CN1311079C - 用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用maoC基因制备中链聚羟基链烷酸酯(MCL-PHA)的方法。本发明的MCL-PHA的制备方法包括步骤：用maoC基因转化微生物得到转化体，即缺失fadB基因并含有PHA合成酶基因的微生物；在含有C6-10碳源的培养基培养转化体；得到含有6-10个碳原子单体的PHA。根据本发明，当采用功能还不确定的maoC基因是，能高效率得到比从前的PHA碳原子数目更多的高质量PHA。

Description

用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯的方法
技术领域
本发明涉及一种用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯(以下所述的PHA)的方法。更具体而言，本发明涉及一种maoC基因，一种具有烯酰-CoA水合酶活性的蛋白质，以及一种采用含有maoC基因的重组载体和含有PHA合成基因的重组载体转化的微生物制备PHA的方法。
背景技术
PHA是一种聚酯型化合物，当微生物体内存在过量的碳而缺少其它营养物质，如磷、氮、镁和氧时，PHA在微生物体内积聚以充当碳源。由于PHA具有与源自汽油的合成聚合物相似的物理性质，并且具有完全的生物降解性，因此其被认为可作为从前所使用的合成塑料的替代物。
通常，将PHA分成含几个碳原子的短链PHA(SCL-PHA)和含较多碳原子的中链PHA(MCL-PHA)。与SCL-PHA相比，MCL-PHA的物理性质更接近于合成的聚合物，于是对MCL-PHA的研究就积极地展开了。在微生物体内形成PHA需要多种酶：能够将微生物代谢物转变成PHA单体的酶以及能够从PHA单体合成PHA聚合物的PHA合成酶。已知的能提供PHA单体的酶包括发现于Aeromonas sp.微生物和Pseudomonas sp.微生物的(R)-特定的烯酰-CoA水合酶，和在E.coli和Pseudomonas sp.微生物中发现的3-酮酯酰-ACP还原酶(Fukui et al.，J.Bacteriol.，180：667-73，1998；Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184：193-8，2000；Taguchi et al.，FEMS Microbiol.Lett.，176：183-90，1999；Ren et al.，J.Bacteriol.，182：2978-81，2000；and Park et al.，FEMS Microbiol..Lett.，214：217-22，2002)。
同时，有报道说MCL-PHA合成酶基因是从Pseudomonas sp.微生物克隆得到的，而且MCL-PHA能够用该基因转化的重组微生物合成得到(Qi etal.，FEMS Microbiol.Lett.，157：155-62，1997；Qi et al.，FEMS Microbiol.Lett.，167：89-94，1998；Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150：303-9，1997；WO 01/55436；USP 6,143,952；WO 98/54329；and WO 99/61624).而且还有报道，即利用一种重组的E.coli也能够产生MCL-PHA，该重组的E.coli缺失脂肪酸降解途径中的酶FadB(Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150：303-9，1997)。
另一方面，由于有报道说当采用缺失fadB基因的重组E.coli时，FadB的同源酶YfcX也能够提供PHA单体(Snell et al.，J.Bacteriol.，184：5696-5705，2002)，还预言了除YfcX以外还存在能提供PHA单体的酶系。由于采用缺失fadB基因的重组E.coli能够有效得制备MCL-PHA，因此仍然继续努力去发现在缺失fadB基因的重组E.coli中提供PHA单体的酶，但至今未见具体的结果。
因此，仍需要在E.coli中找到新的能提供PHA单体的酶。
发明内容
为了在E.coli中找到了提供PHA单体的新酶，本发明人进行了深入细致的研究，结果发现，一种由E.coli基因maoC表达的蛋白质能够作为在缺失fadB基因的重组E.coli中提供PHA单体的酶，该蛋白质的其它功能还不清楚。本发明即建立在这一基础上。
本发明的目的是提供一种maoC基因、一种maoC蛋白质、一种含有maoC基因的重组载体和一种用重组载体转化的微生物。
本发明的另一个目的是提供用maoC基因制备中链PHA的方法。
为达到上述目的，本发明的一个方案是提供一种maoC基因，其编码由SEQ ID NO：1表示的MaoC蛋白。
本发明的另一个方案提供了一种maoC基因，其具有DNA序列为SEQID NO：2，并编码能提供合成MCL-PHA的单体的蛋白质。
本发明又一个方案提供了含有maoC基因的重组载体。
本发明的再一个方案提供了一种MaoC蛋白，其具有氨基酸序列SEQID NO：1，并显示烯酰-CoA水合酶活性。
本发明的进一步方案提供了用重组载体转化的微生物。
本发明中的微生物优选缺失fadB基因并含有PHA合成酶基因。并且，微生物优选用含有PHA合成酶基因的重组载体转化，或含有插入染色体的PHA合成酶的微生物。
本发明的PHA合成酶优选为phaC。
本发明的另一个方案提供了一种制备中链PHA(MCL-PHA)的方法，其包含的步骤为：在含有C6-10的碳源培养基中培养转化的微生物，并得到含有6-10个碳原子单体的MCO-PHA。
本发明还提供了MCL-PHA，其通过如上所述的方法制备而得，以使3-羟基辛酸酯(3HO)和3-羟基癸酸酯(3HD)的每一种在MCL-PHA总单体中的含量都超过30％。
Tsuge et al.报道了烯酰-CoA水合酶与Pseudomonas sp.中的PHA合成有关(Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184：193-8，2000)。为了在E.coli中找到提供PHA单体的新酶，本发明进行了寻找在E.coli中被表达且具有的氨基酸序列与报道的烯酰-CoA水合酶具有高度同源性的蛋白质的研究。结果发现了具有SEQ ID NO：1的MaoC蛋白显示了34％的同源性，并发现具SEQID NO：2的基因编码该蛋白。直到目前，MaoC蛋白的确切功能还不清楚，只是报道了每一个maoC和maoA基因含有一个操纵子(operon)(Steinebach etal.，Eur.J.Biochem.，237：584-91，1996)。
本发明人预言发现的蛋白质将显示PHA合成中烯酰-CoA水合酶的活性。为了确认该预言，克隆了编码maoC蛋白的MaoC基因。换言之，用E.coli染色体为模板，利用基于E.coli的基因序列合成的寡核苷酸作引物进行PCR，而将maoCEc基因放大(Blatmer et al.，Science 277：1453-14，1997)。用SacI/XbaI消化放大的maoGEc基因并将其克隆至p10499A的重组载体中，从而构建p10499MaoC载体。将EcoRV/ScaI消化p10499MaoC的基因片段插入PvuII/DraI消化的pACYC184中，由此建立构建了用于表达maoC基因的pACYC104MaoC重组载体。
用EcoRV/SspI消化能够表达PHA合成酶基因的p10499613C2载体，然后插入EcoRV消化的pBBR1MCS中，由此构建了含有PHA合成酶基因的pMCS104613C2重组载体。
根据Jeong and Lee的方法，即将缺失fadB基因的突变体E.coli WB101中的maoC基因去除，由此得到既缺失fadB基因又缺失maoC基因的突变体E.coli WB 106(Jeong and Lee.，Appl.Environ.Microbiol.，68：4979-85，2002)。
只缺失fabB基因的突变体E.coli WB101能够从具有10个碳原子的癸酸酯制备MCL-PHA，甚至该突变体是用含有PHA合成酶基因的pMCS104613C2转化的，而当fadB基因和maoC基因都缺失的突变体E.coliWB106，仅用pMCS104613C2转化，则不能从具有10个碳原子的癸酸酯制备MCL-PHA。然而，用pMCS104613C2和pACYC104MaoC转化至E.coliWB106而得到的E.coli W3110能够从具有10个碳原子的癸酸酯制备MCL-PHA。
尽管对于培养E.coli的培养基不作特别限制，但优选使用Luria-Bertani(LB)培养基(酵母提取液5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)，该培养基通常被用于培养E.coli.。根据本发明制备的PHA，其得率比用从前的方法高，而且得到了单体3-羟基己酸酯(3HHx)，3-羟基辛酸酯(3HO)和3-羟基癸酸酯(3HD)，尤其是3HO和3HD占单体的大多数。因此，根据本发明制备的PHA比以前方法制备的PHA质量高。
为了测定maoC基因表达的蛋白质的酶活性，构件了表达MaoC蛋白的重组载体pTac99MaoCH，该MaoC蛋白用6个组氨酸作标记，并通过重组载体pTac99MaoCH得到了MaoC-His6-Tag。以巴豆酰-CoA作为底物，测定MaoC-His6-Tag的烯酰-CoA水合酶活性为47.6U/mg。如这里所用，“1U”的定义为每分钟转移1μmol巴豆酰-CoA的酶活性的一个单位。
附图说明
图1是含有maoC基因的重组载体p10499MaoC的基因图谱；
图2是含有maoC基因的重组载体pACYC104MaoC的基因图谱；
图3是含有PHA合成酶基因的重组载体pMCS104613C2的基因图谱；
图4是含有maoC基因的重组载体pTac99MaoCH的基因图谱。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细阐述。然而，对于本领域技术人员而言，这些实施例只是用于举例说明，本发明的范围并不受限于此。
实施例1：用maoC基因制备产生PHA的重组E.coli
构建缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli，一种含有E.colimaoC基因的重组载体，和含有MCL-PHA合成酶基因的重组载体。用这些重组载体制得用于制备MCL-PHA的重组E.coli。
实施例1-1：缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli的制备
根据常规的方法，用λ噬菌体的红色操纵子将maoC基因从E.coli中去除(Jeong and Lee，Appl.Environ.Microbiol.，68：4979-85，2002)。
换言之，缺失fadB基因的突变体E.coli WB101是用含有λ噬菌体的红色操纵子的载体pTrcEBG转化的(Jeong and Lee，Appl.Environ.Microbiol.，68：4979-85，2002)，并加入1mM IPTG以诱导用pTrcEBG转化的E.coliWB101中的红色操纵子的表达，并用该E.coli制备有电穿孔能力的细胞。E.coli WB101是通过将fadB基因从E.coli W3110(KCTC 2223)中去除而得到的(Park et al.，Enzyme Micro.Technol.，33：62-70，2003)。
同时，由于maoC基因5’端的60bp和3’端的60bp含有类似于抗氯霉素基因的5’端的60bp和3’端的60bp的DNA序列，用抗氯霉素基因替代maoC基因能够产生缺失maoC基因的突变体。基于该目的，用pACYC184(New England Biolab，USA)作为模板，引物为MaoCdelf(SEQ ID NO：3)和MaoCdelb(SEQ ID NO：4)进行30次循环的PCR，其包括在94℃变性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸1分钟，由此得到PCR产物。
5’-atgcagcagttagccagtttcttatccggtacctggcagtctggccggggccgtagccgtagcacttcactgacaccctc-3’(SEQ ID NO：3)
5’-ttaatcgacaaaatcaccgtgctgcctggccaccagcgtcagaattgaataacttattcaggcgtagcacc-3’(SEQ ID NO：4)
将PCR片段克隆至如上所述制备的可被电穿孔的细胞中，由此得到缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli WB106。
实施例1-2：p10499A和p10499613C2的构建
用含有PHA合成酶基因(Matsusaki et al.，J.Bacteriol.，180：6459-67，1998)的Pseudomonas sp.61-3的染色体DNA(JCM 10015)作为模板，引物为phaC2Ps-l(SEQ ID NO：5)和phaC2Ps-2(SEQ ID NO：6)进行30次循环的PCR，其包括在94℃变性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸2分钟，由此得到PCR产物。
5’-cgcggatccaataaggagatatctagatgagagagaaaccaacgccg-3’(SEQ ID NO：5)
5’-cggatccccgggtaccgagctcgaattctcagcgcacgcgcacgtaggta-3’(SEQ ID NO：6)
通过琼酯糖凝胶电泳分析PCR产物，1.7kb基因片段对应于phaC2Ps基因。
然后，放大gntT104启动子使PHA合成酶基因继续被表达，用E.coliW3110(ATCC 39936)的染色体基因作为模板，引物为gntT104-1(SEQ ID NO：7)和gntT104-2(SEQ ID NO：8)，30次循环的PCR包括94℃变性50秒，52℃退火50秒，72℃延伸2分钟(Peekhaus and Conway，J.Bacteriol.，180：1777-85，1998)。
5’-gactagttgaaaggtgtgcgcgatctcac-3’(SEQ ID NO：7)
5’-gcggatcccatttgttatgggcgacgtcaattt-3’(SEQ ID NO：8)
用琼酯糖凝胶电泳对PCT产物进行分析，结果显示400bp的基因片段。
质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)通过EcoRV/EcoRI进行消化，然后将相同酶消化的gntT104启动子基因片段用T4DNA连接酶连接到pTrc99A质粒上，由此得到p10499A载体(Lee et al.，Biotechnol.Lett.，16：1247-52，1994)。然后，p10499A载体被EcoRI/HindIII消化，随后将放大的phaC2Ps基因插入至p10499A载体的EcoRI/HindIII识别位点，由此构建了重组表达载体p10499613C2(Park et al.，FEMS Microbiol.Lett.，214：217-22，2002)。
实施例1-3：含有maoC基因的重组载体的构建
首先，根据已知方法将E.coli W3110的染色体DNA分离并纯化(Sambrook et al.，Molecular cloning，2nd ed，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，1989)。利用纯化的E.coli基因序列作为模板，引物为maoC 1(SEQID NO：9)和maoC 2(SEQ ID NO：10)，30次循环的PCR包括在94℃变性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸2分钟，由此得到PCR产物。。
5’-tttcccgagctcatgcagcagttagccagtt-3’(SEQ ID NO：9)
5’-gctctagattaatcgacaaaatcaccgt-3’(SEQ ID NO：10)
同时，p10499A载体被SacI/XbaI消化，然后将PCR片段插入至其中，由此构建重组载体p10499MaoC。p10499MaoC重组载体被EcoRV/ScaI消化，并被克隆至PvuII/DraI消化的pACYC184中，由此构建重组载体pACYC104MaoC(见图1和图2)。图1是含有maoC基因的重组载体p10499MaoC的基因图谱，图2是含有maoC基因的重组载体pACYC104MaoC的基因图谱。
实施例1-4：含有MCL-PHA合成酶基因的重组载体的构建
为了表达MCL-PHA合成酶基因，用EcoRV/SspI消化p10499613C2得到的基因片段被克隆到用EcoRV消化的pBBR1MCS中(Kovach et al.，Gene，166：175-6，1995)，由此构建了MCL-PHA合成酶基因重组载体pMCS104613C2(见图3)。图3是含有PHA合成酶基因的重组载体pMCS104613C2的基因图谱。
实施例1-5：重组E.coli的制备
缺失fadB基因的突变体E.coli WB101和缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli WB106，用MCL-PHA合成酶基因重组载体pMCS104613C2和MaoC重组载体p10499MaoC以及MaoC重组载体pACYC104MaoC转化，由此产生重组E.Coli菌株WB101(用pMCS104613C2转化)，WB101(用pMCS104613C2+p10499MaoC转化)，WB106(用pMCS104613C2转化)和WB106(用pMCS104613C2+pACYC104MaoC转化)。用重组E.coli W3110作为对照组，其用含有PHA合成酶基因重组载体pMCS104613C2和MaoC表达重组载体p10499MaoC转化正常的E.coli W3110而制得。
实施例2：重组E.coli合成MCL-PHA的能力检测
为了检测对照组E.coli菌株和实施例1-5制备的测试组菌株WB101(pMCS104613C2)，WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)，WB106(pMCS104613C2)和WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)合成MCL-PHA的能力，每一个重组E.coli菌株都在含有2g/l癸酸酯的LB培养基(酵母提取液5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)中培养4天。然后，培养基肉汤以2,500rpm离心15分钟，然后在100℃干燥。根据传统方法，将MCL-PHA从干燥的菌落中分离出来，然后测定MCL-PHA的含量。
为了检测分离后的MCL-PHA的组分，将分离后的MCL-PHA经甲醇分解，使其转变为3-羟基链烷酸甲酯，组分3-羟基丁酸酯(3HB)，3-羟基己酸酯(3HHx)，3-羟基辛酸酯(3HO)，3-羟基癸酸酯(3HD)和3-羟基十二烷酸酯(3HDD)之间的比率通过气相色谱测定(Donan Co.，Korea)。在该方法中，用熔融后的硅胶毛细管柱(Supelco SPBTM-5，30m 0.32mm ID 0.25m film，USA)作为气相柱，苯甲酸(Sigma Chem.Co.，USA)作为内标。测试的结果见下表1。
表1重组E.coli中的MCL-PHA含量及其组分的比率
  测试组   MCL-PHA含量(％，w/w)                组分比率(mol％)
  3HB   3HHx   3HO   3HD   3HHD
  对照组   11.9   0   19   74   7   0
  WB101(pMCS104613C2)   44.6   0   9   37   54   0
  WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)   20.0   0   0   61   39   0
  WB106(pMCS104613C2)   0   0   0   0   0   0
  WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)   10   0   12   38   49   0
如上表1的结果，MCL-PHA能够在对照组E.coli菌株，和测试组E.coli菌株WB101(pMCS104613C2)和WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)中产生，但在缺失maoC基因的E.coli菌株WB106(pMCS104613C2)中不产生。然而，由于MCL-PHA在重组的E.coli WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)中产生，其中maoC基因已被克隆至缺失maoC基因的该重组E.coli中，可见，maoC基因在MCL-PHA的制备中发挥着重要的作用。
Langenbach et al.报道了用含有phaClPa基因的重组载体pBHR71转化的fadB突变体E.coli中可产生MCL-PHA，其含量为细胞干重的21.1％(w/w)(Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150：303-9，1997)。Tsugeet al.报道MCL-PHA产生于重组E.coli菌株，该菌株表达源于Pseudomonas sp.的PHA合成酶基因和源于Pseudomonas sp.的(R)-特定的烯酰-CoA水合酶PhaJ1和PhaJ2，其含量为干细胞重量的14和29％(w/w)，产生的PHA主要含有6个碳原子的单体(Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184：193-8，2000)。
与现有技术相比，本发明能使MCL-PGA的含量(44.6％(w/w))高于现有技术产生的MCL-PGA含量(14，21.1和29％(w/w))。而且，由现有技术制备的MCL-PHA主要包含6个碳原子的单体，而由本发明制备的MCL-PHA包含6-10个碳原子的单体(3HHx，3HO and 3HD)，尤其包含大量的8-10个碳原子的单体(3HO和3HD)。由此可见，由本发明制备的MCL-PHA比由现有技术制备的PHA的应用领域范围明显要大。
实施例3：烯酰-CoA水合酶活性的测定
如实施例1-2相同的方法制备PCR片段，不同的是用引物His-Tag：5’-gctctagattaatggtgatgatggtgatgatcgacaaaatcaccg-3’(SEQ ID NO：11)替代maoC引物2。并且将PCR片段插入pTac99A载体中，该载体含有SacI/XbaI消化的tac启动子，由此构建了重组载体pTac99MaoCH(见图4)。pTac99A载体的构建包括，用PvuII/EcoRI消化pKK223-3载体(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)以得到tac启动子，再将tac启动子克隆至PvuII/EcoRI消化的pTrc99A中(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)。图4是含有maoC基因的重组载体pTac99MaoCH的基因图谱。用重组载体pTac99MaoCH转化E.coli DH5α而制备得重组E.coli DH5α(pTac99MaoCH)。E.coli株DH5α在LB培养基中培养一天，并加入1mM IPTG以诱导蛋白质表达。收集菌落，搅匀，利用NTA柱(Qiagen Ni-NTA试剂盒，USA)得到纯化的含有6个组氨酸的MaoC蛋白。
加入纯化的MaoC蛋白和0.25mM作为底物的巴豆酰-CoA，和反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)混合，由于烯酰-CoA水合酶使巴豆酰-CoA水合，使其263nm吸收减弱，从而测得该酶的活性。在该状况下，可以计算出产物烯酰-CoA硫酯的ε263为6700M-1cm-1。结果，MaoC蛋白显示了烯酰-CoA水合酶作用于巴豆酰-CoA的活性为47.6U/mg。
正如以上所描述和证明的，功能还没有完全确定的maoC基因用于本发明中，可以以更高的效率得到与从前PHA相比含有更多数目碳原子的高质量PHA。因此，本发明将被广泛用于高质量PHA的制备中。
并且，用E.coli WB101制备PHA，产量最高，尽管单独使用maoC基因也有可能合成PHA，但MCL-PHA能够通过放大的maoC基因和PHA合成酶基因在重组E.coli W3110(对照组)中制备得到，并且该重组E.coliW3110具有正常的脂肪酸降解途径。考虑到PHA通常不能用缺失fadB基因的E.coli从脂肪酸作为碳源的补料分批培养中制备得，本发明制备MCL-PHA的方法通过重组E.coli中maoC基因的放大，仍具有脂肪酸降解的正常途径，能够通过补料分批培养应用于MCL-PHA的大量生产中。
                        Sequence listing
<110>韩国科学技术院
<120>用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯的方法
<130>PIO34755C
<150>KR10-2003-0025863
<151>2003-04-23
<160>11
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>681
<212>PRT
<213>Escherichia coli
<400>1
Met Gln Gln Leu Ala Ser Phe Leu Ser Gly Thr Trp Gln Ser Gly Arg
1               5                   10                  15
Gly Arg Ser Arg Leu Ile His His Ala Ile Ser Gly Glu Ala Leu Trp
            20                  25                  30
Glu Val Thr Ser Glu Gly Leu Asp Met Ala Ala Ala Arg Gln Phe Ala
        35                  40                  45
Ile Glu Lys Gly Ala Pro Ala Leu Arg Ala Met Thr Phe Ile Glu Arg
    50                  55                  60
Ala Ala Met Leu Lys Ala Val Ala Lys His Leu Leu Ser Glu Lys Glu
65                  70                  75                  80
Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Gln Thr Gly Ala Thr Arg Ala Asp Ser
                85                  90                  95
Trp Val Asp Ile Glu Gly Gly Ile Gly Thr Leu Phe Thr Tyr Ala Ser
            100                 105                 110
Leu Gly Ser Arg Glu Leu Pro Asp Asp Thr Leu Trp Pro Glu Asp Glu
        115                 120                 125
Leu Ile Pro Leu Ser Lys Glu Gly Gly Phe Ala Ala Arg His Leu Leu
    130                 135                 140
Thr Ser Lys Ser Gly Val Ala Val His Ile Asn Ala Phe Asn Phe Pro
145                 150                 155                 160
Cys Trp Gly Met Leu Glu Lys Leu Ala Pro Thr Trp Leu Gly Gly Met
                165                 170                 175
Pro Ala Ile Ile Lys Pro Ala Thr Ala Thr Ala Gln Leu Thr Gln Ala
            180                 185                 190
Met Val Lys Ser Ile Val Asp Ser Gly Leu Val Pro Glu Gly Ala Ile
        195                 200                 205
Ser Leu Ile Cys Gly Ser Ala Gly Asp Leu Leu Asp His Leu Asp Ser
    210                 215                 220
Gln Asp Val Val Thr Phe Thr Gly Ser Ala Ala Thr Gly Gln Met Leu
225                 230                 235                 240
Arg Val Gln Pro Asn Ile Val Ala Lys Ser Ile Pro Phe Thr Met Glu
                245                 250                 255
Ala Asp Ser Leu Asn Cys Cys Val Leu Gly Glu Asp Val Thr Pro Asp
            260                 265                 270
Gln Pro Glu Phe Ala Leu Phe Ile Arg Glu Val Val Arg Glu Met Thr
        275                 280                 285
Thr Lys Ala Gly Gln Lys Cys Thr Ala Ile Arg Arg Ile Ile Val Pro
    290                 295                 300
Gln Ala Leu Val Asn Ala Val Ser Asp Ala Leu Val Ala Arg Leu Gln
305                 310                 315                 320
Lys Val Val Val Gly Asp Pro Ala Gln Glu Gly Val Lys Met Gly Ala
                325                 330                 335
Leu Val Asn Ala Glu Gln Arg Ala Asp Val Gln Glu Lys Val Asn Ile
            340                 345                 350
Leu Leu Ala Ala Gly Cys Glu Ile Arg Leu Gly Gly Gln Ala Asp Leu
        355                 360                 365
Ser Ala Ala Gly Ala Phe Phe Pro Pro Thr Leu Leu Tyr Cys Pro Gln
    370                 375                 380
Pro Asp Glu Thr Pro Ala Val His Ala Thr Glu Ala Phe Gly Pro Val
385                 390                 395                 400
Ala Thr Leu Met Pro Ala Gln Asn Gln Arg His Ala Leu Gln Leu Ala
                405                 410                 415
Cys Ala Gly Gly Gly Ser Leu Ala Gly Thr Leu Val Thr Ala Asp Pro
            420                 425                 430
Gln Ile Ala Arg Gln Phe Ile Ala Asp Ala Ala Arg Thr His Gly Arg
        435                 440                 445
Ile Gln Ile Leu Asn Glu Glu Ser Ala Lys Glu Ser Thr Gly His Gly
    450                 455                 460
Ser Pro Leu Pro Gln Leu Val His Gly Gly Pro Gly Arg Ala Gly Gly
465                 470                 475                 480
Gly Glu Glu Leu Gly Gly Leu Arg Ala Val Lys His Tyr Met Gln Arg
                485                 490                 495
Thr Ala Val Gln Gly Ser Pro Thr Met Leu Ala Ala Ile Ser Lys Gln
            500                 505                 510
Trp Val Arg Gly Ala Lys Val Glu Glu Asp Arg Ile His Pro Phe Arg
        515                 520                 525
Lys Tyr Phe Glu Glu Leu Gln Pro Gly Asp Ser Leu Leu Thr Pro Arg
    530                 535                 540
Arg Thr Met Thr Glu Ala Asp Ile Val Asn Phe Ala Cys Leu Ser Gly
545                 550                 555                 560
Asp His Phe Tyr Ala His Met Asp Lys Ile Ala Ala Ala Glu Ser Ile
                565                 570                 575
Phe Gly Glu Arg Val Val His Gly Tyr Phe Val Leu Ser Ala Ala Ala
            580                 585                 590
Gly Leu Phe Val Asp Ala Gly Val Gly Pro Val Ile Ala Asn Tyr Gly
        595                 600                 605
Leu Glu Ser Leu Arg Phe Ile Glu Pro Val Lys Pro Gly Asp Thr Ile
    610                 615                 620
Gln Val Arg Leu Thr Cys Lys Arg Lys Thr Leu Lys Lys Gln Arg Ser
625                 630                 635                 640
Ala Glu Glu Lys Pro Thr Gly Val Val Glu Trp Ala Val Glu Val Phe
                645                 650                 655
Asn Gln His Gln Thr Pro Val Ala Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Leu Val
            660                 665                 670
Ala Arg Gln His Gly Asp Phe Val Asp
        675                 680
<210>2
<211>2046
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>2
atgcagcagt tagccagttt cttatccggt acctggcagt ctggccgggg ccgtagccgt     60
ttgattcacc acgctattag cggcgaggcg ttatgggaag tgaccagtga aggtcttgat    120
atggcggctg cccgccagtt tgccattgaa aaaggtgccc ccgcccttcg cgctatgacc    180
tttatcgaac gtgcggcgat gcttaaagcg gtcgctaaac atctgctgag tgaaaaagag    240
cgtttctatg ctctttctgc gcaaacaggc gcaacgcggg cagacagttg ggttgatatt    300
gaaggtggca ttgggacgtt atttacttac gccagcctcg gtagccggga gctgcctgac    360
gatacgctgt ggccggaaga tgaattgatc cccttatcga aagaaggtgg atttgccgcg    420
cgccatttac tgacctcaaa gtcaggcgtg gcagtgcata ttaacgcctt taacttcccc    480
tgctggggaa tgctggaaaa gctggcacca acgtggctgg gcggaatgcc agccatcatc    540
aaaccagcta ccgcgacggc ccaactgact caggcgatgg tgaaatcaat tgtcgatagt    600
ggtcttgttc ccgaaggcgc aattagtctg atctgcggta gtgctggcga cttgttggat    660
catctggaca gccaggatgt ggtgactttc acggggtcag cggcgaccgg acagatgctg    720
cgagttcagc caaatatcgt cgccaaatct atccccttca ctatggaagc tgattccctg     780
aactgctgcg tactgggcga agatgtcacc ccggatcaac cggagtttgc gctgtttatt     840
cgtgaagttg tgcgtgagat gaccacaaaa gccgggcaaa aatgtacggc aatccggcgg     900
attattgtgc cgcaggcatt ggttaatgct gtcagtgatg ctctggttgc gcgattacag     960
aaagtcgtgg tcggtgatcc tgctcaggaa ggcgtgaaaa tgggcgcact ggtaaatgct    1020
gagcagcgtg ccgatgtgca ggaaaaagtg aacatattgc tggctgcagg atgcgagatt    1080
cgcctcggtg gtcaggcgga tttatctgct gcgggtgcct tcttcccgcc aaccttattg    1140
tactgtccgc agccggatga aacaccggcg gtacatgcaa cagaagcctt tggccctgtc    1200
gcaacgctga tgccagcac aaaaccagcga catgctctgc aactggcttg tgcaggcggc    1260
ggtagccttg cgggaacgct ggtgacggct gatccgcaaa ttgcgcgtca gtttattgcc    1320
gacgcggcac gtacgcatgg gcgaattcag atcctcaatg aagagtcggc aaaagaatcc    1380
accgggcatg gctccccact gccacaactg gtacatggtg ggcctggtcg cgcaggaggc    1440
ggtgaagaat taggcggttt acgagcggtg aaacattaca tgcagcgaac cgctgttcag    1500
ggtagtccga cgatgcttgc cgctatcagt aaacagtggg tgcgcggtgc gaaagtcgaa    1560
gaagatcgta ttcatccgtt ccgcaaatat tttgaggagc tacaaccagg cgacagcctg    1620
ttgactcccc gccgcacaat gacagaggcc gatattgtta actttgcttg cctcagcggc    1680
gatcatttct atgcacatat ggataagatt gctgctgccg aatctatttt cggtgagcgg    1740
gtggtgcatg ggtattttgt gctttctgcg gctgcgggtc tgtttgtcga tgccggtgtc    1800
ggtccggtca ttgctaacta cgggctggaa agcttgcgtt ttatcgaacc cgtaaagcca    1860
ggcgatacca tccaggtgcg tctcacctgt aagcgcaaga cgctgaaaaa acagcgtagc    1920
gcagaagaaa aaccaacagg tgtggtggaa tgggctgtag aggtattcaa tcagcatcaa    1980
accccggtgg cgctgtattc aattctgacg ctggtggcca ggcagcacgg tgattttgtc    2040
gattaa                                                               2046
<210>3
<211>80
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>3
atgcagcagt tagccagttt cttatccggt acctggcagt ctggccgggg ccgtagccgt    60
agcacttcac tgacaccctc                                                80
<210>4
<211>71
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>4
ttaatcgaca aaatcaccgt gctgcctggc caccagcgtc agaattgaat aacttattca    60
ggcgtagcac c                                                         71
<210>5
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>5
cgcggatcca ataaggagat atctagatga gagagaaacc aacgccg                  47
<210>6
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>6
cggatccccg ggtaccgagc tcgaattctc agcgcacgcg cacgtaggta               50
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>7
gactagttga aaggtgtgcg cgatctcac                                      29
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>8
gcggatccca tttgttatgg gcgacgtcaa ttt                                 33
<210>9
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>9
tttcccgagc tcatgcagca gttagccagt t                                  31
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>10
gctctagatt aatcgacaaa atcaccgt                                      28
<210>11
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR Primer
<400>11
gctctagatt aatggtgatg atggtgatga tcgacaaaat caccg                   45

Claims (6)

1.一种maoC基因，其序列是以SEQ ID NO：2表示的DNA序列1-2046，编码中链聚羟基链烷酸酯合成所需的单体的蛋白质。
2.一种含有权利要求1的基因的重组载体。
3.一种用权利要求2的重组载体转化的细菌，其缺失fadB基因而含有聚羟基链烷酸酯合成酶基因。
4.权利要求3的被转化的细菌，其中该微生物是用含有PHA合成酶基因的重组载体转化的，或聚羟基链烷酸酯合成酶基因被克隆至微生物的染色体中。
5.权利要求3的被转化的细菌，其中聚羟基链烷酸酯合成酶基因是phaC。
6.一种制备中链聚羟基链烷酸酯的方法，其包括步骤：
(i)在含有C6-10碳源的培养基中培养权利要求3的细菌；和
(ii)制得含有6-10个碳原子单体的PHA。
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