JP3880473B2 - (メチルスルファニル)フェノキシ構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 - Google Patents
(メチルスルファニル)フェノキシ構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構成ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート(PHA)と、その製造方法に関する。より具体的には、側鎖末端に(メチルスルファニル)フェノキシ基を有する3−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含む新規な生分解性PHA及び、PHAを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を利用し、末端に(メチルスルファニル)フェノキシ基を置換基として有するアルカン酸を原料とする、前記PHAを製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ−3−ヒドロキシ酪酸(以下、PHBと略す)あるいはその他のPHAを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,P178−197(1995))。これらのポリマーは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。更に、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全に分解されるという利点を有していることから、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材料等としての応用も期待されている。
【0003】
このように微生物産生PHAは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、PHAの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。例えば、アルカリゲネス・ユウトロファスH16株(Alcaligenes eutropus H16、ATCC No.17699)及びその変異株は、その培養時の基質を変化させることによって、3−ヒドロキシ酪酸(以下、3HBと略す)と3−ヒドロキシ吉草酸(以下、3HVと略す)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特公平6−15604号公報、特公平7−14352号公報、特公平8−19227号公報等)。
【0004】
また、特許公報第2642937号には、シュードモナス・オレオボランス・ATCC 29347株(Pseudomonas oleovorans ATCC 29347)に基質として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数6から12までの3−ヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとするPHAを生産することが開示されている。
【0005】
特開平5−7492号公報には、メチロバクテリウム属(Methylobacterium sp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Alcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)の微生物を、炭素数3から7の第一級アルコールに接触させることにより、3HBと3HVとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【0006】
特開平5−93049号公報、及び特開平7−265065号公報には、アエロモナス・キャビエ(Aeromonas caviae)をオレイン酸やオリーブ油を基質として培養することにより、3HBと3−ヒドロキシヘキサン酸との二成分共重合体を生産することが開示されている。
【0007】
特開平9−191893号公報には、コマモナス・アシドボランス・IFO 13852株(Comamonas acidovorans IFO 13852)が、基質としてグルコン酸及び1,4−ブタンジオールを用いた培養により、3HBと4−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【0008】
更に、ある種の微生物では、様々な置換基、例えば、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが導入されたPHAを生産することが報告されており、このような手法によって微生物産生PHAの物性改良を目指す試みもなされている。例えば、Makromol.Chem.,191,1957−1965, (1990)、Macromolecules,24,5256−5260, (1991)、Chirality,3,492−494, (1991)等では、シュードモナス・オレオボランスが3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸(以下、3HPVと略す)をモノマーユニットをして含むPHAを生産することが報告されており、3HPVが含まれることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【0009】
また、置換基を側鎖に導入したPHAのうち、近年フェノキシ基を側鎖に有するPHAの開発が盛んである。
【0010】
Macromol.Chem.Phys., 195,1665−1672 (1994)には、シュードモナス・オレオボランス(Pseudomonasoleovorans)が、11−フェノキシウンデカン酸から3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸ならびに3−ヒドロキシ−9−フェノキシノナン酸をユニットとして含むPHAを生産することが報告されている。
【0011】
Macromolecules, 29,3432−3435 (1996)には、シュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)を用いて、6−フェノキシヘキサン酸から、3−ヒドロキシ−4−フェノキシ酪酸と3−ヒドロキシ−6−フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むPHAを、8−フェノキシオクタン酸から、3−ヒドロキシ−4−フェノキシ酪酸、3−ヒドロキシ−6−フェノキシヘキサン酸及び3−ヒドロキシ−8−フェノキシオクタン酸をユニットとして含むPHAを、11−フェノキシウンデカン酸から、3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸と3−ヒドロキシ−7−フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むPHAを、それぞれ生産することが報告されている。
【0012】
Can.J.Microbiol., 41,32−43 (1995)には、シュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)ATCC 29347株及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2422株を用いて、オクタン酸と6−(4−シアノフェノキシ)ヘキサン酸あるいは6−(p−ニトロフェノキシ)ヘキサン酸を基質として、3−ヒドロキシ−6−(4−シアノフェノキシ)ヘキサン酸あるいは3−ヒドロキシ−6−(4−ニトロフェノキシ)ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むPHAを生産することが報告されている。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】
これら側鎖上に官能基を有するPHAのうち、近年フェノキシ基を側鎖に有するPHAの開発が盛んである。特にフェノキシ基の芳香環部分にフルオロ基、シアノ基、ニトロ基など、機能性置換基を導入したPHAが数多く報告されているものの、上記したものに限られており、新たなる機能性置換基を導入したPHAの報告はないのが現状である。
【0014】
本発明の目的は、フェノキシ基の芳香環部分に、機能性置換基であるメチルスルファニル基を導入した新規なポリヒドロキシアルカノエート、及びその製造方法を提供することにある。
【0015】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、下記一般式(1):
【0016】
【化13】
【0017】
(式中、xは、1〜8から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)で示されるユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートである。
【0018】
なお、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、前記一般式(1)で示されるユニットに加えて、
下記一般式(2):
【0019】
【化14】
【0020】
(式中、yは、0〜8から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)で示される3−ヒドロキシアルカン酸ユニット、あるいは、下記一般式(3):
【0021】
【化15】
【0022】
(式中、zは、3および5から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)で示される3−ヒドロキシアルカ−5−エン酸ユニットのうち、いずれか、或いは両方共を含んでいてもよい。また、そのポリマー分子の数平均分子量は、5000〜300000の範囲である。
【0023】
上記の構成を有する本発明のPHAには、例えば、下記化学式(4):
【0024】
【化16】
【0025】
で示される3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
【0026】
また、本発明は、
下記一般式(5):
【0027】
【化17】
【0028】
(式中、xは、1〜8から選択される任意の整数を表し、一つ以上の値をとり得る)で示される化合物を少なくとも一種類以上含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程を有することを特徴とする、
下記一般式(1):
【0029】
【化18】
【0030】
(式中、xは、1〜8から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)で示されるユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【0031】
本発明の方法で製造されるポリヒドロキシアルカノエートは、前記一般式(1)で示されるユニットに加えて、
下記一般式(2):
【0032】
【化19】
【0033】
(式中、yは、0〜8から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)で示される3−ヒドロキシアルカン酸ユニット、あるいは、下記一般式(3):
【0034】
【化20】
【0035】
(式中、zは、3および5から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)で示される3−ヒドロキシアルカ−5−エン酸ユニットのうち、いずれか、或いは両方共を含んでいてもよい。
【0036】
また、本発明のPHAの製造方法における培養工程において利用する前記培地は、ポリペプトンを含んでいることができる。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、酵母エキスを含んでいることができる。さらに、培養工程において利用する前記培地は、糖類を含んでいることができる。この場合、培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される1種類以上の化合物であることが好ましい。
【0037】
加えて、本発明のPHAの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、有機酸またはその塩を含んでいるものでもよい。その際、培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物であることが好ましい。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、アミノ酸またはその塩を含んでいることもできる。例えば、培地中に含有されるアミノ酸またはその塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物であることが好ましい。
【0038】
場合によっては、本発明のPHAの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、炭素数4から12の直鎖アルカン酸またはその塩を含んでいることもできる。
【0039】
また、本発明のPHAの製造方法においては、前記微生物の培養における二段階以上の培養を行うことができる。この場合、二段階目以降の培養では培地中に窒素源が含まれていないことが好ましい。
【0040】
前記微生物の培養において、二段階以上の培養を行う本発明の製造方法として、
(工程1−1) 下記一般式(5):
【0041】
【化21】
【0042】
(式中、xは、1〜8から選択される任意の整数を表す)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつポリペプトンを含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
(工程1−2) 前記一般式(5)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ有機酸またはその塩とを含む培地中で、工程1−1で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法とすることができる。その際、前記工程1−2で用いる培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程1−2で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【0043】
また更に、
(工程1−3) 下記一般式(5):
【0044】
【化22】
【0045】
(式中、xは、1〜8から選択される任意の整数を表す)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ糖類を含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
(工程1−4) 前記一般式(5)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、また、糖類を含む培地中で、工程1−3で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法とすることもできる。その際、前記工程1−3及び工程1−4で用いるそれぞれの培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される1種類以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程1−4で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【0046】
本発明のPHAの製造方法には、例えば、下記化学式(6):
【0047】
【化23】
【0048】
で示される5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(4):
【0049】
【化24】
【0050】
で示される3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が含まれる。
【0051】
また、本発明の製造方法には、下記化学式(7):
【0052】
【化25】
【0053】
で示される6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(8):
【0054】
【化26】
【0055】
で示される3−ヒドロキシ−6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸ユニット及び、
下記化学式(9):
【0056】
【化27】
【0057】
で示される3−ヒドロキシ−4−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]酪酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が含まれる。
【0058】
なお、本発明のPHAの製造方法においては、前記の培養工程に加えて、培養細胞からポリヒドロキシアルカノエートを分離回収する工程を設けることができ、本工程は、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを可溶化する工程、もしくは、培養された微生物細胞を破砕する工程を含むことを特徴とする製造方法とすることが望ましい。
【0059】
一方、上述した種々の構成をとることが可能な本発明のPHAの製造方法において、利用する微生物は、前記培養方法によって、本発明のPHAを生産しうる微生物であれば如何なる微生物でもよく、その中でも特に、シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物であることが好ましい。例えば、前記シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物が、シュードモナス・チコリアイ YN2株(Pseudomonas cichorii YN2; FERMBP−7375)、シュードモナス・チコリアイ H45株(Pseudomonas cichorii H45; FERM BP−7374)、シュードモナス・ジェッセニイ P161株(Pseudomonas jesseniiP161; FERM BP−7376)のうちから選択される微生物であることがより好ましい。
【0060】
【発明の実施の形態】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、含まれるヒドロキシアルカン酸のモノマーユニット中に、(メチルスルファニル)フェノキシ構造をその側鎖に有し、この構造によりこれまでに知られている微生物生産ポリヒドロキシアルカノエートとは著しく異なった物理化学的性質を有している。本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、例えば、PHA生産能力を有する微生物を、原料となるω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸に加えて、増殖基質を含んだ培地中で培養する工程、この培養工程において微生物により生産され、その細胞内に蓄積される、側鎖末端に(メチルスルファニル)フェノキシ構造を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを分離回収する工程、この二段階の工程を経て製造されるものである。なお、本発明のPHAは一般式(1)に示されるユニットを含め、全ての3−ヒドロキシアルカン酸ユニットの3位の炭素は不斉炭素であるが、その絶対配置は、R体となり、生分解性を示すものである。
【0061】
以下に、本発明について、より詳細に説明する。
【0062】
(生産微生物)
本発明のPHAの製造方法では、目的とする一般式(1)で示されるユニットを含むPHAの生産に用いる微生物は、原料化合物の一般式(5)で示されるω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸を含む培地中で培養した際、対応する側鎖末端に(メチルスルファニル)フェノキシ基を有する3−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むPHAを生産し、その細胞内に蓄積する微生物であれば、いかなる微生物であってもよい。例えば、PHA産生能を有するシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物が挙げられる。好適なシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物の一例を挙げると、シュードモナス・チコリアイ YN2株(Pseudomonas cichorii YN2;FERM BP−7375)、シュードモナス・チコリアイ H 45株(Pseudomonas cichorii H45、FERM BP−7374)、シュードモナス・ジェッセニイ P161株(Pseudomonas jessenii P161、FERM BP−7376)の三種の菌株が挙げられる。これら三種の微生物は、寄託者として本願出願人を名義として、先に国内寄託され、その後、その原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へと移管され、国際寄託機関としての経済産業省 産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所(NIBH)よりそれぞれ、前記の受託番号を付与され、現在の、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。また、新規なPHA産生能を有する菌株として、既に、特開2001−178484号公報に記載されている微生物である。
【0063】
以下に、YN2株、H45株及びP161株について、その菌学的性質を示す。
【0064】
<YN2株の菌学的性質>
(1)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μm×1.5〜2.0μm
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
(2)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
O/F試験 :酸化型(非発酵性)
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β−ガラクトシダーゼ :陰性
King’s B寒天での蛍光色素産生 :陽性
4%NaClでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積:陰性(*)
Tween80の加水分解 :陽性
* nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定
(3)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
L−アラビノース :陽性
D−マンノース :陰性
D−マンニトール :陰性
N−アセチル−D−グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n−カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl−リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【0065】
<H45株の菌学的性質>
(1)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μm×1.0〜1.2μm
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
(2)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
O/F試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β−ガラクトシダーゼ :陰性
King’s B寒天での蛍光色素産生 :陽性
4%NaClでの生育 :陰性
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積:陰性
(3)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
L−アラビノース :陰性
D−マンノース :陽性
D−マンニトール :陽性
N−アセチル−D−グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n−カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl−リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【0066】
<P161株の菌学的性質>
(1)形態学的性質
細胞の形と大きさ :球状、φ0.6μm
桿状、0.6μm×1.5〜2.0μm
細胞の多形性 :あり(伸長型)
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、淡黄色
(2)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
O/F試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β−ガラクトシダーゼ :陰性
King’s B寒天での蛍光色素産生 :陽性
(3)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
L−アラビノース :陽性
D−マンノース :陽性
D−マンニトール :陽性
N−アセチル−D−グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n−カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl−リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、アエロモナス属(Aeromonas sp.)、コマモナス属(Comamonas sp.)、バークホルデリア属(Burkholderia sp.)などに属し、例えば、ω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸を原料(基質)として用いて、3−ヒドロキシ−ω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸ユニットを含むPHAを生産する微生物を用いることも可能である。
【0067】
(培養工程)
本発明にかかるPHAの製造方法は、原料の上記一般式(5)に示されるω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸を含む培地中で、上気するPHA産生能を有する微生物を培養することで、対応する前記一般式(1)で表される、側鎖末端に(メチルスルファニル)フェノキシ基を有する3−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むPHAを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【0068】
微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作製、PHAの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【0069】
温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【0070】
一方、前記したようなPHA生産微生物を用いて、目的とする一般式(1)で示される、側鎖末端に(メチルスルファニル)フェノキシ基を有する3−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むPHAを製造する際には、培地として、PHA生産用の原料として、このモノマーユニットに対応する、上記一般式(5)で示されるω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸に加えて、微生物の増殖用炭素源を少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。原料の一般式(5)で示される化合物は、培地あたり0.01%〜1%(w/v)の範囲、より好ましくは、0.02%〜0.2%(w/v)の範囲に初期の含有率を選択することが望ましい。原料の一般式(5)で示されるω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸の水溶性は必ずしも良好ではないが、本発明においては、上記の微生物を用いる場合、培地中に懸濁された状態であっても何ら問題とはならない。
【0071】
なお、原料の一般式(5)で示される化合物は、分散性を高めるため、場合によっては、1−ヘキサデセンやn−ヘキサデカンのような溶媒に溶解、あるいは、微細な懸濁物とした形状で培地中に添加することも可能である。その際には、利用する1−ヘキサデセンやn−ヘキサデカンのような溶媒の添加濃度は、培地に対して、その濃度は3%(v/v)以下にすることが必要である。
【0072】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質は、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類、TCA回路中の中間体として生じる有機酸ならびにTCA回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸またはその塩、アミノ酸またはその塩、炭素数4〜12の直鎖アルカン酸またはその塩などから、用いる菌株に応じて、増殖基質としての有用性を考慮して、適宜選択することができる。
【0073】
これら種々の増殖基質のうち、糖類としては、
グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる1つ以上の化合物が好適に利用できる。
【0074】
また、有機酸あるいはその塩としては、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸またはそれらの塩からなる群から選ばれる1つ以上の化合物が好適に利用できる。一方、アミノ酸またはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはそれらの塩からなる群から選ばれる1つ以上の化合物が好適に利用できる。
【0075】
一般に、これら種々の増殖基質の中でも、ポリペプトンや糖類を用いるのがより好ましい。原料化合物と共存させる、これらの増殖基質は、通常、培地あたり0.1%〜5%(w/v)の範囲、より好ましくは、0.2%〜2%(w/v)の範囲にその含有率を選択することが望ましい。
【0076】
微生物にPHAを生産・蓄積させる培養方法としては、一旦十分に増殖させた後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態でさらに培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【0077】
より具体的には、(工程1−1)として、一般式(5)で示される化合物、ならびに増殖基質となるポリペプトンを含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、(工程1−2)として、一般式(5)で示される化合物、ならびに増殖基質となる、上に例示したような有機酸またはその塩を含む(好ましくは、窒素源を含まない)培地中で、前段の工程1−1で培養・増殖した微生物の菌体をさらに培養する工程を行う方法、あるいは、(工程1−3)として一般式(5)で示される化合物、ならびに増殖基質となる糖類を含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、(工程1−4)として、一般式(5)で示される化合物、ならびに増殖基質となる糖類とを含む培地中(好ましくは窒素源を含まない)で、工程1−3で培養・増殖した微生物の菌体をさらに培養する工程を行う方法等である。
【0078】
培養温度は、上記の菌株が良好に増殖可能な温度であればよく、例えば、15〜40℃、好ましくは20〜35℃の範囲、より好ましくは20℃〜30℃の範囲に選択することが適当である。
【0079】
培養は、液体培養、固体培養など、利用する微生物が増殖し、培地中に含有される原料の一般式(5)の化合物から、前記一般式(1)で示されるユニットを含むPHAを生産する培養方法ならば、いかなる培養方法をも用いることができる。さらには、原料、増殖基質、さらには酸素の供給が適正に行われるならば、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養などの種類も問わない。
【0080】
例えば、液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【0081】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩など)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など)等、微生物の増殖に必要な成分を含んでいる培地であればいかなるものでも良く、例えば、MSB培地、M9培地等を挙げることができる。
【0082】
例えば、後に述べる実施例において用いた無機塩培地:M9培地の組成を以下に示す。
【0083】
[M9培地]
Na2HPO4 6.2g
KH2PO4 3.0g
NaCl 0.5g
NH4Cl 1.0g
(培地1リットル中、pH7.0)
更に、良好な増殖と、それに伴うPHAの生産のためには、上記の無機塩培地に、例えば、以下に示す微量成分溶液を0.3%(v/v)程度添加して、必須微量元素を補う必要がある。
【0084】
[微量成分溶液]
ニトリロ三酢酸 :1.5g;
MgSO4 :3.0g;
MnSO4 :0.5g;
NaCl :1.0g;
FeSO4 :0.1g;
CaCl2 :0.1g;
CoCl2 :0.1g;
ZnSO4 :0.1g;
CuSO4 :0.1g;
AlK(SO4)2:0.1g;
H3BO3 :0.1g;
Na2MoO4 :0.1g;
NiCl2 :0.1g
(溶液1リットル中、pH7.0)
(PHAの回収工程)
本発明に用いる微生物は、このような培養方法により、上記一般式(1)で示される、側鎖末端に(置換ファニルメチル)スルファニル基を有する3−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むPHAを産生し、その菌体内に蓄積する。従って、本発明のPHAの製造方法では、培養後、その培養菌体から、目的とするPHAを分離回収する工程を設ける。
【0085】
この微生物の培養菌体からのPHAの回収には、溶媒抽出法を利用して、可溶化したPHAを細胞由来の不溶成分と分離し、回収する手段を用いることができる。通常行われているクロロホルム抽出が最も簡便であるが、クロロホルム以外に、ジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン等が用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、SDS等の界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理によって、PHA以外の菌体内成分を可溶化・除去することによって、不溶性画分として、PHAのみを回収する方法を採ることもできる。さらには、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法等の微生物細胞を破砕する処理を行って、細胞中に蓄積されたPHAのみを分離、回収する方法を採ることもできる。
【0086】
なお、本発明のPHAの製造方法において、微生物の培養、その間における、培養される微生物におけるPHAの生産と菌体への蓄積を行う工程、ならびに、培養後、その菌体からのPHA回収を行う工程は、上記の方法に限定されるものではない。
【0087】
本発明の方法により製造される、微生物産生のPHAは、一般式(1)のユニットに加えて、培地中に添加する増殖基質を利用して、脂肪酸合成系を介して生合成する、一般式(2)で示される3−ヒドロキシアルカン酸ユニット、あるいは、一般式(3)で示される3−ヒドロキシアルカ−5−エン酸ユニットを含むこともある。なお、含まれる3−ヒドロキシアルカン酸ユニットは、いずれも、その3位の炭素原子は不斉炭素であるが、その絶対配置は同じくR−体であり、その生分解性を保持することは勿論のことである。
【0088】
本発明のPHAは、例えば、一般的なプラスチックが使用される用途の他、デバイス材料や医薬材料、医療用シート等の医療用材料など、様々な分野においての応用が考えられる。
【0089】
さらに、一般式(1)のユニット中の、(メチルスルファニル)フェノキシ基を有することで、ポリマーそのものに新たな物理化学的な性質が加わり、物性の改良が見込まれ、これまでに応用し得なかった分野への展開が期待できる。
【0090】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されうるものではない。なお、以下における「%」は特に標記した以外は重量基準である。
【0091】
(実施例1)
ポリペプトン0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0092】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA28mg(乾燥重量)が得られた。
【0093】
得られたPHAの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー(GPC;東ソーHLC−8220、カラム;東ソー TSK−GEL SuperHM−H、溶媒;クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した。その結果、数平均分子量 Mn=15600、重量平均分子量 Mw=36000であった。
【0094】
更に、得られたPHAの構造を特定するため、以下の条件でNMR分析を行った。
図1に、測定された1H−NMRスペクトルチャートを示し、また、表1に、その同定結果を示す。
【0095】
【表1】
表1
【0096】
表1に示す結果より、当該PHAは3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを含んでおり、加えて、それ以外のモノマーユニットとして、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸をも含んでおり、具体的には、その構成は
下記化学式(10):
【0097】
【化28】
【0098】
に示されるPHAであることが確認された。また、得られたPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを23.0mol%含んでいることがわかった。
【0099】
(実施例2)
ポリペプトン0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・H45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0100】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA11mg(乾燥重量)が得られた。
【0101】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAも、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式(10)で示されるPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを21.4mol%含むこともわかった。
【0102】
(実施例3)
ポリペプトン0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・ジェッセニイ・P161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0103】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA9mg(乾燥重量)が得られた。
【0104】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAも、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式(10)で示されるPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを18.4mol%含むこともわかった。
【0105】
(実施例4)
D−グルコース0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、D−グルコース0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0106】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA18mg(乾燥重量)が得られた。
【0107】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAも、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式(10)で示されるPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを29.6mol%含むこともわかった。
【0108】
(実施例5)
D−グルコース0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・H45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、D−グルコース0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0109】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA18mg(乾燥重量)が得られた。
【0110】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAも、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式(10)で示されるPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを35.6mol%含むこともわかった。
【0111】
(実施例6)
酵母エキス(DIFCO製)0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0112】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA15mg(乾燥重量)が得られた。
【0113】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAも、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式(10)で示されるPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを15.1mol%含むこともわかった。
【0114】
(実施例7)
グルタミン酸ナトリウム0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0115】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA25mg(乾燥重量)が得られた。
【0116】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAも、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式(10)で示されるPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを12.2mol%含むこともわかった。
【0117】
(実施例8)
ポリペプトン0.5%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ノナン酸0.1%、5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0118】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA30mg(乾燥重量)が得られた。
【0119】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAも、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含んでおり、従って、その構成は上記化学式(10)で示されるPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸モノマーユニットを3.1mol%含むこともわかった。
【0120】
表2に、上記の各実施例における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量比率、ならびに得られたPHAポリマーの3−ヒドロキシ−5−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]吉草酸ユニット(3HMSPxV)ユニットのmol%をまとめて示す。
【0121】
【表2】
表2
【0122】
表3に、実施例1から8で得られたポリマーの分子量を示す。
【0123】
【表3】
表3
【0124】
(実施例9)
ポリペプトン0.5%、6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・YN2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム0.5%、6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0125】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA22mg(乾燥重量)が得られた。
【0126】
得られたPHAの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー(GPC;東ソーHLC−8220、カラム;東ソー TSK−GEL SuperHM−H、溶媒;クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した。その結果、数平均分子量 Mn=14500、重量平均分子量 Mw=33000であった。
【0127】
得られたPHAについて、実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAは、3−ヒドロキシ−6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸ユニット及び3−ヒドロキシ−4−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含むPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸モノマーユニットを8.1mol%並びに3−ヒドロキシ−4−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]酪酸モノマーユニットを9.2mol%含むこともわかった。
【0128】
(実施例10)
D−グルコース0.5%、6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸0.1%を含むM9培地200mlに、シュードモナス・チコリアイ・H45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、D−グルコース0.5%、6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸0.1%を含み、窒素源(NH4Cl)を含まないM9培地200mlに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【0129】
この凍結乾燥菌体ペレットを20mlクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、PHAポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、PHA16mg(乾燥重量)が得られた。
【0130】
実施例1と同様の条件でNMR分析、平均分子量の測定を行った。NMR分析の結果から、本例のPHAは、3−ヒドロキシ−6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸ユニット及び3−ヒドロキシ−4−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]酪酸ユニットを含み、且つそれ以外に、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ吉草酸などの炭素数4から12までの3−ヒドロキシアルカン酸、または3−ヒドロキシアルケン酸のモノマーユニットを含むPHAであることが確認された。なお、本例のPHAは、1H−NMRスペクトル積分比より、3−ヒドロキシ−6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸モノマーユニットを12.4mol%並びに3−ヒドロキシ−4−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]酪酸モノマーユニットを15.1mol%含むこともわかった。
【0131】
表4に、上記の実施例9及び10における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量比率、ならびに得られたPHAポリマーの3−ヒドロキシ−6−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]ヘキサン酸ユニット(3HMSPxHx)ユニット及び3−ヒドロキシ−4−[4−(メチルスルファニル)フェノキシ]酪酸ユニット(3HMSPxB)ユニットのmol%をまとめて示す。
【0132】
表5に、実施例9および10で得られたポリマーの分子量を示す。
【0133】
【表4】
表4
【0134】
【表5】
表5
【0135】
【発明の効果】
本発明のPHAの製造方法においては、原料として、ω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸含む培地中で微生物を培養し、対応する3−ヒドロキシ−ω−[(メチルスルファニル)フェノキシ]アルカン酸ユニットを含む新規な生分解性PHAが効率的に製造される。また、本発明のPHAは、機能性ポリマーとして有用なポリヒドロキシアルカノエートであり、デバイス材料や医薬材料等の各分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1で得られたPHAについて測定された1H−NMRスペクトルチャートである。
Claims (23)
- ポリマー分子の数平均分子量は、5000〜300000の範囲であることを特徴とする請求項1または2に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
- 前記培地は、ポリペプトンを含んでいることを特徴とする請求項5または6に記載の製造方法。
- 前記培地は、酵母エキスを含んでいることを特徴とする請求項5または6に記載の製造方法。
- 前記培地は、糖類を含んでいることを特徴とする請求項5または6に記載の製造方法。
- 培地中に含有される糖類は、
グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される1種類以上の化合物であることを特徴とする請求項9に記載の製造方法。 - 前記培地は、有機酸またはその塩を含んでいることを特徴とする請求項5または6に記載の製造方法。
- 培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物であることを特徴とする請求項11に記載の製造方法。
- 前記培地は、アミノ酸またはその塩を含んでいることを特徴とする請求項5または6に記載の製造方法。
- 培地中に含有されるアミノ酸またはその塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物であることを特徴とする請求項13に記載の製造方法。
- 前記培地は、炭素数4から12の直鎖アルカン酸またはその塩を含んでいることを特徴とする請求項5または6に記載の製造方法。
- 前記微生物の培養が、二段階以上の培養工程を含むことを特徴とする請求項5〜15のいずれかに記載の製造方法。
- 前記微生物の培養において、二段階目以降の培地中に窒素源が含まれていないことを特徴とする請求項16に記載の製造方法。
- 前記工程1−2で用いる培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物であることを特徴とする請求項18に記載の製造方法。
- 前記微生物は、シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物であることを特徴とする請求項5〜21のいずれかに記載の製造方法。
- 前記シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物が、シュードモナス・チコリアイ YN2株(Pseudomonascichorii YN2;FERM BP−7375)、シュードモナス・チコリアイ H45株(Pseudomonas cichorii H45;FERM BP−7374)、シュードモナス・ジェッセニイ P161株(Pseudomonas jessenii P161;FERM BP−7376)のうちから選択される微生物であることを特徴とする請求項22に記載の製造方法。
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