JP3872050B2 - ｍａｏＣ遺伝子及びそれを利用したポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、maoC遺伝子及びそれを利用したポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の製造方法に係り、より詳しくは、maoC遺伝子、エノイル−CoAヒドラターゼ活性(enoyl-CoA hydratase activity)を示すMaoC蛋白質及び、前記maoC遺伝子を含む組換えベクターとPHA合成遺伝子を含む組換えベクターとにより形質転換された微生物を利用したPHAの製造方法に関する。
PHAは、微生物に炭素源が過剰に存在しながらも、燐、窒素、マグネシウム、酸素などほかの栄養分は不足するとき、炭素源の貯蔵物質として微生物の内部に蓄えられるポリエステル(Polyester)型の化合物である。かかるPHAは、石油から由来された合成高分子と類似した物性を有しながらも完全な生分解性を示すことから、従来の合成プラスチックの代替物質として認識されるようになった。
一般に、PHAは、少ない炭素数を有する短鎖のPHA(SCL-PHA, short-chain-length PHA)
と、相対的に多くの炭素数を有する中鎖のPHA(MCL-PHA, medium-chain-length PHA)とに
大別される。この際、少ない炭素数を有するSCL-PHAよりも相対的に多くの炭素数を有す
るMCL-PHAのほうが、合成高分子と類似した物性を有するので、主にMCL-PHAに関する研究
が活発に進行されている。 PHAを微生物から生産するためには、微生物の代謝産物をPHA
モノマーに転換させる酵素と、PHAモノマーを用いてPHA高分子を合成するPHA合成酵素と
を必要とする。PHAモノマーを提供する酵素としては、アエロモナス属微生物とシュード
モナス属微生物とから発見された(R)-特異的エノイル-CoAヒドラターゼ((R)-specific en
oyl-CoA hydratase)と；大腸菌とシュードモナス属微生物とから発見された3-ケトアシル
-ACP還元酵素(3-ketoacyl-ACP reductase)と；が知られている(Fukui et al., J. Bacter
iol., 180: 667-73, 1998; Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184: 193-8, 2000;
Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176: 183-90, 1999; Ren et al., J. Bacteri
ol., 182: 2978-81, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214: 217-22, 2002).
と、相対的に多くの炭素数を有する中鎖のPHA(MCL-PHA, medium-chain-length PHA)とに
大別される。この際、少ない炭素数を有するSCL-PHAよりも相対的に多くの炭素数を有す
るMCL-PHAのほうが、合成高分子と類似した物性を有するので、主にMCL-PHAに関する研究
が活発に進行されている。 PHAを微生物から生産するためには、微生物の代謝産物をPHA
モノマーに転換させる酵素と、PHAモノマーを用いてPHA高分子を合成するPHA合成酵素と
を必要とする。PHAモノマーを提供する酵素としては、アエロモナス属微生物とシュード
モナス属微生物とから発見された(R)-特異的エノイル-CoAヒドラターゼ((R)-specific en
oyl-CoA hydratase)と；大腸菌とシュードモナス属微生物とから発見された3-ケトアシル
-ACP還元酵素(3-ketoacyl-ACP reductase)と；が知られている(Fukui et al., J. Bacter
iol., 180: 667-73, 1998; Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184: 193-8, 2000;
Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176: 183-90, 1999; Ren et al., J. Bacteri
ol., 182: 2978-81, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214: 217-22, 2002).
一方、 MCL-PHAを合成する遺伝子はシュードモナス属微生物からクローニングされ、前記遺伝子により形質転換された組換え微生物を用いてMCL-PHAを合成することができる、ということが報告された(Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157: 155-62, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167: 89-94, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150: 303-9, 1997; WO 01/55436; USP6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624)。また、脂肪酸分解経路の酵素のうちFadBが除去された組換え大腸菌を用いる場合にも、MCL-PHAを生産することができる、ということが報告された(Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150: 303-9,1997)。
一方、FadBの相同体のYfcX酵素はfadB遺伝子が除去された組換え大腸菌を用いる場合、PHAモノマーを提供することができる( Snell et al.,J.Bacteriol.,184: 5696-705,2002)という報告から、YfcX以外もPHAモノマーを提供する新しい酵素が存在することが予測された。前記fadB遺伝子が除去された組換え大腸菌を用いると、 MCL-PHAを効率よく生産することができるので、前記fadB遺伝子が除去された組換え大腸菌から、PHAモノマーを提供する酵素を明らかにしようとする努力が続いているが、まだ何の成果もない。
よって、大腸菌から、PHAモノマーを提供する新しい酵素を明らかにする必要性が絶えず叫ばれている。
したがって、本発明者らは、大腸菌から、PHAモノマーを提供する新しい酵素を明らかにするために鋭意努力した結果、まだ機能が明らかにされていない大腸菌の遺伝子maoCから発現された蛋白質が、fadB遺伝子が除去された組換え大腸菌の、PHAモノマーを提供する酵素としての役割を果せることを確認し、本発明の完成に至った。
本発明の目的は、maoC遺伝子、MaoC蛋白質、前記maoC遺伝子を含む組換えベクター及び前記組換えベクターにより形質転換された微生物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記maoC遺伝子を利用した中鎖PHAの製造方法を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のMaoC蛋白質をコードするmaoC遺伝子を提供する。また本発明は、配列番号１のMaoC蛋白質において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつMaoC蛋白質機能を有する蛋白質をコードするmaoC遺伝子を提供する。
また、本発明は、配列番号２の塩基配列を有し、MCL-PHA合成に必要なモノマーを提供する蛋白質をコードするmaoC遺伝子を提供する。さらに本発明は、配列番号２の相補配列
、配列番号２又はその相補鎖の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列をも提供する。なお、ハイブリダイゼーションの条件は、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，（１９８９）等に従うことができる。
、配列番号２又はその相補鎖の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列をも提供する。なお、ハイブリダイゼーションの条件は、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，（１９８９）等に従うことができる。
また、本発明は、前記maoC遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、エノイル-CoAヒドラターゼ活性(enoy1-CoA hydratase activity)を示すMaoC蛋白質を提供する。
また、本発明は、前記組換えベクターにより形質転換された微生物を提供する。
本発明において、前記微生物は、fadB遺伝子が除去され、PHA合成遺伝子を含むことを特徴とし、PHA合成遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換されるか、或いは染色体上にPHA合成遺伝子が挿入されていることを特徴とする。
本発明において、PHA合成遺伝子はphaCであることを特徴とする。
また、本発明は、前記形質転換された微生物を炭素源C6-10を含む培地で培養する段階
と、炭素数C6-10のモノマーで構成されたPHAを収得する段階とを含むことを特徴とするMC
L-PHAの製造方法を提供する。
と、炭素数C6-10のモノマーで構成されたPHAを収得する段階とを含むことを特徴とするMC
L-PHAの製造方法を提供する。
また、本発明は、上記の方法で製造され、PHAの全体モノマーのうち3HO(3-hydroxyoctanoate)及び3HD(3-hydroxydecanoate)のそれぞれの含量が30モル%以上であることを特徴とするMCL-PHAを提供する。
Tsugeなどは、シュードモナス属微生物からPHAの合成に関与するエノイル-CoAヒドラターゼ(enoyl-CoA hydratase)を報告した(Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184: 193-8, 2000)。本発明者らは、大腸菌から、PHAモノマーを提供する新しい酵素を明らかにするために、前記報告されたエノイル-CoAヒドラターゼのアミノ酸配列を用いて、大腸菌から発現される、高い相同性を有するアミノ酸配列を持つ蛋白質を検索した。その結果、34%の相同性を示すMaoC蛋白質(配列番号１)と、それをコードする遺伝子(配列番号２)を見つけた。まだ、MaoC蛋白質の正確な機能は明らかにされていないし、ただmaoC及びmaoA遺伝子が一つのオペロンを形成する、ということが報告された(Steinebach et al., Eur. J. Biochem., 237: 584-91, 1996)。
本発明者らは、前記検索された蛋白質が、PHAの合成に関与するエノイル-CoAヒドラターゼの活性を示すであろうと予測し、それを確認するために、MaoC蛋白質をコードするmaoC遺伝子をクローニングしようとした。すなわち、大腸菌の染色体DNAを鋳型として、大腸菌遺伝体の配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドプライマを用いたPCRにより、maoCEc遺伝子を増幅した(Blattner et al., Science 277:1453-14, 1997)。前記増幅されたmaoCEc遺伝子をSacI/XbaIで切断し、p10499A組換えベクターに挿入して、p10499MaoCを作製し、その後、前記p10499MaoCベクターをEcoRV/ScaIで切断して得た遺伝子断片を、PvuII/DraIで切断したpACYC184に挿入して、maoC遺伝子を発現させるための組換えベクターpACYC104MaoCを作製した。
PHA合成遺伝子を発現し得るp10499613C2ベクターをEcoRV/SspIで切断し、EcoRVで切断したpBBR1MCSに挿入して、PHA合成遺伝子を含む組換えベクターpMCS104613C2を作製した。
Jeongなどの方法により、fadB遺伝子が除去された突然変異大腸菌WB101からmaoCを除去して、fadB遺伝子及びmaoC遺伝子がすべて除去された突然変異大腸菌WB106を製造した(Jeong and Lee. Appl. Environ. Microbiol., 68: 4979-85, 2002)。
fadB遺伝子だけが除去された突然変異大腸菌WB101は、PHA合成遺伝子を含むpMCS104613C2により形質転換された場合も、炭素数１０のデカノン酸からMCL-PHAを生産することができたのに対して、fadB遺伝子及びmaoC遺伝子がすべて除去された突然変異大腸菌WB106は、pMCS104613C2だけにより形質転換された場合には、炭素数が１０のデカノン酸からMCL-PHAを生産することができなかった。しかし、前記WB106を、pMCS104613C2及びpACYC104MaoCにより同時に形質転換された組換え大腸菌W3110は、炭素数１０のデカノン酸からMCL-PHAを生産することができた。
組換え大腸菌の培養に使われる培地を特に制限する必要はないが、通常大腸菌培養に使われるLB(Luria-Bertani)培地(Yeast extract 5g/L、peptone 10g/L、NaCL 5g/L)を使用するのが望ましい。また、本発明によって生産されるPHAは、従来の方法で生産されたPHAに比べてみると、製造収率に優れており、また、モノマーとして3-ヒドロキシヘキサノエート(3-hydroxyhexanoate, 3HHx)、3-ヒドロキシオクタノエート(3-hydroxyoctanoate, 3HO)及び3-ヒドロキシデカノエート(3-hydroxydecanoate, 3HD)を使用し、特に3HO及び3HDが大部分を占めていることから、従来の方法で生産されたPHAよりも品質面で優れていることがわかる。
この結果により、前記maoC遺伝子から発現される蛋白質の酵素活性を測定するために、６個のヒスチジンでラベルされたMaoC蛋白質を発現させる組換えベクターpTac99MaoCHを作製し、これを利用してMaoC-His6-Tagを収得した。前記MaoC-His6-Tagは、クロトニル-CoA(crotonyl-CoA)を基質として47.6U/mgのエノイル-CoAヒドラターゼ(enoyl-CoA hydratase)活性を示した。本発明では、「1U」を１分当り1μmolのクロトニル-CoAを除去する酵素活性の単位として定義する。
本発明によれば、今まで機能が明らかでなかったmaoC遺伝子を利用すると、従来のPHAよりも多くの炭素数を有する高品質なPHAをより高い効率で生産することができるので、高品質なPHAの製造に幅広く活用することができる。
また、大腸菌WB101が最高のPHA生産量を示し、この際、大腸菌が本来持っているmaoC遺伝子だけを利用してもPHA合成が可能であるが、正常な脂肪酸分解回路を有する組換え大腸菌W3110(対照群)から、maoC遺伝子及びPHA合成酵素遺伝子を増幅して、MCL-PHAを生産することができる。さらに、従来では、fadB遺伝子が除去された大腸菌から、フェッド−バッチ高濃度培養を用いて、脂肪酸を炭素源としてPHAを生産することができなかったのに対して、本発明では、正常な脂肪酸分解回路を有する組換え大腸菌から、maoC遺伝子を増幅してMCL-PHAを製造することができるので、この製造方法は、フェッド−バッチ培養を用いたMCL-PHAの大量生産に適用することができる。
以下、実施例を参照して本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例はただ本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨により本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではないことは、当該分野で通常の知識を有する者には明らかなことである。
（実施例１）
（実施例１）
maoC遺伝子を利用したPHA生産用組換え大腸菌の製造
fadB遺伝子及びmaoC遺伝子が除去された突然変異大腸菌と、大腸菌のmaoC遺伝子を含む
組換えベクターと、MCL-PHA合成遺伝子を含む組換えベクターとをそれぞれ作製し、それ
を利用してMCL-PHA生産用組換え大腸菌を製造した。
（実施例１−１）
fadB遺伝子及びmaoC遺伝子が除去された突然変異大腸菌と、大腸菌のmaoC遺伝子を含む
組換えベクターと、MCL-PHA合成遺伝子を含む組換えベクターとをそれぞれ作製し、それ
を利用してMCL-PHA生産用組換え大腸菌を製造した。
（実施例１−１）
fadB及びmaoC遺伝子が除去された突然変異大腸菌の製造
公知の方法により、バクテリオファージλのレッドオペロン(red operon)を利用して大腸菌からmaoC遺伝子を除去した(Jeong and Lee., Appl. Environ. Microbiol., 68: 4979-85, 2002)。
公知の方法により、バクテリオファージλのレッドオペロン(red operon)を利用して大腸菌からmaoC遺伝子を除去した(Jeong and Lee., Appl. Environ. Microbiol., 68: 4979-85, 2002)。
すなわち、バクテリオファージλのレッドオペロン(red operon)を含むベクターpTrcEBG(Jeong and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 68: 4979-85, 2002)を用いて、fadB遺伝子が除去された突然変異大腸菌WB101の形質転換を行い、IPTG 1mMの添加により、形質転換されたWB101(pTrcEBG)からレッドオペロンの発現を誘導し、それを利用してコンピテント細胞(electroporation-competent cell)を製造した。前記大腸菌WB101は、大腸菌W3110(ATCC39936)からfadB遺伝子を除去して得た(Park et al., Enzyme Micro. Technol., 33: 62-70, 2003)。
一方、maoC遺伝子は、5'末端から60bpと3'末端から60bpとが、クロラムフェニコール(chloromphenicol)抵抗遺伝子の5'末端から60bpと3'末端から60bpとにそれぞれ類似した塩基配列を含むので、クロラムフェニコール抵抗遺伝子によりmaoC遺伝子を置換することにより、maoC遺伝子が欠失した突然変異体を製造することができる。このために、pACYC184(New England Biolab, USA)を鋳型として、プライマMaoCdelf(配列番号３)及びプライマMaoCdelb(配列番号４)を用いて、９４℃での５０秒間変性(denaturation)、５２℃での５０秒間アニール(annealing)、７２℃での１分間伸長(extension)を一周期として、計３０周期を繰り返しながらPCRを行い、PCR断片を収得した。
配列番号３： 5'-atgcagcagttagccagtttcttatccggtacctggcagtctggcc ggggccgtagccgtagcacttcactgacaccctc-3'
配列番号４： 5'-ttaatcgacaaaatcaccgtgctgcctggccaccagcgtcagaatt gaataacttattcaggcgtagcacc-3'
配列番号４： 5'-ttaatcgacaaaatcaccgtgctgcctggccaccagcgtcagaatt gaataacttattcaggcgtagcacc-3'
前記収得したPCR断片を前記製造したコンピテント細胞に挿入し、fadB遺伝子及びmaoC遺伝子がすべて除去された突然変異大腸菌WB106を作製した。
（実施例１−２）
（実施例１−２）
p10499A及びp10499613C2の作製
PHA合成遺伝子を含むシュードモナス属 (Pseudomonas sp.)61-3 (JCM10015)の染色体DNA(Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180: 6459-67, 1998)を鋳型として、下記のプライマphaC2Ps-1(配列番号５)及びphaC2Ps-2(配列番号６)を用いて、PCR(９４℃で５０秒間変性、５２℃で５０秒間アニール、７２℃で２分間伸長、計３０周期)を行った。
PHA合成遺伝子を含むシュードモナス属 (Pseudomonas sp.)61-3 (JCM10015)の染色体DNA(Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180: 6459-67, 1998)を鋳型として、下記のプライマphaC2Ps-1(配列番号５)及びphaC2Ps-2(配列番号６)を用いて、PCR(９４℃で５０秒間変性、５２℃で５０秒間アニール、７２℃で２分間伸長、計３０周期)を行った。
配列番号５： 5'-cgcggatccaataaggagatatctagatgagagagaaaccaacgccg-3'
配列番号６： 5'-cggatccccgggtaccgagctcgaattctcagcgcacgcgcacgtaggta-3'
配列番号６： 5'-cggatccccgggtaccgagctcgaattctcagcgcacgcgcacgtaggta-3'
前記PCR反応産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、phaC2Ps遺伝子に該当する1.7kbサイズの遺伝子断片が確認された。
また、ＰＨＡ合成遺伝子の持続的な発現を目指してgntT104プロモーターを増幅させるために、大腸菌W3110(ATCC39936)染色体(chromosome)遺伝子を鋳型として、下記のプライマgntT104-1(配列番号７)及びgntT104-2(配列番号８)を用いて、PCR(９４℃で５０秒間変性、５２℃で５０秒間アニール、７２℃で２分間伸長、計３０周期)を行った(Peekhaus and Conway, J. Bacteriol., 180: 1777-85, 1998)。
配列番号７： 5'-gactagttgaaaggtgtgcgcgatctcac-3'
配列番号８： 5'-gcggatcccatttgttatgggcgacgtcaattt-3'
配列番号８： 5'-gcggatcccatttgttatgggcgacgtcaattt-3'
前記PCR反応産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、400bpサイズの遺伝子断片が確認された。
プラスミドpTrc99A(Pharmacia Biotech. Co., Uppsala, Sweden)をEcoRV/EcoRI酵素で処理し、切断したあと、同一の酵素で切断したgntT104プロモーター遺伝子断片とを、T4DNAリガーゼを用いて連結することにより、p10499Aベクターを製造した(Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214: 217-22, 2002)。次いで、p10499AベクターをEcoRI/HindIII酵素で切断した後、前記増幅されたphaC2Ps遺伝子をp10499AのEcoRI/HindIII認識部位に挿入することにより、組換え発現ベクターp10499613C2を作製した。
（実施例１−３）
（実施例１−３）
maoC遺伝子を含む組換えベクターの作製
先ず、大腸菌W3110の染色体を公知の方法で分離及び精製した(Sambrook et al., Molecular cloning, ２nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989)。 前記精製された大腸菌遺伝体の配列を鋳型として、プライマmaoC 1(配列番号９)とプライマ maoC2(配列番号１０)を用いて、９４℃での５０初間変性、５２℃での５０秒間アニール、７２℃での２分間伸長を一周期として、計３０周期を繰り返しながらPCRを行い、PCR断片を収得した。
先ず、大腸菌W3110の染色体を公知の方法で分離及び精製した(Sambrook et al., Molecular cloning, ２nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989)。 前記精製された大腸菌遺伝体の配列を鋳型として、プライマmaoC 1(配列番号９)とプライマ maoC2(配列番号１０)を用いて、９４℃での５０初間変性、５２℃での５０秒間アニール、７２℃での２分間伸長を一周期として、計３０周期を繰り返しながらPCRを行い、PCR断片を収得した。
配列番号９： 5'-tttcccgagctcatgcagcagttagccagtt-3'
配列番号１０： 5'-gctctagattaatcgacaaaatcaccgt-3'
配列番号１０： 5'-gctctagattaatcgacaaaatcaccgt-3'
一方、p10499AベクターをSacI/XbaI酵素で切断した後、前記収得したPCR断片を挿入して、組換えベクターp10499MaoCを作製した。また、それをEcoRV/ScaIで切断して得た断片を、PvuII/DraIで切断したpACYC184に挿入して、組換えベクターpACYC104MaoCを作製した(図１、図２)。図１は、maoC遺伝子を含む組換えベクターp10499MaoCの遺伝子を示した図であり、図２は、maoC遺伝子を含む組換えベクターpACYCMaoCの遺伝子を示した図である。
（実施例１−４）
（実施例１−４）
MCL-PHA合成遺伝子を含む組換えベクターの作製
MCL-PHA合成遺伝子の発現のために、p10499613C2をEcoRV/SspI制限酵素で切断して得た遺伝子断片を、EcoRVで切断したpBBRIMCS(Kovach et al., Gene, 166: 175-6, 1995)に挿入して、MCL-PHA合成遺伝子の組換えベクターpMCS104613C2を作製した(図３)。図３は、PHA合成遺伝子を含む組換えベクターpMCS104613C2の遺伝子を示した図である。
（実施例１−５）
MCL-PHA合成遺伝子の発現のために、p10499613C2をEcoRV/SspI制限酵素で切断して得た遺伝子断片を、EcoRVで切断したpBBRIMCS(Kovach et al., Gene, 166: 175-6, 1995)に挿入して、MCL-PHA合成遺伝子の組換えベクターpMCS104613C2を作製した(図３)。図３は、PHA合成遺伝子を含む組換えベクターpMCS104613C2の遺伝子を示した図である。
（実施例１−５）
組換え大腸菌の製造
前記実施例で作製された、fadB遺伝子が除去された突然変異大腸菌WB101と、fadB及びMoaC遺伝子がすべて除去された突然変異大腸菌WB106とを、それぞれMCL-PHA合成遺伝子組換えベクターpMCS104613C2、MaoC組換えベクターp10499MaoC及びMaoC組換えベクターpACYC104MaoCを用いて形質転換することにより、組換え大腸菌であるWB101(pMCS104613C2)、WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)、WB106(pMCS104613C2)及びWB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)を製造した。対照群としては、正常大腸菌W3110を、PHA合成遺伝子組換えベクターpMCS104613C2とMaoC発現組換えベクターp10499MaoCとにより形質転換した組換え大腸菌W3110(pMCS104613C2+p10499MacC)を利用した。
（実施例２）
前記実施例で作製された、fadB遺伝子が除去された突然変異大腸菌WB101と、fadB及びMoaC遺伝子がすべて除去された突然変異大腸菌WB106とを、それぞれMCL-PHA合成遺伝子組換えベクターpMCS104613C2、MaoC組換えベクターp10499MaoC及びMaoC組換えベクターpACYC104MaoCを用いて形質転換することにより、組換え大腸菌であるWB101(pMCS104613C2)、WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)、WB106(pMCS104613C2)及びWB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)を製造した。対照群としては、正常大腸菌W3110を、PHA合成遺伝子組換えベクターpMCS104613C2とMaoC発現組換えベクターp10499MaoCとにより形質転換した組換え大腸菌W3110(pMCS104613C2+p10499MacC)を利用した。
（実施例２）
組換え大腸菌のMCL-PHA合成能測定
前記実施例１−５でそれぞれ製造された対照群、組換え大腸菌である WB101(pMCS104613C2)、WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC) 、WB106(pMCS104613C2)及びWB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)のMCL-PHA合成能を測定するために、前記各組換え大腸菌を2g/Lのデカノン酸を含むLB培地(yeast extract 5g/L, peptone 10g/L, NaCl 5g/L)で４日間培養した。その後、培養物を2,500rpmで１５分間遠心分離し１００℃で乾燥した。公知の方法により乾燥した菌体からMCL-PHAを分離し、その含量を測定した。
前記実施例１−５でそれぞれ製造された対照群、組換え大腸菌である WB101(pMCS104613C2)、WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC) 、WB106(pMCS104613C2)及びWB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)のMCL-PHA合成能を測定するために、前記各組換え大腸菌を2g/Lのデカノン酸を含むLB培地(yeast extract 5g/L, peptone 10g/L, NaCl 5g/L)で４日間培養した。その後、培養物を2,500rpmで１５分間遠心分離し１００℃で乾燥した。公知の方法により乾燥した菌体からMCL-PHAを分離し、その含量を測定した。
得られたMCL-PHAの組成を測定するために、前記分離されたMCL-PHAはメタノリシス(methanolysis)を行い、3-ヒドロキシアルカン酸メチルエステル(3-hydroxyalkanoic acid methyl ester)に転換し、ガスクロマトグラフィ(Gas Chromatography:Donan Co., Korea)を利用して、3HB(3-3HB(3-hydroxybutyrate)、3HHx(3-hydroxyhexanoate)、3HO(3-hydroxyoctanoate)、3HD(3-hydroxydecanoate)及び3HDD(3-hydroxydodecanoate)の組成比を測定した。 この時、GCカラムとしてはシリカカラム(fused silica capillary column, Supelco SPBRM-5,30m 0.32mm ID 0.25m film, USA)を使用し、 安息香酸(benzoic acid, Sigma Chem. Co., USA)を標準物質(internal standard)として使用した(表１)。
上記表１に示すように、対照群、 大腸菌WB101(pMCS104613C2)及びWB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)からはMCL-PHAが生産されたが、maoC遺伝子が欠失した組換え大腸菌WB106(pMCS104613C2)からはMCL-PHAが生産されなかった。しかし、maoC遺伝子が欠失した組換え大腸菌にmaoC遺伝子を挿入した組換え大腸菌WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)からは再びMCL-PHAが生産されたことから、maoC遺伝子がMCL-PHAの生産に対して重要な役割を果たすことがわかった。
Langenbachなどは、phaC1Pa遺伝子を含む組換えベクターpBHR71により形質転換されたfadB突然変異大腸菌を用いて、細胞乾燥重量の21.1%(w/w)の含量でMCL-PHAを生産した(Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150: 303-9, 1997)。また、Tsugeなどは、シュードモナス由来のPHA合成遺伝子と、シュードモナス由来の(R)-特異的エノイル-CoAヒドラターゼ ((R)-specific enoyl-CoA hydratase)のphaJ1及びPhaJ2と、を発現させる組換え大腸菌を用いて、細胞乾燥重量の14及び29%(w/w)の含量でMCL-PHAを生産し、生産されたPHAは主に炭素数６のモノマーで構成される、ということが報告された(Tsuge et al. FEMS Microbiol. Lett., 184: 193-8, 2000)。
かかる従来の技術と比べたところ、本発明では、従来のMCL-PHA含量(14, 21.1及び29%(w/w))よりも高い含量(44.6%(w/w))でMCL-PHAを生産することができた。また、従来の方法で生産されたMCL-PHAは、主に炭素数６のモノマーで構成されるのに対して、本発明の方法で生産されたMCL-PHAは、炭素数６〜１０を有するモノマー(3HHx, 3HO, 3HD)から構成され、特に炭素数８〜１０を有するモノマー(3HO, 3HD)を多量含むことから、炭素数６のモノマーで構成される従来の方法で生産されたPHAよりもその応用分野が極めて広いということがわかった。
（実施例３）
（実施例３）
MaoCのエノイル-CoAヒドラターゼ活性(enoyl-CoA hydratase activity)測定
maoCプライマ２の代わりに、プライマHis-tag：5'-gctctagattaatggtgatgatggt gatgatcgacaaaatcaccg-3'(配列番号１１)が使われることを除いては、実施例１−２と同じ方法でPCR断片を収得した。また、tacプローモーター(tac promoter)を含むpTac99AベクターをSacI/XbaIで切断した後、前記収得したPCR断片を挿入して組換えベクターpTac99MaoCHを作製した（図４）。 前記pTac99Aベクターは、pKK223-3 (Pharmacia Biotech. Co., Uppsala, Sweden)ベクターをPvuII/EcoRIで切断して得たtacプロモーター(tac promoter)を、PvuII/EcoRIで切断したpTrc99A(Pharmacia Biotech. Co., Uppsala, Sweden)に挿入して作製した。図４は、maoC遺伝子を含む組換えベクターpTac99MaoCHの遺伝子を示した図である。 前記組換えベクターを用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、組換え大腸菌DH5α(pTac99MaoCH)を製造し、それをLB培地で１日間培養した後、IPTG 1mMを添加して蛋白質発現を誘導した後、菌体を収得し、次いで菌体を粉砕して得た粉砕物をＮＴＡカラム(Qiagen Ni-NTA kit, USA)に適用し、６個のヒスチジンを含むMaoC蛋白質を精製した。
maoCプライマ２の代わりに、プライマHis-tag：5'-gctctagattaatggtgatgatggt gatgatcgacaaaatcaccg-3'(配列番号１１)が使われることを除いては、実施例１−２と同じ方法でPCR断片を収得した。また、tacプローモーター(tac promoter)を含むpTac99AベクターをSacI/XbaIで切断した後、前記収得したPCR断片を挿入して組換えベクターpTac99MaoCHを作製した（図４）。 前記pTac99Aベクターは、pKK223-3 (Pharmacia Biotech. Co., Uppsala, Sweden)ベクターをPvuII/EcoRIで切断して得たtacプロモーター(tac promoter)を、PvuII/EcoRIで切断したpTrc99A(Pharmacia Biotech. Co., Uppsala, Sweden)に挿入して作製した。図４は、maoC遺伝子を含む組換えベクターpTac99MaoCHの遺伝子を示した図である。 前記組換えベクターを用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、組換え大腸菌DH5α(pTac99MaoCH)を製造し、それをLB培地で１日間培養した後、IPTG 1mMを添加して蛋白質発現を誘導した後、菌体を収得し、次いで菌体を粉砕して得た粉砕物をＮＴＡカラム(Qiagen Ni-NTA kit, USA)に適用し、６個のヒスチジンを含むMaoC蛋白質を精製した。
前記精製されたMaoC蛋白質と基質0.25mMクロトニル-CoA(crotonyl-CoA)とを、反応緩衝溶液(50mM Tris-HCl、pH8.0)に加えて混合し、反応させることにより、263nmの波長で吸光度が減少することを利用して、エノイル-CoAヒドラターゼ活性を測定した。この際、生成物であるエノイル-CoAチオエステル(enoyl-CoA thioester)のε263は6700M-1cm-1で計算した。その結果、MaoC蛋白質はクロトニル-CoAに対して47.6U/mgのエノイル-CoAヒドラターゼ活性を示す、ということが明らかになった。
Claims (5)
- 以下から選ばれる少なくとも１の塩基配列により表されるエノイル-CoAヒドラターゼ活性を示す蛋白質をコードするmaoC遺伝子を含む、MCL-PHA製造用組換えベクターで形質転換されたMCL-PHA製造用微生物を用いて、該遺伝子を発現させエノイル-CoAヒドラターゼ活性を示す蛋白質を生成することを含む、MCL-PHAの製造方法：
１）配列番号２、
２）配列番号２の相補配列、
３）上記１）又は２）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列。 - 前記微生物は、fadB遺伝子が除去され、PHA合成遺伝子を含むことを特徴とする請求項１記載のMCL-PHAの製造方法。
- 前記微生物は、PHA合成遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換されるか、或いは染色体上にPHA合成遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項２記載のMCL-PHA製造方法。
- 前記PHA合成遺伝子はphaCであることを特徴とする請求項３記載のMCL-PHA製造方法。
- 前記微生物を炭素源C6-10を含む培地で培養する段階と、炭素数C6-10のモノマーで構成されたPHAを収得する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１記載のMCL-PHAの製造方法。
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