KR100479943B1 - 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소 및 상기 효소를 코딩하는 유전자 - Google Patents

Abstract

신규한 곁사슬 구조를 가지는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산할 수 있는 미생물로부터 유래되는 신규한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)합성효소 및 합성효소에 대한 아미노산서열을 코딩하는 DNA를 제조한다. 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 2개의 PHA합성효소 단백질(서열번호 1 및 3) 및 상기 PHA합성효소를 코딩하는 PHA합성효소 유전자(서열번호 2 및 4)를 각각 제공한다. 재조합미생물에 PHA 생산 능력을 부여한다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 및 상기 효소를 코딩하는 유전자{Polyhydroxyalkanoate Synthase and Gene Encoding the Same Enzyme}

본 발명은, 폴리하이드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 함) 합성효소, 그 PHA합성효소를 코딩하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 재조합벡터, 그 재조합벡터에 의해 형질전환되고, PHA합성효소의 발현능을 가진 형질전환체, 이 형질전환체를 이용한 PHA합성효소의 생산방법, 및 이 형질전환체를 이용한 PHA의 제조방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은, 폴리하이드록시알카노에이트의 생산능을 가진 미생물 유래의 PHA합성효소, 및 그 PHA합성효소의 재조합 발현에 이용되는 PHA합성효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

이제까지, 많은 미생물이 폴리-3-하이드록시부티르산(PHB) 또는 기타의 PHA를 생산해서, 균체 내에 축적하는 것이 보고되어 왔다("생분해성 플라스틱핸드북", 생분해성 플라스틱연구회편, (주)NTS, P178-197). 이들 폴리머는 종래의 플라스틱과 마찬가지로 용융가공 등에 의해 각종 제품의 생산에 이용할 수 있다. 또한, 이들은 생분해성이 있기 때문에, 자연계에서 미생물에 의해 완전분해된다고 하는 이점을 가지고 있어, 종래의 많은 합성고분자화합물과 같이 자연환경에 잔류해서 오염을 야기하는 일은 없다. 또한 생체적합성도 뛰어나서, 의료용 연질부재 등으로서의 응용도 기대되고 있다.

이와 같은 미생물에 의해 생산된 PHA는 그 생산에 사용하는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등에 따라 여러 가지 조성이나 구조의 것으로 될 수 있는 것이 알려져 있으며, 이제까지 주로 PHA의 물성의 개량이라고 하는 관점으로부터 이와 같은 조성이나 구조의 제어에 관한 연구가 행해져 왔다.

예를 들면, 알칼리게네스 유트로푸스 H16주(Alcaligenes eutropus H16, ATCC No. 17699) 및 그 변이주는 그 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써 3-하이드록시부티르산(3HB)과 3-하이드록시발레르산(3HV)과의 공중합체를 여러 가지 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(일본국 특표평 6-15604호 공보, 동 특표평 7-14352호 공보, 동 특표평 8-19227호 공보 등).

또한, 일본국 특허공보 제 2642937호에서는 슈도모나스 올레오보란스 ATCC 29347주(Pseudomonas oleovorans ATCC29347)에 탄소원으로서 비환상 지방족 탄화수소를 부여함으로써 탄수소가 6에서 12까지의 3-하이드록시알카노에이트를 모노머유닛으로 하는 PHA를 생산하는 것이 기재되어 있다.

일본국 특개평 5-74492호 공보에는 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 파라코커스속(Paracoccus sp.), 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.), 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)의 미생물을 탄소수 3에서 7의 제 1급 알콜에 접촉시킴으로써 3HB와 3HV와의 공중합체를 생산하는 방법이 기재되어 있다.

일본국 특개평 5-93049호 공보 및 동 특개평 7-265065호 공보에는 아에로모나스 캬비에(Aeromonas caviae)를 올레인산이나 올리브유를 탄소원으로서 배양함으로써 3HB와 3-하이드록시헥산산(3HHx)의 2성분 공중합체를 생산하는 것이 기재되어 있다.

일본국 특개평 9-191893호 공보에는 코마모나스 아시도보란스 IFO13852주(Comamonas acidovorans IFO13852)가 탄소원으로서 글루콘산 및 1,4-부탄디올을 사용한 배양에 의해 3HB와 4-하이드록시부티르산을 모노머유닛으로서 가진 폴리에스테르를 생산하는 것이 기재되어 있다.

또한, 어떤 미생물에서는 여러 가지 치환기, 예를 들면 불포화 탄화수소, 에스테르기, 아릴기(방향환기), 시아노기, 할로겐화 탄화수소, 에폭시드 등이 도입된 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 최근, 이와 같은 수법에 의해서 미생물에 의해 생산되는 PHA의 물성개량을 목표로 하는 시도도 행해지기 시작하고 있다. 예를 들면 Makromol. chem., 191, 1957-1965(1990), Macromolecules, 24, 5256-5260(1991), Chirality, 3, 492-494(1991) 등에는 슈도모나스 올레오보란스가 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3HPV)을 모노머유닛으로서 포함하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있어, 3HPV가 포함되는 것에 기인한다고 생각되는 폴리머물성의 변화가 인정되고 있다.

이상과 같이, 미생물에 의해 생산되는 PHA에 있어서는 그 생산에 사용하는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등을 변화시킴으로써 여러 가지 조성 및 구성의 조합이 얻어지고 있다. 그러나, 그 미생물 자체의 PHA합성효소는 각각의 미생물에 따라서 그 기질특성이 크게 다르다. 그에 따라 공지의 미생물 또는 그와 같은 공지의 미생물이 가진 PHA합성효소만으로는 여러 가지 사용목적에 적합한 각종 모노머단위를 조성에 포함하는 PHA를 생산하는 것은 곤란하였다.

한편, 상술한 바와 같이, 여러 가지 치환기를 곁사슬에 도입한 PHA는 도입한 치환기의 특성 등에 기인해서 극히 유용한 기능ㆍ특성을 구비한 "기능성 폴리머"로서의 전개도 기대할 수 있다. 따라서, 그와 같은 기능성과 생분해성을 겸비한 뛰어난 유용성을 가진 폴리머를 생산해서, 균체 내에 축적할 수 있는 미생물의 탐색, 개발은 극히 유용하고 중요하다. 또한, 이 높은 유용성을 가진 PHA의 생산에 관한 PHA합성효소의 특정, 그 PHA합성효소를 코딩하는 유전자를 취득하는 것은 목적으로 하는 PHA의 생산능을 가진, 신규한 형질전환미생물의 생산을 가능하게 한다. 즉, PHA합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터를 구축하고, 이 재조합벡터에 의해 형질전환된 형질전환미생물을 얻고, 이 형질전환미생물을 이용한 PHA의 제조, 또는 재조합형 PHA합성효소를 발현시키는 방법에의 적용을 가능하게 한다. 이와 같이, 형질전환미생물을 이용해서 목적하는 PHA를 제조하는 것은 PHA의 생산성을 높이는데 있어서 극히 유용한 수단을 제공하고, PHA의 이용을 촉진함에 있어서도 중요한 것으로 여겨진다.

본 발명은 상기의 과제를 해결하는 것으로, 본 발명의 목적은 신규한 곁사슬 구조를 가진 PHA를 생산해서, 그 균체 내에 축적하는 능력을 가진 신규한 미생물을 탐색하고, 그 신규한 PHA생산능에 관련하는 효소 단백질, 즉 신규한 PHA합성효소를 특정하고, 또한 그 아미노산서열을 코딩하는 유전자를 해명하는 데 있다. 더 구체적으로는, 본 발명의 목적은, 신규한 곁사슬 구조를 가진 PHA를 생산하는 미생물에 유래하는 신규한 PHA합성효소와 그 아미노산서열을 코딩하는 DNA를 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은, 제공되는 PHA합성효소를 코딩하는 DNA를 도입해서, 숙주미생물의 형질전환에 이용되는 재조합벡터 및 이 재조합벡터를 사용해서 형질전환된 형질전환미생물을 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 얻어진 형질전환미생물에 있어서, 재조합형 PHA합성효소의 발현ㆍ생산을 행하는 방법, 및 형질전환미생물을 이용해서 목적하는 PHA를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질전환미생물에 있어서의 재조합형 PHA합성효소의 발현시에 효소활성을 손상시키지 않는 범위에서 PHA합성효소의 아미노산서열을 개변시킨 개변형의 PHA합성효소 및 그 개변아미노산서열을 코딩하는 DNA를 제공하는 데 있다.

상기의 과제를 해결하기 위해서 본 발명자들은 디바이스재료나 의료용 재료 등으로서 유용한, 신규한 곁사슬 구조를 가진 PHA의 개발을 목표로 해서, 소망의 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 능력을 가진 신규한 미생물의 탐색을 행했다. 또한, 본 발명자들은 예의 연구를 거듭해서, 탐색한 신규한 PHA를 생산하는 신규 미생물에 대해서 그 신규한 PHA의 생산에 관한 PHA합성효소의 특정, 및 그 PHA합성효소를 코딩하는 유전자의 취득을 행했다. 또한, 본 발명자들은 취득된 PHA합성효소의 유전자를 포함하는 재조합벡터의 구축, 이 재조합벡터에 의한 숙주미생물의 형질전환, 얻어진 형질전환미생물에 있어서의 재조합형 PHA합성효소의 발현, 그에 수반하는 소망의 PHA의 생산의 확인을 행했다.

상기 탐색과정에서, 본 발명자들은 화학식(Ⅱ):

로 표시되는 5-(4-플루오로페닐)발레르산(FPVA)을 합성하고, 이것을 원료(기질)로 해서 대응하는 화학식(Ⅲ):

으로 표시되는 대응하는 3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산(3HFPV)으로 변환하고, 이 3HFPV에 유래하는 화학식(Ⅰ):

로 표시되는 모노머유닛을 포함하는 신규한 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 능력을 가진 미생물을 토양으로부터 새로이 분리했다. 이 새로이 분리한 미생물을 YN2균주라 표시한다. 본 발명자들은, 상기 FPVA로부터 3HFPV로의 변환을 행하는 효소 활동 이외에, 이 YN2균주는 하기 화학식(Ⅳ):

로 표시되는 4-시클로헥실부티르산(CHxBA)을 기질로 해서, 대응하는 화학식(V):

로 표시되는 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산(3HCHxB)으로 변환하고, 이 3HCHxB에 유래하는 하기 화학식(Ⅵ):

으로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 능력을 가지는 것도 발견하였다.YN2균주의 균학적 성질은 다음과 같다.

<YN2균주의 균학적 성질>

(형태학적 성질):

세포의 형태 및 크기 : 간균, 0.8㎛×1.0 내지 1.2㎛

세포의 다형성 : 없음

운동성 : 있음

포자형성 : 없음

그램 염색성 : 음성

코로니형상(Colonization): 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 낮은 볼록성, 매끄러운 표면, 광택, 황색띤 흰색

(생리학적 특성)

카탈라아제: 양성

옥시다제: 양성

O/F테스트: 산화적

질산염의 환원: 음성

인돌의 생성 : 음성

포도당의 산성화: 음성

아르기닌디하이드롤라제 :음성

우레아제: 음성

에스쿨린가수분해: 음성

젤라틴가수분해: 음성

β-갈락토시다제: 음성

King's B 한천에서의 형광색소 생산성 : 양성

4% NaCl에서의 형성 : 음성

폴리-β-하이드록시부티르산의 축적 : 음성

(기질동화능)

포도당: 양성

L-아라비노스: 음성

D-만노스: 양성

D-만니톨: 양성

N-아세틸-D-글루코사민: 양성

말토스: 음성

글루콘산 칼륨: 양성

n-카프린산: 양성

아디핀산: 음성

dl-말산: 양성

시안산 나트륨: 양성

아세트산 페닐: 양성

상기 균학적 성질로부터, 본 발명자들은, 문헌「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제1권(1984)」 및 문헌「Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 제 9판(1994)」에 의거하여 검토한 바, YN2균주를 분류해서, 해당 균주는 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii)에 속하는 것으로 판명하였다. 따라서, 상기 균주는 슈도모나스 치코리이 YN2라 명명하였다.

YN2균주에 의하여 표시되는 PHA를 생산할 수 있는 슈도모나스 치코리이의 균주에 관한 보고는 없었다. 그러므로 발명자들은, YN2균주를 신규한 미생물이라고 판단하였다. 본 출원인은, 슈도모나스 치코리이 YN2을 기탁번호 "FERM BP-7375"로서 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소의 특허미생물기탁센터에 기탁하였다. 이 YN2균주는 부다페스트조약에 의거하여 국제적으로 기탁하였고, 국제승인번호는 "FERM BP-7375"이다.

본 발명자들은, 이 신규 미생물 YN2균주로부터 PHA 합성효소를 위한 유전자를 클로닝하는 것에 성공하여, 유전자의 서열을 결정했다. 또한, 발명자들은 상기 유전자에 의하여 코딩된 PHA 합성효소의 아미노산서열을 판명했다. 이상의 연구에 의거하여, 본 발명이 완성되었다.

상세하게는, 본 발명의 PHA 합성효소는 서열번호 1 또는 3의 아미노산서열을 가지는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소이다. 또한, 본 발명의 PHA 합성효소는, 서열번호 1의 아미노산서열을 실질적으로 보유하고, 그 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 활동을 손상하지 않는 범위에서, 아미노산의 결실, 치환 또는 부가가 이루어지는 개변 아미노산서열을 갖는 PHA 합성효소이거나, 또는 서열번호 3의 아미노산서열을 실질적으로 보유하고, 그 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소로서의 활성을 손상하지 않는 범위에서, 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 개변된 아미노산서열을 갖는 PHA 합성효소이기도 하다.

본 발명의 PHA 합성효소 유전자는 서열번호 1의 아미노산서열 또는 그의 개변 아미노산의 서열을 코딩하는 DNA를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자이거나, 또는 서열번호 3의 아미노산서열 또는 그의 개변 아미노산의 서열을 코딩하는 DNA를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자이다. YN2균주의 게놈유전자로부터 유래된 본 발명의 PHA 합성효소 유전자의 형태는, 서열번호 1의 아미노산서열을 코딩하는 DNA로서 서열번호 2의 DNA염기서열을 함유하는 PHA 합성효소 유전자 및 서열번호 3의 아미노산서열을 코딩하는 DNA로서 서열번호 4의 DNA염기서열을 함유하는 PHA 합성효소 유전자를 포함한다.

본 발명은, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자로서 상기 아미노산서열을 코딩하는 유전자DNA를 함유하는 재조합벡터를 또한 제공한다. 본 발명은 숙주로서 적합한 재조합벡터를 도입함으로써 형질전환된 형질전환미생물을 또한 제공한다.

본 발명은, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 기재를 함유하는 배지에서, 재조합백터를 도입한 형질전환 미생물을 배양하는 단계와, 얻어진 배양물로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 취득하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법을 또한 제공한다. 본 발명은, 재조합백터가 도입된 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계와, 형질전환된 미생물에 하이드록시알카노에이트를 생산시키는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산 방법을 또한 제공한다.

폴리하이드록시알카노에이트의 바람직한 제조방법은, YN2균주로부터 유도된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 기질특이성을 이용할 수 있고: 예를 들면, 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 3HFPV로부터 유래된 화학식(Ⅰ)로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 및 3HCHxB로부터 유래된 화학식(Ⅵ)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법이다.

본 발명의 PHA 합성효소 및 이 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는, 신규한 미생물인 슈도모나스 치코리이 YN2균주로부터 유래되고, 신규한 곁사슬 구조를 가지는 모노머유닛을 함유하는 PHA를 선택적으로 제조하도록 기질특이성을 표시한다. PHA 합성효소 유전자를 함유하는 재조합 백터 및 이 재조합벡터에 의하여 형질전환된 미생물은 슈도모나스 치코리이 YN2와 마찬가지의 기질특이성을 표시하는 PHA를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 PHA 합성효소 유전자는, 신규한 곁사슬 구조를 가지는 모노머유닛을 선택적으로 함유하는 PHA의 제조를 가능하게 하는 효소를 코딩해 놓고, 또한 기능성 폴리머에의 응용이 기대되는 다양하게 유용한 물성을 가진 PHA를 제조하는데 유용한 형질전환된 미생물을 생산할 수 있도록 한다.

본 발명의 PHA 합성효소는, 본 발명자들에 의하여 분리된 신규의 미생물, 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 효소 단백질이다. 즉, 5-(4-플루오로페닐)발레르산(FPVA)을 대응하는 3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산(3HFPV)으로 변환하거나, 또는 4-시클로헥실부티르산(CHxBA)을 대응하는 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산(3HCHxB)으로 변환함으로써, 대응하는 모노머유닛을 함유하는 PHA의 합성에 관계하는 효소활성을 가진다.

본 발명의 PHA 합성효소 및 효소를 코딩하는 유전자에 대하여 이하에 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자들은, YN2균주로부터, 상기 기질특이성을 표시하는 PHA 합성효소로 번역되는 유전자의 클로닝을 행하여, 적어도 2개의 아미노산서열을 함유하는 PHA 합성효소의 존재를 확인하였다. 즉, 본 발명의 PHA 합성효소는, YN2균주의 앰색체유전자에 있어서는, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 DNA에 의하여 코딩된 서열번호 1의 아미노산 서열을 함유하는 PHA 합성효소 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 DNA에 의하여 코딩된 서열번호 3의 아미노산 서열을 함유하는 PHA합성효소 등의 2개의 효소를 가진다. 서열번호 2 및 4의 염기서열의 유전자 DNA는 이하의 처리에 의해 클로닝을 행한다.

PHA 합성효소는 슈도모나스 치코리이 YN2균주의 염색체유전자로부터 번역되는 효소 단백질이므로, 소망의 PHA 합성효소를 함유하는 염색체DNA가 우선 획득된다. 염색체DNA는 공지의 분리방법에 의해 YN2균주로부터 분리된다. 예를 들면, YN2균주는 LB 배지 또는 M9 배지에 적절한 탄소원을 부가하여 배양한 후, 균체를 파쇄하고, 예를 들면 마머(Marmer) 등의 「Journal of Molecular Biology, 3권 208페이지(1961)」에 설명된 바와 같이 염색체 DNA를 제조한다.

다음에, 상기와 같이 얻어진 염색체 DNA로부터 유전자 라이브러리(library)를 제작한다. 염색체 DNA를 적당한 제한효소(예를 들면, Sau3AI)를 이용해서 분해하고, 적당한 길이의 단편은, 제한효소(예를 들면, BamHI)에 의하여 절단된 연결가능한 벡터에 연결되어 유전자 라이브러리를 제작한다.

라이브러리의 제작에 이용되는 벡터에 따라서, 적당한 단편길이는, 예를 들면, 통상적인 플라스미드 벡터에 대해서는 대략 4000 내지 25000bps로 변화하고, 코스미드(cosmid)나 파지(Phage)벡터에 대해서는 대략 15000 내지 30000bps로 변화한다. 적당한 길이의 DNA단편은, 자당밀도구배를 이용한 방법 및 문헌「Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)」에 기재된 아가로즈 겔(agarose gel)을 사용한 방법 등의 공지된 방법에 의하여 수집되어도 된다.

대장균을 유전자 라이브러리의 숙주미생물로서 이용하므로, 벡터는 숙주미생물(대장균)에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지벡터 또는 플라스미드벡터이다. 파지 또는 코스믹(cosmic)벡터의 예로서는, pWE15, M13, λEMLB3, λEMBL4, λFIXⅡ, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A 및 Charon21A를 일반적으로 포함한다. 플라스미드벡터로서 흔히 사용되는 예는, pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ 및 pETr계를 포함한다. 대장균이외에, 다양한 셔틀벡터, 예를 들면, 슈도모나스 속 등의 복수의 숙주미생물을 자율적으로 증식할 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 또한, 이들 벡터는 그들을 연결하는 염색체 DNA에 따라서 적당한 제한효소로 절단함으로써 소망의 단편을 제조할 수 있다.

염색체 DNA 단편은, DNA 리가아제(ligase)를 사용하여 벡터단편에 연결된다. 예를 들면, 시판하는 라이게션 키트(타카라 슈조(주) 제품)가 사용된다. 따라서, 예를 들면, 다양한 염색체 DNA단편은 플라스미드 벡터단편에 의하여 연결되어 다양한 DNA단편(이하, "유전자 라이브러리"라 칭함)을 함유하는 재조합 플라스미드의 혼합물을 제조한다.

유전자 라이브러리의 제작에 있어서, 적절한 길이의 염색체 DNA 단편을 사용하는 방법이외에, 문헌「Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982」에 기재된 바와 같이, 모든 mRNA는 YN2균주로부터 추출되고 정제되어, 역전사효소를 이용해서 cDNA단편을 합성하는 방법을 이용하는 것도 가능하다. 또는, 문헌 「Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982」에 기재된 바와 같이, 제작된 벡터는 유전자 라이브러리에 이용되어 대장균에 형질전환 또는 형질도입한 후에, 숙주대장균을 배양하여, 대량으로 유전자 라이브러리를 증폭할 수 있다.

유전자 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터는 공지의 방법에 의하여 숙주미생물로 도입될 수 있다. 예를 들면, 숙주미생물로서 대장균을 이용하는 경우에, 재조합 플라스미드벡터는 염화칼슘법(「Jourbal of Molecular Biology 53권, 159페이지 (1970)」), 염화루비듐방법(「Method in Enzymology, 68권 253페이지(1979)」), 일렉트로포레이션(electroporation)법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권 1.8.4페이지(1994))을 사용하여 도입될 수 있다. 코스미드벡터 또는 파지벡터를 이용하는 경우에, 숙주대장균의 형질도입은 인 비트로 패키징(in vitro packaging)(문헌「Current Protocols in Molecular Biology, 1권 5.7.1페이지(1994)」)를 사용하여 이루어진다. 또는, 재조합벡터를 유지하는 균주와의 접합전달에 의한 방법도, 벡터를 보유하는 균주의 취득에 이용가능하다.

다음에, 상기 유전자 라이브러리로부터, YN2균주의 PHA 합성효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 획득하기 위한 프로브를 제조한다.

몇몇의 염기서열은, 공지의 미생물에 있어서, 그 PHA 합성효소 유전자에 대하여 보고되어 있다. 예를 들면, 문헌「Peopels, O.P. and Sinskey, A. J., J. Biol. Chem., 264, 15293(1989)」; 문헌「Huisman, G. W. et al., J. Biol. Chem., 266, 2191(1991)」;문헌「Pieper, U. et al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 73(1992)」; 문헌「Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992)」; 문헌「Matsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6459(1998)」 등이 있다. 상기 보고된 염기서열을 비교하여, 염기서열의 보존도가 높은 영역을 선택한 다음에 폴리머라제 연쇄반응(이하, "PCR"이라 칭함)에 사용되는 프라이머용의 올리고뉴클레오티드을 설계한다. PHA 합성효소 유전자의 공통성을 이용하는, 이와 같은 프라이머용의 상기 올리고뉴클레오티드는, 문헌「Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992)」에 기재된 염기서열을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 올리고뉴클레오티드는, 설계된 염기서열에 따라서, 예를 들면, 아머샴-파마시아 바이오텍(Amersham-Pharmacia Biotech)의 커스톰 합성 서비스(Custom Synthesis Service) 등의 시판하는 DNA합성장치 등을 이용하여 합성화할 수 있다.

본 발명의 YN2균주로부터 유래된 PHA 합성효소 유전자에 대해서는, 서열번호 5 및 6을 가지는 염기서열을 함유하는 합성 DNA를 설계했다.

다음에, 프라이머로서의 설계한 올리고뉴클레오티드는, 주형으로서 YN2주의 염색체DNA를 사용하여 폴리머라제(PCR) 연쇄반응을 행하여 PCR증폭된 단편을 얻는다. 얻어진 PCR증폭단편은, 프라이머로부터 유래되어, PHA 합성효소 유전자에 공통하는 염기서열을 양단에 포함한다. 주형으로서의 YN2균주의 PHA 합성효소 유전자 자체에 유래된 부분염기서열은, 양단의 프라이머에 상보적인 염기서열사이에, 함유된다.

따라서, 얻어진 PCR증폭단편은, YN2균주의 PHA 합성효소 유전자와 거의 100% 상동성이며, 콜로니하이브리다이제이션시의 프로브로서 높은 S/N비를 발휘할 것으로 기대된다. 또한, 하이브리다이제이션의 스트린전시 제어(stringency control of hybridization)를 이용하는 것이 가능하다.

상기 PCR증폭단편을 적당한 시약을 사용해서 표지(labelling)하고, 프로브로서 사용해서 상기 염색체 DNA 라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리다이제이션을 행해서, PHA합성효소 유전자를 유지하는 재조합대장균 균주를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 6.0.3쪽(1994년)). 예를 들면, PCR증폭단편의 표지는 표지효소를 사용하는 범용의 검출계, AlkPhosDirect(아머샴-파마시아 바이오텍) 등의 시판의 키트를 이용할 수 있다.

또한, PHA합성효소 유전자를 포함하는 유전자 단편을 유지하는 재조합대장균 균주의 선발은, 상기 유전자형을 이용한 선발방법 이외에도 PHA합성의 유무를 직접 평가하는 표현형을 이용한 방법에 의하는 것도 가능하다. 즉, 재조합대장균 균주에 있어서, 유지하는 PHA합성효소 유전자로부터 PHA합성효소의 발현이 행해질 경우, 그 PHA합성효소에 의한 PHA의 생산이 행해진다. 이 PHA합성의 유무를 조사해서 PHA합성효소의 발현이 행해지고 있는 재조합대장균 균주를 선별하는 것도 가능하다. PHA합성의 유무를 조사하는 방법으로서는, 예를 들면 수단 블랙 B에 의해 염색하는 방법(Archives of Biotechnology, 71권, 283쪽(1970년)), 위상차현미경에 의해 PHA의 축적을 조사하는 방법 등을 사용할 수 있다.

상기의 어느 하나의 방법에 의해 선발한 재조합대장균으로부터, 알칼리법(「Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 1.6.1쪽(1994년)」)을 사용해서 플라스미드를 회수한다. 이 회수된 플라스미드로부터 PHA합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편, 또는 PHA합성효소 유전자를 부분적으로 포함하는 복수의 DNA단편을 얻을 수 있다. 채취한 DNA단편의 염기서열의 결정은, 예를 들면 상거법(「Molecular Cloning, 2권, 13.3쪽(1989년)」) 등에 의해서 행하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 염기서열 자동분석장치, 예를 들면 DNA시퀀서 377A(퍼킨 엘머) 등을 사용해서 다이프라이머법 또는 다이터미네이터법에 의해 행할 수 있다. DNA단편이 편입된 벡터 자체의 염기서열은 기지이기 때문에 그 곳에 클로닝되어 있는 DNA단편의 염기서열은 일의적으로 해석이 가능하다.

또한, 상기 방법에 의해, 채취한 PHA합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편의 전체 염기서열을 결정한 후에는, 화학합성법, 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR법 또는 이 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해 등의 임의의 방법에 의해 조제된 DNA단편을 프로브로서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 PHA합성효소 유전자DNA를 얻는 것이 가능하다.

본 발명자들은 상술한 순서에 따라서 YM2균주로부터 상기한 기질특이성을 표시하는 PHA합성효소로 번역되는 유전자의 선별을 행해서, 적어도 2종의 아미노산서열을 가진 PHA합성효소의 존재를 발견했다. 즉, 본 발명자들은 YN2균주의 염색체 DNA로부터 채취한, 서열번호 2로 표시하는 염기서열을 가진 본 발명의 PHA합성효소 유전자와, 이 유전자에 의해 코딩되어 있는 서열번호 1로 표시하는 아미노산서열을 가진 PHA합성효소, 및 서열번호 4로 표시하는 염기서열을 가진 본 발명의 PHA합성효소 유전자와, 이 유전자에 의해 코딩되어 있는 서열번호 3으로 표시하는 아미노산서열을 가진 PHA합성효소를 발견했다.

또한, 본 발명의 PHA합성효소 유전자는, 예를 들면 그 코딩하는 아미노산서열이 같게 되는, 축중 코돈에 있어서만 다른, 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 축중 이성체도 포함한다. 더 구체적으로는, 동일한 아미노산을 코딩하는 축중 코돈을 숙주에 의존해서 보다 사용빈도가 높은 코돈을 선택해서, 변환한 축중 이성체도 포함한다. 한편, 본 발명의 PHA합성효소는 YN2균주 고유의 서열번호 1로 표시하는 아미노산서열을 가진 PHA합성효소, 및 서열번호 3으로 표시하는 아미노산서열을 가진 PHA합성효소에 추가해서, 그 PHA합성활성 및 기질특이성을 손상시키지 않는 한, 또한 아미노산서열을 실질적으로 유지하는 범위 내에서, 몇 개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 여기서, 결실, 치환, 부가 등의 변이는 서열번호 2로 표시하는 염기서열 또는 서열번호 4로 표시하는 염기서열을 가지는, YN2균주 고유의 PHA합성효소 유전자에 의거해서 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 8.1.1쪽(1994년)) 등에 의해 도입가능하다.

본 발명의 재조합벡터는, 본 발명의 재조합형 PHA합성효소를, 슈도모나스속에 속하는 미생물, 대장균 등의 미생물을 숙주로 해서 발현하는 용도에 사용하는 것이다. 따라서, 본 발명의 재조합벡터 자체가, 사용하는 숙주 속에서 자율 복제가 가능한 동시에, 발현을 야기하는 프로모터, 본 발명의 PHA합성효소 유전자DNA, 및 숙주에 적합한 전사종결서열을 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 또한, 재조합벡터의 도입 후, 그 선별에 이용되는 각종 마커 유전자를 구비하는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

슈도모나스속에 속하는 미생물, 대장균 등 다종의 세균의 숙주에 적합한 발현벡터로서는, 광범위한 숙주에 있어서 복제ㆍ유지되는 RK2복제기점을 가진 pLA2917(ATCC 37355)이나 RSF1010복제기점을 가진 pJRD215(ATCC 37533) 등을 들 수 있다. 이들에 한정되지 않고, 광범위한 숙주에 있어서 복제ㆍ유지되는 복제기점을 가진 벡터라면 모두 사용가능하다. 프로모터는 숙주로 하는 세균중에서 발현할 수 있는 것이면 모두 사용가능하며, 예를 들면 trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다.

효모를 숙주로서 이용하는 경우에, 발현벡터로서는, YEp13, YCp50, pRS계 또는 pYEX계 벡터 등을 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터 또는 AOD프로모터이어도 된다.

본 발명의 형질전환미생물은 본 발명의 재조합벡터를, 그 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 중에 도입함으로써 얻어진다. 숙주로서 이용가능한 균종류로서, 에세리치아(대장균)(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 벌크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로소모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리듐(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르스로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 세균으로의 재조합DNA의 도입방법으로서는 상술한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

또한, 상기 세균 이외에도 숙주로 이용할 수 있는 미생물로서 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 곰팡이 등을 들 수 있다. 효모로의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933(1978)), 초산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등을 이용가능하다.

본 발명의 PHA합성효소는 상기 수법으로 창제되는 본 발명의 형질변환체를 배양해서, 도입되어 있는 발현벡터 중의 대응하는 PHA합성효소 유전자로부터 재조합형 단백질로서 생산된다. 그 배양물(배양균체 또는 배양상청) 중에 본 발명의 PHA합성효소를 생산ㆍ축적시키고, 배양물로부터 목적하는 PHA합성효소를 분리ㆍ취득함으로써 재조합형 효소단백질의 생산을 행할 수 있다. 이 목적에는, 본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다. 또한, 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 또한, 이 배양에는, 예를 들면 상기 폴리하이드록시알카노에이트합성효소 유전자발현의 유도물질을 포함하는 배지를 사용할 수도 있다.

대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻어진 형질변환체에 있어서는, 배양에 사용하는 배지로서, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또한, 배양온도는 25~37℃의 범위에서 호기적으로 8~72시간 배양함으로써 미생물의 증식을 도모한다. 그 후, 집균해서, 균체내에 축적된 PHA합성효소의 회수를 행할 수 있다. 이 미생물의 증식에 필요한 탄소원으로서, 예를 들면 글루코스, 프락토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세린 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 젖산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면, 암모니아; 염화암모늄 및 인산암모늄 등의 암모늄염; 펩톤, 고기추출물, 효모 추출물, 맥아추출물, 카세인 분해물 및 콘 스팁 리쿼(corn steep liquor) 등의 자연물생산 유래체를 포함한다. 무기물의 예로서는, 인산 제 1칼륨, 인산제 2칼륨, 인산마그네숨, 황산마그네슘 및 염화나트륨을 포함한다. 배지에는, 예를 들면, 마커유전자로서 이용되는 각종 약제내성유전자에 따라서, 카나마이신, 암피시린, 테트라사이클린, 클로암페니콜 및 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또한, 발현벡터에 있어서, 유도성의 프로모터를 사용하고 있는 경우는, 형질전환한 미생물을 배양할 때에 그 프로모터의 종류에 따라서 적합한 유도물질을 배지에 첨가해서 발현을 촉진하면 된다.

예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린 또는 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

PHA합성효소의 분리ㆍ정제는 얻어지는 배양물을 원심ㆍ회수해서, 어피니티(affinty) 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토그래피, 겔여과 등의 수단을 단독으로 또는 적절히 조합함으로써 행할 수 있다. 얻어진 정제물질이 목적하는 효소인 지의 확인은 통상의 방법, 예를 들면 SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 웨스턴 블로팅(Western boltting) 등에 의해 행한다.

또한, 본 발명의 형질전환미생물의 배양, 본 발명의 형질전환미생물에 의한 PHA합성효소의 생산, 균체 내로의 축적, 및 균체로부터의 PHA합성효소의 회수 및 정제는 위에 예시한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 형질전환미생물을 배양해서, 재조합형 PHA합성효소를 발현시켜서, 목적하는 PHA를 생산시킬 수 있다. 예를 들면, 이 미생물을 상기 배양조건에서 배양해서, 재조합형 PHA합성효소를 생산시키고, 그 때, 목적으로 하는 PHA에 대응하는 기질을 배지에 첨가하고, PHA합성효소를 작용시킨다. 배양물 및 생산균체로부터의 PHA의 회수는, 통상 행해지고 있는 클로로포름 등의 유기용매에 의한 추출이 가장 간편하다. 또한, 클로로포름 등의 유기용매를 사용하기 어려운 환경 속에 있어서는 SDS 등의 계면활성제에 의한 처리, 리소자임 등의 효소에 의한 처리, EDTA, 차아염소산나트륨, 암모니아 등의 약제에 의한 처리에 의해서 PHA 이외의 균체성분을 제거하고, PHA를 회수하는 방법을 사용할 수도 있다. 또한, PHA제조를 목적으로 하는 본 발명의 형질전환 미생물의 배양, 배양한 미생물에 의한 PHA의 생산, 균체 내로의 축적, 및 재조합미생물의 균체로부터의 PHA의 회수는 위에 예시한 방법에 한정되는 것은 아니다.

(실시예)

이하, 실시예를 참조해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 이러한 실시예는 본 발명의 최선의 실시예로서 기술하고 본 발명의 기술적인 범위를 제한하지 않는다.

(실시예 1) YN2균주의 PHA합성효소 유전자의 클로닝

YN2균주를 100㎖의 LB배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨, PH 7.4)에서 30℃에서, 하룻밤 동안 배양 후, 마머 등의 방법에 의해 염색체 DNA를 분리회수했다. 얻어진 염색체 DNA를 제한효소 BglII로 완전 분해했다. 벡터 pUC18은 제한효소 BamHI로 절단했다. 말단의 탈인산화처리(Molecular Cloning, 1권, 5.7.2쪽(1989년); Cold Spring Harbor Laboratory출판) 후, DNA 라이게이션 키트 Ver.II(타카라 슈조(주) 제품)를 사용해서 벡터의 절단부위(클로닝 사이트)와 염색체 DNA의 BglⅡ완전분해 단편을 연결했다. 이 염색체 DNA단편을 편입시킨 플라스미드 벡터를 사용해서 대장균(Escherichia coli) HB101주를 형질전환해서, YN2균주의 염색체 DNA라이브러리를 제작했다.

다음에, YN2균주의 PHA합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편을 선택하기 위해서, 콜로니 하이브리다이즈용의 프로브의 조제를 행했다. 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 합성하고(아머샴-파마시아 바이오텍), 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용해서 염색체 DNA를 템플레이트로 해서 PCR을 행했다. PCR증폭되어 온 DNA단편을 프로브로서 사용했다. 프로브의 표지화는 시판의 표지효소계 AlkPhosDirect(아머샴-파마시아 바이오텍)를 이용해서 행했다. 얻어진 표지화 프로브를 사용해서 YN2균주의 염색체 DNA 라이브러리로부터 콜로니 하이브리다이제이션법에 의해서 PHA합성효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 가진 대장균 균주를 선발했다. 선발한 균주로부터 알칼리법에 의해서 플라스미드를 회수함으로써 PHA합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편을 얻을 수 있다.

여기서 취득한 유전자DNA단편을 불화합성 그룹인 IncP,IncQ, 또는 IncW의 어느 것에도 속하지 않는 광숙주역 복제영역을 포함하는 벡터 pBBR122(Mo BiTec)로 재조합했다. 이 재조합 플라스미드를 슈도모나스 치코리이 YN2ml주(PHA합성능결손주)로 일렉트로포레이션법에 의해 형질전환한 바, YN2ml주의 PHA합성능이 복귀되어, 상보성을 표시했다. 따라서, 선발된 유전자DNA단편은 슈도모나스 치코리이 YN2ml주 내에 있어서, PHA합성효소로 번역가능한 PHA합성효소 유전자 영역을 포함하는 것이 확인된다.

이 PHA합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편에 대해서 상거법(Sanger's sequencing method)에 의해 염기서열을 결정했다. 그 결과, 결정된 염기서열 중에는 각각 펩티드사슬을 코딩하는, 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열이 존재하는 것이 확인되었다. 아래에서 설명하는 바와 같이, 개개의 펩티드사슬로 이루어진 단백질은 모두 효소 활성을 가지고 있으며, 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열은 각각 PHA 합성효소 유전자인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 서열번호 1로 표시하는 아미노산 서열을 서열번호 2의 염기서열은 코딩하고 있으며, 서열번호 3으로 표시하는 아미노산 서열을 서열번호 4의 염기서열은 코딩하고 있으며, 이 어느 한 쪽의 아미노산서열을 가진 단백질만으로 PHA합성능이 발휘되는 것을 확인했다.

(실시예 2) YN2균주의 PHA합성효소 유전자의 발현벡터로의 재조합

서열번호 2로 표시되는 염기서열의 PHA합성효소 유전자에 대해서, 염색체 DNA를 템플레이트로 해서 PCR을 행해서, PHA합성효소 유전자의 완전길이를 재조제했다. 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 대해서, 상류 쪽 프라이머가 되고, 그 개시 코돈보다도 상류의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드(서열번호 7) 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 대해서 하류 쪽 프라이머가 되고, 종지 코돈보다 하류의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드(서열번호 8)를 각각 설계 합성했다(아머샴-파마시아 바이오텍). 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 해서 PCR을 행하고, PHA합성효소 유전자의 완전길이를 증폭했다(LA-PCR키트; 타카라 슈조(주)제품).

마찬가지로, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 PHA합성효소 유전자에 대해서도, 염색체 DNA를 템플레이트로 해서 PCR을 행해서, PHA합성효소 유전자의 완전길이를 재조제했다. 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 대해서, 상류 쪽 프라이머가 되고, 그 개시 코돈보다 상류의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드(서열번호 9) 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 대해서, 하류 쪽 프라이머가 되고, 종지 코돈보다 하류의 염기서열을 가진 올리고 뉴클레오티드(서열번호 10)를 각각 설계합성했다(아머샴-파마시아 바이오텍), 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 PCR을 행하고, PHA합성효소 유전자의 완전길이를 증폭했다(LA-PCR 키트; 타카라 슈조(주) 제품).

다음에, 얻어진 PHA합성효소 유전자의 완전길이를 포함하는 PCR증폭단편을 각각에 대해서, 제한효소 Hind III을 사용해서 완전분해했다. 별도로, 발현벡터 pTrc 99A도 제한효소 Hind III으로 절단하고, 탈인산화처리(Molecular Cloning, 1권, 5.7.2쪽(1989년); Cold Spring Harbor Laboratory 출판)했다. 이 발현벡터 pTrc 99A의 절단부위에, 양 말단의 불필요한 염기서열을 제외한 PHA합성효소 유전자의 완전길이를 포함하는 DNA단편을, DNA 라이게이션 키트 Ver.II(타카라 슈조(주) 제품)를 사용해서 연결했다.

얻어진 재조합 플라스미드에 의해 대장균(Escherichia coli) HB101(타카라 슈조(주) 제품)을 염화칼슘법에 의해 형질변환했다. 얻어진 재조합체를 배양해서, 재조합 플라스미드의 증폭을 행하고, 재조합 플라스미드를 각각 회수했다. 서열번호 2의 유전자 DNA를 유지하는 재조합 플라스미드를 pYN2-C1(서열번호 2 유래), 서열번호 4의 유전자DNA를 유지하는 재조합 플라스미드를 pYN2-C2(서열번호 4 유래)로 했다.

(실시예 3)

PHA합성효소 유전자 재조합 대장균을 이용한 PHA 생산(1)

실시예 2에서 얻어진 재조합 플라스미드, pYN2-C1(서열 번호 2 유래) 및 pYN2-C2(서열번호 4 유래)를 이용해서, 대장균(Esherichia coli) HB101fB(fadB 결손주)를 염화 칼슘법에 의해 형질전환하고, 각각의 재조합 플라스미드를 유지하는 재조합 대장균주, pYN2-C1 재조합주, pYN2-C2 재조합주를 얻었다.

pYN2-C1재조합주 및 pYN2-C2재조합주의 각각을, 효모추출물 0.5%, FPVA 0.1%를 포함하는 M9배지 200ml로 식균해서, 37℃, 125스트로크(strokes)/분에서 흔들어 배양했다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한 번 세정해서 동결건조했다.

이 동결건조 펠렛(pellet)을 100ml의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20 시간 교반해서 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터에 의해 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축했다. 이어서, 농축액을 냉메탄올 중에서 재현탁시키고, 다시 침전 만을 회수해서 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 통상과 같이 메탄올리시스(methanolysis)를 행한 후, 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 1에 각 균주에 대해서 균체건조중량, 회수된 PHA의 폴리머건조중량, 균체당의 폴리머수율(폴리머 건조중량/균체건조중량) 및 모노머유닛의 동정결과를 아울러서 표시한다.

	pYN2-C1 재조합균주	pYN2-C2 재조합균주
균체건조중량	1150 ㎎/L	1200 ㎎/L
폴리머건조중량	101 ㎎/L	110 ㎎/L
폴리머건조중량/균체건조중량	9%	9%
모노머유닛 조성(면적비)
3-하이드록시부티르산	0%	0%
3-하이드록시발레르산	0%	0%
3-하이드록시헥산산	0%	0%
3-하이드록시헵탄산	3%	3%
3-하이드록시옥탄산	8%	10%
3-하이드록시노난산	2%	1%
3-하이드록시데칸산	12%	10%
3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산	75%	76%

이상에 표시한 바와 같이, pYN2-C1재조합주, pYN2-C2재조합주 모두, 기질인 5-(4-플루오로페닐)발레르산으로부터, 대응하는 3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산에 유래하는 화학식(I)로 표시하는 모노머유닛을 주성분으로 하는 PHA를 생산하는 것을 알 수 있다. 따라서, pYN2-C1재조합주는 서열번호 2로 표시하는 염기서열을 포함하는 PHA합성효소 유전자로부터 번역되는, 서열번호 1로 표시하는 아미노산서열의 PHA합성효소만을, pYN2-C2재조합주는 서열번호 4로 표시하는 염기서열을 포함하는 PHA합성효소 유전자로부터 번역되는, 서열번호 3으로 표시하는 아미노산서열의 PHA합성효소만을 각각 생산하지만, 양자 모두 마찬가지로 기질인 5-(4-플루오로페닐)발레르산으로부터, 대응하는 3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산에 유래하는 화학식(I)로 표시하는 모노머유닛으로의 변환과, 그것을 포함하는 PHA의 합성을 행하는 것이 확인된다.

(실시예 4) PHA합성효소 유전자 재조합 대장균을 이용한 PHA 생산(1)

실시예 2에서 얻은 재조합 플라스미드, pYN2-C1(서열번호 2로부터 유래) 및 pYN2-C2(서열번호 4로부터 유래)를 이용해서, 대장균 HB101fB(fadB 결손주)를 염화칼슘법에 의하여 형질전환하고, 상기 재조합 플라스미드로부터 재조합 대장균주를 제조하였다.

pYN2-C1재조합균주 및 pYN2-C2 재조합균주의 각각을 0.5% 효모추출물 및 0.1% 4-시클로헥실부티르산을 함유하는 M9 배지의 200ml에 식균하고, 37℃, 125스트로크/분의 속도로 진탕배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의하여 회수하고, 냉 메탄올로 한 번 세정하여 동결건조시켰다.

이 동결건조 펠렛을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기로 농축했다. 농축액을 냉메탄올 속에서 재현탁시키고, 다시 침전물만을 회수해서 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 통상과 같이 메탄올리시스를 행한 후, 가스 크로마토그래피질량 분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 확인을 행했다. 표 2에 각 균주에 대해서 전체 건조중량, 회수된 PHA의 폴리머건조중량, 균체당의 폴리머수율(폴리머건조중량/균체건조중량) 및 모노머유닛의 동정결과를 아울러서 표시한다.

	pYN2-C1 재조합균주	pYN2-C2 재조합균주
균체건조중량	900㎎/L	880㎎/L
폴리머건조중량	55㎎/L	52㎎/L
폴리머건조중량/균체건조중량	6%	6%
모노머유닛 조성(면적비)
3-하이드록시부티르산	0%	0%
3-하이드록시발레르산	0%	0%
3-하이드록시헵산산	0%	0%
3-하이드록시헵탄산	1%	0%
3-하이드록시옥탄산	4%	5%
3-하이드록시노난산	2%	1%
3-하이드록시데칸산	9%	8%
3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산	84%	86%

이상에 표시한 바와 같이, pYN2-C1재조합주, pYN2-C2재조합주 모두, 기질인 4-시클로헥실부티르산으로부터, 대응하는 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산에 유래하는 화학식(Ⅵ)으로 표시하는 모노머유닛을 주성분으로 하는 PHA를 생산하는 것을 알 수 있다. 따라서, pYN2-C1재조합주는 서열번호 2로 표시하는 염기서열을 포함하는 PHA합성효소 유전자로부터 번역되는, 서열번호 1로 표시하는 아미노산서열의 PHA합성효소만을, pYN2-C2재조합주는 서열번호 4로 표시하는 염기서열을 포함하는 PHA합성효소 유전자로부터 번역되는, 서열번호 3으로 표시하는 아미노산 서열의 PHA합성효소만을 각각 생산하지만, 양자 모두 마찬가지로 기질인 4-시클로헥실부티르산으로부터 대응하는 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산에 유래하는 화학식(Ⅵ)으로 표시하는 모노머유닛으로의 변환과, 그것을 포함하는 PHA의 합성을 행하는 것이 확인된다.

상기 실시예 3의 결과와 함께, 본 실시예의 결과는, 서열번호 1 및 3의 아미노산 염기서열을 가지는 PHA합성효소가, 상호간의 기질의 특이성이 유사한 효소활성을 가지는 것으로 판명되었다.

본 발명의 PHA 합성효소 및 이 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는, 신규한 미생물 슈도모나스 치코리이 YN2균주로 유래되는 것이고, 신규한 곁사슬 구조를 가지는 모노머유닛을 선택적으로 함유한 PHA 합성을 행하는 기질특이성을 나타낸다. 또한, 이 PHA 합성효소 유전자를 함유한 재조합벡터 및 이 재조합벡터에 의해 형질전환된 형질전환미생물은, 슈도모나스 치코리이 YN2균주와 마찬가지의 기질특이성을 나타내는 PHA합성능을 가지는 것으로 된다. 이와 같이, 본 발명의 PHA 합성효소 유전자는, 신규한 곁사슬 구조를 가지는 모노머유닛을 선택적으로 함유하는 PHA 합성을 가능하게 하는 효소를 코딩하고, 각종 유용한 물성을 가지고, 기능성 폴리머에 응용하는 것이 기대되는 PHA를 합성하므로, 유용한 형질전환미생물의 제작을 가능하게 한다.

도 1은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 1 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 2는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 1 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 3은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 1 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 4는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 1 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 5는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 1 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 6은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 2 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 7은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 2 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 8은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 2 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 9는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 2 PHA합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

도 10은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제 2 PHA 합성효소를 코딩하는 염기서열을 표시한 도면

<110> CANON KABUSHIKI KAISHA <120> Polyhydroxyalkanoate Synthase and Gene Encoding the Same Enzyme <150> JP2000-095002 <151> 2000-03-30 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7375 <400> 1 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Glu Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 2 <211> 1680 <212> DNA <213> Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7375 <400> 2 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gccatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt tttcgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgatgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gcgcctgctc cggcggcatc 900 acttgcaccg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg atgttgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc ataccgattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacggtaa 1680 1680 <210> 3 <211> 560 <212> PRT <213> Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7375 <400> 3 Met Arg Asp Lys Pro Ala Arg Glu Ser Leu Pro Thr Pro Ala Lys Phe 1 5 10 15 Ile Asn Ala Gln Ser Ala Ile Thr Gly Leu Arg Gly Arg Asp Leu Val 20 25 30 Ser Thr Leu Arg Ser Val Ala Ala His Gly Leu Arg His Pro Val His 35 40 45 Thr Ala Arg His Ala Leu Lys Leu Gly Gly Gln Leu Gly Arg Val Leu 50 55 60 Leu Gly Asp Thr Leu His Pro Thr Asn Pro Gln Asp Arg Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Leu Asn Pro Phe Tyr Arg Arg Ser Leu Gln Ala 85 90 95 Tyr Leu Ser Trp Gln Lys Gln Val Lys Ser Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Met Ser Pro Asp Asp Arg Ala Arg Ala His Phe Ala Phe Ala Leu Leu 115 120 125 Asn Asp Ala Val Ser Pro Ser Asn Ser Leu Leu Asn Pro Leu Ala Ile 130 135 140 Lys Glu Ile Phe Asn Ser Gly Gly Asn Ser Leu Val Arg Gly Ile Gly 145 150 155 160 His Leu Val Asp Asp Leu Leu His Asn Asp Gly Leu Pro Arg Gln Val 165 170 175 Thr Arg His Ala Phe Glu Val Gly Lys Thr Val Ala Thr Thr Thr Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Glu Leu Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Met Ser Glu Lys Gln Tyr Ser Lys Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Phe Asp Leu Ser Pro His Asn Ser Phe Val 225 230 235 240 Gln Phe Ala Leu Lys Asn Gly Leu Gln Thr Phe Val Ile Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Asp Val Arg His Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Val Glu 260 265 270 Ala Val Glu Glu Ala Met Asn Val Cys Arg Ala Ile Thr Gly Ala Arg 275 280 285 Glu Val Asn Leu Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala 290 295 300 Leu Gln Gly His Leu Gln Ala Lys Arg Gln Leu Arg Arg Val Ser Ser 305 310 315 320 Ala Thr Tyr Leu Val Ser Leu Leu Asp Ser Gln Leu Asp Ser Pro Ala 325 330 335 Thr Leu Phe Ala Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg Arg Ser 340 345 350 Tyr Gln Lys Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala 355 360 365 Trp Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Ser Tyr Phe Val Asn Asn Tyr 370 375 380 Leu Met Gly Lys Glu Pro Pro Ala Phe Asp Ile Leu Tyr Trp Asn Asn 385 390 395 400 Asp Asn Thr Arg Leu Pro Ala Ala Leu His Gly Asp Leu Leu Asp Phe 405 410 415 Phe Lys His Asn Pro Leu Ser His Pro Gly Gly Leu Glu Val Cys Gly 420 425 430 Thr Pro Ile Asp Leu Gln Lys Val Thr Val Asp Ser Phe Ser Val Ala 435 440 445 Gly Ile Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Asp Ala Val Tyr Arg Ser Thr 450 455 460 Leu Leu Leu Gly Gly Glu Arg Arg Phe Val Leu Ala Asn Ser Gly His 465 470 475 480 Val Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Asn Asn Pro Lys Ala Asn Tyr Leu 485 490 495 Glu Gly Ala Lys Leu Ser Ser Asp Pro Arg Ala Trp Tyr Tyr Asp Ala 500 505 510 Lys Pro Val Asp Gly Ser Trp Trp Thr Gln Trp Leu Gly Trp Ile Gln 515 520 525 Glu Arg Ser Gly Ala Gln Lys Glu Thr His Met Ala Leu Gly Asn Gln 530 535 540 Asn Tyr Pro Pro Met Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val Arg Val Arg 545 550 555 560 <210> 4 <211> 1683 <212> DNA <213> Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7375 <400> 4 atgcgcgata aacctgcgag ggagtcacta cccacccccg ccaagttcat caacgcacaa 60 agtgcgatta ccggcctgcg tggccgggat ctggtttcga ctttgcgcag tgtcgccgcc 120 catggcctgc gccaccccgt gcacaccgcg cgacacgcct tgaaactggg tggtcaactg 180 ggacgcgtgt tgctgggcga caccctgcat cccaccaacc cgcaagaccg tcgcttcgac 240 gatccggcgt ggagtctcaa tcccttttat cgtcgcagcc tgcaggcgta cctgagctgg 300 cagaagcagg tcaagagctg gatcgacgaa agcaacatga gcccggatga ccgcgcccgt 360 gcgcacttcg cgttcgccct gctcaacgat gccgtgtcgc cgtccaacag cctgctcaat 420 ccgctggcga tcaaggaaat cttcaactcc ggcggcaaca gcctggtgcg cgggatcggc 480 catctggtcg atgacctctt gcacaacgat ggcttgcccc ggcaagtcac caggcatgca 540 ttcgaggttg gcaagaccgt cgccaccacc accggcgccg tggtgtttcg caacgagctg 600 ctggagctga tccaatacaa gccgatgagc gaaaagcagt attccaaacc gctgctggtg 660 gtgccgccac agatcaacaa gtactacatt tttgacctca gcccccataa cagcttcgtc 720 cagttcgcgc tcaagaacgg cctgcaaacc ttcgtcatca gctggcgcaa tccggatgta 780 cgtcaccgcg aatggggcct gtcgacctac gtcgaagcgg tggaagaagc catgaatgtc 840 tgccgggcaa tcaccggcgc gcgcgaggtc aacctgatgg gcgcctgcgc tggcgggctg 900 accattgctg ccctgcaggg ccacttgcaa gccaagcgac agctgcgccg cgtctccagc 960 gcgacgtacc tggtgagcct gctcgacagc caactggaca gcccggccac actcttcgcc 1020 gacgaacaga ccctggaggc ggccaagcgc cgctcctacc agaaaggtgt gctggaaggc 1080 cgcgacatgg ccaaggtttt cgcctggatg cgccccaacg atttgatctg gagctacttc 1140 gtcaacaatt acctgatggg caaggagccg ccggcgttcg acattctcta ctggaacaat 1200 gacaacacac gcctgccggc cgccctgcat ggtgacttgc tggacttctt caagcacaac 1260 ccgctgagcc atccgggtgg cctggaagtg tgcggcaccc cgatcgactt gcaaaaggtc 1320 accgtcgaca gtttcagcgt ggccggcatc aacgatcaca tcacgccgtg ggacgcggtg 1380 tatcgctcaa ccctgttgct cggtggcgag cgtcgctttg tcctggccaa cagcggtcat 1440 gtgcagagca ttctcaaccc gccgaacaat ccgaaagcca actacctcga aggtgcaaaa 1500 ctaagcagcg accccagggc ctggtactac gacgccaagc ccgtcgacgg tagctggtgg 1560 acgcaatggc tgggctggat tcaggagcgc tcgggcgcgc aaaaagaaac ccacatggcc 1620 ctcggcaatc agaattatcc accgatggag gcggcgcccg ggacttacgt gcgcgtgcgc 1680 tga 1683 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 5 tgctggaact gatccagtac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 6 gggttgagga tgctctggat gtg 23 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 7 ggaccaagct tctcgtctca gggcaatgg 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 8 cgagcaagct tgctcctaca ggtgaaggc 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 9 gtattaagct tgaagacgaa ggagtgttg 29 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 10 catccaagct tcttatgatc gggtcatgcc 30

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
2. 삭제
3. 삭제
4. 서열번호 1의 아미노산서열을 코딩하는 서열번호 2의 DNA염기서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자.
5. 서열번호 3의 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
6. 삭제
7. 삭제
8. 서열번호 3의 아미노산서열을 코딩하는 서열번호 4의 DNA염기서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자.
9. 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자로서, 제 4항 또는 제 8항에 기재된 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
10. 제 9항에 기재된 재조합벡터의 도입에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환미생물.
11. 제 10항에 기재된 형질전환미생물을, 폴리하이드록시알카노에이트합성효소의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 배지에서 배양하는 단계와, 얻어진 배양물로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 취득하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
12. 제 10항에 기재된 형질전환미생물을 배양하는 단계와, 상기 형질전환미생물에 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 산출시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 생산방법.