CN1498270A - 基因已被破坏的酵母 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酵母，其中特定的基因被单独破坏，并使其具有营养缺陷型，以通过基因重组，利用酵母的特点，构建生产具有工业实用性物质的体系。在本发明实施中，使用编码麦芽糖假丝酵母氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(EC6.3.2.6)的ADE1基因片段，与染色体DNA同源重组，构建ADE1基因被破坏的酵母菌株。在本发明实施中，将该破坏的菌株用含有可生物降解聚酯合成酶基因的基因表达盒转化，培养所获的转化体，从而生产可生物降解的聚酯。

Description

基因已被破坏的酵母

技术领域

本发明涉及在酵母中破坏(disrupte)特定染色体DNA的方法，该方法基于同源重组的原理。本发明还涉及使用所述已被破坏的(disrupted)菌株生产具有工业实用性的物质。

背景技术

基因重组技术的进步使得利用原核或真核生物大规模生产具有工业实用性的物质成为可能。在真核生物中，酵母，特别是属于糖酵母属(Saccharomyces)的酵母，已被长期应用于生产发酵食物产品，包括日本米酒(sake)和其它酒精饮料，还有麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)也曾被用作含微生物蛋白的食物或饲料。这样，就已证明了酵母本身的安全性。

酵母能够快速生长，并且与细菌相比，酵母通常能以更高的密度培养。另外，与细菌相比，酵母细胞可容易地从培养基中分离，所以，可以进一步简化产品的提取和纯化方法。鉴于这些特征，利用重组DNAs，酵母已被用作生产有用产品的宿主，并且其实用性也被证实。

在各种酵母中，假丝酵母属的酵母不象糖酵母属的酵母，当在有氧条件下培养时，不会形成乙醇，而且乙醇也不会抑制其生长，所以，通过连续地高密度培养可以有效地制备细胞从而有效地制备产品。另外，不产子囊孢子的酵母——麦芽糖假丝酵母的特征在于它能够利用并生长在C₆-C₄₀直链烃，脂肪和油上，如棕榈油和椰子油，每一种都可单独作为碳源。由于这个特点有益于转换疏水性化学物质生产有用物质以及将该酵母作为反应器进行应用，因此，都期待着能够将酵母应用于生产各种化合物(参见：Wolf K(编)：Nonconventional yeaste in Biotechnology.A Handbook，Springer-Verlag Berlin(1996)，411-580页)。另外，该特点还被期待通过基因重组麦芽糖假丝酵母从而用于生产有用物质，因此，已经积极地研究发展了一些基因表达系统用于该目的(Japanese Kokai Publication Sho-62-74287，Japanese Kokai Publication Sho-62-74288，Japanese Kokai PublicationHei-02-72822)。最近，公开了通过基因重组麦芽糖假丝酵母，可将其用于生产直链二羧酸(WO99/04014)。

当通过基因重组将酵母用作生产物质的宿主时，有必要获得具有选择性标记的突变体，如适当的营养缺陷特征，就象使用大肠杆菌(Escherichiacoli)等菌株那样。这种突变已通过用诱变剂，如亚硝基胍或甲基磺酸乙酯，随机突变而获得。尽管这种突变方法会产生营养缺陷型突变株，但是，具有转化到目的位点之外的一个或几个位点的突变体的可能性不可避免。与大肠杆菌等相比，这妨碍了酵母宿主的发展，可以将其视为阻碍将酵母应用为物质生产场所的原因。

例如，虽然麦芽糖假丝酵母的宿主-载体系统已发展了很长时间，并通过诱变处理已获得了很多营养缺陷型突变株，但是没有由这些酵母重组体生产的新型商业可利用的化学物质。原因是还没有获得任何的营养缺陷型菌株能够比得上野生型的增殖潜力以及对直链烃链的应用能力。通过对麦芽糖假丝酵母的诱变处理获得的CHA1菌株已被确认在ADE1基因和HIS5基因上带有突变(Kawai S等，Agric.Biol.Chem.，55：59-65(1991))，但是其增殖潜力与野生型相差甚远。认为这是因为在目的位点之外的另一位点或另外几个位点也存在突变。

随机突变所获突变株的另一问题是突变位点的自发回复现象。这种情况下，回复体优选在培养期间生长，因此，重组体的物质产率会降低。另外，如果这个回复体泄漏到环境中，其生存和生长可能性很高，很可能引发安全标准方面的问题。因此，将通过随机突变所获的酵母菌株作为物质生产体是不完善的。这样，就渴望获得一种特定营养缺陷基因被单独破坏的破坏菌株。

如上所述，已经获得了在ADE1基因，磷酸组氨醇氨基转移酶(HIS5基因)，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(URA3基因)等基因中突变产生的许多麦芽糖假丝酵母突变体(参见，Wolf K(编)：Nonconvertional Yeast in Biotechnology411-580页)。但是，还未获得任何带有单独破坏的特定基因和营养缺陷型的麦芽糖假丝酵母菌株。利用酵母的特点，通过基因重组技术构建系统用于生产具有工业实用性的物质，这种基因破坏的菌株是我们期望的。这种基因破坏的菌株不仅是麦芽糖假丝酵母，还可以是我们期望的其它酵母种。

另外，还期望利用麦芽糖假丝酵母的特点在其中生产具有工业实用性的物质，所述特点也就是其利用并生长于直链烃，和脂肪/油，例如棕榈油和椰子油的能力，每一种都可单独作为碳源。

发明内容

本发明做了大量研究，试图解决前面讨论的问题，通过充分利用基因重组技术，在染色体DNA同源重组的原理基础上，利用编码氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamidesynthase)(EC6.3.2.6)的DNA(ADE1基因)片段，获得了ADE1基因破坏的酵母，并成功地获得了必需腺嘌呤的酵母。该基因破坏酵母的增殖潜力和基因表达能力与诱变处理麦芽糖假丝酵母所获的ADE1基因突变体CHA1的比较结果，证明了基因破坏的菌株两种能力都高于CHA1菌株。这个以及其它发现引导完成了本发明。

由此，本发明涉及

一种酵母，其中染色体DNA中的ADE1基因已通过与ADE1 DNA片段同源重组而被破坏。本发明还涉及

ADE1基因破坏的酵母转化体，

该转化体被含有同源或异源基因的DNA序列转化。

另外，本发明涉及

产生基因表达产物的方法，

其包括，培养ADE1基因破坏的酵母的转化体，并从所获的培养物中回收同源或异源基因表达产物。更具体地，本发明提供一种利用转化菌株用于生产工业实用性物质的方法，所述转化体是通过将同源或异源基因表达系统转化到ADE1基因破坏的麦芽糖假丝酵母菌株中而获得。这里，由3-羟丁酸(3-hydroxybutyrate)(下文简写为“3HB”)和3-羟己酸(3-hydroxyhexanoate)(下文简写为“3HH”)形成的两组份共聚聚酯(下文简写为“P(3HB-co-3HH)”)用作生物可降解聚酯，聚酯聚合酶和烯酰基-CoA水合酶是该聚酯合成反应中所用的酶。本发明者利用将这些聚酯聚合酶基因和烯酰基-CoA水合酶基因的转化表达系统转化到本发明的ADE1基因破坏的麦芽糖假丝酵母菌株中，从而成功地生产了P(3HB-co-3HH)，这说明应用ADE1基因破坏的麦芽糖假丝酵母的实用性。这样，本发明还涉及利用ADE1基因破坏的菌株的转化株生产聚酯的方法，其中包括收集培养转化体所获培养物中的聚酯。

具体实施方式

现在详细描述本发明。

通过同源重组用于ADE1基因破坏的酵母没有特殊限制，可使用保藏在微生物保藏处(如IFO，ATCC等)的酵母，其属于以下属：Aciculoconidium，Ambrosiozyma，Arthroascus，Arxiozyma，Ashbya，Babjevia，Bensingtonia，Botryoascus，Botryozyma，酒香酵母属(Brettanomyces)，布氏弹孢酵母属(Bullera)，Bulleromyces，假丝酵母属(Candida)，固囊酵母属(Citeromyces)，Clavispora，隐球酵母属(Cryptococcus)，Cystofilobasidium，德巴利氏酵母属(Debaryomyces)，德克酵母属(Dekkara)，Dipodascopsis，双足囊菌属(Dipodascus)，Eeniella，Endomycopsella，丝囊霉属(Eremascus)，假囊酵母属(Eremothecium)，Erythrobasidium，Fellomyces，Filobasidium，Galactomyces，地霉(Geotrichum)，小季氏酵母属(Guilliermondella)，有孢汉逊氏酵母属(Hanseniaspora)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，Hasegawaea，胶珊瑚属(Holtermannia)，Hormoascus，Hyphopichia，Issatchenkia，克勒克氏酵母属(Kloeckera)，克勒克氏孢属(Kloeckeraspora)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，Kondoa，Kuraishia，Kurtzmanomyces，白冬孢酵母属(Leucosporidium)，油脂酵母属(Lipomyces)，洛德酵母属(Lodderomyces)，鳞斑霉属(Malassezia)，梅奇酵母属(Metschnikowia)，Mrakia，Myxozyma，拿逊酵母属(Nadsonia)，Nakazawaea，针孢酵母属(Nematospora)， Ogataea，卵孢酵母属(Oosporidium)，管囊酵母属，achysolen)，Phachytichospora，Phaffia，毕赤酵母属，(Pichia)，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，红酵母属(Rhodotorula)，糖酵母属(Saccharomyces)，类糖酵母属(Saccharomycodes)，复膜孢糖酵母属(Saccharomycopsis)，Saitoella，Sakaguchia，Saturnospora，裂芽酵母属(Schizoblastosporion)，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)，许旺氏酵母属(Schwanniomyces)，锁掷酵母属(Sporidiobolus)，掷孢酵母属(Sporobolomyces)，Sporopachydermia，Stephanoascus，梗孢酵母属(Sterigmatomyces)，Sterigmatosporidium，Symbiotaphrina，Sympodiomyces，Sympodiomycopsis，有孢圆酵母属(Torulaspora)，Trichosporiella，丝孢酵母属(Trichosporon)，三角酵母属(Trigonopsis)，Tsuchiyaea，Udeniomyces，Waltomyces，威克酵母属(Wickerhamia)，拟威克酵母属(Wickerhamiella)，Williopsis，Yamadazyma，Yarrowia，Zygoascus，接合糖酵母属(Zygosaccharomyces)，Zygowilliopsis，和Zygozyma等。

在这些酵母中，假丝酵母属，Yarrowia，克鲁维氏酵母属，有孢汉逊氏酵母，汉逊氏酵母属等，鉴于其持续高密度培养下的高效细胞生产和物质生产能力而优选这些酵母。特别优选假丝酵母属，鉴于其宿主-载体系统的先进研究，因此这种系统可轻松获得，以及其利用直链烃，脂肪和油等等的较高能力。

根据本发明进行的ADE1基因破坏的菌株构建及其利用中，麦芽糖假丝酵母作为一个实例。

实施本发明所用的野生型麦芽糖假丝酵母菌株IAM12247可从theInstitute of Applied Microbiology，University of Tokyo或the American TypeCulture Colletion(Manassas，VA，USA)获得，登记号ATCC 28140。麦芽糖假丝酵母CHA1菌株，腺嘌呤和组氨酸-需要型标记突变体，可从上述保藏机构获得，登记号ATCC 90625。

本发明所获的ADE1基因破坏的麦芽糖假丝酵母AC16菌株已根据布达佩斯条约，于2000年11月15日保藏在日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology International Patent Organism Depositary，Central6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏号FERM BP-7366。

同源重组指两个DNA碱基序列之间在它们具有类似序列或同源序列的区域所发生的重组。

基因破坏指使基因碱基序列突变或插入其它DNA，或者缺失基因的一部分使得基因不再发挥功能。基因破坏的结果就是该基因不能被转录成mRNA，继而该结构基因不被翻译，或转录产物mRNA变得不完整，因此突变或缺失发生在翻译产物结构蛋白的氨基酸序列中，使得该蛋白不能行使其原始功能。

ADE1基因指基因片段，所述基因片段含有：带有5′未翻译区的启动子区域，氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(EC6.3.2.6)编码区，和带有3′未翻译区的终止子区。麦芽糖假丝酵母ADE1基因基因的碱基序列已公布在GenBank：D00855。其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

ADE1 DNA片段指能够与染色体ADE1基因在微生物细胞内进行同源重组从而破坏ADE1基因的DNA。

ADE1酶指氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(EC6.3.2.6)。

术语“同源基因”指在宿主酵母染色体中存在的基因，或其部分DNA。术语“异源基因，，指本来并不存在于宿主酵母染色体中的基因，或其部分DNA。

基因表达盒指环状质粒，其含有转录启动子DNA序列，编码待表达基因的DNA，以及含有终止子用以终止转录的DNA，基因表达盒可包括能够于染色体之外行使功能的类型，以及待整合到染色体DNA上才能行使功能的类型。

至于基因表达产物，当基因表达的物质(基因表达的产物)是目的蛋白或酶时，该物质本身就是基因表达产物。与基因表达产物全然不同的物质，但是也产生在宿主细胞中，其显示出各种酶和辅酶不同的催化活性，也是基因表达的产物，这些物质也属于基因表达产物。

“PHA”是聚羟基烷羧酸酯(polyhydroxyalkanoate)的简写，表示由3-羟基烷羧酸(3-hydroxyalkanoic acid)共聚形成的可生物降解聚酯。

“ORF2”指根据来自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的聚酯聚合酶编码基因设计的DNA(Japanese Kokai Publication Hei-10-108682)，使得其能够在麦芽糖假丝酵母中表达。其碱基序列如SEQ ID NO：6所示。

“ORF3”指根据来自豚鼠气单胞菌的烯酰基-CoA编码基因设计的DNA(Japanese Kokai Publication Hei-10-108682)，使得其能够在麦芽糖假丝酵母中表达。其碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

下文中，描述了构建ADE1基因破坏的菌株的方法实例，使用该破坏的菌株生产聚酯的方法实例。

(1)构建ADE1基因被破坏菌株的方法

可使用任何方法用于基因被破坏菌株的构建，只要获得的该被破坏的菌株不能表达ADE1酶。已经报道了各种基因被破坏的方法，优选通过同源重组进行的基因破坏，因为特定的基因可单独被破坏(Nickoloff J.A.(编)Method in Molecular Biology，47：291-302(1995)，Humana Press Inc.Totowa，NJ)。在同源重组技术中，优选简单一步基因破坏技术，该技术仅含有一个将基因转化到酵母细胞中的过程，因为被破坏菌株所获得的重组菌株在处理过程中非常安全，不带有自发性回复。

一步基因破坏法中通常所用的ADE1 DNA片段是来自基因的DNA片段，所述基因通过部分基因内DNA消除和剩余两末端的重新连接而形成。这种DNA片段可通过如PCR(聚合酶链式反应)方法制备，或用限制性酶酶切载体，再重新连接。ADE1 DNA片段两个末端的同源区域长度足以使其包含至少10个碱基，优选不少于200个碱基，更优选不少于300个碱基。两末端中每个末端的同源性优选不少于90％，更优选不少于95％。

待消除的部分DNA是这样的部分：由于这种消除，ADE1基因不再表现有酶活性。该部分DNA的长度使得ADE1酶活性不能通过自发性回复而恢复其酶活性。这种部分DNA链的长度没有特殊限制，但优选不少于50个碱基，更优选不少于100个碱基。

在本发明的实施中，使用通过消除555bp ADE1酶的编码DNA片段并将630bp 5′侧DNA片段和400bp 3′侧DNA片段相连接而构建被破坏的DNA(图1)。被消除的部分相应于ADE1酶蛋白的大约80％。5′和3′侧DNA片段与原始ADE1基因具有100％的同源性。本发明实施中所用的破坏的DNA片段碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明实施中所用DNA片段是使用pUC119-ADE1制备(Kawai S.等，Agric.Biol.Chem.，55：59-65(1991))。这样，培养pUC119-ADE1质粒转化的大肠杆菌，并从中制备该质粒。用合适的限制性酶将ADE1基因的一部分结构基因(编码ADE1酶蛋白的基因)从质粒中切割出来，收集载体端并使用连接酶重新连接。这样就得到含有被破坏的DNA的载体。

将含有被破坏的DNA的载体转化到足够多的大肠杆菌菌株中，如JM109或DH5α，大量培养的述大肠杆菌菌株，氯化铯超速离心大规模制备高纯度的质粒(Sambrook等，(编)，Molecular cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，1.42-1.47，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。尽管该载体可直接用于基因的破坏，但期望用一步破坏法利用合适的限制性酶将含有ADE1区域的同源部分从纯化的载体中切除，以用作被破坏的DNA。在本发明实施中，用限制性酶SalI切割，并无需纯化，即可将DNA片段转化到酵母中，其中ADE1基因可被同源重组而破坏。

而原生质体方法，醋酸锂方法(Takagi M.等，J.Bacteriol，167；551-5(1986))，和电脉冲方法(Kasuske A等，Yeast，8：691-197(1992)是已知转化麦芽糖假丝酵母的方法，本发明应用电脉冲方法。可使用商业仪器用于产生电脉冲。本发明中使用BTX生产的ELECTRO CELL MANIPULATOR600(San Diego，CA，USA)。所用比色杯为BIO MEDICAL CORPORATIONCO.，LTD(Tokyo，Japan)生产的BM6200(2mm gap blue cap)。电脉冲后，用合适的培养基培养酵母，筛选所获的培养细胞中期望的ADE1被破坏菌株。

在转化体回收的各种方法中，可应用所谓的制霉菌素浓缩方法(Snow R.，Nature 211：206-207(1966))。该方法原本用于高效地筛选随机突变所产生的突变体，但是也认为该方法可用于基因被破坏的菌株。例如，在本发明的优选实施方案中，电脉冲后将培养的细胞转移到基本培养基中，例如进行培养。洗涤细胞，培养在不含氮源的基本培养基中，然后再在含氮源的基本培养基中培养一个较短的时期。直接向该培养基中加入制霉菌素，在30℃下进行有氧培养1小时，其中野生型被优先杀死。将细胞悬液涂布在适当的琼脂培养基平板上，在30℃培养约2天，生成红色菌落。

从生成的红色菌落中，可通过PCR方法或基因组southern杂交法(Sambrook等，(编)，Molecular cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，1.42-1.47，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))简易地证实基因被破坏的菌落。

如果使用PCR，当使用ADE1基因的两个末端作为引物时，可在琼脂糖凝胶电泳中检测到野生型菌株的正常大小DNA带，而被破坏菌株检测到的是由于缺失序列形成的一条较短的带。在本发明实施中，可检测到约1kbpDNA的带。当染色体DNA，例如在基因被破坏中带有基因取代或整合时，应该考虑到该基因可能会被插入到预期位点之外的一个或几个位点中，例如插入到一个未知的、高度同源的一个或几个位点中。这种情况下，PCR方法也许无法进行证实。当获得了大量被破坏菌株时，PCR方法可作为选择候选(candidate)的理想手段。

为鉴定被破坏的菌株等，必须进行基因组southern分析。通过实施该方法，可以简易并确定地证明：仅仅在预期位点发生了基因重组。制备被破坏的菌株染色体DNA和作为对照的野生型菌株染色体DNA，用适当的限制性酶切割后，进行琼脂糖凝胶电泳。在本发明的实施中，使用两种限制性酶通过三种切割方法进行鉴定。将DNA从琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上，用限制性酶HpaI和NdeI切割ADE1基因后获得264bp的DNA片段，认为其仍然存在于被破坏的菌株的基因组中，用GeneImage标记/检测试剂盒(Amersham制造)对该片段进行酶标记，然后按照内附手册所述进行操作，标记产物用作souther杂交的检测探针(SEQ ID NO：5)。杂交后，洗涤尼龙膜，用内附手册所述的荧光激发剂检测DNA带。检测出的条带与野生型的相比较(IAM 12247)。结果显示，三种切割方法确定了两种菌株，ADE1基因被缩短了约有550bp的部分。

所获的ADE1基因被破坏的菌株不能合成ADE1酶，从而不能合成腺嘌呤，而腺嘌呤正是ATP的前体。因此，这些菌株不能在不含腺嘌呤的培养基或不含腺嘌呤的环境中生长。

ADE1基因被破坏的菌株中的一个菌株被称为麦芽糖假丝酵母AC16。

(2)使用ADE1基因被破坏的菌株表达异源基因：聚酯的生产方法

可使用本发明的ADE1被破坏的基因表达同源基因或异源基因。由于酵母可以向培养基中分泌糖链修饰(sugar chain-added)的蛋白，而大肠杆菌则不能，所以可利用ADE1被破坏的菌株生产这种蛋白。

能够转化的同源基因没有特殊限制，但一个具有工业实用性产物生产的实例为二羧酸产物，其通过将来自麦芽糖假丝酵母的P450酶基因转化到相同的酵母菌株中而获得，如WO99/04014所述。异源基因没有特殊限制，例如转化脂酶基因，淀粉酶基因等等生产这类蛋白。

公知一些假丝酵母属的酵母，如本发明所用的麦芽糖假丝酵母，其中的密码子的翻译不同于其它生物体从mRNA到蛋白的翻译过程。在麦芽糖假丝酵母中，亮氨酸密码子CTG被翻译成丝氨酸(Ohama T等，Nucleic AcidRes.，21：4039-4045(1993))，因此，来自大肠杆菌的lacZ基因不会翻译成活性-半乳糖苷酶(Sugiyama H等，Yeast，11：43-52(1995))。这样，当期望表达异源基因时，并不总能保证该基因会在麦芽糖假丝酵母中翻译成功能性蛋白。因此，当麦芽糖假丝酵母作为宿主表达异源基因时，原则上必须单独转换亮氨酸密码子。但是，为得到更有效的表达，也可根据麦芽糖假丝酵母密码子的使用来修饰其它的氨基酸密码子。例如可参照Mauersberger S等，(作者)，Candida Maltosa，in Wolf K(编)，Nonconventional Yeasts inBiotechnology.524-527页，进行密码子转换。

聚酯合成相关基因可以是与下述通式聚酯的合成相关的任何基因。下述通式代表聚酯P(3HB-co-3HH)的结构通式，X和Y代表整数，分别表示聚酯合成中3HB和3HH单位的数目。

例如，可使用Japanese Kokai Publication Hei-10-108682所述的聚酯聚合酶基因片段。除该聚酯聚合酶基因外，其它与聚酯合成相关的任何基因都可被进一步转化。这样的基因可以是，如(R)型特异性烯酰基-CoA水合酶基因，用以将β氧化途径中间体烯酰基-CoA转换为(R)-3-羟酰-CoA(FukuiT等，FEMS Microbiology Letters，170：69-75(1999)；Japanese KokaiPublication Hei-10-108682)。这些基因可含有一个或多个突变，如在其碱基序列中的缺失，取代和插入，只要该表达产物具有实质的酶活性。但如果是异源基因的话，如上所述，无法保证这些基因总会在麦芽糖假丝酵母中被翻译成能发挥功能的蛋白，因此有必要修饰氨基酸密码子。

在本发明实施中，使用了来自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的聚酯聚合酶和烯酰基CoA水合酶(Japanese Kokai Publication Hei-10-108682；Fukui T.等，FEMS Microbiology Letters，170：69-75(1999))。但是，由于这些酶基因极有可能未被正常翻译，因此可能不显示酶活性，要将这两种酶的一些氨基酸密码子修饰成在麦芽糖假丝酵母中最适的密码子，并全部合成两种DNA。来自麦芽糖假丝酵母聚酯聚合酶和烯酰基-CoA水合酶的DNA整个合成序列分别如序列表中SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。但是，这些序列标示符号码表示的碱基序列没有任何限制性含义。可使用任何其它的碱基序列，只要这些酶的氨基酸序列能够在麦芽糖假丝酵母中表达。

在酵母中使用的基因表达盒可如下构建：将启动子和5′上游激活序列(UAS)的DNA序列在5′上游侧与目的基因连接，并将poly(A)添加信号和终止子DNA序列在3′下游侧与该基因连接。这些DNA序列可以是任何序列，只要它们在目的酵母中具有功能。

启动子包括组成型表达类型启动子和诱导型启动子。可使用任一类型，但理想的启动子来自与宿主相同的麦芽糖假丝酵母。在一个实施例中，使用麦芽糖假丝酵母ALK1启动子和ALK1终止子(Gen Bank D00481)(TakagiM等，Agric.Biol.Chem.，5：2217-2226(1989))。

本发明中用于转化的基因表达盒可按如下构建：用于构建的载体可以是任何能够在大肠杆菌中自主复制的质粒。还可以具有能够在酵母中自主复制的区域。已知能够在酵母中自主复制的载体仍保留在酵母细胞中。还可以将基因表达盒整合到染色体中。例如，可使用能在麦芽糖假丝酵母中自主复制的pUTU1(M.Ohkuma等，J.Biol.Chem.273卷，3948-3953(1998))。

在本发明实施中，麦芽糖假丝酵母ALK1基因启动子ALK1p(SEQ IDNO：8)与ORF2和ORF3中之一在其5′上游侧连接，而终止子ALK1t(SEQ IDNO：9)则在3′下游侧与其连接。

连接启动子、终止子和结构基因的限制性酶切位点可使用PCR方法制备。适用于PCR的引物序列如SEQ ID NO：10到SEQ ID NO：13所示。可在任何条件下实施PCR，只要目的基因片段可以扩增即可。

至于启动子部分，具有5′-末端PvuII位点和3′末端EcoRI位点的ALK1p可使用SEQ ID NO：8所示模板和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示引物构建。而终止子部分，具有5′-末端HindIII位点和3′末端EcoRV位点的ALK1t可使用SEQ ID NO：9所示模板和SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13所示引物构建。通过将标记基因尿嘧啶改为腺嘌呤，可使用衍生自pUTU1和麦芽糖假丝酵母Ade1基因的载体pUTA1作为载体。当ALK1p与PUCNT(WO94/03613所述)在其PvuII-EcoRI位点连接并且ALK1t在HindIII-SspI位点与PUCNT连接时，即可构建pUAL1。然后，将ORF2与PUAL1在其NdeI-PstI位点连接，构建得到pUAL-ORF2。另外，ORF3与构建pUAL1过程中构建的pUCNT-ALK1t在NdeI-HindIII位点连接，再进一步连接ALK1p，这样构建得到pUAL-ORF3。

然后，使用EcoT22I将ORF2和上游启动子及下游终止子从pUAL-ORF2质粒中切除，并与pUTA1在PstI位点连接，构建得到pUTA-ORF2。另外，使用SalI将ORF3和上游启动子及下游终止子从PUAL-ORF3切除，并与PUTA-ORF2在SalI位点连接，构建得到PUTA-ORF23(上图2)。通过这种方式，可构建在麦芽糖假丝酵母中生产聚酯的基因表达盒。

使用上述的转化方法用该基因表达盒转化本发明的酵母菌株，就产生了具有pUTA-ORF23的麦芽糖假丝酵母AC16(ORF23)菌株。

培养用参与聚酯合成的基因表达盒进行转化的酵母，可以下述方式生产聚酯。培养中所用碳源可以是任何酵母可利用的碳源。当启动子是诱导型时，可适时地加入诱导剂。有些情况下，有些诱导剂可作为主要的碳源。至于除了碳源的其它营养源，可使用进一步含有氮源的培养基，无机盐和其它有机营养源。培养温度可以是任何酵母能够生长的温度。但是优选20-40℃。培养时间没有特殊限制但是约为1-7天。此后，可从所获细胞或培养物中收集聚酯。

碳源包括碳水化合物，脂肪和油，脂肪酸等。碳水化合物包括葡萄糖，蔗糖，甘油，n-烷等，脂肪和油包括，如油菜籽油，椰子油，棕榈油，棕榈仁油等。脂肪酸包括饱和及不饱和脂肪酸，如己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，油酸，棕榈酸，亚油酸，亚麻酸和豆蔻酸，以及脂肪酸衍生物，如酯和这种脂肪酸的盐。在实施例中，可使用脂肪或油作为碳源来培养麦芽糖假丝酵母。当使用不能被利用的或利用效率极低的脂肪和油时，可向培养基中加入脂肪酶改进利用能力。还可通过转化脂肪酶基因提供带有可利用脂肪和油能力的酵母。

至于氮源，可使用氨，铵盐，如氯化铵，硫酸铵和磷酸铵，还可使用蛋白栋，肉汁提取物，酵母提取物等。

无机盐包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸镁，硫酸镁，氯化钠等。

其它有机营养源可以是，例如氨基酸，如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，脯氨酸等，以及维生素，如维生素B1，维生素B12，生物素，烟酰胺，泛酸，维生素C等。

诱导剂可以是，例如与脂肪酸代谢相关的、并且可被脂肪和油或者其降解产物(即脂肪酸)诱导的酶(Alk1，Alk2，Alk3，Alk4，Alk5等)(Ohkuma M等，J.Biol.Chem.，273：3948-3953(1998))。

已经报道了许多方法从酵母细胞中收集聚酯。在本发明中，可使用下述的方法。培养完毕后，通过离心培养基等方法分离并收集细胞，再例如用蒸馏水和甲醇洗涤细胞，干燥。利用有机溶剂如氯仿，从干燥的细胞中提取聚酯。为去除细胞组份，过滤或其它方法处理含有聚酯的有机溶剂溶液，再向过滤液中加入不良溶剂，如甲醇或己烷，使聚酯沉淀。过滤或离心去除上清，再干燥收集到的聚酯沉淀。这样可收集聚酯。

可通过例如气相层析法，核磁共振光谱测定法等分析所获的聚酯。

附图说明

图1显示pUC119-ADE1以及构建ADE1被破坏的DNA方法的图。

图2显示来自豚鼠气单胞菌的聚酯聚合酶和烯酰基CoA水合酶表达盒，pUTA-ORF23(图2，上)，以及不含这两种酶表达基因的对照盒pUTA1(图2，下)。

图3显示PCR方法初次筛选ADE1基因被破坏的菌株的结果。认为C16和C17是被破坏的菌株。

图4显示基因组southern杂交法证实ADE1基因被破坏。在C16和C17中，发现该基因被正常破坏。

图5显示在ADE1基因破坏的麦芽糖假丝酵母染色体中破坏的ADE1基因临近区域的限制性酶切图谱，按照southern杂交所示。

图6显示ADE1基因破坏的菌株AC16在YPD培养基中的生长曲线。

图7显示分别利用棕榈油，椰子油和十四烷作为碳源，所获的ADE1基因破坏的菌株AC16生长曲线。

图8显示AC16(ORF23)菌株所产生的聚酯P(3HB-co-3HH)的400MHz质子图表。聚酯每个质子的分配都用数字表示。

具体实施方式

下述实施例更具体地说明本发明。但是这些实施例并不意味着对本发明范围的限制。

除非另有说明，培养酵母所用试剂都是购自Wako Pure ChemicalIndusties的商品。

(培养基组份)

LB培养基：10g/L胰蛋白栋，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠。如果是LB平板，还需要加入16g/L的琼脂。

YPD培养基：10g/L酵母提取物，20g/L聚蛋白栋，20g/L葡萄糖。如果是YPD平板，还要加入20g/L琼脂，如果是含腺嘌呤的YPD培养基，还需要加入0.1g/L的腺嘌呤。

YM培养基：3g/L酵母提取物，3g/L麦芽提取物，5g/L Bacto-蛋白栋，10g/L葡萄糖。

SD培养基：6.7g/L不含氨基酸的酵母含氮碱基(YNB)，20g/L葡萄糖。如是含腺嘌呤的培养基，还需加入24mg/L腺嘌呤。如果是SD平板，还需加入20g/L琼脂。

M培养基：0.5g/L硫酸镁，0.1g/L氯化钠，0.4mg/L硫胺素，0.4mg/L吡哆醇，0.4mg/L泛酸钙，2mg/L肌醇，0.002mg/L生物素，0.05mg/L氯化铁，0.07mg/L硫酸锌，0.01mg/L硼酸，0.01mg/L硫酸铜，0.01mg碘化钾，87.5mg/L磷酸二氢钾，12.5mg/L磷酸氢二钾，0.1g/L氯化钙，20g/L葡萄糖。如果是含硫酸铵的M培养基，还需要加入1g/L硫酸铵。如果是含硫酸铵和腺嘌呤的M培养基，还需要向M培养基中加入1g/L硫酸铵和24mg/L腺嘌呤。

聚酯生产培养基：6.7g/L YNB，10g/L酪蛋白氨基酸，用20g/L n-链烷或脂肪/油补充，作为碳源。

使用50ml的检测试管，500ml Sakaguchi烧瓶或2L Sakaguchi烧瓶进行酵母细胞的液体培养。如果使用50ml试管培养，则以300rpm进行摇床培养，如果是500ml Sakaguchi烧瓶(flask)，则以100-110rpm进行，2L Sakaguchi烧瓶为90-100rpm。在液体培养和平板培养中温度均为30℃。

(限制性酶处理)

在操作手册推荐的条件下，或根据Sambrook等(编)：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，second Editoin，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)所述方法的条件，进行限制性酶处理。

在本发明中，使用了许多商品试剂盒，除非另有说明，操作都按照内附手册所述进行。

(实施例1)构建被破坏的DNA

用MunI和HpaI，切割大肠杆菌中所用的、含ADE1基因的载体pUC119-ADE1(4.64kbp)(Kawai S等，Agric.Biol.Chem.，55：59-65(1991))，然后使用TAKARA平头(Bluting)试剂盒(Takara Shuzo制品)进行平头处理。处理后将DNA在1％的琼脂糖凝胶上电泳，将含有载体及ADE1两侧的片段(4.19kbp)与MunI/HpaI切割片段(约550bp)彼此分离。使用EASYTRAP(Takara Shuzo制品)，从琼脂糖凝胶中收集带有ADE1两个端点片段的载体，再用TAKARA连接试剂盒Ver2(Takara Shuzo制品)，连接ADE1的两个端点。将反应混合物以不高于5％的溶液比率加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，从而转化大肠杆菌。加入足量的LB培养基，经过1小时的摇床培养后，用细胞悬液涂布LB平板，37℃过夜培养。挑取形成的几个菌落，并以常规方式培养在LB培养基中，从培养细胞中提取质粒DNA。用限制性酶SalI酶切质粒，琼脂糖凝胶电泳证实了1.03kbp的条带。这样，获得了用于被破坏的目的载体。在LB培养基中大规模生产这种转化的大肠杆菌菌株，根据Molecular cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，1.42-1.47，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，通过氯化铯超速离心大量制备该载体。使用SalI酶切用于被破坏的ADE1 DNA，以进行一步破坏法。将DNA的总量控制在5mg/ml水溶液，酶切的DNA无需纯化，即可用于基因破坏。

(实施例2)基因破坏实验

将麦芽糖假丝酵母菌株IAM 12247接种在10ml YM培养基中，过夜预培养。然后将1ml预培养的培养基接种在100ml YM培养基中(500-mlSakaguchi烧瓶)，经过6小时培养后，离心收集细胞。将细胞悬浮在500ìl 1M山梨醇中，加入100μg被破坏的DNA，并轻轻搅拌混合物。

利用电脉冲方法进行转化。所用基因转化仪为BTX′s ELECTRO CELLMANIPULATOR 600。所用比色皿为BIO MEDICAL CORPORATION CO.LTD.生产的BM 6200。取100μl制备好的感受态细胞/DNA悬液，加入每个比色皿，将比色皿置于脉冲仪中。然后按下述条件应用电脉冲：静电容量40μF，阻力系数(resistance value)246ohm，电压1.9kV。脉冲后，向每个比色皿中加入1ml1M山梨醇，轻轻混合后，室温下放置1小时。然后，将混合物转移到100ml YM培养基，过夜培养。

(实施例3)筛选被破坏菌株

然后，将培养在YM培养基中的细胞接种到50ml不含硫酸铵的M培养基中(500-ml Sakaguchi烧瓶)，过夜培养。再将细胞悬浮在100ml含有硫酸铵的M培养基中，30℃培养6小时。向该培养基中加入3mg/ml的制霉菌素在乙醇中的溶液(Sigma制品)，使终浓度为10μg/ml，继续培养混合物1小时。用无菌水洗涤制霉菌素处理的细胞两次，再次悬浮在50ml无菌水中。用该细胞悬液涂布YPD平板。30℃下培养该平板2天，这样形成了24个红色的菌落。证实了这些菌株在SD培养基上均不能生长。

(实施例4)PCR分析

使用PCR方法，从大量红色菌落中初次筛选被破坏的菌株。将获得的红色菌落培养在YPD培养基中。使用染色体提取试剂盒Gentle-Kun(TakaraShuzo制品)，从每个培养物中提取染色体DNA。使用该染色体DNA和两个ADE1基因末端引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，进行PCR。使用Perkin Elmer Amplitaq试剂盒进行PCR。用Biometra′s TRIO-Thermoblock^TM影响基因扩增。进行30个循环：94℃1分钟，50℃1分钟，70℃3分钟。用野生型菌株扩增1.56kbp DNA，而用基因被破坏的菌株扩增缩短的1.0kbp DNA。将PCR反应混合物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，以检测1.0kbpDNA片段。结果显示，在24个菌株中，发现3个菌株的ADE1基因被缩短，因此认为该基因被破坏。三种菌株中两种的PCR模式(C16，C17)如图3所示。

(实施例5)染色体组southern杂交分析。

使用染色体提取试剂盒Gentle-Kun(Takara Shuzo制品)，提取染色体DNA。用三种方法，即，用DraI，DraI+NdeI，或NdeI对5μg所获的每个染色体DNA进行酶切，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。根据Molecular cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，9.31-9.57，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，将电泳条带转移到Hybond N+过滤膜(Amersham制品)上，过夜。southem杂交中所用的检测探针为HpaI-NdeI片段(264 bp)，该片段是ADE1基因内的序列，其使用GeneImage标记/检测试剂盒(Amersham制品)酶标记(SEQ ID NO：5)。杂交后，洗涤滤器，使用同一试剂盒内所附的荧光激发剂进行DNA条带检测。根据与野生型菌株IAM 12247所检测到的条带相对比，已证实，在两种菌株中(C16，C17)，ADE1基因中确实缩短了约550bp(图4)，即，染色体中ADE1基因已经被破坏。在图5中，显示southern杂交所揭示的：ADE1基因破坏的麦芽糖假丝酵母染色体中，破坏的ADE1基因临近区域的限制性图谱。“555 bp”指MunI和HpaI位点之间缺失的部分。“探针”指southern杂交中所用的部分DNA。当使用该探针时，证实了染色体DNA以下的碱基长度，如图4所示。在野生型IAM12247中，证实了向这些值中加上约550bp所获得的值。

这样获得的一个ADE1基因被破坏菌株被命名为麦芽糖假丝酵母AC16。

(实施例6)ADE1基因被破坏菌株的增殖能力实验

与野生型菌株IAM 12247和CHA1菌株比较基因被破坏菌株AC16在完全培养基(含腺嘌呤(100mg/L)和组氨酸(100mg/L)的YPD培养基)上的增殖能力。将每种酵母接种在10ml YPD培养基中，过夜培养后，以1％的接种量，将该培养物接种在10ml相同的培养基中。一定时间间隔内测定660nm下的OD值。结果显示，AC16菌株和野生型菌株的生长在15个小时内达到最终阶段，而AC16菌株的生长仅为野生型菌株的83％。另一方面，CHA1菌株的生长与AC16菌株的浓度类似；但是AC16菌株提前6小时达到该浓度(图6)。这样就说明AC16菌株在完全培养基中的增殖能力高于CHA1菌株。

(实施例7)ADE1基因被破坏菌株的脂肪/油利用能力实验

在基因被破坏菌株中，对比AC16菌株与野生型IAM 12247和CHA1菌株的油/脂肪利用能力。使用的脂肪/油为棕榈油，椰子油和十四烷，该烷是含有14个碳原子的n-烷。将每种酵母接种在50ml添加有2％油的YNB培养基中(500-ml Sakaguchi烧瓶)，过夜培养后，以10％的接种量，接种到相同体积的培养基中，一定时间间隔内测定660nm下的OD值。结果显示，该时间获得的AC16菌株比野生型菌株在棕榈油和椰子油中的增殖能力约低15％，而比CHA1菌株的油/脂肪利用能力约高4倍(32小时后6倍)。当利用十四烷时，CHA1显示出高于脂肪/油(棕榈油和椰子油)的利用能力，但其能力仅为野生型的55％，AC16菌株的80％。通过这种方式可见，ADE1被破坏菌株对油/脂肪和烷的利用能力高于CHA1菌株。碳源中的生长曲线分别如图7所示。

(实施例8)聚酯合成相关基因的合成

根据豚鼠气单胞菌的PHA聚合酶和(R)形特异性烯酰基-CoA水合酶的氨基酸序列设计聚酯合成相关的酶基因，所述水合酶能够将烯酰基-CoA转换为单体(R)-3-羟酰-CoA(Fukui T等，FEMS Microbiology Letters，第170卷，69-75页(1999))，其中的烯酰基-CoA是β氧化途径中的中间体。

在碱基序列的设计中，CTG不为亮氨酸密码子，因为麦芽糖假丝酵母中CTG并不被翻译成亮氨酸而是丝氨酸。这些麦芽糖假丝酵母偏爱(mostfrequency used)的密码子优选作为每个相应氨基酸的相应密码子。密码子频率的可参照Mauersberger S等(著)，Candida maltosa，in Wolf K(编)，Novconventional Yeasts in Biotechnology，524-527页。这样设计的序列ORF2和ORF3分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。DNA的合成完全是根据这些碱基序列进行。

(实施例9)构建用于聚酯合成的重组质粒

为使上面的ORF2和ORF3能够在麦芽糖假丝酵母中表达，决定将麦芽糖假丝酵母Alk1基因的启动子ALK1p(SEQ ID NO：8)连接到ORF2和ORF3之一的5′上游，并将麦芽糖假丝酵母Alk1基因的终止子ALK1t(SEQID NO：9)连接到3′下游。为制备启动子和终止子与结构基因相连接的限制性酶切位点，使用PCR方法。PCR的条件为，94℃1分钟，55℃2分钟，72℃ 3分钟，进行25个循环，使目的基因片段扩增。所用的聚合酶时TakaraShuzo′s ExTaq。至于启动子部分，使用SEQ ID NO：8的序列作为模板，以及进一步使用SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的序列，构建ALK1p，使其具有5′末端的PvuII位点和3′末端的EcoRI位点。使用SEQ ID NO：9的序列作为模板，以及进一步使用SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列，构建ALK1t的终止子部分，使其具有5′末端的HindIII位点和3′末端的EcoRV位点。最终与ORF2和ORF3连接用的载体为pUTA1载体(图2下)，其衍生自pUTU1(M.Ohkuma等，J.Biol.Chem.，第273卷，3948-3953页(1998))和麦芽糖假丝酵母的ADE1基因，以便将标记基因由尿嘧啶转换为腺嘌呤，所述pUTU1是通过将麦芽糖假丝酵母自主复制的序列(ARS)(Gen Bank D29758)和URA3基因(Gen Bank D12720)与pUC19相连而形成。pUTA1载体是使用XhoI，从pUTU1中去除URA3基因，再将其与SalI酶切的ADE1基因片段相连而形成。

将ALK1p与pUCNT(WO 94/03613所述)在PvuII-EcoRI位点相连，将ALK1t与pUCNT在HindIII-SspI位点相连，构建pUAL1。然后，将ORF2与pUAL1在NdeI-PstI位点相连，构建质粒pUAL-ORF2。另外，将ORF3与pUAL1构建过程中构建的pUCNT-ALK1t在NdeI-HindIII位点连接，构建pUAL-ORF3，再进一步连接ALK1p。

然后，使用EcoT22I将ORF2和上游启动子及下游终止子从质粒pUAL-ORF2中酶切除去，并与pUTA1在PstI位点连接，构建pUTA-ORF2。另外，使用SalI将ORF3和上游启动子及下游终止子从质粒pUAL-ORF3中酶切除去，并与pUTA-ORF2在SalI位点连接，构建质粒pUTA-ORF23(图2，上)。以上述方式，构建得到聚酯生产所用的麦芽糖假丝酵母基因表达盒。

(实施例10)转化细胞生产聚酯

为转化AC16菌株和CHA1菌株，将每种酵母都培养在YM培养基中，直到660nm下OD值达到0.8-1.0，离心收集细胞，将上述表达载体(pUTA-ORF23)转化到这些细胞中。在基因转化中，从感受态细胞的制备到基因转化均使用GENO TECH′S FastTrack^TM-Yeast Transformation_SM试剂盒进行。基因转化后用这些细胞涂布M培养基，培养2天。由于ADE1基因已经被插入到pUTA-ORF23中，可以合成腺嘌呤。所以，在不含腺嘌呤的培养基上生长的细胞是转化体。收集在不含腺嘌呤培养基上生长的细胞以得到转化株，AC16(ORF23)。以同样的方法，将pUTA-ORF23转化到CHA1菌株中获得转化株CHA1(ORF23)。另外，以同样的方法，使用不含聚酯合成酶的对照载体pUTA1转化AC16菌株和CHA1菌株，获得转化株AC16(CT)和CHA1(ORFCT)。

(实施例11)聚酯生产培养

所有的聚酯生产培养均使用2-L Sakaguchi烧瓶。首先，将100ìl含有各种重组菌株的甘油贮藏液接种到10ml SD培养基中，过夜培养。再将1ml这样培养的酵母接种到50ml含硫酸铵的M培养基(含100g/L硫酸铵)中，进行葡萄糖饥饿(starvation)。利用该培养基培养2天使得培养基中的葡萄糖完全耗尽。然后将10ml酵母接种到50ml聚酯生产培养基(500ml Sakaguchi烧瓶)中，培养8小时，然后将整个培养物转移到500ml相同的聚酯培养基中，进行生产培养120个小时。灭菌培养基，离心收集细胞，甲醇洗涤，然后冷冻干燥。研磨干燥的细胞，加入100ml氯仿，过夜搅拌该混合物，以提取聚酯。过滤回收氯仿溶液，并使用蒸发器浓缩到1-2ml，向浓缩物中加入10ml己烷，使不溶于己烷的物质沉淀。AC16(ORF23)菌株产生沉淀，而CHA1(ORF23)仅有痕量沉淀。AC16(CT)菌株没有任何沉淀。干燥AC16(ORF23)所获的己烷中的沉淀，然后进行400MHz质子NMR分析(JEOL，JNM-EX400)。NMR图表结果如图8所示。相应于聚酯P(3HB-co-3HH)每个质子的每个峰均由数字表示。分析显示3HH级分是9.7％，聚酯的产量是酵母干重的0.1％，在CHA1(ORF23)菌株中也可鉴定聚酯而产量至多0.05％。由此表明可使用本发明的ADE1基因被破坏的麦芽糖假丝酵母菌株生产聚酯P(3HB-co-3HH)。另外，还说明该被破坏菌株转化株的聚酯产率高于随机诱变获得的ADE1基因突变酵母CHA1。这样，就证实了本发明ADE1基因被破坏的酵母的应用。

工业实用性

本发明已说明ADE1基因被破坏的酵母菌株的应用。ADE1基因被破坏的麦芽糖假丝酵母菌株可预期在基因表达或基因表达产物的生产中用作基因重组的宿主酵母。可以使其进一步具有不同的营养缺陷型，这会发展得到作为重组体可安全使用的酵母。

                   序列表

<110>钟渊化学工业株式会社(KANEKA CORPORATION)

<120>基因已被破坏的酵母

<130>T648.PBT-3

<150>JP2001-011191

<151>2001-01-19

<160>13

<210>1

<211>1820

<212>DNA

<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)

<220>

<221>CDS

<222>538..1413

<223>Ade1

<400>1

gatccccttc ttcaaacctt taaatgacat tgtttcgttt ctctatgttt ggtatcggtt 60

cttcttcttc ttcaaaaaaa aggggggcac tattcaaaaa aaaatattat aacagtatga 120

tttttttccc tctcccgtcg attgaggttt tttttttctc tttcgtcttg gtcttttgct 180

tttcactcca aaaatggaaa cacgcgcggc tcaactcgaa atccgtgatc aaaaaaataa 240

aggctgtgag tttcgagcca ataattatga attagtggta ttttttttaa agataaataa 300

tcaagaatcg cattagggag acgaatatgc gttattcaaa taaaaagaca attcttttag 360

ggtagcattt cccttcaagt tcatcccaca tgtacattaa tgtcaatgat gtcgcagaag 420

ttaaattagc agaagaaaaa aaaaatgtga attactccga gtcaactctt ctttctcttc 480

ttctttttct tctttatcac cataatcacc accaccacca ccaccaccag ctcccagatg 540

acttcaacta acttagaagg aactttccca ttgattgcca aaggtaaagt cagagatatt 600

taccaagttg acgacaacac tcttttattc gttgctactg atagaatttc cgcatacgat 660

gtgattatgt ctaatggtat cccaaataaa ggtaaaatct taaccaaatt gtctgaattc 720

tggtttgatt tcttgccaat tgaaaaccat ttaatcaaag gagacatttt ccaaaaatat 780

cctcaactag aaccatatag aaaccaattg gaaggcagat ccttacttgt tagaaaattg 840

aaattgatcc ctcttgaagt tattgttaga ggttacatca ccggttccgg ctggaaagaa 900

taccaaaaat ctaaaaccgt ccacggtatt cctattggtg atgtggttga atcacaacaa 960

atcactccta tcttcacccc atccactaaa gcagaacaag gtgaacatga tgaaaatatc 1020

accaaagaac aagctgacaa gattgttgga aaagaattat gtgatagaat tgaaaaaatt 1080

gctattgatt tgtacaccaa agccagagat tacgctgcca ctaaaggaat tattatcgct 1140

gatactaaat ttgaatttgg tttagatggt gacaacatcg ttcttgttga cgaagtttta 1200

actccagatt cttccagatt ctggaatgct gctaaatacg aagttggtaa atctcaagac 1260

tcttacgata aacaattttt gagagattgg ttaacttcta atggtgttgc tggtaaagat 1320

ggtgttgcta tgcctgaaga cattgtcact gaaaccaaga gcaaatacgt tgaagcttac 1380

gaaaatttaa ctggtgacaa atggcaagaa taaattaagg atatctatta ttaaagcttt 1440

ctatttatcc caaactttcg tagtattttc tgacatgttc agatgttttt actttatctt 1500

tcctgaaatt tttgatttct aaccgactct tgcatgtagc tcttgataat gcaacatatg 1560

cttgaccatt agcaaaactt ctacctaaat ctattttgac tctgtccaaa gtttgacctt 1620

gagctttgtg gatcgacatc gcccacgaca agatcatttg gtttgttttt atggtgggtt 1680

attggcactt ggtgcaactg atggtttaac tttggaagag gctaagaaat tgaagacttg 1740

gaatgaagaa cgtgcatctg atttcaaatt gggtgaagaa ttgacttata cttgttataa 1800

aatgtatcat gatgttgatc 1820

<210>2

<211>1032

<212>DNA

<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)

<400>2

attataacag tatgattttt ttccctctcc cgtcgattga ggtttttttt ttctctttcg 60

tcttggtctt ttgcttttca ctccaaaaat ggaaacacgc gcggctcaac tcgaaatccg 120

tgatcaaaaa aataaaggct gtgagtttcg agccaataat tatgaattag tggtattttt 180

tttaaagata aataatcaag aatcgcatta gggagacgaa tatgcgttat tcaaataaaa 240

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atgatgtcgc agaagttaaa ttagcagaag aaaaaaaaaa tgtgaattac tccgagtcaa 360

ctcttctttc tcttcttctt tttcttcttt atcaccataa tcaccaccac caccaccacc 420

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aaagtcagag atatttacca agttgacgac aacactcttt tattcgttgc tactgataga 540

atttccgcat acgatgtgat tatgtctaat ggtatcccaa ataaaggtaa aatcttaacc 600

aaattgtctg aattctggtt tgatttcttg ccaattaact tctaatggtg ttgctggtaa 660

agatggtgtt gctatgcctg aagacattgt cactgaaacc aagagcaaat acgttgaagc 720

ttacgaaaat ttaactggtg acaaatggca agaataaatt aaggatatct attattaaag 780

ctttctattt atcccaaact ttcgtagtat tttctgacat gttcagatgt ttttacttta 840

tctttcctga aatttttgat ttctaaccga ctcttgcatg tagctcttga taatgcaaca 900

tatgcttgac cattagcaaa acttctacct aaatctattt tgactctgtc caaagtttga 960

ccttgagctt tgtggatcga catcgcccac gacaagatca tttggtttgt ttttatggtg 1020

ggttattggc ac 1032

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

taacagtatg atttttttcc ctct 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

aacaaaccaa atgatcttgt cgtg 24

<210>5

<211>264

<212>DNA

<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)

<220>

<221>CDS

<223>探针

<400>5

aacttctaat ggtgttgctg gtaaagatgg tgttgctatg cctgaagaca ttgtcactga 60

aaccaagagc aaatacgttg aagcttacga aaatttaact ggtgacaaat ggcaagaata 120

aattaaggat atctattatt aaagctttct atttatccca aactttcgta gtattttctg 180

acatgttcag atgtttttac tttatctttc ctgaaatttt tgatttctaa ccgactcttg 240

catgtagctc ttgataatgc aaca 264

<210>6

<211>1785

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>1..1785

<223>ORF2

<400>6

atg tct caa cca tct tat ggt cca ttg ttc gaa gct ttg gct cat tac 48

aat gat aaa ttg ttg gct atg gct aaa gct caa acc gaa aga act gct 96

caa gcc ttg ttg caa act aac ttg gat gat ttg ggt caa gtt ttg gaa 144

caa ggt tct caa caa cca tgg caa ttg att caa gct caa atg aat tgg 192

tgg caa gat caa tta aaa ttg atg caa cac act ttg tta aaa tct gct 240

ggt caa cca tct gaa cca gtt att act cca gaa aga tct gat aga aga 288

ttt aaa gct gaa gct tgg tct gaa caa cca att tat gat tac tta aaa 336

caa tcc tat ttg tta act gct aga cat ttg ttg gct tct gtt gat gct 384

ttg gaa ggt gtc cca caa aaa tct aga gaa aga ttg aga ttc ttt act 432

aga caa tac gtc aac gct atg gct cca tct aat ttc ttg gct act aac 480

cca gaa ttg tta aaa ttg act ttg gaa tcc gat ggt caa aat ttg gtt 528

aga ggt ttg gct tta ttg gct gaa gat ttg gaa aga tct gct gat caa 576

tta aac att aga ttg act gat gaa tcc gct ttt gaa tta ggt aga gat 624

ttg gct ttg act cca ggt aga gtt gtt caa aga act gaa tta tat gaa 672

tta att caa tac tct cca act act gaa acc gtt ggt aaa acc cca gtt 720

ttg atc gtt cca cca ttc att aat aaa tat tac att atg gat atg aga 768

cca caa aac tcc ttg gtc gct tgg ttg gtc gct caa ggt caa acc gtt 816

ttc atg att tcc tgg aga aac cca ggt gtt gct caa gct caa att gat 864

tta gat gat tat gtt gtt gat ggt gtc att gct gct ttg gat ggt gtt 912

gaa gcc gct act ggt gaa aga gaa gtt cac ggt att ggt tac tgt att 960

ggt ggt acc gct ttg tct tta gct atg ggt tgg ttg gcc gcc aga aga 1008

caa aaa caa aga gtt aga act gct act ttg ttt act act ttg ttg gat 1056

ttc tcc caa cca ggt gaa ttg ggt att ttt att cat gaa cca att atc 1104

gcc gcc tta gaa gcc caa aat gaa gct aaa ggt att atg gat ggt aga 1152

caa ttg gcc gtc tcc ttc tct ttg ttg aga gaa aac tct tta tat tgg 1200

aat tac tat att gat tct tac tta aaa ggt caa tct cca gtt gct ttt 1248

gat ttg ttg cac tgg aac tct gat tct act aat gtt gcc ggt aaa act 1296

cat aac tct ttg ttg aga aga tta tat ttg gaa aat caa ttg gtt aaa 1344

ggt gaa tta aaa att aga aac act aga att gat tta ggt aaa gtt aaa 1392

act cca gtt ttg ttg gtt tct gcc gtt gat gat cac att gct tta tgg 1440

caa ggt acc tgg caa ggt atg aaa ttg ttc ggt ggt gaa caa aga ttt 1488

tta ttg gcc gaa tcc ggt cat att gct ggt att att aat cca cca gct 1536

gct aac aaa tac ggt ttc tgg cac aat ggt gct gaa gct gaa tct cca 1584

gaa tct tgg ttg gct ggt gcc acc cat caa ggt ggt tcc tgg tgg cca 1632

gaa atg atg ggt ttt att caa aac aga gat gaa ggt tct gaa cca gtc 1680

cca gcc aga gtc cca gaa gaa ggt ttg gct cca gct cca ggt cac tat 1728

gtc aaa gtt aga tta aac cca gtt ttc gct tgt cca acc gaa gaa gat 1776

gct gct taa 1785

<210>7

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>1..404

<223>ORF3

<400>7

atg tct gct caa tcc ttg gaa gtt ggt caa aaa gct aga tta tct aaa 48

aga ttc ggt gcc gcc gaa gtt gct gct ttt gct gcc tta tct gaa gat 96

ttc aac cca ttg cac ttg gat cca gct ttt gct gct act acc gcc ttc 144

gaa aga cca atc gtc cat ggt atg ttg tta gct tct tta ttt tcc ggt 192

ttg ttg ggt caa caa ttg cca ggt aaa ggt tct att tat ttg ggt caa 240

tct tta tct ttc aaa ttg cca gtc ttt gtc ggt gat gaa gtt acc gct 288

gaa gtt gaa gtt act gct ttg aga gaa gat aaa cca att gct act ttg 336

act act aga att ttc act caa ggt ggt gct tta gct gtt acc ggt gaa 384

gct gtt gtc aaa ttg cca taa 405

<210>8

<211>1017

<212>DNA

<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)

<220>

<223>启动子ALK1p

<400>8

atgcatgaac aggatttaat cccaagaaaa aagtctattt tctattttca caaggaaact 60

ggaaaaacct ttttgtgttt tgaagtagct ccgtaataac ctgtaaaaaa ataaattttg 120

aagatttgac ttgctgatga aaatgctatc agtgtagctc tagacttgat actagactat 180

gatggcaaca catggtggtc aacgtgcaag acatcaccca atgagaagac tgctaaccag 240

aaaaaaaagg ggacaaaaga aaaactcgag agaaaaagtc aaattggtgt aaaattggct 300

atttttggta ctttcctaat ggggaaatta attgtttaaa attccagttt ttccagagtt 360

aagatttcga ccaattattt ttaatccata tgatcttcat cattatcaac ttgtgaaaaa 420

taataatcga ggtacgttta atacgagata ttagtctacg gctatgaatg ttggatatac 480

ttcattgacg atcagaagct tgattggtta ttcaggtgca tgtgtggata taaacccaac 540

aaattatcta gcaactgtgc cttccccaca ttggtcaaag aaaccctaaa gcaaattaaa 600

atctggataa ataaatcatt catttcacat tttccggtta gtataaggtt ttttaaattt 660

ttttttacag tttagccctt tcaattacca aatacggtaa caatgtgctt tgtaacatgc 720

aggggatttt ctccgttgct gttttctcca catgctttta atgtgtaata aattaaaaaa 780

attacaaaga aaaaccggca tataagcatc ggagtttaca ttgttaacta actgcaaaat 840

ggcgatgttt caaatcaaca aaatttaaaa aaaccccaaa aaaaaagtat catataaatt 900

aaactcaaaa tccttttgat tgcataaaat ttttaaatct cttctttttt ttctttttta 960

ctttcttatc tattctattc tttttttata tatctaattc atttataaca tctggtc 1017

<210>9

<211>218

<212>DNA

<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)

<220>

<223>终止子ALK1t

<400>9

atagatggat ttttcttttt tatgtgtatt tccggttaat aaatgtttaa attttttttt 60

taataaaaat atttgtagtt atttatatgc aaaaaaaaaa aatattcaaa gcaatcttcc 120

tttctttctt tatctttccc ccatgctaag gtctaaaaca ccacaactta aaacccaact 180

taaccgtata atactaagat caatctccaa agatgcat 218

<210>10

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

tttttcagct ggagctcgtc gacatgcatg aacaggattt aatccc 46

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

ccggaattcc atatgcagat gttataaatg aattagata 39

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

cggaagctta tagatggatt tttctttttt at 32

<210>13

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

tttttgatatc gagctcgtcg acatgcatct ttggagattg atctt 45

Claims (12)

1.一种酵母，其中染色体DNA中的ADE1基因已通过与ADE1 DNA片段进行的同源重组而破坏。

2.权利要求1所述的ADE1基因已被破坏的酵母，其可属于下述的任何属：Aciculoconidium，Ambrosiozyma，Arthroascus，Arxiozyma，Ashbya，Babjevia，Bensingtonia，Botryoascus，Botryozyma，酒香酵母属，布氏弹孢酵母属，Bulleromyces，假丝酵母属，固囊酵母属，Clavispora，隐球酵母属，Cystofilobasidium，德巴利氏酵母属，德克酵母属，Dipodascopsis，双足囊菌属，Eeniella，Endomycopsella，丝囊霉属，假囊酵母属，Erythrobasidium，Fellomyces，Filobasidium，Galactomyces，地霉属，小季氏酵母属，有孢汉逊氏酵母属，汉逊氏酵母属，Hasegawaea，胶珊瑚属，Hormoascus，Hyphopichia，Issatchenkia，克勒克氏酵母属，克勒克氏孢属，克鲁维氏酵母属，Kondoa，Kuraishia，Kurtzmanomyces，白冬孢酵母属，油脂酵母属，洛德酵母属，鳞斑霉属，梅奇酵母属，Mrakia，Myxozyma，拿逊氏酵母属，Nakazawaea，针孢酵母属，Ogataea，卵孢酵母属，管囊酵母属，Phachytichospora，Phaffia，毕赤氏酵母属，红冬孢酵母属，红酵母属，糖酵母属，类糖酵母属，复膜孢糖酵母属，Saitoella，Sakaguchia，Saturnospora，裂芽酵母属，裂殖糖酵母属，许旺氏酵母属，锁掷酵母属，掷孢酵母属，Sporopachydermia，Stephanoascus，梗孢酵母属，Sterigmatosporidium，Symbiotaphrina，Sympodiomyces，Sympodiomycopsis，有孢圆酵母属，Trichosporiella，丝孢酵母属，三角酵母属，Tsuchiyaea，Udeniomyces，Waltomyces，威克酵母属，拟威克酵母属，Williopsis，Yamadazyma，Yarrowia，Zygoascus，接合糖酵母属，Zygowilliopsis，和Zygozyma。

3.权利要求1所述的ADE1基因已被破坏的酵母，其可属于以下任何属：假丝酵母属，Yarrowia，克鲁维氏酵母属，有孢汉逊氏酵母属。

4.权利要求1所述的ADE1基因已被破坏的酵母，其属于假丝酵母属。

5.权利要求4所述的ADE1基因已被破坏的酵母，其为麦芽糖假丝酵母。

6.权利要求5所述的ADE1基因已被破坏的酵母，其为麦芽糖假丝酵母AC16(FERM BP-7366)。

7.权利要求1-6任一的ADE1基因已被破坏的酵母转化体，其被含有同源或异源基因的DNA序列转化。

8.权利要求7的转化体，其中ADE1基因已被破坏的酵母属于假丝酵母属。

9.权利要求8的转化体，其中ADE1基因已被破坏的酵母是麦芽糖假丝酵母。

10.权利要求9的转化体，其中ADE1基因已被破坏的酵母是麦芽糖假丝酵母AC16(FERM BP-7366)。

11.一种生产基因表达产物的方法，包括培养权利要求7-10的任一转化体，并从所获的培养物中收集同源或异源基因表达产物。

12.权利要求11的生产基因表达产物的方法，其中基因表达产物是聚酯。

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