KR100447535B1

KR100447535B1 - Ｐ(3ＨＢ-ｃｏ-3ＨＡ)를 생산하는 재조합 박테리아 시스템

Info

Publication number: KR100447535B1
Application number: KR10-2002-0010324A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박시재; 박종필; 한미정
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2004-09-08
Also published as: KR20030070789A

Abstract

본 발명은 지방산 분해대사경로 중 일부가 제거되고 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA) 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 그를 이용하여 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발현벡터는 PHA 합성유전자(phaC), β-케토티올라제(β-ketothiolase) 합성유전자(phaA) 및 NADPH 의존적 아세토아세틸-CoA 환원효소(NADPH dependent acetoacetyl-CoA reductase) 합성유전자(phaB)를 포함한다. 본 발명에 의하면, 종래의 방법에 비하여 기존의 합성고분자와 유사한 물성을 가지는 3HB를 높은 비율로 함유하는 PHA를 다량으로 생산할 수 있으므로, 이를 이용한 신소재의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

Ｐ(3ＨＢ-ｃｏ-3ＨＡ)를 생산하는 재조합 박테리아 시스템{Recombinant Bacterial System for Producing P(3HB-co-3HA)}

본 발명은 폴리(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시알카노에이트(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoate, P(3HB-co-3HA))의 생합성을 위한 재조합 박테리아 시스템에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 지방산 분해대사경로 중 일부가 제거되고 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA) 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 그를 이용하여 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 생산하는 방법에 관한 것이다.

PHA는 미생물이 과도한 탄소원이 존재하면서, 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 에너지나 탄소원 저장물질로 미생물 내부에 축적되는 폴리에스테르(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에, 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다. 기존에 알려진 PHA는 대표적으로 짧은 탄소수를 가진 SCL-PHA(short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가진 MCL-PHA(medium-chain-length PHA)로 나눌 수 있다. 짧은 탄소수를 가진 PHA의 대표적인 물질로 폴리하이드록시부티레이트(P(3HB))가 있으며, 이를 합성하는 유전자는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)와 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus)로부터 클로닝되어있어, 이를 함유하고 있는 재조합 대장균이 포도당으로부터 P(3HB)를 합성할 수 있다고 보고되었다(참조: Schubert et al., J. Bacteriol., 170:5837-5847(1988); Lee et al., Biotechnol. Lett., 19:1033-1035(1997); Wang and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 63:4765-4769(1997); Wang and Lee, Biotechnol. Bioeng., 58:325-328(1998); Kim et al., Biotechnol. Lett., 14:811-816(1992); Ahn et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:3624-3627(2000); Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903(1998)). 또한, 긴 탄소수를 가진 PHA를 합성하는 유전자는 주로 슈도모나스 속(Pseudomonasspp.) 미생물로부터 클로닝되었으며, 재조합 대장균을 통해 긴 탄소수를 가진 PHA를 합성할 수 있고, 특히 지방산분해대사 경로 중 fadB를 제거한 재조합 대장균을 사용하거나 재조합 대장균의 fadA의 활성을 화학물질에 의해 억제함으로써, 긴 탄소수의 MCL-PHA생산을 할 수 있음이 보고되었다(참조: Qi et al., FEMS Microbiol Lett., 157:155-162(1997); Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89-94(1998); Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303-309(1997); Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155-162(1997); Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89-94(1998)).

최근에는, 특이하게도 짧은 탄소수와 긴 탄소수의 모노머(monomer)로 함께 이루어진 PHA를 합성할 수 있는 미생물도 분리되어 연구되었는데, 대표적인 미생물로는 에어로모나스 속(Aeromonassp.) 미생물과 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) 미생물인데, 슈도모나스 속 미생물 61-3을 이용하여 PHA 합성에 관여하는 상기 유전자를 클로닝하고, 이를 이용하여 제조한 재조합 대장균이 지방산으로부터 P(3HB-co-3HA)를 합성할 수 있음이 보고되었다(참조: Fukui and Doi, J. Bacteriol., 180:667-673(1998); Fukui and Doi., J. Bacteriol., 179:4821-4830(1999); Fukui et al., Biotechnol. Lett., 19:1093-1097(1997); Tsuge et al., FEMS. Microbiol. Lett., 184:193-198(2000); Brandl et al., Int. J. Biol. Macromol., 49-55(1989); Hall et al., Can. J. Microbiol., 44:687-691(1998); Haywood et al., Int. J. Biol. Macromol., 13:83-87(1991); Lieberygesell et al., Arch. Microbiol., 55:415-421(1991); Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 67:240-244(2000); Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459-6467(1998); Tsuge et al., FEMS. Microbiol. Lett., 184:193-198(1999)). 그러나, 상기 방법으로 생산된 재조합 대장균으로부터 생산된 P(3HB-co-3HA) 경우, 3HB의 조성이 몰비율로 약 20% 정도에 불과하여 합성고분자를 대체하여 사용하기에는 물성이 좋지 않은 단점이 있었다.

최근에는 기존의 합성고분자인 저밀도 폴리에틸렌(low density polyethylene, LDPE)과 유사한 물성을 갖는 P(3HB-co-3HA) 생산을 보고하였는데,phaC유전자가 제거된 돌연변이 슈도모나스 속 미생물 61-3을 랄스토니아 유트로파 유래의 PHA 합성유전자phaAB _Re 와 슈도모나스 속 미생물 61-3 유래의 합성유전자phaC1 _Ps 를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환하고, 글루코스가 함유된 배지에서 전기 재조합 균주를 배양한 결과, 94mol%의 3HB가 함유된 P(3HB-co-3HA)를 생산할 수 있음을 보고하였다(참조: Matsusaki et al., Biomacromolecules, 1:17-22(2000); WO 0043523; USP 5,498,692; USP 5,990,271; USP 6,013,590; WO 0037528; WO 0130892; WO 0130893).

상술한 바와 같이, 짧은 탄소수와 긴 탄소수를 가진 모노머를 동시에 함유한 PHA는 그것의 물성이 기존의 상용 고분자와 비슷하기 때문에 산업계의 큰 관심을 얻어 왔다. 그러나, 이제까지 PHA 생산에 가장 효율적인 것으로 결과가 나온 재조합 대장균의 경우 이러한 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 생산할 수 있도록 개발되지 못하였기 때문에, 기존의 합성고분자와 유사한 물성을 가지면서 생분해성을 동시에 가지는 PHA를 고효율로 생산할 수 있는 재조합 대장균 시스템의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 종래의 합성고분자와 유사한 물성을 가지면서 생분해성을 동시에 가지도록 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 생산할 수 있는 재조합 대장균 시스템을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 짧은 탄소수와 긴 탄소수 단량체 모두에 기질 특이성을 가지는 PHA 합성유전자(phaC), β-케토티올라제(β-ketothiolase) 합성유전자(phaA) 및 NADPH 의존적 아세토아세틸-CoA 환원효소(NADPH dependent acetoacetyl-CoA reductase) 합성유전자(phaB)를 함유하고 있는 재조합 발현벡터를 제작하고, 이를 이용하여 형질전환된 재조합 대장균이 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 고효율로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 고효율로 생산할 수 있는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 재조합 대장균을 이용하여 P(3HB-co-3HA)를 고효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 P(3HB-co-3HA)가 합성되는 경로를 나타내는 모식도이다.

도 2는 재조합 플라스미드 pKO3fadAKm의 유전자 지도이다.

도 3은 재조합 플라스미드 pKO3fadBKm의 유전자 지도이다.

도 4는 재조합 플라스미드 pKO3fadABKm의 유전자 지도이다.

도 5는 재조합 플라스미드 p104613C2ReABstb의 유전자 지도이다.

본 발명의 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 생산할 수 있는 재조합 발현벡터는 PHA 합성유전자(phaC), β-케토티올라제(β-ketothiolase) 합성유전자(phaA) 및 NADPH 의존적 아세토아세틸-CoA 환원효소(NADPH dependent acetoacetyl-CoA reductase) 합성유전자(phaB)를 포함하는데, 이때 PHA 합성유전자(phaC)는 PHA 합성유전자(phaC)는 탄소수 3-5의 짧은 단량체와 탄소수 6-14의 긴 단량체 모두에 기질 특이성을 가지는 것을 특징으로 하고,phaC는 슈도모나스 속 미생물로부터 유래된 것을 사용함이 바람직하며,phaA및phaB는 랄스토니아 속 미생물로부터 유래된 것을 사용함이 바람직하다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

대장균과 같은 박테리아에서 지방산은 fad계열의 효소의 영향으로 아실-CoA 계열의 중간체 화합물로 전환된 후, PHA 합성효소에 의하여 PHA로 생합성된다. 다른 방법으로는 pha계열 효소의 영향으로 아실-CoA 계열의 중간체 화합물이 전환되거나 또는 섭취된 당류로 부터 전환된 아세틸-CoA계열 중간체 화합물로 전환된 후, PHA 합성효소에 의하여 PHA로 생합성된다(참조: 도 1). 이때, fad계열의 효소인 fadD와 fadF는 지방산을 PHA 합성의 전구체로 사용되는 아실-CoA 계열의 중간체 화합물로 전환시키고, pha계열 효소인 phaA와 phaB는 아세틸-CoA를 통한 PHA 생합성 경로를 담당하며, fad계열의 효소인 fadA와 fadB는 PHA 합성의 전구체로 사용되는 아실-CoA 계열의 중간체 화합물을 초기형태로 환원시킨다.

본 발명에서 사용된 짧은 탄소수와 긴 탄소수의 단량체 모두에 기질 특이성을 가지는Pseudomonassp. 61-3 유래의 PHA 합성 유전자를 도이 등이 보고한 바 있는데, 이 PHA 합성유전자를 함유한 플라스미드 pBSEB50를 획득하였다(참조: Doi et al., Macromolecules, 28:4822-4828(1995); Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459-6467(1998)). 이에, 본 발명자들은 PHA 합성유전자를 클로닝하고자, 먼저, 슈도모나스 속 미생물 61-3의 PHA 합성유전자phaC2 _Ps 의 유전자 서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응(PCR)으로phaC2 _Ps 유전자를 증폭시켰다. 이어, 발현벡터를 만들기 위해 우선 랄스토니아 유트로파 PHA 합성유전자를 함유한 플라스미드 pSYL107(참조: Lee and Chang, Ann. NY Acad. Sci., 782:133-142(1996))로부터phaAB _Re 유전자를 제한효소PstI으로 절단한 다음, 유전자 절편을 pBluescript SK(-)의PstI 인식부위에 삽입하고, PHA 합성 유전자를 재조합 대장균에서 지속적으로 발현하기 위한 지속발현 프로모터인gntT104프로모터(참조: Peekhaus and Conway, J. Bacteriol., 180:1777-1785(1998))와 DNA중합효소반응으로 증폭된Pseudomonassp. 61-3의 PHA 합성유전자phaC2 _Ps 를phaAB _Re 유전자가 미리 삽입된 플라스미드의SacI/BamHI 인식부위에 삽입하여, 재조합 발현벡터 p104613C2ReABstb를 제조하였다. 또한, 숙주세포로 사용하기 위하여fadA가 소실(knock-out)된 대장균 WA101,fadB가 소실된 WB101,fadAB가 소실된 WAB101를 동형 재조합(homologous recombination) 방법을 이용하여 제작하고, 각각을 전기충격법에 의하여 상기 p104613C2ReABstb 벡터로 형질전환시켜서, 상기 유전자를 발현하는 각각의 재조합 대장균인 WA101(p104613C2ReABstb), WB101(p104613C2ReABstb) 및 WAB101(p104613C2ReABstb)을 제작하였는데, 이들을 탄소수가 10개인 데카논산(sodium decanoate)과 같은 지방산 또는 지방산과 당류를 포함하는 배지에서 배양할 경우, P(3HB-co-3HA)를 합성할 수 있음을 확인할 수 있었다.

특히, 높은 분율의 3HB를 함유하고 있는 P(3HB-co-3HA)를 생산하기 위해서, 글루콘산(sodium gluconate)과 데카논산이 첨가된 생산배지에 위의 재조합 대장균을 접종하고, 호기적 조건하에서 배양한 결과, 3-히드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate, 3HB), 3-히드록시헥사노에이트(3-hydroxyhexanoate, 3HHx), 3-히드록시옥타노에이트(3-hydroxyoctanoate, 3HO) 및 3-히드록시데카노에이트(3-hydroxydecanoate, 3HD)로 구성된 P(3HB-co-3HA)를 생산하였다. 또한, 생산된 P(3HB-co-3HA)은 그 물성이 상용고분자인 LDPE와 물성이 비슷한 것으로 확인된 모노머 조성 중, 3HB의 비율이 높음을 알 수 있었다(참조: Matsusaki et al., Biomacromolecules, 1:17-22(2000)).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 대장균 W3110 의 염색체 DNA 분리

대장균 W3110 의 염색체 DNA를 샘브룩(Sambrook) 등의 방법에 따라 분리 정제하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1989)). 즉, 대장균 W3110을 500mL의 LB 배지에서 24시간 동안 배양하고, 원심분리에 의하여 균체를 회수한 다음, 10mg/mL의 리소자임(lysozyme, Sigma Chem. Co., USA)이 포함되어 있는 TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.6) 50mL에 현탁시켰다. 전기 균주 현탁액을 24시간 동안 서서히 교반하면서 상온에서 배양하고, 10% 소디움 도데실 설페이트(SDS) 용액 16mL과 20mg/mL의 프로티네이즈 K(proteinase K, Sigma Chem. Co., USA) 570㎕를 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 5M 염화나트륨 용액 14mL과 0.7M 염화나트륨 용액에 용해되어 있는 10% 세틸트리메틸암모니움브로마이드(cetyltrimethylammoniumbromide, CTAB, Sigma Chem. Co., USA) 10.66mL을 첨가한 다음, 65℃에서 10분간 반응시키고, 전기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol=24:1(v/v))을 가한 후, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 전기 혼합액을 6,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 수득하고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 DNA를 침전시킨 후, 침전된 DNA를 유리봉으로 수득하였다. 전기 유리봉을 자연건조시켜 에탄올을 제거하고, 1mL TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)에 DNA 를 용해시켰다. 전기 DNA 용액에 RNase(Sigma Chem. Co., USA)를 최종농도50㎕/mL이 되도록 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 다음, 다시 전기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol = 24:1(v/v))을 가하고, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 전기 혼합액을 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 비이커에 옮겨 담고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 DNA 를 침전시킨 후, 유리봉으로 DNA를 말아서 감아 올렸다. 전기 유리봉을 자연 건조시켜 에탄올을 제거하고, 최종적으로 1mL TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)에 정제된 대장균 W3110의 염색체 DNA 를 용해시켰다.

실시예 2: 지방산 분해경로가 제거된 돌연변이 대장균의 제작

대장균 W3110의 지방산 분해경로를 제거하기 위해, 동형재조합(homologous recombination) 방법을 사용하였으며, 이를 위하여 지방산 분해경로의 유전자들 중fadA, fadB, fadAB의 중앙에 카나마이신 저항 효소가 삽입된 플라스미드를 제조하였다(참조: Link et al., J. Bacteriol., 179:6228-6237(1997)). 이를 위하여, 실시예 1에서 분리된 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여, fadA, fadB의 유전자를 5'말단기로부터 600 bp, 3'말단기로부터 600bp씩 PCR(94℃에서 50초간 변성, 52℃에서 50초간 서냉복원, 72℃에서 2분간 신장, 총 30주기)을 수행하였다.

fadAnotI 5'-ataagaatgcggccgcatggaacaggttgtcattgtc-3'(서열번호 1)

fadAxbaI 5'-gctctagaggcatcctgcatttcacggct-3'(서열번호 2)

fadAEcorI 5'-ggaattctttgccgcgcggtcacacgcc-3'(서열번호 3)

fadAsalI 5'-acgcgtcgacttaaacccgctcaaacaccgt-3'(서열번호 4)

fadBnotI 5'-ataagaatgcggccgcatgctttacaaaggcgacaccctgtac-3'(서열번호 5)

fadBxbaI 5'-gctctagagcctggcgtaaaaccgcctttc-3'(서열번호 6)

fadBEcorI 5'-ggaattcttccgcaagatcgacaaag-3'(서열번호 7)

fadBsalI 5'-acgcgtcgacttaagccgttttcaggtcgcc-3'(서열번호 8)

한편, 카나마이신 유전자를 얻기 위해 플라스미드 pACYC177(참조: Chang et al., J. Bacteriol., 134:141-1156(1978))를 주형으로 사용하고, 하기의 프라이머를 사용하여 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.

cana1 5'-gctctagagccacgttgtgtctcaaa-3'(서열번호 9)

cana2 5'-cgaattcttagaaaaactcatcgagca-3'(서열번호 10)

상기 프라이머로 증폭된 유전자 중,fadB유전자의 5'말단기로부터 증폭된 600bp는 pBluescript SK(-) 플라스미드의NotI/XbaI인식부위에 삽입하고, 3'말단기로부터 증폭된 600bp는 pBluescript SK(-) 플라스미드의EcoRI/SalI 인식부위에 삽입하며, 카나마이신 저항 유전자는 상기 제조된 플라스미드의XbaI/EcoRI 인식부위에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하고,fadA유전자가 삽입된 플라스미도 역시fadB의 경우와 같은 방식으로 제작하였다. 또한, 대장균의fadA와fadB는fadB와fadA의 순서로 하나의 오페론(operon)을 형성하고 있기 때문에, 5'말단기부터는fadB의 600 bp를 3'말단기로부터는fadA를 상기한 방법으로 PCR을 수행한 후 동일한 방법으로 플라스미드를 제작하였다.

상기 제조된 각각의 플라스미드에서fad유전자와 카나마이신 유전자를NotI/SalI으로 잘라내어 pKO3 플라스미드에 삽입하였다. 즉,fadA유전자 및 카나마이신 유전자를 pKO3 플라스미드에 삽입시켜서 재조합 플라스미드 pKO3fadAKm를 제조하고(참조: 도 2),fadB유전자 및 카나마이신 유전자를 pKO3 플라스미드에 삽입시켜서 재조합 플라스미드 pKO3fadBKm를 제조하였으며(참조: 도 3),fadA유전자,fadB유전자 및 카나마이신 유전자를 pKO3 플라스미드에 삽입시켜서 재조합 플라스미드 pKO3fadABKm를 제조하였다(참조: 도 4).

상기 제조된 각각의 재조합 플라스미드로 대장균 W3110을 형질전환시키고, 공지된 방법에 의하여 지방산 분해경로 중 일부가 제거된 돌연변이 대장균을 제조하였다(참조: Link et al., J. Bacteriol., 179:6228-6237(1997)). 이에,fadA가 제거된 대장균은 'WA101', fadB가 제거된 대장균은 'WB101',fadA와fadB가 제거된 대장균은 'WAB101'이라 각각 명명하였다.

실시예 3: PHA 합성유전자phaC2 _Ps 와phaAB _Re 를 함유하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환된 대장균의 제작

먼저, 슈도모나스 속(Pseudomonasspp.) 미생물 61-3으로부터 분리된 PHA 합성유전자phaC2 _Ps 와 랄스토니아 유트로파로부터 분리된 PHA 합성유전자phaAB _Re 를 함유하고 있는 재조합 발현벡터를 제조하였다.

슈도모나스 속 미생물 61-3의 PHA 합성 유전자를 함유한 플라스미드 pBSEB50을 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여 PCR(94℃에서 50초간 변성, 52℃에서 50초간 서냉복원, 72℃에서 2분간 신장, 총 30주기)을 수행하였다.

phaC2_Ps-1 5'-cgcggatccaataaggagatatctagatgagagagaaaccaacgccg-3'(서열번호 11)

phaC2_Ps-2 5'-cggatccccgggtaccgagctcgaattctcagcgcacgcgcacgtaggta-3'(서열번호 12)

상기 PCR 반응산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과,phaC2Ps유전자에 해당하는 1.7 kb 크기의 유전자 절편을 확인하였다.

또한, PHA 합성유전자의 지속적으로 발현하도록gntT104프로모터를 증폭시키기 위하여, 대장균 W3110 염색체 유전자를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여, PCR(94℃에서 50초간 변성, 52℃에서 50초간 서냉복원, 72℃에서 2분간 신장, 총 30주기)을 수행하였다(참조: Peekhaus and Conway, J. Bacteriol., 180:1777-1785(1998))

gntT104-1 5'-gactagttgaaaggtgtgcgcgatctcac-3'(서열번호 13)

gntT104-2 5'-gcggatcccatttgttatgggcgacgtcaattt-3'(서열번호 14)

상기 PCR 반응산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과, 400bp 크기의 유전자 절편을 확인하였다. 상기 증폭된phaC2 _Ps 는 pBluescript SK(-)의BamHI 인식부위에 삽입하고,gntT104프로모터는 pBluescript SK(-)의SpeI/BamHI 인식부위에 삽입하였다.

한편, 플라스미드 pSYL107에PstI 효소를 처리하여, 랄스토니아 유트로파의phaAB _Re 에 해당하는 유전자를 수득하고, 이를 pBluescript SK(-) 벡터의PstI 인식부위에 삽입하였다(참조: Lee et al., Biotechnol. Lett., 16:1247-1252(1994)).gntT104프로모터와phaC2 _Ps 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에SacI/BamHI 절단효소를 처리하여gntT104프로모터와phaC2 _Ps 유전자를 수득하고, 이를 랄스토니아 유트로파의phaAB _Re 가 삽입된 벡터의SacI/BamHI에 삽입한 다음, 플라스미드 안정성을 높이기 위해 pSYL107로부터parB(hok/sok)유전자를 수득하여, 전기 플라스미드의EcoRI/HindIII 인식부위에 삽입하여 재조합 발현벡터인 p104613C2ReABstb를 제조하였다(참조: 도 5). 이어, 실시예 2에서 제조된 대장균 WA101, WB101 및 WAB101을 상기 재조합 발현벡터 p104613C2ReABstb로 형질전환시켜서, PHA 합성유전자를 발현하는 재조합 대장균 WA101(p104613C2ReABstb), WB101(p104613C2ReABstb) 및 WAB101(p104613C2ReABstb)을 제작하였다.

실시예 4: 재조합 대장균의 PHA 합성능 측정

상기 실시예 3에서 제조한 각각의 재조합 대장균의 PHA 합성능을 확인하기 위하여, 각 재조합 대장균을 데카논산 2g/L가 포함된 LB 배지와 글루콘산 10g/L 와 데카논산 2g/L 이 동시에 포함된 LB 배지에서 4일 동안 각각 배양하였다. 배양 후, 2,500rpm에서 15분 동안 원심분리하여, 각 균체를 수득하고, 100℃에서 건조하였다.

PHA의 조성은 건조된 균체에 메탄올을 처리하여 PHA를 3-히드록시알칸산 메틸에스테르(3-hydroxyalkanoic acid methyl ester)로 전환시키고, 이를 가스크로마토그래피(gas chromatography, Donan Co., Seoul, Korea)로 측정하고, 이의 단량체인 3HB, 3HHx, 3HO 및 3HD의 조성비를 측정하였다. 이때, GC 컬럼으로는 실리카컬럼(fused silica capillary column, Supelco SPBTM-5, 30m 0.32mm ID 0.25m film, USA)을 사용하였으며, 표준용액(internal standard)으로는 벤조산(benzoic acid, Sigma Chem. Co., USA)을 사용하였다(참조: 표 1).

재조합 대장균을 이용한 PHA생산

균주	배지	DCW (g/L)	PHA (g/L)	PHA (wt%)	조성비(mol%)
균주	배지	DCW (g/L)	PHA (g/L)	PHA (wt%)	3HB	3HHx	3HO	3HD
WA101	데카논산	1.9	0.60	31.4	34	63	3	0
WA101	글루콘산+데카논산	3.92	1.90	48.4	89	8	2	1
WB101	데카논산	1.2	0.3	25.5	86	10	4	0
WB101	글루콘산+데카논산	3.48	0.88	25.3	87	11	1	1
WAB101	데카논산	1.25	0.31	25.0	70	26	3	1
WAB101	글루콘산+데카논산	4.15	1.34	32.3	95	2	2	1

상기 표 1에서 보듯이, 각 재조합 대장균으로부터 P(3HB-co-3HA)가 생성됨을 확인할 수 있었다.

도이(Doi) 등은 짧은 탄소수의 SCL-PHA의 대표격인 3HB와 긴 탄소수의 MCL-PHA 모노머로 이루어진 SCL-MCL PHA에 있어서, SCL과 MCL의 조성에 따라 고분자 물성이 크게 좌우됨을 보고하였다(참조: Doi et al., Macromolecules, 28:4822-4828(1995); Matsusaki et al., Biomacromolecules, 1:17-22(2000)). 또한, 쯔게(Tsuge) 등은 두 가지 PHA합성 유전자를 재조합 대장균에 도입하여 서로 다른 몰조성의 PHA 생산을 보고하였는데, P(3HB-co-3HA)의 생산시 3HB의 조성이 10mol%이하로서 합성고분자를 대체하기에는 물성이 좋지 않다는 단점이 있다(참조: Tsuge et al., FEBS. Microbiol. Lett., 184:193-198(1999)).

상기 공지된 쯔게의 자료와 비교하여, 본 발명의 방법으로 생산된 P(3HB-co-3HA)는 3HB의 조성이 현저히 증가됨을 알 수 있었는 바, 기존의 합성고분자와 유사한 물성을 가지는 PHA를 재조합 대장균으로부터 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 지방산 분해대사경로 중 일부가 제거되고 PHA 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 그를 이용하여 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 종래의 방법에 비하여 기존의 합성고분자와 유사한 물성을 가지는 3HB를 높은 비율로 함유하는 PHA를 다량으로 생산할 수 있으므로, 이를 이용한 신소재의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Bacterial System for Producing P(3HB-co-3HA) <160> 14 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAnotI <400> 1 ataagaatgc ggccgcatgg aacaggttgt cattgtc 37 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAxbaI <400> 2 gctctagagg catcctgcat ttcacggct 29 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAEcorI <400> 3 ggaattcttt gccgcgcggt cacacgcc 28 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAsalI <400> 4 acgcgtcgac ttaaacccgc tcaaacaccg t 31 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBnotI <400> 5 ataagaatgc ggccgcatgc tttacaaagg cgacaccctg tac 43 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBxbaI <400> 6 gctctagagc ctggcgtaaa accgcctttc 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBEcorI <400> 7 ggaattcttc cgcaagatcg acaaag 26 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBsalI <400> 8 acgcgtcgac ttaagccgtt ttcaggtcgc c 31 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cana1 <400> 9 gctctagagc cacgttgtgt ctcaaa 26 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cana2 <400> 10 cgaattctta gaaaaactca tcgagca 27 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phaC2Ps-1 <400> 11 cgcggatcca ataaggagat atctagatga gagagaaacc aacgccg 47 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phaC2Ps-2 <400> 12 cggatccccg ggtaccgagc tcgaattctc agcgcacgcg cacgtaggta 50 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gntT104-1 <400> 13 gactagttga aaggtgtgcg cgatctcac 29 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gntT104-2 <400> 14 gcggatccca tttgttatgg gcgacgtcaa ttt 33

Claims

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폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 합성관련 효소 중 PHA 합성유전자(phaC), β-케토티올라제(β-ketothiolase) 합성유전자(phaA) 및 NADPH 의존적 아세토아세틸-CoA 환원효소(NADPH dependent acetoacetyl-CoA reductase) 합성유전자(phaB)를 포함하고, 도 5의 유전자지도를 갖는 재조합 발현벡터 p104613C2ReABstb.
fadA유전자,fadB유전자 또는 전기 두 유전자가 모두 결실된 대장균을 제 5항의 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체.
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제 6항에 있어서,

형질전환체는 대장균 WA101(p104613C2ReABstb),

대장균 WB101(p104613C2ReABstb) 또는

대장균 WAB101(p104613C2ReABstb)인 것을 특징으로 하는

형질전환체.
제 8항의 형질전환체를 지방산을 함유하거나 또는 지방산과 당류(carbohydrate)를 동시에 함유하는 배양배지를 사용하여 배양하고, 이로부터 P(3HB-co-3HA)를 수득하는 단계를 포함하는 PHA의 제조방법.
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