JP3740358B2 - 側鎖にエポキシ基を含むポリエステルの製造方法及び架橋ポリマーの製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリエステルの微生物による製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・テイー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがなく、また、焼却処理も不要なためダイオキシンや環境ホルモン等の有害物質を発生させる心配もない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている(特開平５-１５９号公報)。
【０００３】
近年、この様なＰＨＡを産業上利用していく上で、通常のモノマーユニットとは異なったユニットで構成されたＰＨＡを生産させ、物理化学的特性の多様性を拡げようとする試みがなされてきている。
【０００４】
その中の一つの方法として、ＰＨＡの側鎖にエポキシ基を導入し、この部分を活性点として架橋反応や、化学修飾を行うことでＰＨＡの物理化学的性質を改良しようとする試みがなされている。
【０００５】
Ｍacromolecules, 31, 1480-1486(1998)及び Journal of Polymer Science:Part Ａ:Polymer Ｃhemistry, 36, 2381-2387(1998)には、Pseudomonas oleovoransをオクタン酸ナトリウムと不飽和脂肪酸である１０-ウンデセン酸を様々な割合で加えた培地中で培養することにより、側鎖の末端に不飽和結合を持つユニットを様々な割合で含むＰＨＡを合成し、その後不飽和部分を３-クロロ安息香酸により化学的にエポキシ化し、側鎖末端にエポキシ基を含むＰＨＡを合成したと報告されている。更に Journal of Polymer Science:PartＡ:Polymer Ｃhemistry,３６, 2389-2396(1998)において、前記エポキシＰＨＡを、２-エチル-４-メチルイミダゾールをイニシエーターとし、無水コハク酸を用いて架橋反応を行ったと報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ＰＨＡの物理化学的性質を改良していく上で、側鎖末端のエポキシ基は非常に有用であるが、側鎖末端の不飽和部分を化学的にエポキシ化する以外にその合成方法が無く、操作が非常に煩雑で現実問題としてコスト面でもデメリットとなる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では上記の様な課題を解決するための方法を提供する。即ち、本発明は、１-アルケンを原料として側鎖にエポキシ基を含むポリエステルを製造する方法であって、該１-アルケンを取り込み該ポリエステルに変換する能力を有する微生物に、該１-アルケンを接触させて該ポリエステルに変換する工程を有することを特徴とする側鎖にエポキシ基を含むポリエステルの製造方法に関するものである。
【０００８】
具体的には、１-アルケンを含む培地中で、該微生物を培養する工程を含む、側鎖にエポキシ基を含むポリエステルの製造方法、更には、該微生物により生産された該ポリエステルを単離する工程、とりわけ該微生物細胞から該ポリエステルを回収する工程を含む、側鎖にエポキシ基を含むポリエステルの製造方法に関するものである。
【０００９】
さらに、前記記載の方法により得られたポリエステルとジアミン化合物とを反応させることを特徴とする架橋ポリマーの製造方法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法で得られるポリエステルは、モノマーユニット中に、化学式[１]で示すユニットのうち一つ、が少なくとも１ユニット％以上含まれている。
【００１１】
【化４】

(n:１〜７の整数) [１]
更に本発明の方法で得られるポリエステルは、モノマーユニット中に、化学式[２]で示すユニットが少なくとも１ユニット％含まれていてもよい。
【００１２】
【化５】

(ｍ:１〜７の整数) [２]
更に本発明の方法で得られるポリエステルは、モノマーユニット中に、化学式[３]で示すユニットが少なくとも１ユニット％含まれていてもよい。
【００１３】
【化６】

(k:０〜８の整数) [３]
本発明の方法おける原料である１-アルケンは、炭素数７から１２までの１-アルケン、即ち、１-ヘプテン、１-オクテン、１-ノネン、１-デセン、１-ウンデセン、１-ドデセンを用いることが望ましい。
また、本発明で得られるポリエステルの数平均分子量は、10 000 から 1 000 000 であり、更に詳しくは 10 000 から 500 000 である。
【００１４】
(微生物)
本発明の方法で用いる微生物は、１-アルケンをエポキシ化する能力・該エポキシ化化合物の末端をカルボン酸に変換する能力・該エポキシ化カルボン酸を側鎖にエポキシ基を含むポリエステルに変換する能力を有する微生物であり、その様な微生物としては、シュードモナス属に属する微生物が挙げられ、更に具体的には本発明の実施例にて用いたシュードモナス チコリアイ ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ Ｐ-17411)が挙げられる。
【００１５】
本発明で用いる微生物であるシュードモナス チコリアイ ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ Ｐ-17411)は以下の様な性質を持つ微生物であり、通産省工業技術院 生命工学工業技術研究所に寄託されている(寄託番号:ＦＥＲＭ Ｐ-17411)。
【００１６】
ここで、ＹＮ２株の菌学的性質を以下に示す。
(１)形態学的性質
培養温度 :３０℃
細胞形態 :棹菌(0.8×1.5〜2.0 ｍｍ)
グラム染色 :陰性
胞子形成 :陰性
運動性 :陽性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :非発酵性
硝酸還元 :陰性
インドール産生 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing‘sＢ寒天での蛍光色産生 :陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性(＊)
Ｔｗeen８０の加水分解 :陽性
＊ nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
本菌株はまた、特願平１１-３７１８６３号に開示されている微生物である。本菌株は、以下の実施例にも示すように、１-アルケンをエポキシ化する能力を有している。通常この様な能力を発揮するための酵素は、アルケンモノオキシゲナーゼである。本菌株もこのアルケンモノオキシゲナーゼを有している可能性が非常に高い。また、本菌株は、アルケン酸から対応するエポキシ酸を生産するという知見は得られていない。以上の結果から判断し、本菌株が本発明に示したポリエステルを生産する経路は図７に示すような経路であることが示唆される。
【００１７】
(培養工程)
本発明で用いる培地としては、リン酸塩及びアンモニウム塩或いは硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地ならいかなる培地でも良いが、窒素源の濃度を調節することでＰＨＡの生産性を向上せしめることが可能である。添加する１-アルケンは水への溶解性が良くなく、揮発性が高いので、培養の際には、ガス状で供給し、該微生物が必要とする酸素を確保した上で密閉する必要がある。
【００１８】
無機塩培地の例として本発明の一方法に用いた培地の組成を以下に示す。
【００１９】
＜Ｍ９培地＞
Ｎa₂ＨＰＯ₄ :６.３
ＫＨ₂ＰＯ₄ :３.０
ＮＨ₄Ｃl :１.０
ＮaＣl :０.５ g/L、pＨ＝７.０
＜１/１０Ｎ-Ｍ９培地＞
Ｎa₂ＨＰＯ₄ :６.３
ＫＨ₂ＰＯ₄ :３.０
ＮＨ₄Ｃl :０.１
ＮaＣl :０.５ g/L、pＨ＝７.０
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を０.３％(v/v)程度添加する必要がある。
【００２０】

培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、２０℃から３０℃程度が適当である。
【００２１】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。
【００２２】
本発明にかかる培養菌体と培養液とからなる培養物からのＰＨＡの取得には通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行われているクロロホルム抽出が最も簡便であるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤処理によってＰＨＡ以外の菌体内成分を除去することによってＰＨＡのみを回収する方法を採ることもできる。
【００２３】
尚、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,５４, 2924-2932(1988)には、シュードモナス オレオボランスを用いた、本発明の方法に準じたポリエステルの生産が報告されているが、生産されるポリエステルは側鎖にエポキシ基を持たず、側鎖の末端に二重結合を有するユニットと側鎖か飽和アルキレン鎖であるユニットからなるポリエステルである。
【００２４】
本発明の方法で得られるポリマーは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、ヘキサメチレンジアミンや無水コハク酸、２-エチル-４-メチルイミダゾール、電子線照射による、架橋反応が挙げられる。また、水酸基に変換したり、スルホン基を導入することも可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもできる。
【００２５】
更に本発明は、上記のようにしてポリエステルとジアミン化合物とを反応させることにより得られる架橋ポリマーの製造方法を提供する。更に詳しくは、前記ポリエステルとヘキサメチレンジアミンとを反応させることにより得られる前記架橋ポリマーの製造方法を提供する。この様な反応経路は、下記のスキームに示すような形で反応が進行し、架橋ポリマーが生成する。
【００２６】
【化７】

反応温度は５０℃から１２０℃が好ましく、反応時間が１０分から１２０分の範囲が望ましい。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を示すが本発明は以下の実施例によって何等制限されうるものではない。
【００２８】
[実施例１]
酵母エキス０.１％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ２株のコロニーを、ＯＤ(600nｍ)＝１.０となるように滅菌した生理食塩水に懸濁した。
予め作成しておいた、炭素源を含まない１/１０Ｎ-Ｍ９寒天培地２０枚に、上記懸濁液を塗布し、１-ヘプテン雰囲気中で３０℃で静置培養した。
【００２９】
４日後、菌体を集め、メタノールで洗浄して遠心分離によって集菌し、減圧乾燥した。
【００３０】
乾燥菌体にクロロホルム５０ｍLを加え、３０℃で４８時間攪拌してＰＨＡを抽出した。クロロホルム層をろ過し、エバポレーターで濃縮した後、冷メタノールに注加し、沈殿を回収して減圧乾燥した。
【００３１】
[実施例２]
１-ヘプテンを１-オクテンに変更した以外は実施例１と同様の方法で生産実験及び評価を行った。
【００３２】
[実施例３]
１-ヘプテンを１-ノネンに変更した以外は実施例１と同様の方法で生産実験及び評価を行った。
【００３３】
[実施例４]
１-ヘプテンを１-デセンに変更した以外は実施例１と同様の方法で生産実験及び評価を行った。
【００３４】
[実施例５]
１-ヘプテンを１-ウンデセンに変更した以外は実施例１と同様の方法で生産実験及び評価を行った。
【００３５】
[実施例６]
１-ヘプテンを１-ドデセンに変更した以外は実施例１と同様の方法で生産実験及び評価を行った。
【００３６】
実施例１から６の、得られた菌体及びポリマーの乾燥重量を表１に示す。
【００３７】
【表１】

実施例１から６で得られたポリマーのユニット分析は以下のようにして行った。すなわち、約１０ｍgのＰＨＡを２５ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍLに溶解させ、３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍLを加えて、１００℃で還流しながら３.５時間反応させた。反応終了後、脱イオン水１０ｍLを加えて激しく１０分間振とうした後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウムで脱水したのち、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)にかけて、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。トータルイオンクロマト(ＴIＣ)のエリア％の結果を表２に示す。この場合、メタノリシスによってモノマーユニットが変換されるため、エポキシユニットの検出はできなかった。
【００３８】
【表２】

Ｃ4:３-ヒドロキシ酪酸、Ｃ5:３-ヒドロキシ吉草酸、Ｃ6:３-ヒドロキシヘキサン酸、Ｃ6＝:３-ヒドロキシ-５-ヘキセン酸、Ｃ7:３-ヒドロキシヘプタン酸、Ｃ7＝:３-ヒドロキシ-６-ヘプテン酸、Ｃ8:３-ヒドロキシオクタン酸、Ｃ8＝:３-ヒドロキシ-７-オクテン酸、Ｃ9:３-ヒドロキシノナン酸、Ｃ9＝:３-ヒドロキシ-８-ノネン酸、Ｃ10:３-ヒドロキデカン酸、Ｃ10＝:３-ヒドロキシ-９-デセン酸、Ｃ11:３-ヒドロキシウンデカン酸、Ｃ11＝:３-ヒドロキシ-１０-ウンデセン酸、Ｃ12:３-ヒドロキシドデカン酸、Ｃ12＝:３-ヒドロキシ-１１-ドデセン酸
実施例１から６で得られたポリマーは¹Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:¹Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。側鎖末端のメチン、側鎖の末端二重結合およびエポキシに関わるプロトンの帰属はＭacroｍolecules,３１, 1480-1486(1998)に従って行った。得られたスペクトルを図１から図６に示す。
【００３９】
これらから計算した各側鎖ユニット(飽和、末端不飽和(二重結合)、末端エポキシ)のユニット％を表３に示す。
【００４０】
【表３】

更に、実施例１から６で得られたポリマーの分子量をＧＰＣ(東ソー ＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した。結果を表４に示す。
【００４１】
【表４】

[実施例７]
ＹＮ２株を、ポリペプトン０.５％を含む培地で３０℃、２４時間培養し、遠心分離にて集菌し、無機塩培地に再懸濁した。この菌懸濁液１０ｍLを、２７ｍL容バイアル瓶に移し、ブチルゴム栓及びアルミシールにて密閉し、１-ヘキセンガスを含む空気をシリンジで加えた。対照として、菌を含まない無機塩培地のみの試料も同様に作成し、各バイアル瓶を３０℃で１時間振とうした。振とう後、バイアル瓶の気相部分０.１ｍLをシリンジで採取し、ガスクロマトグラフィー(ＧＣ)分析を行った。ＧＣの条件は以下の通りである。
【００４２】
[島津ＧＣ-１４Ｂ、カラム：ＤＢ-624(Ｊ&Ｗ社製)、カラム温度：１００℃恒温、注入・検出器温度：２３０℃、検出器：ＦIＤ]
結果を図８に示す。Ａは、菌を含まない無機塩培地のみの試料である。１-ヘキセンのピークが 1.05分付近に見られる。Ｂは、ＹＮ２株の菌懸濁液試料である。2.47分付近に、Ａでは見られなかったピークが出現している。Ｃは、１,２-エポキシヘキサンの標品である。相当するピークが 2.47分付近に見られる。以上の結果より、ＹＮ２株が１-ヘキセンを１,２-エポキシヘキサンに変換していることが明らかとなった。
【００４３】
[実施例８]
実施例７と同様の方法で、１-オクタンに対するＹＮ２株の変換挙動を評価した（ＧＣカラム温度：１５０℃）。結果を図９に示す。Ａは、菌を含まない無機塩培地のみの試料である。１-オクテンのピークが 1.21分付近に見られる。Ｂは、ＹＮ２株の菌懸濁液試料である。2.38分付近に、Ａでは見られなかったピークが出現している。Ｃは、１,２-エポキシオクタンの標品である。相当するピークが 2.38分付近に見られる。以上の結果より、ＹＮ２株が１-オクテンを１,２-エポキシオクタンに変換していることが明らかとなった。
【００４４】
つまり、実施例７、８の結果より、ＹＮ２株が１−アルケンを対応する１,２-エポキシアルカンにエポキシ化する能力を有することが明らかとなった。
【００４５】
[実施例９]
実施例４によって得られたポリマー２０ｍgをクロロホルム０.２ｍLに溶解し、氷冷しながらヘキサメチレンジアミン１０ｍgを加えて溶解させた。溶解を確認後、クロロホルムを除去し、示差走査熱量計(ＤＳＣ；パーキンエルマー社、Pyris1、昇温：１０℃/分)装置で測定を行った。更に、サンプルを９０℃で１時間反応させたものを同じくＤＳＣ測定を行った。
【００４６】
結果を図１０に示す。図中▲１▼に示すチャートが前者(混合のみ)のサンプルであり、▲２▼に示すチャートが後者(９０℃で１時間反応させた)サンプルである。▲１▼では９０℃付近に明確な発熱ピークがみられ、実施例４によって得られたポリマー中のエポキシ基とヘキサメチレンジアミンとの反応が起こり、ポリマー同士の架橋が進行していることが示される。一方、▲２▼では明確なヒートフローは見られず、架橋反応が完了していることが示される。
【００４７】
更に、同様のサンプルにつき、赤外吸収を測定した(ＦＴ-IＲ；パーキンエルマー社、1720Ｘ)。結果を図１１に示す。▲１▼で見られたアミン(3340cｍ^-1付近)及びエポキシ(822cｍ^-1付近)のピークが▲２▼では消失している。
【００４８】
以上の結果より、該１-アルケンを取り込み該ポリエステルに変換する能力を有する微生物に、該１-アルケンを接触させて該ポリエステルに変換する工程を有する方法により得られる、側鎖にエポキシユニットを持つポリエステルとヘキサメチレンジアミンを反応させることにより、架橋ポリマーが得られることが明らかとなった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の方法により、炭素数７以上１２以下の１-アルケンを単一炭素源とし、側鎖にエポキシユニットを持つ３-ヒドロキシ脂肪酸を含むポリエステルの製造、更に得られたポリマー由来の架橋ポリマーの製造が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたポリマーの¹Ｈ-ＮＭＲを示す。
【図２】実施例２で得られたポリマーの¹Ｈ-ＮＭＲを示す。
【図３】実施例３で得られたポリマーの¹Ｈ-ＮＭＲを示す。
【図４】実施例４で得られたポリマーの¹Ｈ-ＮＭＲを示す。
【図５】実施例５で得られたポリマーの¹Ｈ-ＮＭＲを示す。
【図６】実施例６で得られたポリマーの¹Ｈ-ＮＭＲを示す。
【図７】ＹＮ２株の１-アルケンからのポリマー生産経路を示す。
【図８】実施例７で示される結果のＧＣチャートを示す。
【図９】実施例８で示される結果のＧＣチャートを示す。
【図１０】実施例９で示されるポリマーのＤＳＣチャートを示す。
【図１１】実施例９で示されるポリマーのＦＴ-IＲチャートを示す。

Claims (13)

1. １-アルケンを原料として側鎖にエポキシ基を含むポリエステルを製造する方法であって、該１-アルケンを取り込み該ポリエステルに変換する能力を有する微生物であるシュードモナス チコリアイ ＹＮ２株 (Pseudo ｍ onas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ Ｐ -17411)に、該１-アルケンを接触させて該ポリエステルに変換する工程を有することを特徴とする側鎖にエポキシ基を含むポリエステルの製造方法。
2. １-アルケンを含む培地中で、該微生物を培養する工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 該微生物により生産された該ポリエステルを単離する工程を更に有する請求項２に記載の方法。
4. 該単離工程が、該微生物細胞から該ポリエステルを回収する工程である請求項３に記載の方法。
5. １-アルケンが、炭素数７から12までの１-アルケンである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 該ポリエステルが、モノマーユニット中に、化学式[１]で示すユニットが少なくとも１ユニット％含まれる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
   

   

   (n:１〜７の整数) [１]
7. 該ポリエステルが、モノマーユニット中に、化学式[２]で示すユニットが少なくとも１ユニット％含まれる請求項６に記載の方法。
   

   

   (ｍ:１〜７の整数) [２]
8. 該ポリエステルが、モノマーユニット中に、化学式[３]で示すユニットが少なくとも１ユニット％含まれる請求項６または７に記載の方法。
   

   

   (k:０〜８の整数) [３]
9. 該ポリエステルの数平均分子量が、10000から1000000である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 請求項１から９のいずれかに記載の方法により得られたポリエステルとジアミン化合物とを反応させることを特徴とする架橋ポリマーの製造方法。
11. 前記ジアミン化合物がヘキサメチレンジアミンである請求項10に記載の方法。
12. 反応温度が50℃から120℃の範囲である請求項10または11に記載の方法。
13. 反応時間が10分から120分の範囲である請求項10から12のいずれかに記載の方法。

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