KR100447531B1 - Ｍｃｌ-ｐｈａ를 생산하는 재조합 박테리아 시스템 - Google Patents

Ｍｃｌ-ｐｈａ를 생산하는 재조합 박테리아 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방산 분해대사경로 중 일부가 제거되고 PHA 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 그를 이용하여 MCL-PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 MCL-PHA를 생산할 수 있는 재조합 발현벡터는 PHA 합성유전자(phaC)와,fadF유전자 및/또는fadD유전자를 포함한다. 본 발명에 의하면, 종래의 방법에 비하여 MCL-PHA를 다량으로 생산할 수 있고, 이들의 모노머의 조성을 변형시킬 수 있으므로, 이를 이용한 신소재의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＭＣＬ-ＰＨＡ를 생산하는 재조합 박테리아 시스템{Recombinant Bacterial System for Producing MCL-PHA}
본 발명은 중간사슬길이 폴리하이드록시알카노에이트(medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates), MCL-PHA)의 생합성을 위한 재조합 박테리아 시스템에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 지방산 분해대사경로 중 일부가 제거되고 PHA 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 그를 이용하여 MCL-PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
PHA는 미생물이 과도한 탄소원이 존재하면서, 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 에너지나 탄소원 저장물질로 미생물 내부에 축적되는 폴리에스테르(polyester)이다. PHA는 종래의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에, 종래의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다. 종래에 알려진 PHA는 대표적으로 짧은 탄소수를 가진 SCL-PHA(short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가진 MCL-PHA(medium-chain-length PHA)로 나눌 수 있는데, 짧은 탄소수를 가진 PHA의 대표적인 물질로 폴리하이드록시부티레이트(poly(3-hydroxybutyrate, P(3HB))가 있고, 이를 합성하는 유전자는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)와 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus)로부터 클로닝되어 있어, 이를 함유하고 있는 재조합 대장균이 포도당으로부터 P(3HB)를 합성할 수 있다고 보고되었다(참조: Schubert et al., J. Bacteriol. 170:5837-5847(1988); Lee et al., Biotechnol. Lett. 19:1033-1035(1997); Wang and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 63:4765-4769(1997); Wang and Lee, Biotechnol. Bioeng., 58:325-328(1998); Kim et al., Biotechnol. Lett., 14:811-816(1992); Ahn et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:3624-3627(2000); Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903(1998)). 또한, 긴 탄소수를 가진 PHA를 합성하는 유전자는 슈도모나스 속 미생물(Pseudomonassp.)로부터 클로닝되었으며, 역시 재조합 미생물을 통해 긴 탄소수를 가진 PHA를 합성할 수 있다고 보고되었다(참조: Qi et al., FEMS. Microbiol.Lett., 157:155-162(1997); Qi et al., FEMS. Microbiol. Lett., 167:89-94(1998); Langenbach et al., FEMS. Microbiol. Lett., 150:303-309(1997); WO 0155436; USP 6,143,952; WO 9854329; WO 9961624).
그러나, 상술한 방법으로 MCL-PHA를 생산하면 PHA를 구성하고 있는 모노머의 조성을 인위적으로 바꿀 수 없으며, PHA 합성유전자의 기질특이성에 의존할 수밖에 없었기 때문에, 종래의 합성고분자와 유사한 물성을 가지면서 생분해성을 동시에 가지는 MCL-PHA을 고효율로 생산할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 MCL-PHA을 고효율로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, MCL-단량체를 기질로 사용할 수 있는 PHA 합성유전자(phaC)와 대장균 염색체에서 분리한 지방산분해대사 유전자인fadD또는fadF를 함께 발현시키는 재조합 발현벡터를 제작하고, 이를 이용하여 형질전환된 재조합 대장균이 MCL-PHA를 고효율로 생산할 수 있고, 이들의 모노머 중에서 3-히드록시데카노에이트(3-hydroxydecanoate, 3HD) 또는 3-히드록시도데카노에이트(3-hydroxydodecanoate, 3HDD)의 몰분율을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 MCL-PHA를 고효율로 생산할 수 있는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 재조합 대장균을 이용하여 MCL-PHA를 고효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 MCL-PHA가 합성되는 경로를 나타내는 모식도이다.
도 2는 재조합 플라스미드 pKO3fadAKm의 유전자 지도이다.
도 3은 재조합 플라스미드 pKO3fadBKm의 유전자 지도이다.
도 4는 재조합 플라스미드 pKO3fadABKm의 유전자 지도이다.
도 5는 재조합 플라스미드 p10499613C2의 유전자 지도이다.
도 6은 재조합 플라스미드 pACYC104fadFD의 유전자 지도이다.
본 발명의 MCL-PHA를 생산할 수 있는 재조합 발현벡터는 PHA 합성유전자(phaC)와,fadF유전자 및/또는fadD유전자를 포함하는데, 이때phaC는 탄소수 6-14의 긴 단량체 모두에 기질 특이성을 가지는 것을 특징으로 하고,phaC는 슈도모나스 속 미생물로부터 유래된 것을 사용함이 바람직하다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
대장균과 같은 박테리아에서 지방산은 fad계열의 효소의 영향으로 아실-CoA 계열의 중간체 화합물로 전환된 후, PHA 합성효소에 의하여 PHA로 생합성된다(참조: 도 1). 이때, fad계열의 효소 중 fadD와 fadF는 지방산을 PHA 합성의 전구체로 사용되는 아실-CoA 계열의 중간체 화합물로 전환시키고, fadA와 fadB는 PHA 합성의 전구체로 사용되는 아실-CoA 계열의 중간체 화합물을 초기형태로 환원시키므로, 본 발명자들은 fadA와 fadB의 활성을 저해시키고, fadD와 fadF의 활성을 향사시키려 하였다.
먼저, PHA 합성유전자를 함유한 플라스미드 pBSEB50를 획득하고, 이로부터 PHA 합성유전자를 클로닝하고자, 슈도모나스 속 미생물 61-3의 PHA 합성유전자phaC2 Ps 의 유전자 서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응(PCR)으로phaC2 Ps 유전자를 증폭시켰다. 이어, PCR 방법에 의하여 증폭된gntT104프로모터를 미리 EcoRV/EcoRI으로 절단된 pTrc99A에 삽입시켜서, p10499A 발현벡터를 제조하였다. 그런 다음, 증폭된phaC2 Ps 유전자를 EcoRI/HindIII로 절단된 p10499A 발현벡터에 삽입하여, 재조합 발현벡터 p10499613C2를 제조하였다.
한편, 대장균 염색체에서부터 분리된 프로모터gntT104,fadD및fadF를 pBluescript SK(-)에 삽입시켜서, 재조합 발현벡터 pBlue104fadFD를 제조하고, SspI으로 삽입된 3가지 유전자들을 절단하고EcoRV로 절단한 pACYC184 플라스미드에 삽입하여 재조합 발현벡터 pACYC104fadFD를 제조하였다
상기 제조된 재조합 발현벡터에 의하여, 형질전환된 재조합 대장균 WA101(W3110fadA:K m ), WB101(W3110fadB:K m ), WAB101(W3110fadB:K m ), KA101(KS272fadB:K m ), KB101(KS272fadB:K m ) 및 KAB101(KS272fadB:K m )은 탄소수가 10개인 데카논산 및 12개인 도데카논산으로부터 MCL-PHA를 생산할 수 있었고, 이들은 3-히드록시헥사노에이트(3-hydroxyhexanoate, 3HHx), 3-히드록시옥타노에이트(3-hydroxyoctanoate, 3HO), 3HD 및 3HDD를 모노머로서 포함하며,fadF와fadD의 발현에 따라 3HD과 3HDD 모노머의 조성을 조절할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 대장균 W3110 의 염색체 DNA 분리
대장균 W3110 의 염색체 DNA를 샘브룩(Sambrook) 등의 방법에 따라 분리하였다(Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1989)). 즉, 대장균 W3110을 500mL의 LB 배지에서 24시간 동안 배양하고, 원심분리에 의하여 균체를 회수한 다음, 10mg/mL의 리소자임(lysozyme, Sigma Chem. Co., USA)이 포함되어 있는 TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.6) 50mL에 현탁시켰다. 전기 균주 현탁액을 24시간 동안 서서히 교반하면서 상온에서 배양하고, 10% 소디움 도데실 설페이트(SDS) 용액 16mL과 20mg/mL의 프로티네이즈 K(proteinase K, Sigma Chem. Co., USA) 570㎕를 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 5M 염화나트륨 용액 14mL과 0.7M 염화나트륨 용액에 용해되어 있는 10% 세틸트리메틸암모니움브로마이드(cetyltrimethylammoniumbromide, CTAB, Sigma Chem. Co., USA) 10.66mL을 첨가한 다음, 65℃에서 10분간 반응시키고, 전기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol=24:1(v/v))을 가한 후, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 전기 혼합액을 6,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 수득하고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 DNA를 침전시킨 후, 침전된 DNA를 유리봉으로 수득하였다. 전기 유리봉을 자연 건조시켜 에탄올을 제거하고, 1mL TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)에 DNA 를 용해시켰다. 전기 DNA 용액에 RNase(Sigma Chem. Co., USA)를 최종농도 50㎕/mL이 되도록 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 다음, 다시 전기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol = 24:1(v/v))을 가하고, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 전기 혼합액을 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 비이커에 옮겨 담고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 DNA 를 침전시킨 후, 유리봉으로 DNA 를 말아서 감아 올렸다. 전기 유리봉을 자연건조시켜 에탄올을 제거하고, 최종적으로 1 mL TE 용액 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 정제된 대장균 W3110 의 염색체 DNA 를 용해시켰다.
실시예 2: 지방산 분해경로가 제거된 돌연변이 대장균의 제작
대장균 W3110의 지방산 분해경로를 제거하기 위해, 동형재조합(homologous recombination) 방법을 사용하였으며, 이를 위하여 지방산 분해경로의 유전자들 중fadA, fadB, fadAB의 중앙에 카나마이신 저항 효소가 삽입된 플라스미드를 제조하였다(참조: Link et al., J. Bacteriol., 179:6228-6237(1997)). 이를 위하여, 실시예 1에서 분리된 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여,fadA, fadB의 유전자를 5'말단기로부터 600 bp, 3'말단기로부터 600 bp씩 PCR( 94℃에서 50초간 변성, 52℃에서 50초간 서냉복원, 72℃에서 2분간 신장, 총 30주기)을 수행하였다.
fadAnotI 5'-ataagaatgcggccgcatggaacaggttgtcattgtc-3'(서열번호 1)
fadAxbaI 5'-gctctagaggcatcctgcatttcacggct-3'(서열번호 2)
fadAEcorI 5'-ggaattctttgccgcgcggtcacacgcc-3'(서열번호 3)
fadAsalI 5'-acgcgtcgacttaaacccgctcaaacaccgt-3'(서열번호 4)
fadBnotI 5'-ataagaatgcggccgcatgctttacaaaggcgacaccctgtac-3'(서열번호 5)
fadBxbaI 5'-gctctagagcctggcgtaaaaccgcctttc-3'(서열번호 6)
fadBEcorI 5'-ggaattcttccgcaagatcgacaaag-3'(서열번호 7)
fadBsalI 5'-acgcgtcgacttaagccgttttcaggtcgcc-3'(서열번호 8)
한편, 카나마이신 유전자를 얻기 위해 플라스미드 pACYC177(참조: Chang et al., J. Bacteriol., 134:141-1156(1978))를 주형으로 사용하고, 하기의 프라이머를 사용하여 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.
cana1 5'-gctctagagccacgttgtgtctcaaa-3'(서열번호 9)
cana2 5'-cgaattcttagaaaaactcatcgagca-3'(서열번호 10)
상기 프라이머로 증폭된 유전자 중,fadB유전자의 5'말단기로부터 증폭된 600bp는 pBluescript SK(-) 플라스미드의NotI/XbaI인식부위에 삽입하고, 3'말단기로부터 증폭된 600bp는 pBluescript SK(-) 플라스미드의EcoRI/SalI 인식부위에 삽입하며, 카나마이신 저항 유전자는 상기 제조된 플라스미드의XbaI/EcoRI 인식부위에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하고,fadA유전자가 삽입된 플라스미드 역시fadB의 경우와 같은 방식으로 제작하였다. 또한, 대장균의fadA와fadB는fadB와fadA의 순서로 하나의 오페론(operon)을 형성하고 있기 때문에, 5'말단기부터는fadB의 600 bp를 3'말단기로부터는fadA를 상기한 방법으로 PCR을 수행한 후 동일한 방법으로 플라스미드를 제작하였다.
상기 제조된 각각의 플라스미드에서fad유전자와 카나마이신 유전자를NotI/SalI으로 잘라내어 pKO3 플라스미드에 삽입하였다. 즉,fadA유전자 및 카나마이신 유전자를 pKO3 플라스미드에 삽입시켜서 재조합 플라스미드 pKO3fadAKm를 제조하고(참조: 도 2),fadB유전자 및 카나마이신 유전자를 pKO3 플라스미드에 삽입시켜서 재조합 플라스미드 pKO3fadBKm를 제조하였으며(참조: 도 3),fadA유전자,fadB유전자 및 카나마이신 유전자를 pKO3 플라스미드에 삽입시켜서 재조합 플라스미드 pKO3fadABKm를 제조하였다(참조: 도 4).
상기 제조된 각각의 재조합 플라스미드로 대장균 W3110 및 KS272를 형질전환시키고, 공지된 방법에 의하여 지방산 분해경로 중 일부가 제거된 돌연변이 대장균을 제조하였다(참조: Link et al., J. Bacteriol., 179:6228-6237(1997)). 이에,fadA가 제거된 대장균은 'WA101(W3110,fadA::Km)/KA101 (KS272,fadA::Km)', 'fadB가 제거된 대장균은 WB101(W3110,fadB::Km)/KB101(KS272,fadB::Km)',fadA와fadB가 제거된 대장균은 'WAB101(W3110fadBA::Km)/KAB101 (KS272,fadBA::Km)'라 명명하였다.
실시예 3: PHA 합성유전자phaC2 Ps 를 함유하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환된 대장균의 제작
슈도모나스 속(Pseudomonassp.) 미생물 61-3의 PHA 합성 유전자를 함유한 플라스미드 pBSEB50을 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여 PCR( 94℃에서 50초간 변성, 52℃에서 50초간 서냉복원, 72℃에서 2분간 신장, 총 30주기)을 수행하였다.
phaC2Ps-1 5'-cgcggatccaataaggagatatctagatgagagagaaaccaacgccg-3'(서열번호11)
phaC2Ps-2 5'-cggatccccgggtaccgagctcgaattctcagcgcacgcgcacgtaggta-3'(서열번호 12)
상기 PCR 반응산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과,phaC2Ps유전자에 해당하는 1.7 kb 크기의 유전자 절편을 확인하였다.
또한, PHA 합성유전자의 지속적으로 발현하도록gntT104프로모터를 증폭시키기 위하여, 대장균 W3110의 염색체 유전자를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여 PCR(94℃에서 50초간 변성, 52℃에서 50초간 서냉복원, 72℃에서 2분간 신장, 총 30주기)을 수행하였다(참조: Peekhaus and Conway, J. Bacteriol., 180:1777-1785(1998))
gntT104-1 5'-gactagttgaaaggtgtgcgcgatctcac-3'(서열번호 13)
gntT104-2 5'-gcggatcccatttgttatgggcgacgtcaattt-3'(서열번호 14)
상기 PCR 반응산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과, 400bp 크기의 유전자 절편을 확인하였다.
한편, 플라스미드 pTrc99A에 EcoRV/EcoRI 효소를 처리하여 절단한 다음, 동일한 효소로 절단한gntT104프로모터 유전자 절편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결하여 p10499A 벡터를 제조하였다(참조: Lee et al., Biotechnol. Lett., 16: 1247-1252(1994)). 이어, p10499A 벡터를 EcoRI/HindIII 효소로 절단한 다음 pBSEB50로부터 증폭된phaC2 Ps 유전자를 p10499A의 EcoRI/HindIII 인식부위에 삽입함으로써, 재조합 발현벡터인 p10499613C2를 제조하였다(참조: 도 5).
이어, 실시예 2에서 제조된 대장균 WA101, WB101, WAB101, KA101, KB101 및 KAB101을 상기 재조합 발현벡터 p10499613C2로 형질전환시켜서, PHA 합성유전자를 발현하는 재조합 대장균 WA101(p10499613C2), WB101(p10499613C2), WAB101(p10499613C2), KA101(p10499613C2), KB101(p10499613C2) 및 KAB101(p10499613C2)을 제조하였다.
실시예 4: 대장균의 염색체에서 분리된fadF, fadD유전자를 함유하는 재조합 벡터의 제작
대장균의 염색체를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 실시예 2와 동일한 조건으로 수행하여 프로모터인gntT104와fadD, fadF유전자를 각각증폭시켰다.
gntT104-1 5'-cgggagctcaatatttgaaaggtgtgcgcgatctcac-3'(서열번호 15)
gntT104-2 5'-ataagaatgcggccgctatctccttattcatttgttatgggcgacgtcaattt-3'(서열번호 16)
fadD-1 5'-gctctagaaataaggagatatttagatgaagaaggtttggcttaacc-3'(서열번호 17)
fadD-2 5'-cccaagcttaatattgtaataagtgcgcgtacgaac-3'(서열번호 18)
fadF-1 5'-ataagaatgcggccgcaataaggagatatttagatggtcagacctcctacaagt-3'(서열번호 19)
fadF-2 5'-gctctagattacgcggcttcaactttccg-3'(서열번호 20)
상기 증폭한 프로모터gntT104는SacI/NotI으로 처리하고,fadF유전자는NotI/XbaI으로 처리하며,fadD유전자는XbaI/HindIII으로 처리한 다음, 이들을SacI/NotI으로 절단한 pBluescript SK(-) 플라스미드에 삽입하여 pBlue104fadFD 벡터를 제작하였다. 이어,SspI 효소를 처리하여 삽입된 세 개의 유전자를 수득하고,EcoRV로 절단한 pACYC184 플라스미드에 삽입하여 재조합 발현벡터 pACYC104fadFD를 제조하였다(참조: 도 6).
실시예 5: 재조합 대장균의 PHA 합성능 측정
실시예 5-1: p10499613C2를 함유하고 있는 재조합 대장균에서의 MCL-PHA생산
상기 실시예 3에서 제조한 각각의 재조합 대장균의 MCL-PHA 합성능을 확인하기 위하여, 각 재조합 대장균을 데카논산 또는 도데카논산이 각각 2g/L씩 포함된 LB 배지에서 4일 동안 각각 배양하였다. 배양 후, 2,500rpm에서 15분 동안 원심분리하여, 각 균체를 수득하고, 100℃에서 건조하였다. 이들의 대조군으로 사용하기 위하여 재조합 대장균 LS1298(p10499613C2)을 제조하였는데, 이는 대장균 LS1298을 플라스미드 p10499613C2로 형질전환하여 제작하였다.
PHA의 조성은 건조된 균체에 메탄올을 처리하여 PHA를 3-히드록시알칸산 메틸에스테르(3-hydroxyalkanoic acid methyl ester)로 전환시키고, 이를 가스크로마토그래피(gas chromatography, Donan Co., Seoul, Korea)로 측정하고, 이들의 단량체인 3-히드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate, 3HB), 3HHx, 3HO, 3HD 및 3HDD의 조성비를 측정함으로써 결정하였다. 이때, GC 컬럼으로는 실리카 컬럼(fused silica capillary column, Supelco SPBTM-5, 30m 0.32mm ID 0.25m film, USA)을 사용하였으며, 표준용액(internal standard)으로는 벤조산(benzoic acid, Sigma Chem. Co., USA)을 사용하였다(참조: 표 1).
p10499613C2를 함유하고 있는 재조합 대장균에서의 MCL-PHA생산
균주 배지 PHA함량(wt%) 조성비 (mol%)
3HB 3HHx 3HO 3HD 3HDD
LS1298 데카논산 9.2 0 14 50 36 0
도데카논산 9.7 0 10 45 30 15
KA101 데카논산 15.4 0 28 44 29 0
도데카논산 11.1 0 9 33 41 17
KB101 데카논산 16.5 0 10 39 51 0
도데카논산 4.7 0 0 27 50 23
KAB101 데카논산 15.3 0 12 43 46 0
도데카논산 6.6 0 0 33 47 20
WA101 데카논산 44.2 2 12 33 53 0
도데카논산 33.5 0 7 24 47 22
WB101 데카논산 31 2 9 35 54 0
도데카논산 24 0 8 29 46 17
WAB101 데카논산 33.9 0 9 36 55 0
도데카논산 16.9 0 0 29 49 22
상기 표 1에서 보듯이, 각 재조합 대장균으로부터 MCL-PHA가 생성됨을 확인할 수 있었다. 생성된 MCL-PHA는 각각 탄소수가 10개인 데카논산으로부터는 3HD, 3HO, 3HHx로 구성되었으며, 탄소수가 12개인 도데카논산으로부터는 3HDD, 3HD, 3HO로 구성되었음을 알 수 있었다. 또한, 그것의 몰 조성은 각각의 재조합 대장균과 적용된 돌연변이의 종류에 영향을 받고 있음을 알 수 있었다.
실시예 5-2: p10499613C2와 pACYC104fadFD를 함유하고 있는 재조합 대장균에서의 MCL-PHA생산
상기 실시예 2에서 제작한 돌연변이 대장균 WA101, WB101, WAB101, KA101, KB101 및 KAB101을 상기 재조합 발현벡터 p10499613C2 와 pACYC104fadFD로 형질전환시켜서 PHA 합성유전자와 fadD 와 fadF를 발현하는 재조합 대장균 WA101(p10499613C2 +pACYC104fadFD), WB101(p10499613C2 +pACYC104fadFD),WAB101(p10499613C2 +pACYC104fadFD), KA101(p10499613C2 +pACYC104fadFD), KB101(p10499613C2 +pACYC104fadFD) 및 KAB101(p10499613C2 +pACYC104fadFD)을 제조하고, 이들의 대조군으로 사용하기 위하여 LS1298(p10499613C2 +pACYC104fadFD)을 제조하였는데, 이는 대장균 LS1298을 플라스미드 p10499613C2 및 pACYC104fadFD로 형질전환하여 제작하였다.
제조한 각각의 재조합 대장균의 MCL-PHA 합성능을 확인하기 위하여, 각 재조합 대장균을 데카논산과 도데카논산이 각각 2g/L씩 포함된 LB 배지에서 4일 동안 각각 배양하였다. 배양 후, 2,500rpm에서 15분 동안 원심분리하여, 각 균체를 수득하고, 100℃에서 건조하였다.
PHA의 조성은 실시예 5-1과 동일한 방법으로, 이들의 단량체인 3HHx, 3HO, 3HD 및 3HDD의 조성비를 측정함므로써 결정하였다(참조: 표 2).
p10499613C2와 pACYC104fadFD를 함유하고 있는 재조합 대장균에서의 MCL-PHA생산
균주 배지 PHA함량 (wt%) 조성비 (mol%)
3HHx 3HO 3HD 3HDD
LS1298 데카논산 2.2 0 33 67 0
도데카논산 14.1 0 22 46 32
KA101 데카논산 8.6 12 34 54 0
도데카논산 9.7 0 15 37 48
KB101 데카논산 4.8 0 33 67 0
도데카논산 12.1 0 13 40 47
KAB101 데카논산 9.1 0 34 66 0
도데카논산 8.6 0 13 39 48
WA101 데카논산 21.0 4 17 80 0
도데카논산 16.7 4 30 42 24
WB101 데카논산 31.0 3 23 74 0
도데카논산 15.7 0 27 45 28
WAB101 데카논산 10.6 7 32 61 0
도데카논산 25 0 11 47 42
상기 표 2에서 보듯이, 표 1에 제시된phaC2 Ps 만 발현하는 재조합 대장균에 비하여phaC2 Ps ,fadF및fadD을 동시발현시킨 대장균에서 생산된 MCL-PHA는 그 모노머의 조성 중 특히 3HD 혹은 3HDD의 몰분율이 높게 나타났다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 지방산 분해대사경로 중 일부가 제거되고 PHA 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 그를 이용하여 MCL-PHA를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 종래의 방법에 비하여 MCL-PHA를 다량으로 생산할 수 있고, 이들의 모노머의 조성을 변형시킬 수 있으므로, 이를 이용한 신소재의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Bacterial System for Producing MCL-PHA <160> 20 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAnotI <400> 1 ataagaatgc ggccgcatgg aacaggttgt cattgtc 37 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAxbaI <400> 2 gctctagagg catcctgcat ttcacggct 29 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAEcorI <400> 3 ggaattcttt gccgcgcggt cacacgcc 28 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadAsalI <400> 4 acgcgtcgac ttaaacccgc tcaaacaccg t 31 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBnotI <400> 5 ataagaatgc ggccgcatgc tttacaaagg cgacaccctg tac 43 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBxbaI <400> 6 gctctagagc ctggcgtaaa accgcctttc 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBEcorI <400> 7 ggaattcttc cgcaagatcg acaaag 26 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadBsalI <400> 8 acgcgtcgac ttaagccgtt ttcaggtcgc c 31 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cana1 <400> 9 gctctagagc cacgttgtgt ctcaaa 26 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cana2 <400> 10 cgaattctta gaaaaactca tcgagca 27 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phaC2Ps-1 <400> 11 cgcggatcca ataaggagat atctagatga gagagaaacc aacgccg 47 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phaC2Ps-2 <400> 12 cggatccccg ggtaccgagc tcgaattctc agcgcacgcg cacgtaggta 50 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gntT104-1 <400> 13 gactagttga aaggtgtgcg cgatctcac 29 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gntT104-2 <400> 14 gcggatccca tttgttatgg gcgacgtcaa ttt 33 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gntT104-1 <400> 15 cgggagctca atatttgaaa ggtgtgcgcg atctcac 37 <210> 16 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gntT104-2 <400> 16 ataagaatgc ggccgctatc tccttattca tttgttatgg gcgacgtcaa ttt 53 <210> 17 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadD-1 <400> 17 gctctagaaa taaggagata tttagatgaa gaaggtttgg cttaacc 47 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadD-2 <400> 18 cccaagctta atattgtaat aagtgcgcgt acgaac 36 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadF-1 <400> 19 ataagaatgc ggccgcaata aggagatatt tagatggtca gacctcctac aagt 54 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadF-2 <400> 20 gctctagatt acgcggcttc aactttccg 29

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 폴리하이드록시알카노에이트(poly(3-hydroxyalkanoate), PHA) 합성유전자(phaC)를 포함하고, 도 5의 유전자지도를 갖는 재조합 발현벡터 p10499613C2.
  5. fadA유전자,fadB유전자 또는 전기 두 유전자가 모두 결실된 대장균을 제 4항의 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서,
    형질전환체는 대장균 WA101(p10499613C2), WB101(p10499613C2),
    WAB101(p10499613C2), KA101(p10499613C2), KB101(p10499613C2)
    또는 KAB101(p10499613C2)인 것을 특징으로 하는
    형질전환체.
  8. 제 7항의 형질전환체를 지방산을 함유하는 배양배지를 사용하여 배양하고, 이로부터 중간사슬길이의 폴리하이드록시알카노에이트(medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoate), MCL-PHA)를 수득하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트(poly(3-hydroxyalkanoate), PHA)의 제조방법.
  9. 삭제
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