9，室温下搅拌12小时。所得反应液减压浓缩后，通过硅胶凝胶层析柱(溶离液组成：氯仿/甲醇＝10/1～5/1)精制，定量获得2.0g 2-脱氧-D-核糖内酯浆液。

[实施例14]使用木糖酸钠作为醛糖酸合成3，4-二羟基丁烷酸钠

把用实施例7图1中所示的质粒进行转化后的大肠菌K12W3110接种于添加了50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养一晚。培养后通过离心分离回收菌体。将所获湿菌体0.5g加入到含有D-木糖酸钠13g、氯化镁10μmole、用氢氧化钠调整pH至8.5的反应液53g中，在40℃下进行反应。反应24小时后，反应液中无D-木糖酸的残留，生成9.8g 2-酮-3-脱氧-D-木糖酸。

用浓盐酸把2-酮-3-脱氧-D-木糖酸水溶液的pH值调至5.0，在水冷下一边用浓盐酸把pH值调至4.5～5.0一边用1小时的时间把次氯酸钠水溶液(12.2重量％)53g滴入到反应液中。反应结束后添加碳酸氢钠调整pH值至8.0，把所得反应液在50℃下减压浓缩。在残渣中加入甲醇，除去无机盐的结晶回收滤液。重复此操作两次后，浓缩除去滤液溶媒，获得9.4g 3，4-二羟基丁烷酸钠。

序列表

<110>三井化学株式会社

<120>D-葡萄糖酸脱水酶

<130>案卷参考号

<140>专利申请号

<141>专利申请日

<150>优先权号

<151>优先权日

<160>序列表中序列的个数

<210>1

<211>1782

<212>DNA

<213>木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)

<220>

<223>发明人：三宅仁基；八卷俊文；及川利洋

<220>

<221>名称/关键词

<222>1..1782

<223>/生物体＝″木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)″/菌株＝″ATCC9220″

<220>

<222>(1)..(1779)

<223>/基因＝″D-葡萄糖酸脱水酶(D-gluconic acid dehydratase)″/产物＝″D-葡萄糖酸脱水酶(D-gluconic acid dehydratase)″

<400>1

atg acc gac act ccc cgc aag ctg cgc agc cag aaa tgg ttc gac gat    48

Met Thr Asp Thr Pro Arg Lys Leu Arg Ser Gln Lys Trp Phe Asp Asp

1               5                   10                  15

ccc gcc cac gcc gac atg acg gcg atc tac gtc gag cgc tac ctg aac    96

Pro Ala His Ala Asp Met Thr Ala Ile Tyr Val Glu Arg Tyr Leu Asn

        20                  25                  30

tac ggc ctg acg cgc cag gaa ctg caa tcg ggc cgg ccc atc atc ggc    144

Tyr Gly Leu Thr Arg Gln Glu Leu Gln Ser Gly Arg Pro Ile Ile Gly

    35                  40                  45

atc gcc cag acc ggc agc gac ctg gcg ccc tgc aac cgc cac cac ctg    192

Ile Ala Gln Thr Gly Ser Asp Leu Ala Pro Cys Asn Arg His His Leu

   50                  55                  60

gcg ctg gcc gaa cgc atc aag gcc ggc atc cgc gac gcc ggc ggc atc    240

Ala Leu Ala Glu Arg Ile Lys Ala Gly Ile Arg Asp Ala Gly Gly Ile

65                  70                  75                  80

ccg atg gag ttc ccg gtg cat ccg ctg gcc gag cag ggc cgc cgc ccg    288

Pro Met Glu Phe Pro Val His Pro Leu Ala Glu Gln Gly Arg Arg Pro

                85                  90                  95

acc gcg gcg ctg gac cgc aac ctg gcc tac ctg ggc ctg gtg gag atc    336

Thr Ala Ala Leu Asp Arg Asn Leu Ala Tyr Leu Gly Leu Val Glu Ile

            100                 105                 110

ctg cac ggc tat ccg ctg gac ggc gtg gtg ctg acc acg ggc tgc gac    384

Leu His Gly Tyr Pro Leu Asp Gly Val Val Leu Thr Thr Gly Cys Asp

        115                 120                 125

aag acc acg ccc gcc tgc ctg atg gcg gcg gcc acc gtc gac att ccc    432

Lys Thr Thr Pro Ala Cys Leu Met Ala Ala Ala Thr Val Asp Ile Pro

130                 135                 140                 145

gcc atc gtg ctg tcc ggc ggc ccg atg ctg gac ggc tgg cat gac ggc    480

Ala Ile Val Leu Ser Gly Gly Pro Met Leu Asp Gly Trp His Asp Gly

                150                 155                 160

cag cgc gtc ggg tcc ggc acg gtc atc tgg cat gcc cgc aac ctg atg    528

Gln Arg Val Gly Ser Gly Thr Val Ile Trp His Ala Arg Asn Leu Met

            165                 170                 175

gcc gcg ggc aag ctg gac tac gaa ggc ttc atg acg ctg gcc acc gcc    576

Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Glu Gly Phe Met Thr Leu Ala Thr Ala

        180                 185                 190

tcc tcg ccc tcg atc ggc cac tgc aac acc atg ggc acg gcg ctg tcc    624

Ser Ser Pro Ser Ile Gly His Cys Asn Thr Met Gly Thr Ala Leu Ser

    195                 200                 205

atg aat tcg ctg gcc gag gcg ctg ggc atg tcg ctg ccc acc tgc gcc    672

Met Asn Ser Leu Ala Glu Ala Leu Gly Met Ser Leu Pro Thr Cys Ala

210                 215                 220                 225

agc atc ccc gcg ccc tac cgc gaa cgc ggg cag atg gcc tac gcc acc    720

Ser Ile Pro Ala Pro Tyr Arg Glu Arg Gly Gln Met Ala Tyr Ala Thr

                230                 235                 240

ggc ctg cgc atc tgc gac atg gtg cgc gag gac ctg cgc ccg tcc cgc    768

Gly Leu Arg Ile Cys Asp Met Val Arg Glu Asp Leu Arg Pro Ser Arg

            245                 250                 255

atc ctg acg cgc gag gcc ttc gaa aac gcc atc gtc gtg gcc tcg gcg    816

Ile Leu Thr Arg Glu Ala Phe Glu Asn Ala Ile Val Val Ala Ser Ala

        260                 265                 270

ctg ggc gcg tcc agc aac tgt ccg ccg cac ctg atc gcc atg gcg cgc    864

Leu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Pro Pro His Leu Ile Ala Met Ala Arg

    275                 280                 285

cat gcc ggc atc gac ctg agc ctg gac gac tgg cag cgg ctg ggc gaa    912

His Ala Gly Ile Asp Leu Ser Leu Asp Asp Trp Gln Arg Leu Gly Glu

290                 295                 300                 305

gac gtg ccg ctg ctg gtg aac tgc gtg ccc gcc ggc gaa cac ctg ggc  960

Asp Val Pro Leu Leu Val Asn Cys Val Pro Ala Gly Glu His Leu Gly

                310                 315                 320

gag ggc ttc cac cgc gcc ggc ggc gtg ccg gcc gtg atg cac gaa ctg  1008

Glu Gly Phe His Arg Ala Gly Gly Val Pro Ala Val Met His Glu Leu

            325                 330                 335

ctg gcc gcc ggc cgc ctg cac gcc gac tgc gcc acc gtg tcc ggc aag  1056

Leu Ala Ala Gly Arg Leu His Ala Asp Cys Ala Thr Val Ser Gly Lys

        340                 345                 350

acc atc ggc gaa atc gcg gcc ggc gcc aag acc cac gac gcc gac gtc  1104

Thr Ile Gly Glu Ile Ala Ala Gly Ala Lys Thr His Asp Ala Asp Val

    355                 360                 365

atc cgc ggc tgc gac gcg ccg ctc aag cac cgc gcc ggc ttc atc gtg  1152

Ile Arg Gly Cys Asp Ala Pro Leu Lys His Arg Ala Gly Phe Ile Val

370                 375                 380                 385

ctg tcg ggc aat ttc ttc gac agc gcg gtc atc aag atg tcg gtg gtg  1200

Leu Ser Gly Asn Phe Phe Asp Ser Ala Val Ile Lys Met Ser Val Val

                390                 395                 400

ggc gag gcg ttc cgc cgc gcc tac ctg tcc gcg ccc ggc gac gag aat  1248

Gly Glu Ala Phe Arg Arg Ala Tyr Leu Ser Ala Pro Gly Asp Glu Asn

                405                 410                 415

gcc ttc gag gcc cgg gcc atc gtg ttc gaa gga ccg gag gac tac cac  1296

Ala Phe Glu Ala Arg Ala Ile Val Phe Glu Gly Pro Glu Asp Tyr His

            420                 425                 430

gcg cgc atc gaa gac ccg gcc ctg aac atc gac gaa cac tgc atc ctg  1344

Ala Arg Ile Glu Asp Pro Ala Leu Asn Ile Asp Glu His Cys Ile Leu

        435                 440                 445

gtc atc cgc ggc gcc ggc acg gtc ggc tat ccg ggc agc gcc gag gtc  1392

Val Ile Arg Gly Ala Gly Thr Val Gly Tyr Pro Gly Ser Ala Glu Val

450                 455                 460                 465

gtc aac atg gcg ccg cca tcg cac ctg atc aag cgc ggc atc gac tcg  1440

Val Asn Met Ala Pro Pro Ser His Leu Ile Lys Arg Gly Ile Asp Ser

                470                 475                 480

ctg ccc tgc ctg ggc gac ggc cgc cag agc ggc acc tcg gcc agt ccg  1488

Leu Pro Cys Leu Gly Asp Gly Arg Gln Ser Gly Thr Ser Ala Ser Pro

            485                 490                 495

tcg atc ctg aac atg tcg cca gaa gcc gcc gtg ggt ggc ggt ctg gcg  1536

Ser Ile Leu Asn Met Ser Pro Glu Ala Ala Val Gly Gly Gly Leu Ala

        500                 505                 510

ctg ctg cgc acc ggc gac cgc atc cgc gtc gac ctg aac cag cgc agc  1584

Leu Leu Arg Thr Gly Asp Arg Ile Arg Val Asp Leu Asn Gln Arg Ser

    515                 520                 525

gtc atc gcg ctg gtg gac gaa gcc gaa ctg gcg cgg cgg cgg cag gat  1632

Val Ile Ala Leu Val Asp Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Asp

530                 535                 540                 545

ccg ccc tac cag ccg ccg ccg gcc cag acg ccg tgg cag gag ctg tac  1680

Pro Pro Tyr Gln Pro Pro Pro Ala Gln Thr Pro Trp Gln Glu Leu Tyr

    550                 555                 560

cgg caa ctg gtc ggc cag ttg tca acc ggc ggc tgc ctg gaa ccc tcc  1728

Arg Gln Leu Val Gly Gln Leu Ser Thr Gly Gly Cys Leu Glu Pro Ser

565                 570                 575

acc ctg tac ctg aag gtg gtc gaa acg cgc ggt gat ccc cgg cat tcg  1776

Thr Leu Tyr Leu Lys Val Val Glu Thr Arg Gly Asp Pro Arg His Ser

                580                 585                 590

cae tga

1782

His

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)

<220>

<223>发明人：三宅仁基；八卷俊文；及川利洋

<220>

<223>由赖氨酸末端肽酶(lysil-end peptidase)分解的D-葡萄糖酸脱水酶片断的N末端氨基酸序列。

<400>2

Thr Asp Thr Pro Arg Lys Leu Arg Ser Gln Lys Trp Phe Asp Asp

1               5                   10                  15

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)

<220>

<223>发明人：三宅仁基；八卷俊文；及川利洋

<220>

<223>由赖氨酸末端肽酶(lysil-end peptidase)分解的D-葡萄糖酸脱水酶片断的N末端氨基酸序列。

<400>3

Ala Arg Ala Ile Val Phe Glu Gly Pro Glu Asp Tyr His Ala Arg

1               5                   10                  15

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>发明人：三宅仁基；八卷俊文；及川利洋

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸

<400>4

acngayacnc cgcggaaryt nmgnwsncar aartggttyg ayga

44

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>发明人：三宅仁基；八卷俊文；及川利洋

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸

<400>5

ctcgagcrtg rtartcytcn ggnccytcra anacdatngc

40

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>发明人：三宅仁基；八卷俊文；及川利洋

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸

<400>6

ccgaagctta cgaggcaccc

20

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>发明人：三宅仁基；八卷俊文；及川利洋

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸

<400>7

acgcatctag atcctctaca ttgcgggcgt

30

Claims (14)

1.葡萄糖酸脱水酶，其特征在于，具有使D-葡萄糖酸脱水生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的功能，在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的30mM tris缓冲液(pH8.5)中，于55℃、保持2小时的情况下，保持95％或其以上的活性。

2.如权利要求1所述的葡萄糖酸脱水酶，其源自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。

3.如权利要求1所述的葡萄糖酸脱水酶，其是用序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列表示。

4.如权利要求1所述的葡萄糖酸脱水酶，其是用显示出与序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列有70％或其以上同源性的氨基酸序列表示。

5.决定权利要求1至4中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。

6.决定用序列表的序列编号1中记载的碱基序列表示的权利要求1至3所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。

7.以在高严格条件下、与权利要求5或6所述的基因进行杂交的碱基序列表示的、决定权利要求1至4中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。

8.含有决定权利要求5至7中任意一项所述葡萄糖酸脱水酶遗传密码基因的质粒。

9.利用权利要求8所述的质粒使宿主细胞进行转化得到的转换细胞。

10.如权利要求9所述的转换细胞，其中，宿主细胞是大肠菌。

11.用权利要求1至4中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶、权利要求9或10所述的转换细胞，或它们的处理物中的任意一种，在水介质中，转换成与醛糖酸对应的2-酮-3-脱氧醛糖酸的方法。

12.2-脱氧醛糖酸的制造方法，其特征在于，由以下的工序组成，

(A)在醛糖酸类或醛糖酸盐中，使权利要求1至4任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶、或权利要求9或10所述的转换细胞、或它们的处理物的任意一种在水介质中发生作用，转换成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序；

(B)上述工序(A)中得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸在水介质中使氧化剂发生作用，进行脱羧反应，得到碳原子数减少1个的2-脱氧醛糖酸的工序。

13.2-脱氧醛糖的制造方法，其特征在于，由以下的工序组成，

A)在醛糖酸类或醛糖酸盐中，使权利要求1至4任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶、或权利要求9或10所述的转换细胞或它们的处理物的任意一种在水介质中发生作用，转换成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序；

B)上述工序(A)中得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸在水介质中使还原剂发生作用，得到2-羟基-3-脱氧醛糖酸的工序；

C)上述工序(B)中得到的2-羟基-3-脱氧醛糖酸在水介质中使氧化剂发生作用，进行脱羧反应，得到碳原子数减少1个的2-脱氧醛糖的工序。

14.权利要求11至13中任意一项所述的方法，其中，醛糖酸是D-葡萄糖酸、D-半乳糖酸、D-岩藻糖酸、D-木糖酸或L-阿拉伯糖酸的任何一种。