JP3720774B2 - （フェニルメチル）スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 - Google Patents
（フェニルメチル）スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3720774B2 JP3720774B2 JP2002039259A JP2002039259A JP3720774B2 JP 3720774 B2 JP3720774 B2 JP 3720774B2 JP 2002039259 A JP2002039259 A JP 2002039259A JP 2002039259 A JP2002039259 A JP 2002039259A JP 3720774 B2 JP3720774 B2 JP 3720774B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- polyhydroxyalkanoate
- group
- sulfanyl
- chemical formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 title claims description 220
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 title claims description 217
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 2154-56-5 Chemical class [CH2]C1=CC=CC=C1 SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical group NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 66
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 63
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 41
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 30
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 claims description 29
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 22
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 19
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 12
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 108
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 77
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 63
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 63
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 60
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 28
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 22
- PYCDBXXHVJMKMJ-UHFFFAOYSA-N 5-benzylsulfanyl-3-hydroxypentanoic acid Chemical group OC(=O)CC(O)CCSCC1=CC=CC=C1 PYCDBXXHVJMKMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 20
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 20
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 20
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 19
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 18
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 18
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 18
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 18
- IKCMTEJPJAABMO-UHFFFAOYSA-N OC(=O)CC(O)CSCC1=CC=CC=C1 Chemical group OC(=O)CC(O)CSCC1=CC=CC=C1 IKCMTEJPJAABMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- -1 (phenylmethyl) sulfanyl group Chemical group 0.000 description 14
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 14
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 14
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 14
- AKJYYMZJBSAQRW-UHFFFAOYSA-N 5-benzylsulfanylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCSCC1=CC=CC=C1 AKJYYMZJBSAQRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000723343 Cichorium Species 0.000 description 12
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 12
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 11
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 11
- IBLXLPXUVKDGNI-UHFFFAOYSA-N 4-benzylsulfanylbutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCSCC1=CC=CC=C1 IBLXLPXUVKDGNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XQRBQCBPBNFYDX-UHFFFAOYSA-N CC1=CC=C(CSCCC(O)CC(O)=O)C=C1 Chemical group CC1=CC=C(CSCCC(O)CC(O)=O)C=C1 XQRBQCBPBNFYDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CSSYPYQACZLMPS-UHFFFAOYSA-N 5-[(4-methylphenyl)methylsulfanyl]pentanoic acid Chemical compound CC1=CC=C(CSCCCCC(O)=O)C=C1 CSSYPYQACZLMPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001300822 Pseudomonas jessenii Species 0.000 description 6
- 241000589781 Pseudomonas oleovorans Species 0.000 description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 5
- 208000003464 asthenopia Diseases 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- 241001508466 Pseudomonas cichorii Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N nonanoic acid Chemical compound CCCCCCCCC(O)=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- YTBSYETUWUMLBZ-UHFFFAOYSA-N D-Erythrose Natural products OCC(O)C(O)C=O YTBSYETUWUMLBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YTBSYETUWUMLBZ-IUYQGCFVSA-N D-erythrose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C=O YTBSYETUWUMLBZ-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 3
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 3
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010056474 Erythrosis Diseases 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 3
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 3
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 3
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 3
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 3
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 3
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 3
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 3
- GQEZCXVZFLOKMC-UHFFFAOYSA-N 1-hexadecene Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC=C GQEZCXVZFLOKMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SVCWRQUTOZJFFP-UHFFFAOYSA-N 11-benzylsulfanylundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCSCC1=CC=CC=C1 SVCWRQUTOZJFFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYSWIMKOZCXIH-UHFFFAOYSA-N 11-phenylsulfanylundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCSC1=CC=CC=C1 BPYSWIMKOZCXIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- ONPCOUSOOPCZNI-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-phenoxybutanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)COC1=CC=CC=C1 ONPCOUSOOPCZNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKPPNJNGKKHGLI-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-5-phenoxypentanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CCOC1=CC=CC=C1 ZKPPNJNGKKHGLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGVJVFCUYBCCTR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-6-phenoxyhexanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CCCOC1=CC=CC=C1 MGVJVFCUYBCCTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 2
- 229920001002 functional polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N heptanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)=O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N hexadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 125000001037 p-tolyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N (2s)-2-[[4-[2-(2,4-diaminoquinazolin-6-yl)ethyl]benzoyl]amino]-4-methylidenepentanedioic acid Chemical compound C1=CC2=NC(N)=NC(N)=C2C=C1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CC(=C)C(O)=O)C(O)=O)C=C1 NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N (R)-flurbiprofen Chemical compound FC1=CC([C@H](C(O)=O)C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHSYYLCXQKCYQX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthalen-2-ylethanamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C(N)C)=CC=C21 KHSYYLCXQKCYQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRHWHSJDIILJAT-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCCC(O)C(O)=O JRHWHSJDIILJAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBUMJQMCBIZBLC-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxynonanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(C(O)=O)OC1=CC=CC=C1 CBUMJQMCBIZBLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIWQVBDRRFMUIB-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyundecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(C(O)=O)OC1=CC=CC=C1 PIWQVBDRRFMUIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMBJAVFTESEKLJ-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-5-phenylsulfanylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CCSC1=CC=CC=C1 LMBJAVFTESEKLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZGUUXCNURSYJV-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-7-phenoxyheptanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CCCCOC1=CC=CC=C1 JZGUUXCNURSYJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVHALYHLQUSEMQ-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-8-phenoxyoctanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CCCCCOC1=CC=CC=C1 RVHALYHLQUSEMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCC(O)CC(O)=O HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940006015 4-hydroxybutyric acid Drugs 0.000 description 1
- SSFHTIKBQWULIU-UHFFFAOYSA-N 6-(4-nitrophenoxy)hexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCOC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 SSFHTIKBQWULIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJWBACOFHDCTDI-UHFFFAOYSA-N 6-phenoxyhexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCOC1=CC=CC=C1 KJWBACOFHDCTDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OREIERLPMAUXLB-UHFFFAOYSA-N 7-benzylsulfanyl-3-hydroxyheptanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CCCCSCC1=CC=CC=C1 OREIERLPMAUXLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXBSZFQIKPSFNJ-UHFFFAOYSA-N 8-phenoxyoctanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCOC1=CC=CC=C1 WXBSZFQIKPSFNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000588810 Alcaligenes sp. Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- LMWQBORWKRUWCL-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(CSC)cc1 Chemical compound Cc1ccc(CSC)cc1 LMWQBORWKRUWCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000589309 Methylobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000589598 Paracoccus sp. Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 238000010128 melt processing Methods 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003356 phenylsulfanyl group Chemical group [*]SC1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Biological Depolymerization Polymers (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構成ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合がある)と、その製造方法に関する。より具体的には、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含む新規な生分解性ＰＨＡ及び、ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を利用し、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有するアルカン酸を原料とする、前記ＰＨＡの製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合がある)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。更に、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全に分解されるという利点を有していることから、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材料等としての応用も期待されている。
【０００３】
このように微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
[１]まず、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)をはじめとする比較的簡単な構造のモノマーユニットを重合させたＰＨＡの生合成についての報告や開示としては、次のものが挙げられる。
【０００５】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファスＨ16株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の基質を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)と３-ヒドロキシ吉草酸(以下、３ＨＶと略す)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特公平６-15604号公報、特公平７-14352号公報、特公平８-19227号公報等)。
【０００６】
また、特許公報第2642937号には、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Ｐseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に基質として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数６から 12までの３-ヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとするＰＨＡを生産することが開示されている。
【０００７】
特開平5-7492号公報には、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Ｐaracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一級アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００８】
特開平５-93049号公報、及び特開平７-265065号公報には、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)をオレイン酸やオリーブ油を基質として培養することにより、３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸との二成分共重合体を生産することが開示されている。
【０００９】
特開平９-191893号公報には、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、基質としてグルコン酸及び１,４-ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【００１０】
これらはいずれも微生物による炭化水素等のβ酸化や糖からの脂肪酸合成により合成された、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【００１１】
[２]しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待される。そして、ある種の微生物では、これら「unusual ＰＨＡ」を生産することが報告されており、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性改良を目指す試みもなされている。
【００１２】
置換基の例としては、不飽和炭化水素、エステル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド、さらには芳香環を含むものなどが挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【００１３】
例えば、Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,191，1957-1965,(1990)、Ｍacroｍolecules,24，5256-5260,(1991)、Ｃhirality,３，492-494,(1991)等では、シュードモナス・オレオボランスが３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(以下、３ＨＰＶと略す)をモノマーユニットをして含むＰＨＡを生産することが報告されており、３ＨＰＶが含まれることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００１４】
また、置換基を側鎖に導入したＰＨＡのうち、近年フェノキシ基を側鎖に有するＰＨＡの開発が盛んである。
【００１５】
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,195，1665-1672,(1994)には、シュードモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ならびに３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１６】
Ｍacroｍolecules,29，3432-3435,(1996)には、シュードモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)を用いて、６-フェノキシヘキサン酸から、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸と３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、11-フェノキシウンデカン酸から、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、それぞれ生産することが報告されている。
【００１７】
Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,41，32-43,(1995)には、シュードモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス・プチダ(Ｐseudoｍonas putida)ＫＴ 2422株を用いて、オクタン酸と６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸あるいは６-(p-ニトロフェノキシ)ヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸あるいは３-ヒドロキシ-６-(４-ニトロフェノキシ)ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１８】
また、置換基を側鎖に導入したＰＨＡのうち、スルフィド型(-Ｓ-)の硫黄原子を側鎖に有するＰＨＡの開発としては、Ｍacroｍolecules.,32，8315-8318,(1999)には、シュードモナス・プチダ(Ｐseudoｍonas putida)27Ｎ01株を用いて、オクタン酸と 11-(フェニルスルファニル)ウンデカン酸を基質として、３-ヒドロキシ-５-(フェニルスルファニル)吉草酸と３-ヒドロキシ-７-(フェニルスルファニル)へプタン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。ただし、その際、シュードモナス・プチダ 27Ｎ01株は、予め、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として 11-(フェニルスルファニル)ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００１９】
更に、Ｐolyｍer Ｐreprints，Japan Ｖol 49,Ｎo.５,1034,(2000)では、シュードモナス・プチダ(Ｐseudoｍonas putida)27Ｎ01株を用いて、11-[(フェニルメチル)スルファニル]ウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-[(フェニルメチル)スルファニル]へプタン酸の２つのモノマーユニットからなるＰＨＡを生産することが報告されている。但し、この場合、シュードモナス・プチダ 27Ｎ01株は、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として 11-[(フェニルメチル)スルファニル]ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
これら側鎖上に官能基を有するＰＨＡのうち、３-ヒドロキシ-ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸ユニットを含むＰＨＡに注目すると、その生合成に関しては、上に挙げた１例の報告があるに過ぎず、更にその生産方法も限定されているために、得られるポリマーの種類、純度、収量において十分なものではなかった。更に、上記の３-ヒドロキシ-ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸ユニットを含むＰＨＡの生産方法は、炭素鎖長が長いω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸のみを基質として含む培地中で微生物を培養することによりポリマー生産を行なっているが、この場合、ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸が増殖のための基質として利用されるため、ポリマーの構造の制御が困難であるという問題点があった。
【００２１】
本発明の目的は、新規な、側鎖に(フェニルメチル)スルファニル構造を有するユニットを含む新規なＰＨＡ、及びその製造方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねてきた結果、以下の様な発明に至った。即ち、本発明の第一は、化学式(１)で示すユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート(但し、化学式(２)及び(３)に示す２つのユニットの組み合わせのみからなるポリヒドロキシアルカノエートを除く)そのものである。
【００２３】
【化１７】
【００２４】
(式中、Ｒ１は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、xは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)
【００２５】
【化１８】
【００２６】
なお、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、化学式(１)に示されるユニットに加えて、化学式(４)及び(５)に示されるユニットのいずれか、或いは両方共を含んでいてもよい。
【００２７】
【化１９】
【００２８】
(y及びzは化学式(１)で示すユニットと独立して化学式中に示した範囲内で任意の一つ以上の整数値をとり得る)
【００２９】
本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、数平均分子量が 5000 から 300000 の範囲である。
【００３０】
上記の構成を有する本発明のＰＨＡには、例えば、下記化学式(２):
【００３１】
【化２０】
【００３２】
で示される３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。(但し、それ以外のユニットが化学式(３)に示すユニットのみからなるポリヒドロキシアルカノエートを除く。)
【００３３】
または、下記化学式(６):
【００３４】
【化２１】
【００３５】
で示される３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
【００３６】
または、下記化学式(７):
【００３７】
【化２２】
【００３８】
で示される３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
【００３９】
また、本発明は、化学式(８)で示される化合物を少なくとも１種類含む培地中で微生物を培養することを特徴とする、化学式(１)で示したポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。(但し、化学式(２)及び(３)に示す２つのユニットのみからなるポリヒドロキシアルカノエートを除く)
【００４０】
【化２３】
【００４１】
(式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、ｋは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る。)
【００４２】
【化２４】
【００４３】
(式中、Ｒ１は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、xは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る。)
【００４４】
【化２５】
【００４５】
本発明の方法で製造されるポリヒドロキシアルカノエートは、前記化学式(１)で示されるユニットに加えて、下記化学式(４)及び(５)に示されるユニットのいずれか、或いは両方共を含んでいてもよい。
【００４６】
【化２６】
【００４７】
(y及びzは化学式(１)で示すユニットと独立して化学式中に示した範囲内で任意の一つ以上の整数値をとり得る)
【００４８】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、ポリペプトンを含んでいることができる。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、酵母エキスを含んでいることができる。さらに、培養工程において利用する前記培地は、糖類を含んでいることができる。この場合、培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。
【００４９】
加えて、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、有機酸またはその塩を含んでいるものでもよい。その際、培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、アミノ酸またはその塩を含んでいることもできる。例えば、培地中に含有されるアミノ酸またはその塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。
【００５０】
場合によっては、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、炭素数４から 12の直鎖アルカン酸またはその塩を含んでいることもできる。
【００５１】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記微生物の培養において二段階以上の培養を行なうことができる。この場合、二段階目以降の培養では培地中に窒素源が含まれていないことが好ましい。
【００５２】
前記微生物の培養において二段階以上の培養を行なう本発明の製造方法として、
(工程１-１)下記化学式(８):
【００５３】
【化２７】
【００５４】
(式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、ｋは、１〜８から選択される任意の整数を表し、一つ以上の値をとり得る)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつポリペプトンを含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
(工程１-２)前記化学式(８)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ有機酸またはその塩とを含む培地中で、工程１-１で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法が挙げられる。その際、前記工程１-２で用いる培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１-２で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００５５】
また更に
(工程１-３)下記化学式(８):
【００５６】
【化２８】
【００５７】
(式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、ｋは、１〜８から選択される任意の整数を表し、一つ以上の値をとり得る)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ糖類を含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
(工程１-４)前記一般式(８)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、また、糖類を含む培地中で、工程１-３で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法を挙げることもできる。その際、前記工程１-３及び工程１-４で用いるそれぞれの培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１-４で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００５８】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式(９):
【００５９】
【化２９】
【００６０】
で示される５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(２):
【００６１】
【化３０】
【００６２】
で示される３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が含まれる。
【００６３】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式(10):
【００６４】
【化３１】
【００６５】
で示される４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(６):
【００６６】
【化３２】
【００６７】
で示される３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法もまた含まれる。
【００６８】
本発明の製造方法には、例えば、下記化学式(11):
【００６９】
【化３３】
【００７０】
で示される５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(７):
【００７１】
【化３４】
【００７２】
で示される３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法もまた含まれる。
【００７３】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記の培養工程に加えて、培養細胞からポリヒドロキシアルカノエートを分離回収する工程を設けることができ、本工程は、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを可溶化する工程、もしくは、培養された微生物細胞を破砕する工程を含むことを特徴とする製造方法とすることが望ましい。
【００７４】
一方、上述した種々の構成をとることが可能な本発明のＰＨＡの製造方法において、利用する微生物は、前記培養方法によって、本発明のＰＨＡを生産しうる微生物であれば如何なる微生物でもよく、その中でも特に、シュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物であることが好ましい。例えば、前記シュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物が、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45；ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161；ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)のうちから選択される微生物であることがより好ましい。
【００７５】
【発明の実施の形態】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、含まれるヒドロキシアルカン酸のモノマーユニット中に、(フェニルメチル)スルファニル構造をその側鎖に有し、この構造によりこれまでに知られている微生物生産ポリヒドロキシアルカノエートとは著しく異なった物理化学的性質を有している。
【００７６】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、例えば、ＰＨＡ生産能力を有する微生物を、原料となるω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸に加えて、増殖基質を含んだ培地中で培養する工程、この培養工程において微生物により生産され、その細胞内に蓄積される、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程、この二段階の工程を経て製造されるものである。また、かかる微生物により産生されるＰＨＡは、化学式(１)に示されるユニットを含め、全ての３-ヒドロキシアルカン酸ユニットの、３位の炭素は不斉炭素であるが、その絶対配置は、Ｒ体となり、生分解性を示すものである。
【００７７】
以下に、本発明について、より詳細に説明する。
【００７８】
(生産微生物)
本発明のＰＨＡの製造方法では、目的とする化学式(１)で示されるユニットを含むＰＨＡの生産に用いる微生物は、原料化合物の化学式(８)で示されるω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸を含む培地中で培養した際、対応する側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産し、その細胞内に蓄積する微生物であれば、いかなる微生物であってもよい。例えば、ＰＨＡ産生能を有するシュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物が挙げられる。
【００７９】
好適なシュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物の一例を挙げると、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)の三種の菌株が挙げられる。これら三種の微生物は、寄託者として本願出願人を名義として、先に国内寄託され、その後、その原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へと移管され、国際寄託機関としての経済産業省 産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所(ＮＩＢＨ)よりそれぞれ、前記の受託番号を付与され、現在の、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。また、新規なＰＨＡ産生能を有する菌株として、既に、特願平11-371863号(特開2001-178484号公報)に記載されている微生物である。
【００８０】
(培養工程)
本発明にかかるＰＨＡの製造方法は、原料の上記化学式(８)に示されるω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸を含む培地中で、上記するＰＨＡ産生能を有する微生物を培養することで、対応する前記化学式(１)で表される、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【００８１】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ポリヒドロキシアルカノエートの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００８２】
前記したようなポリヒドロキシアルカノエート生産微生物を用いて、目的とするポリヒドロキシアルカノエートを製造するためには、ポリヒドロキシアルカノエート生産用の原料として、該モノマーユニットに対応する、上記化学式(８)で示される化合物と、微生物の増殖基質とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。上記化学式(８)で示される化合物は、培地あたり 0.01％から１％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.02％から 0.2％の割合で含有していることが望ましい。化学式(８)で示される化合物は、水溶性は必ずしも良好ではないが、本発明に示す微生物を用いれば、懸濁された状態であっても何ら問題は無い。
【００８３】
なお、原料の化学式(８)で示される化合物は、分散性を高めるため、場合によっては１-ヘキサデセンやn-ヘキサデカンのような溶媒に溶解或いは懸濁された形で培地中に含有させることも可能である。この場合、該溶媒の濃度は培地溶液に対して３％(v/v)以下にすることが必要である。
【００８４】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質としては、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸、或いはＴＣＡ回路から更に１段階ないしは２段階の生化学反応により得られる有機酸或いはその塩、アミノ酸或いはその塩、炭素数４から 12の直鎖アルカン酸或いはその塩等、から用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。
【００８５】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００８６】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００８７】
また、アミノ酸或いはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００８８】
これらの中では、ポリペプトンや糖類を用いるのが好ましく、また糖類の中ではグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。これらの基質は通常培地あたり 0.1％から５％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.2％から２％の割合で含有していることが望ましい。
【００８９】
微生物にポリヒドロキシアルカノエートを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【００９０】
より具体的には、化学式(８)で示される化合物、及びポリペプトンを含む培地中で微生物を培養する工程(工程１-１)を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、菌体を遠心分離等で回収したのち、これに続く、化学式(８)で示される化合物と先に列挙したような有機酸或いはその塩とを含む培地中(好ましくは、窒素源を含まない)で、工程１で培養された微生物を更に培養する工程(工程１-２)を行なう方法、あるいは、化学式(８)で示される化合物、及び先に列挙したような糖類を含む培地中で微生物を培養する工程(工程１-３)を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、菌体を遠心分離等で回収したのち、これに続く、化学式(８)で示される化合物と糖類とを含む培地中(好ましくは、窒素源を含まない)で、工程１で培養された微生物を更に培養する工程(工程１-４)を行なう方法等である。
【００９１】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【００９２】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ポリヒドロキシアルカノエートを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００９３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩など)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など)等、当該微生物の増殖に必要な成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【００９４】
本発明の一方法に用いた無機塩培地(Ｍ９培地)の組成を以下に示す。
【００９５】
[Ｍ９培地]
Ｎa2ＨＰＯ4 6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 3.0g
ＮaＣl 0.5g
ＮＨ4Ｃl 1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
【００９６】
更に、良好な増殖及びポリヒドロキシアルカノエートの生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加する必要がある。
【００９７】
[微量成分溶液]
ニトリロ三酢酸: 1.5g；ＭgＳＯ4: 3.0g ；
ＭnＳＯ4: 0.5g ；ＮaＣl: 1.0g ；ＦeＳＯ4: 0.1g ；
ＣaＣl2: 0.1g ；ＣoＣl2: 0.1g ；ＺnＳＯ4: 0.1g ；
ＣuＳＯ4: 0.1g ；ＡlＫ(ＳＯ4)2: 0.1g ；
Ｈ3ＢＯ3: 0.1g ；Ｎa2ＭoＯ4: 0.1g ；ＮiＣl2: 0.1g
(溶液１リットル中、pＨ 7.0)
【００９８】
(ＰＨＡ回収工程)
本発明に用いる微生物は、このような培養方法により、上記化学式(１)で示される、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産し、その菌体内に蓄積する。従って、本発明のポリヒドロキシアルカノエート製造方法では、培養後、その菌体内から、目的とするポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程を設ける。
【００９９】
この微生物の培養菌体からのポリヒドロキシアルカノエートの回収には、溶媒抽出法を利用して、可溶化したポリヒドロキシアルカノエートを細胞由来の不溶成分と分離し、回収する手段を用いることができる。通常行なわれているクロロホルム抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。
【０１００】
また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡによる処理によってポリヒドロキシアルカノエート以外の菌体成分を除去して、菌体内成分を除去することによってポリヒドロキシアルカノエートのみを回収する方法を採ることもできる。或いは、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法等の微生物細胞を破砕する処理によって細胞中に蓄積されたポリヒドロキシアルカノエートのみを分離、回収する方法を採ることもできる。
【０１０１】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるポリヒドロキシアルカノエートの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのポリヒドロキシアルカノエートの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の方法により製造される、微生物産生のポリヒドロキシアルカノエートは、化学式(１)のユニットに加えて、培地中に添加する増殖基質を利用して、脂肪酸合成系を介して生合成する、化学式(４)で示される３-ヒドロキシアルカン酸ユニット、あるいは、化学式(５)で示される３-ヒドロキシアルカ-５-エン酸ユニットを含むこともある。なお、含まれる３-ヒドロキシアルカン酸ユニットは、いずれも、その３位の炭素原子は不斉炭素であるが、その絶対配置は同じくＲ-体であり、その生分解性を保持することは勿論のことである。化学式(１)のユニット中の、(フェニルメチル)スルファニル基を有することで、ポリマーそのものに新たな物理化学的な性質が加わり、物性の改良が見込まれ、これまでに応用し得なかった分野への展開が期待できる。
【０１０３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されうるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１０４】
[実施例１]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１０５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 159ｍg得た。
【０１０６】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
1Ｈ-ＮＭＲ、13Ｃ-ＮＭＲスペクトルチャートをそれぞれ図１、図２に、その同定結果を表１、表２にそれぞれ示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
表１及び表２に示す通り、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸をモノマーユニットとして含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 85.9ｍol％含むことがわかった。
【０１１０】
【化３５】
【０１１１】
また、得られたポリヒドロキシアルカノエートの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8220、カラム；東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝14400、Ｍｗ＝56700 であった。
【０１１２】
[実施例２]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 138ｍg得た。
【０１１４】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 95.2ｍol％含むことがわかった。
【０１１５】
[実施例３]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 164ｍg 得た。
【０１１７】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 96.7ｍol％含むことがわかった。
【０１１８】
[実施例４]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業) 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 161ｍg 得た。
【０１２０】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるＰＨＡであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 83.8ｍol％含むことがわかった。
【０１２１】
[実施例５]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業) 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１２２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 113ｍg 得た。
【０１２３】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 96.2ｍol％含むことがわかった。
【０１２４】
[実施例６]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業) 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１２５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 126ｍg 得た。
【０１２６】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 89.8ｍol％含むことがわかった。
【０１２７】
[実施例７]
ノナン酸 0.1％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１２８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 90ｍg 得た。
【０１２９】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 29.2ｍol％含むことがわかった。
【０１３０】
[実施例８]
酵母エキス 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１３１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 103ｍg 得た。
【０１３２】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 96.0ｍol％含むことがわかった。
【０１３３】
[実施例９]
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１３４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 87ｍg 得た。
【０１３５】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 86.4ｍol％含むことがわかった。
【０１３６】
表３は、各実施例における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量及び得られたポリマーの３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸(３ＨＢzyＴＶと略す。)ユニットのｍol％を示したものである。
【０１３７】
【表３】
【０１３８】
[実施例10]
３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
酵母エキス 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１３９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、ＰＨＡ 39ｍg(乾燥重量)が得られた。
【０１４０】
得られたＰＨＡの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8220、カラム；東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した。その結果、数平均分子量 Ｍn＝44500、質量平均分子量 Ｍｗ＝106800 であった。
【０１４１】
更に、得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
図３に、測定された1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示し、また、表４に、その同定結果を示す。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
表４に示す結果より、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸モノマーユニットを含んでおり、加えて、それ以外のモノマーユニットとして、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸、または３-ヒドロキシアルケン酸をも含んでおり、具体的には、その構成は
下記化学式(13):
【０１４４】
【化３６】
【０１４５】
に示されるＰＨＡであることが確認された。また、得られたＰＨＡは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸ユニットを 85.4ｍol％含んでいることがわかった。
【０１４６】
[実施例11]
ノナン酸 0.1％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１４７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 68ｍg 得た。
【０１４８】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 27.7ｍol％含むことがわかった。
【０１４９】
[実施例12]
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５０】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 72ｍg 得た。
【０１５１】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 50.3ｍol％含むことがわかった。
【０１５２】
[実施例13]
Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含み、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 148ｍg 得た。
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 66.7ｍol％含むことがわかった。
【０１５４】
[実施例14]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業)0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含み、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 20ｍg 得た。
【０１５６】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 57.2ｍol％含むことがわかった。
【０１５７】
[実施例15]
Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含み、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 64ｍg 得た。
【０１５９】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 31.6ｍol％含むことがわかった。
【０１６０】
表５は、各実施例における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量及び得られたポリマーの３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸(３ＨＢzyＴＢと略す。)ユニットのｍol％を示したものである。
【０１６１】
【表５】
【０１６２】
[実施例16]
３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍＬに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１６３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 96ｍg 得た。
【０１６４】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の方法でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸をモノマーユニットとして含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(14)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 41.0ｍol％含むことがわかった。
【０１６５】
【化３７】
【０１６６】
また、得られたポリヒドロキシアルカノエートの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8220、カラム；東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝21500、Ｍｗ＝83200 であった。
【０１６７】
[実施例17]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１６８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 82ｍg 得た。
【０１６９】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(14)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 56.2ｍol％含むことがわかった。
【０１７０】
[実施例18]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１７１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 75ｍg 得た。
【０１７２】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(14)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 38.8ｍol％含むことがわかった。
【０１７３】
表６は、各実施例における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量及び得られたポリマーの３-ヒドロキシ-３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸(３ＨＭＢzyＴＶと略す。)ユニットのｍol％を示したものである。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
【発明の効果】
本発明により、側鎖に(フェニルメチル)スルファニル構造を有するユニットである３−ヒドロキシ−ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートが提供される。また、これらのポリヒドロキシアルカノエートの微生物を用いて生産する方法が提供される。
【０１７６】
これにより、機能性ポリマーとして有用なポリヒドロキシアルカノエートが効率的に生産でき、デバイス材料や医薬材料等の各分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるポリヒドロキシアルカノエートの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図２】実施例１におけるポリヒドロキシアルカノエートの13Ｃ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図３】実施例10 におけるポリヒドロキシアルカノエートの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構成ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合がある)と、その製造方法に関する。より具体的には、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含む新規な生分解性ＰＨＡ及び、ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を利用し、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有するアルカン酸を原料とする、前記ＰＨＡの製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合がある)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。更に、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全に分解されるという利点を有していることから、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材料等としての応用も期待されている。
【０００３】
このように微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
[１]まず、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)をはじめとする比較的簡単な構造のモノマーユニットを重合させたＰＨＡの生合成についての報告や開示としては、次のものが挙げられる。
【０００５】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファスＨ16株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の基質を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)と３-ヒドロキシ吉草酸(以下、３ＨＶと略す)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特公平６-15604号公報、特公平７-14352号公報、特公平８-19227号公報等)。
【０００６】
また、特許公報第2642937号には、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Ｐseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に基質として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数６から 12までの３-ヒドロキシアルカノエートをモノマーユニットとするＰＨＡを生産することが開示されている。
【０００７】
特開平5-7492号公報には、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Ｐaracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一級アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００８】
特開平５-93049号公報、及び特開平７-265065号公報には、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)をオレイン酸やオリーブ油を基質として培養することにより、３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸との二成分共重合体を生産することが開示されている。
【０００９】
特開平９-191893号公報には、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、基質としてグルコン酸及び１,４-ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【００１０】
これらはいずれも微生物による炭化水素等のβ酸化や糖からの脂肪酸合成により合成された、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【００１１】
[２]しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待される。そして、ある種の微生物では、これら「unusual ＰＨＡ」を生産することが報告されており、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性改良を目指す試みもなされている。
【００１２】
置換基の例としては、不飽和炭化水素、エステル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド、さらには芳香環を含むものなどが挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【００１３】
例えば、Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,191，1957-1965,(1990)、Ｍacroｍolecules,24，5256-5260,(1991)、Ｃhirality,３，492-494,(1991)等では、シュードモナス・オレオボランスが３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(以下、３ＨＰＶと略す)をモノマーユニットをして含むＰＨＡを生産することが報告されており、３ＨＰＶが含まれることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００１４】
また、置換基を側鎖に導入したＰＨＡのうち、近年フェノキシ基を側鎖に有するＰＨＡの開発が盛んである。
【００１５】
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,195，1665-1672,(1994)には、シュードモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ならびに３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１６】
Ｍacroｍolecules,29，3432-3435,(1996)には、シュードモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)を用いて、６-フェノキシヘキサン酸から、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸と３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、11-フェノキシウンデカン酸から、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、それぞれ生産することが報告されている。
【００１７】
Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,41，32-43,(1995)には、シュードモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス・プチダ(Ｐseudoｍonas putida)ＫＴ 2422株を用いて、オクタン酸と６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸あるいは６-(p-ニトロフェノキシ)ヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸あるいは３-ヒドロキシ-６-(４-ニトロフェノキシ)ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１８】
また、置換基を側鎖に導入したＰＨＡのうち、スルフィド型(-Ｓ-)の硫黄原子を側鎖に有するＰＨＡの開発としては、Ｍacroｍolecules.,32，8315-8318,(1999)には、シュードモナス・プチダ(Ｐseudoｍonas putida)27Ｎ01株を用いて、オクタン酸と 11-(フェニルスルファニル)ウンデカン酸を基質として、３-ヒドロキシ-５-(フェニルスルファニル)吉草酸と３-ヒドロキシ-７-(フェニルスルファニル)へプタン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。ただし、その際、シュードモナス・プチダ 27Ｎ01株は、予め、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として 11-(フェニルスルファニル)ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００１９】
更に、Ｐolyｍer Ｐreprints，Japan Ｖol 49,Ｎo.５,1034,(2000)では、シュードモナス・プチダ(Ｐseudoｍonas putida)27Ｎ01株を用いて、11-[(フェニルメチル)スルファニル]ウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-[(フェニルメチル)スルファニル]へプタン酸の２つのモノマーユニットからなるＰＨＡを生産することが報告されている。但し、この場合、シュードモナス・プチダ 27Ｎ01株は、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として 11-[(フェニルメチル)スルファニル]ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
これら側鎖上に官能基を有するＰＨＡのうち、３-ヒドロキシ-ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸ユニットを含むＰＨＡに注目すると、その生合成に関しては、上に挙げた１例の報告があるに過ぎず、更にその生産方法も限定されているために、得られるポリマーの種類、純度、収量において十分なものではなかった。更に、上記の３-ヒドロキシ-ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸ユニットを含むＰＨＡの生産方法は、炭素鎖長が長いω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸のみを基質として含む培地中で微生物を培養することによりポリマー生産を行なっているが、この場合、ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸が増殖のための基質として利用されるため、ポリマーの構造の制御が困難であるという問題点があった。
【００２１】
本発明の目的は、新規な、側鎖に(フェニルメチル)スルファニル構造を有するユニットを含む新規なＰＨＡ、及びその製造方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねてきた結果、以下の様な発明に至った。即ち、本発明の第一は、化学式(１)で示すユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート(但し、化学式(２)及び(３)に示す２つのユニットの組み合わせのみからなるポリヒドロキシアルカノエートを除く)そのものである。
【００２３】
【化１７】
(式中、Ｒ１は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、xは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る)
【００２５】
【化１８】
なお、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、化学式(１)に示されるユニットに加えて、化学式(４)及び(５)に示されるユニットのいずれか、或いは両方共を含んでいてもよい。
【００２７】
【化１９】
(y及びzは化学式(１)で示すユニットと独立して化学式中に示した範囲内で任意の一つ以上の整数値をとり得る)
【００２９】
本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、数平均分子量が 5000 から 300000 の範囲である。
【００３０】
上記の構成を有する本発明のＰＨＡには、例えば、下記化学式(２):
【００３１】
【化２０】
で示される３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。(但し、それ以外のユニットが化学式(３)に示すユニットのみからなるポリヒドロキシアルカノエートを除く。)
【００３３】
または、下記化学式(６):
【００３４】
【化２１】
で示される３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
【００３６】
または、下記化学式(７):
【００３７】
【化２２】
で示される３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸ユニットを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートが含まれる。
【００３９】
また、本発明は、化学式(８)で示される化合物を少なくとも１種類含む培地中で微生物を培養することを特徴とする、化学式(１)で示したポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。(但し、化学式(２)及び(３)に示す２つのユニットのみからなるポリヒドロキシアルカノエートを除く)
【００４０】
【化２３】
(式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、ｋは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る。)
【００４２】
【化２４】
(式中、Ｒ１は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、xは、１〜８から選択される任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る。)
【００４４】
【化２５】
本発明の方法で製造されるポリヒドロキシアルカノエートは、前記化学式(１)で示されるユニットに加えて、下記化学式(４)及び(５)に示されるユニットのいずれか、或いは両方共を含んでいてもよい。
【００４６】
【化２６】
(y及びzは化学式(１)で示すユニットと独立して化学式中に示した範囲内で任意の一つ以上の整数値をとり得る)
【００４８】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、ポリペプトンを含んでいることができる。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、酵母エキスを含んでいることができる。さらに、培養工程において利用する前記培地は、糖類を含んでいることができる。この場合、培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。
【００４９】
加えて、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、有機酸またはその塩を含んでいるものでもよい。その際、培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。あるいは、培養工程において利用する前記培地は、アミノ酸またはその塩を含んでいることもできる。例えば、培地中に含有されるアミノ酸またはその塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。
【００５０】
場合によっては、本発明のＰＨＡの製造方法においては、培養工程において利用する前記培地は、炭素数４から 12の直鎖アルカン酸またはその塩を含んでいることもできる。
【００５１】
また、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記微生物の培養において二段階以上の培養を行なうことができる。この場合、二段階目以降の培養では培地中に窒素源が含まれていないことが好ましい。
【００５２】
前記微生物の培養において二段階以上の培養を行なう本発明の製造方法として、
(工程１-１)下記化学式(８):
【００５３】
【化２７】
(式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、ｋは、１〜８から選択される任意の整数を表し、一つ以上の値をとり得る)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつポリペプトンを含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
(工程１-２)前記化学式(８)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ有機酸またはその塩とを含む培地中で、工程１-１で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法が挙げられる。その際、前記工程１-２で用いる培地中に含有される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１-２で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００５５】
また更に
(工程１-３)下記化学式(８):
【００５６】
【化２８】
(式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｈ原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2基、(ＣＨ3)2ＣＨ基、(ＣＨ3)3Ｃ基から選択される基であり、また、ｋは、１〜８から選択される任意の整数を表し、一つ以上の値をとり得る)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、かつ糖類を含む培地中で、ポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生物を培養する工程と、これに続き、
(工程１-４)前記一般式(８)で示される化合物を少なくとも一種類以上含み、また、糖類を含む培地中で、工程１-３で培養された微生物を更に培養する工程とを有する製造方法を挙げることもできる。その際、前記工程１-３及び工程１-４で用いるそれぞれの培地中に含有される糖類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群から選択される１種類以上の化合物であることが好ましい。なお、前記工程１-４で利用する培地中には、窒素源が含まれていないことがより好ましい。
【００５８】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式(９):
【００５９】
【化２９】
で示される５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(２):
【００６１】
【化３０】
で示される３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が含まれる。
【００６３】
本発明のＰＨＡの製造方法には、例えば、下記化学式(10):
【００６４】
【化３１】
で示される４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(６):
【００６６】
【化３２】
で示される３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法もまた含まれる。
【００６８】
本発明の製造方法には、例えば、下記化学式(11):
【００６９】
【化３３】
で示される５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸を含む培地中で微生物を培養し、
下記化学式(７):
【００７１】
【化３４】
で示される３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸ユニットをポリマー分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法もまた含まれる。
【００７３】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法においては、前記の培養工程に加えて、培養細胞からポリヒドロキシアルカノエートを分離回収する工程を設けることができ、本工程は、培養された微生物細胞中に蓄積されるポリヒドロキシアルカノエートを可溶化する工程、もしくは、培養された微生物細胞を破砕する工程を含むことを特徴とする製造方法とすることが望ましい。
【００７４】
一方、上述した種々の構成をとることが可能な本発明のＰＨＡの製造方法において、利用する微生物は、前記培養方法によって、本発明のＰＨＡを生産しうる微生物であれば如何なる微生物でもよく、その中でも特に、シュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物であることが好ましい。例えば、前記シュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物が、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45；ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161；ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)のうちから選択される微生物であることがより好ましい。
【００７５】
【発明の実施の形態】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、含まれるヒドロキシアルカン酸のモノマーユニット中に、(フェニルメチル)スルファニル構造をその側鎖に有し、この構造によりこれまでに知られている微生物生産ポリヒドロキシアルカノエートとは著しく異なった物理化学的性質を有している。
【００７６】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカノエートは、例えば、ＰＨＡ生産能力を有する微生物を、原料となるω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸に加えて、増殖基質を含んだ培地中で培養する工程、この培養工程において微生物により生産され、その細胞内に蓄積される、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程、この二段階の工程を経て製造されるものである。また、かかる微生物により産生されるＰＨＡは、化学式(１)に示されるユニットを含め、全ての３-ヒドロキシアルカン酸ユニットの、３位の炭素は不斉炭素であるが、その絶対配置は、Ｒ体となり、生分解性を示すものである。
【００７７】
以下に、本発明について、より詳細に説明する。
【００７８】
(生産微生物)
本発明のＰＨＡの製造方法では、目的とする化学式(１)で示されるユニットを含むＰＨＡの生産に用いる微生物は、原料化合物の化学式(８)で示されるω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸を含む培地中で培養した際、対応する側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産し、その細胞内に蓄積する微生物であれば、いかなる微生物であってもよい。例えば、ＰＨＡ産生能を有するシュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物が挙げられる。
【００７９】
好適なシュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物の一例を挙げると、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)の三種の菌株が挙げられる。これら三種の微生物は、寄託者として本願出願人を名義として、先に国内寄託され、その後、その原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へと移管され、国際寄託機関としての経済産業省 産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所(ＮＩＢＨ)よりそれぞれ、前記の受託番号を付与され、現在の、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。また、新規なＰＨＡ産生能を有する菌株として、既に、特願平11-371863号(特開2001-178484号公報)に記載されている微生物である。
【００８０】
(培養工程)
本発明にかかるＰＨＡの製造方法は、原料の上記化学式(８)に示されるω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸を含む培地中で、上記するＰＨＡ産生能を有する微生物を培養することで、対応する前記化学式(１)で表される、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【００８１】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ポリヒドロキシアルカノエートの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００８２】
前記したようなポリヒドロキシアルカノエート生産微生物を用いて、目的とするポリヒドロキシアルカノエートを製造するためには、ポリヒドロキシアルカノエート生産用の原料として、該モノマーユニットに対応する、上記化学式(８)で示される化合物と、微生物の増殖基質とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。上記化学式(８)で示される化合物は、培地あたり 0.01％から１％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.02％から 0.2％の割合で含有していることが望ましい。化学式(８)で示される化合物は、水溶性は必ずしも良好ではないが、本発明に示す微生物を用いれば、懸濁された状態であっても何ら問題は無い。
【００８３】
なお、原料の化学式(８)で示される化合物は、分散性を高めるため、場合によっては１-ヘキサデセンやn-ヘキサデカンのような溶媒に溶解或いは懸濁された形で培地中に含有させることも可能である。この場合、該溶媒の濃度は培地溶液に対して３％(v/v)以下にすることが必要である。
【００８４】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質としては、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸、或いはＴＣＡ回路から更に１段階ないしは２段階の生化学反応により得られる有機酸或いはその塩、アミノ酸或いはその塩、炭素数４から 12の直鎖アルカン酸或いはその塩等、から用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。
【００８５】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００８６】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００８７】
また、アミノ酸或いはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００８８】
これらの中では、ポリペプトンや糖類を用いるのが好ましく、また糖類の中ではグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。これらの基質は通常培地あたり 0.1％から５％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.2％から２％の割合で含有していることが望ましい。
【００８９】
微生物にポリヒドロキシアルカノエートを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【００９０】
より具体的には、化学式(８)で示される化合物、及びポリペプトンを含む培地中で微生物を培養する工程(工程１-１)を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、菌体を遠心分離等で回収したのち、これに続く、化学式(８)で示される化合物と先に列挙したような有機酸或いはその塩とを含む培地中(好ましくは、窒素源を含まない)で、工程１で培養された微生物を更に培養する工程(工程１-２)を行なう方法、あるいは、化学式(８)で示される化合物、及び先に列挙したような糖類を含む培地中で微生物を培養する工程(工程１-３)を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、菌体を遠心分離等で回収したのち、これに続く、化学式(８)で示される化合物と糖類とを含む培地中(好ましくは、窒素源を含まない)で、工程１で培養された微生物を更に培養する工程(工程１-４)を行なう方法等である。
【００９１】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【００９２】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ポリヒドロキシアルカノエートを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００９３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩など)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など)等、当該微生物の増殖に必要な成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【００９４】
本発明の一方法に用いた無機塩培地(Ｍ９培地)の組成を以下に示す。
【００９５】
[Ｍ９培地]
Ｎa2ＨＰＯ4 6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 3.0g
ＮaＣl 0.5g
ＮＨ4Ｃl 1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
【００９６】
更に、良好な増殖及びポリヒドロキシアルカノエートの生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加する必要がある。
【００９７】
[微量成分溶液]
ニトリロ三酢酸: 1.5g；ＭgＳＯ4: 3.0g ；
ＭnＳＯ4: 0.5g ；ＮaＣl: 1.0g ；ＦeＳＯ4: 0.1g ；
ＣaＣl2: 0.1g ；ＣoＣl2: 0.1g ；ＺnＳＯ4: 0.1g ；
ＣuＳＯ4: 0.1g ；ＡlＫ(ＳＯ4)2: 0.1g ；
Ｈ3ＢＯ3: 0.1g ；Ｎa2ＭoＯ4: 0.1g ；ＮiＣl2: 0.1g
(溶液１リットル中、pＨ 7.0)
【００９８】
(ＰＨＡ回収工程)
本発明に用いる微生物は、このような培養方法により、上記化学式(１)で示される、側鎖末端に(フェニルメチル)スルファニル基を有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産し、その菌体内に蓄積する。従って、本発明のポリヒドロキシアルカノエート製造方法では、培養後、その菌体内から、目的とするポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程を設ける。
【００９９】
この微生物の培養菌体からのポリヒドロキシアルカノエートの回収には、溶媒抽出法を利用して、可溶化したポリヒドロキシアルカノエートを細胞由来の不溶成分と分離し、回収する手段を用いることができる。通常行なわれているクロロホルム抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。
【０１００】
また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡによる処理によってポリヒドロキシアルカノエート以外の菌体成分を除去して、菌体内成分を除去することによってポリヒドロキシアルカノエートのみを回収する方法を採ることもできる。或いは、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法等の微生物細胞を破砕する処理によって細胞中に蓄積されたポリヒドロキシアルカノエートのみを分離、回収する方法を採ることもできる。
【０１０１】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるポリヒドロキシアルカノエートの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのポリヒドロキシアルカノエートの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の方法により製造される、微生物産生のポリヒドロキシアルカノエートは、化学式(１)のユニットに加えて、培地中に添加する増殖基質を利用して、脂肪酸合成系を介して生合成する、化学式(４)で示される３-ヒドロキシアルカン酸ユニット、あるいは、化学式(５)で示される３-ヒドロキシアルカ-５-エン酸ユニットを含むこともある。なお、含まれる３-ヒドロキシアルカン酸ユニットは、いずれも、その３位の炭素原子は不斉炭素であるが、その絶対配置は同じくＲ-体であり、その生分解性を保持することは勿論のことである。化学式(１)のユニット中の、(フェニルメチル)スルファニル基を有することで、ポリマーそのものに新たな物理化学的な性質が加わり、物性の改良が見込まれ、これまでに応用し得なかった分野への展開が期待できる。
【０１０３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されうるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１０４】
[実施例１]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１０５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 159ｍg得た。
【０１０６】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
【０１０７】
【表１】
【表２】
表１及び表２に示す通り、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸をモノマーユニットとして含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 85.9ｍol％含むことがわかった。
【０１１０】
【化３５】
また、得られたポリヒドロキシアルカノエートの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8220、カラム；東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝14400、Ｍｗ＝56700 であった。
【０１１２】
[実施例２]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 138ｍg得た。
【０１１４】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 95.2ｍol％含むことがわかった。
【０１１５】
[実施例３]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 164ｍg 得た。
【０１１７】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 96.7ｍol％含むことがわかった。
【０１１８】
[実施例４]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業) 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 161ｍg 得た。
【０１２０】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるＰＨＡであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 83.8ｍol％含むことがわかった。
【０１２１】
[実施例５]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業) 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１２２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 113ｍg 得た。
【０１２３】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 96.2ｍol％含むことがわかった。
【０１２４】
[実施例６]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業) 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１２５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 126ｍg 得た。
【０１２６】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 89.8ｍol％含むことがわかった。
【０１２７】
[実施例７]
ノナン酸 0.1％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１２８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 90ｍg 得た。
【０１２９】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 29.2ｍol％含むことがわかった。
【０１３０】
[実施例８]
酵母エキス 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１３１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 103ｍg 得た。
【０１３２】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 96.0ｍol％含むことがわかった。
【０１３３】
[実施例９]
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１３４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 87ｍg 得た。
【０１３５】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例１と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(12)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 86.4ｍol％含むことがわかった。
【０１３６】
表３は、各実施例における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量及び得られたポリマーの３-ヒドロキシ-５-[(フェニルメチル)スルファニル]吉草酸(３ＨＢzyＴＶと略す。)ユニットのｍol％を示したものである。
【０１３７】
【表３】
[実施例10]
３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
酵母エキス 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１３９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を、冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させた。更に、沈澱物のみを回収し、次いで、真空乾燥した後、ＰＨＡポリマーの乾燥重量(回収量)を秤量した。本例では、ＰＨＡ 39ｍg(乾燥重量)が得られた。
【０１４０】
得られたＰＨＡの平均分子量は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8220、カラム；東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した。その結果、数平均分子量 Ｍn＝44500、質量平均分子量 Ｍｗ＝106800 であった。
【０１４１】
更に、得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
【０１４２】
【表４】
表４に示す結果より、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸モノマーユニットを含んでおり、加えて、それ以外のモノマーユニットとして、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸、または３-ヒドロキシアルケン酸をも含んでおり、具体的には、その構成は
下記化学式(13):
【０１４４】
【化３６】
に示されるＰＨＡであることが確認された。また、得られたＰＨＡは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸ユニットを 85.4ｍol％含んでいることがわかった。
【０１４６】
[実施例11]
ノナン酸 0.1％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１４７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 68ｍg 得た。
【０１４８】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 27.7ｍol％含むことがわかった。
【０１４９】
[実施例12]
グルタミン酸ナトリウム 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５０】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 72ｍg 得た。
【０１５１】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 50.3ｍol％含むことがわかった。
【０１５２】
[実施例13]
Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含み、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 148ｍg 得た。
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 66.7ｍol％含むことがわかった。
【０１５４】
[実施例14]
ポリペプトン(販売元 和光純薬工業)0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含み、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 20ｍg 得た。
【０１５６】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 57.2ｍol％含むことがわかった。
【０１５７】
[実施例15]
Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸 0.1％を含み、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。また、凍結乾燥された菌体の重量(菌体乾燥重量)を秤量した。
【０１５８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 64ｍg 得た。
【０１５９】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(13)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸のモノマーユニットを 31.6ｍol％含むことがわかった。
【０１６０】
表５は、各実施例における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量及び得られたポリマーの３-ヒドロキシ-４-[(フェニルメチル)スルファニル]酪酸(３ＨＢzyＴＢと略す。)ユニットのｍol％を示したものである。
【０１６１】
【表５】
[実施例16]
３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍＬに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１６３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 96ｍg 得た。
【０１６４】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10 と同様の方法でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸をモノマーユニットとして含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(14)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 41.0ｍol％含むことがわかった。
【０１６５】
【化３７】
また、得られたポリヒドロキシアルカノエートの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8220、カラム；東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝21500、Ｍｗ＝83200 であった。
【０１６７】
[実施例17]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１６８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 82ｍg 得た。
【０１６９】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(14)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 56.2ｍol％含むことがわかった。
【０１７０】
[実施例18]
Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１７１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリヒドロキシアルカノエートを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリヒドロキシアルカノエートを 75ｍg 得た。
【０１７２】
得られたポリヒドロキシアルカノエートは、実施例10と同様の条件でＮＭＲ分析を行なった結果、当該ポリヒドロキシアルカノエートは３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを含み、且つそれ以外のモノマーユニットが３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ吉草酸などの炭素数４から 12までの飽和、不飽和脂肪酸である３-ヒドロキシアルカン酸または３-ヒドロキシアルケン酸を含む、化学式(14)で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが確認された。また、得られたポリヒドロキシアルカノエートは、1Ｈ-ＮＭＲスペクトル積分比より、３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸のモノマーユニットを 38.8ｍol％含むことがわかった。
【０１７３】
表６は、各実施例における菌体乾燥重量、ポリマー乾燥重量、ポリマー乾燥重量/菌体乾燥重量及び得られたポリマーの３-ヒドロキシ-３-ヒドロキシ-５-[[(４-メチルフェニル)メチル]スルファニル]吉草酸(３ＨＭＢzyＴＶと略す。)ユニットのｍol％を示したものである。
【０１７４】
【表６】
【発明の効果】
本発明により、側鎖に(フェニルメチル)スルファニル構造を有するユニットである３−ヒドロキシ−ω-[(フェニルメチル)スルファニル]アルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートが提供される。また、これらのポリヒドロキシアルカノエートの微生物を用いて生産する方法が提供される。
【０１７６】
これにより、機能性ポリマーとして有用なポリヒドロキシアルカノエートが効率的に生産でき、デバイス材料や医薬材料等の各分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるポリヒドロキシアルカノエートの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図２】実施例１におけるポリヒドロキシアルカノエートの13Ｃ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【図３】実施例10 におけるポリヒドロキシアルカノエートの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
Claims (8)
- 化学式(１):
- 化学式(１)に示されるユニット以外に、化学式(４)及び(５)に示されるユニットの少なくとも一つを含む、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
- 化学式(８)で示される化合物を少なくとも一種類含む培地中で微生物を培養する工程と、
前記微生物細胞からポリヒドロキシアルカノエートを分離回収する工程とを有することを特徴とする、化学式(１)で示すユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート(化学式(２)及び(３)に示す２つのユニットの組み合わせのみからなるポリヒドロキシアルカノエートを除く)の製造方法。
- 前記微生物の培養が、二段階以上の培養工程を含むことを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
- 前記微生物の培養において、二段階目以降の培地中に窒素源を含まないことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
- 前記微生物の培養が、
(工程１-１)化学式(８)で示される化合物を少なくとも一種類含み、且つポリペプトンを含む培地中で微生物を培養する工程と、これに続き、(工程１-２)化学式(８)で示される化合物を少なくとも一種類含み、且つ有機酸或いはその塩とを含む培地中で、工程１-１で培養された微生物を更に培養する工程とを有することを特徴とする請求項４または５に記載の製造方法。 - 前記微生物の培養が、(工程１-３)化学式(８)で示される化合物を少なくとも一種類含み、且つ糖類を含む培地中で微生物を培養する工程と、これに続き、
(工程１-４)化学式(８)で示される化合物を少なくとも一種類含み、且つ糖類を含む培地中で、工程１-３で培養された微生物を更に培養する工程とを有することを特徴とする請求項４または５に記載の製造方法。 - 前記ポリヒドロキシアルカノエート分離回収工程が、微生物細胞を破砕する工程を含むことを特徴とする請求項３〜７のいずれかに記載の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002039259A JP3720774B2 (ja) | 2001-05-31 | 2002-02-15 | （フェニルメチル）スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 |
| US10/157,142 US6911521B2 (en) | 2001-05-31 | 2002-05-30 | Polyhydroxyalkanoate that comprises unit having substituted or unsubstituted (phenylmethyl) sulfanyl structure in side chain thereof and process for producing the same |
| KR10-2002-0030338A KR100491307B1 (ko) | 2001-05-31 | 2002-05-30 | 곁사슬에 치환 혹은 무치환 (페닐메틸)설파닐구조를 지닌 유닛을 함유하는 신규의 폴리하이드록시알카노에이트 및 그의 제조방법 |
| CNB02160617XA CN1184250C (zh) | 2001-05-31 | 2002-05-31 | 在侧链具有取代或未取代的（苯基甲基）硫烷基结构的单元的新聚羟基链烷酸酯及其制备方法 |
| EP02012096A EP1262508B1 (en) | 2001-05-31 | 2002-05-31 | Novel polyhydroxyalkanoate that comprises unit having substituted (phenylmethyl) sulfanyl structure in side chain thereof and process for producing the same |
| DE60221603T DE60221603T2 (de) | 2001-05-31 | 2002-05-31 | Polyhydroxyalkanoat welches eine substituierte (Phenylmethyl)Sulfanyl-Struktureinheit in der Seitenkette enthält und Verfahren zu dessen Herstellung |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001-165239 | 2001-05-31 | ||
| JP2001165239 | 2001-05-31 | ||
| JP2001209898 | 2001-07-10 | ||
| JP2001-209898 | 2001-07-10 | ||
| JP2002039259A JP3720774B2 (ja) | 2001-05-31 | 2002-02-15 | （フェニルメチル）スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003089720A JP2003089720A (ja) | 2003-03-28 |
| JP2003089720A5 JP2003089720A5 (ja) | 2004-11-25 |
| JP3720774B2 true JP3720774B2 (ja) | 2005-11-30 |
Family
ID=27346837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002039259A Expired - Fee Related JP3720774B2 (ja) | 2001-05-31 | 2002-02-15 | （フェニルメチル）スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3720774B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4812061B2 (ja) * | 2001-05-31 | 2011-11-09 | キヤノン株式会社 | ［（置換フェニル）メチル］スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 |
| JP4579502B2 (ja) * | 2003-05-02 | 2010-11-10 | キヤノン株式会社 | 構造体及びその製造方法、該構造体を含むトナー並びにそれを用いた画像形成方法及び装置 |
| JP2006206834A (ja) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | ポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法、該ポリヒドロキシアルカノエートを含有するバインダー樹脂 |
-
2002
- 2002-02-15 JP JP2002039259A patent/JP3720774B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003089720A (ja) | 2003-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6479621B2 (en) | Polyhydroxyalkanoate containing 3-hydroxythienylalkanoic acid as monomer unit and method for producing the same | |
| KR100485119B1 (ko) | 폴리히드록시알카노에이트와, 그 생산방법, 및 ω-(2-티에닐설파닐)알칸산과 그 생산방법 | |
| KR100487877B1 (ko) | 3-하이드록시벤조일알칸산을 모노머유닛으로서 함유하는폴리하이드록시알카노에이트 및 그 제조방법 | |
| KR100498221B1 (ko) | 곁사슬에 (메틸술파닐)페녹시 구조를 가지는 유닛을포함하는 신규한 폴리하이드록시알카노에이트 및 그제조방법 | |
| US7056708B2 (en) | Method of producing polyhydroxyalkanoate from alkane having residue containing aromatic ring in its molecule | |
| US20020160467A1 (en) | Polyhydroxyalkanoate and manufacturing method thereof | |
| KR100491307B1 (ko) | 곁사슬에 치환 혹은 무치환 (페닐메틸)설파닐구조를 지닌 유닛을 함유하는 신규의 폴리하이드록시알카노에이트 및 그의 제조방법 | |
| JP2004196832A (ja) | 側鎖にブロモ基を有するユニットを分子中に含む新規なポリヒドロキシアルカノエート共重合体及びその製造方法 | |
| JP3720774B2 (ja) | （フェニルメチル）スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
| JP3880566B2 (ja) | 側鎖に（フェニルメチル）オキシ構造を有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
| JP2001316462A (ja) | ３−ヒドロキシチエニルアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
| JP3880473B2 (ja) | （メチルスルファニル）フェノキシ構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
| JP3880462B2 (ja) | 側鎖にエステル基を有するユニットを分子中に含む新規なポリヒドロキシアルカノエート共重合体及びその製造方法 | |
| JP4812061B2 (ja) | ［（置換フェニル）メチル］スルファニル構造を側鎖に有するユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
| JP3768835B2 (ja) | ３−ヒドロキシ置換ベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
| JP2007014300A (ja) | ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 | |
| JP2002256066A (ja) | ３−ヒドロキシ−５−（４−シアノフェノキシ）吉草酸ユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート、およびその製造方法 | |
| JP2002256064A (ja) | ３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニット及び３−ヒドロキシ−５−（４−シアノフェノキシ）吉草酸ユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート、およびその製造方法 | |
| JP2002173521A (ja) | ３−ヒドロキシベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
| JP2004187648A (ja) | ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031210 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20031210 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20031210 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050524 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132 Effective date: 20050601 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050801 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050831 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050908 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090916 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090916 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100916 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100916 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110916 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110916 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120916 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120916 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130916 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |