DE60221603T2

DE60221603T2 - Polyhydroxyalkanoat welches eine substituierte (Phenylmethyl)Sulfanyl-Struktureinheit in der Seitenkette enthält und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE60221603T2
Application number: DE60221603T
Authority: DE
Inventors: Takashi Kenmoku; Etsuko Sugawa; Tetsuya Yano; Tsuyoshi Nomoto; Takeshi Imamura; Tomohiro Suzuki; Tsutomu Honma
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2022-06-01
Also published as: EP1262508B1; CN1184250C; US20030096384A1; KR100491307B1; EP1262508A2; DE60221603D1; US6911521B2; CN1424337A; EP1262508A3; KR20020091824A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat (hier nachstehend auch als "PHA" abgekürzt), das eine neue Struktureinheit aufweist, und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues, biologisch abbaubares PHA, das 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten mit einer substituierten oder unsubstituierten (Phenylmethyl)sulfanylgruppe am Ende ihrer Seitenkette umfaßt, und ein Verfahren zur Produktion dieser PHA aus Alkansäure mit einer substituierten oder unsubstituierten (Phenylmethyl)sulfanylgruppe am Ende ihrer Seitekette unter Verwendung eines Mikroorganismus, der PHA produzieren und in der Zelle speichern kann.
Einschlägiger Stand der Technik
Es ist bereits berichtet worden, daß verschiedene Mikroorganismen Poly-3-hydroxybutyrat (hier nachfolgend auch als "PHB" abgekürzt) oder ein anderes PHA produzieren und in der Zelle speichern können ("Biodegradable Plastics Handbook", Biodegradable Plastics Society Ed., NTS, S. 178–197 (1995)). Diese Polymere können wie herkömmliche Kunststoffe zum Beispiel durch Verarbeiten aus der Schmelze für die Herstellung verschiedener Produkte verwendet werden, im Gegensatz zu vielen herkömmlichen synthetischen Polymerverbindungen führen diese Polymere jedoch nicht zu einer Verschmutzung in der Umwelt, da sie biologisch abbaubar sind, das heißt sie werden von Mikroorganismen in der Natur vollständig abgebaut. Außerdem zeigen sie eine gute Biokompatibilität, und es läßt sich deren Verwendung auf dem Gebiet der Medizin als weiche Materialien erwarten.
Es ist bekannt, daß mikrobielle PHA zum Beispiel in Abhängigkeit von der Art des Mikroorganismus, der Zusammensetzung des Kulturmediums und den Züchtungsbedingungen unterschiedliche Zusammensetzungen und/oder Strukturen aufweisen. Folglich sind Untersuchungen durchgeführt worden, um die Zusammensetzung und Struktur zu regeln, so daß physikalische Eigenschaften des PHA verbessert werden.

(1) Erstens wird in den folgenden Dokumenten die Synthese von PHA durch Polymerisation von relativ einfachen Monomereinheiten, wie 3-Hydroxybuttersäure (hier nachstehend als 3HB abgekürzt) aufgeführt oder offenbart.

Es ist zum Beispiel bekannt, daß Alcaligenes eutrophus H16 (ATCC Nr. 17699) und dessen Mutanten Copolymere von 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat (hier nachstehend als 3HV abgekürzt) mit unterschiedlichen Zusammensetzungsverhältnissen produzieren (japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-15604 und japanische Patentveröffentlichungen Nr. 7-14352 und 8-19227).
Das japanische Patent Nr. 2642937 offenbart die Produktion von PHA aus 3-Hydroxyakanoat-Monomereinheiten mit C₆ bis C₁₂, wenn Pseudomonas oleovorans (ATCC Nr. 29347) acyclische aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen als Substrate erhält.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-7492 offenbart ein Verfahren zur Produktion eines Copolymers von 3HB und 3HV unter Verwendung eines Mikroorganismus, wie Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp. und Pseudomonas sp., im Kontakt mit einem primären C₃-C₇-Alkohol.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-93049 und die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 7-265065 offenbaren die Herstellung von Copolymeren mit zwei Komponenten aus 3HB und 3-Hydroxyhexanat durch Züchten von Aeromonos caviae mit Oleinsäure oder Olivenöl als Substrat.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 9-191893 offenbart, daß Comamonas acidovorans IFO 13852 einen Polyester produziert, der 3HB und 4-Hydroxybutyrat als Monomereinheiten enthält, wenn er in Gegenwart von Gluconsäure und 1,4-Butandiol als Substrate gezüchtet wird.
Die vorstehend genannten PHA sind "übliche PHA", die Monomereinheiten einschließen, die eine Alkylgruppe als ihre Seitenkette aufweisen, die von Mikroorganismen durch β-Oxidation von Kohlenwasserstoffen usw. oder über die Fettsäuresynthese aus Sacchariden synthetisiert werden.

(2) Von "unüblichen PHA", das heißt PHA mit einem von einer Alkylgruppe verschiedenen Substituenten an der Seitenkette, wird jedoch erwartet, daß sie sehr nützlich sind, wenn eine umfassendere Verwendung der mikrobiellen PHA, zum Beispiel als funktionelle Polymere, in Betracht gezogen wird. Von bestimmten Mikroorganismen ist bereits bekannt, daß sie solche "unüblichen PHA" produzieren, und es ist versucht worden, mit einer solchen Methode die physikalischen Eigenschaften von mikrobiellem PHA zu verbessern.

Zu Beispielen der Substituenten gehören ungesättigte Kohlenwasserstoffe, Estergruppen, Cyanogruppen, Halogenkohlenwasserstoffe, Epoxide und jene, die einen aromatischen Ring oder aromatische Ringe enthalten. Davon sind PHA mit einem aromatischen Ring aktiv untersucht worden.
Macromol. Chem., 191, 1957–1965 (1990), Macromolecules, 24, 5256–5260 (1991) und Chirality, 3, 492–494 (1991) berichten zum Beispiel, daß Pseudomonas oleovorans PHA produziert, die 3-Hydroxy-5-phenylvalerat (hier nachstehend als 3HPV abgekürzt) als Monomereinheit enthalten, wobei Änderungen der physikalischen Eigenschaften des PHA beobachtet wurden, die wahrscheinlich auf dem Vorhandensein des 3HPV beruhen.
Von den PHA mit einem Substituenten an ihrer Seitenkette sind kürzlich jene aktiv weiterentwickelt worden, die eine Phenoxygruppe an der Seitenkette aufweisen.
Es ist berichtet worden, daß Pseudomonas oleovorans aus 11-Phenoxyundecansäuren ein PHA produziert, das aus Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxy-5-phenoxyvalerat und 3-Hydroxy-9-phenoxynonanoat aufgebaut ist (Macromol. Chem. Phys., 195, 1665–1672 (1994)).
Macromolecules, 29, 3432–3435 (1996) berichtet von der Produktion von PHA mit Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxy-4-phenoxybutyrat und 3-Hydroxy-6-phenoxyhexanoat aus 6-Phenoxyhexansäuren; von der Produktion von PHA mit Einheiten aus 3-Hydroxy-4-phenoxybutyrat, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexanoat, 3-Hydroxy-4-phenoxybutyrat, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexanoat und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctanoat aus 8-Phenoxyoctansäure; und der Produktion von PHA, das aus Einheiten in Form von 3-Hydroxy-5-Phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure aufgebaut ist, aus 11-Hydroxyundecansäure unter Verwendung von Pseuomonas oleovorans.
Can. J. Micrabiol., 41, 32–43 (1995) berichtet von der Herstellung von PHA, die 3-Hydroxy-6-(4-cyanophenoxy)hexansäuren oder 3-Hydroxy-6-(4-nitrophenoxy)hexansäure als Monomereinheiten enthalten, durch Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 oder Pseudomonas putida KT 2422, wobei Octansäure und 6-(4-Cyanophenoxy)hexansäure oder 6-(p-Nitrophenoxy)hexansäure als Substrat verwendet wird.
Bei bisher entwickelten unüblichen PHA wird in Macromolecules, 32, 8315–8318 (1999) von der Herstellung jener berichtet, die Schwefelatome in Form von Sulfid (-S-) in ihrer Seitenkette enthalten, wobei Pseudomonas putida 27N01 PHA produziert, die 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure und 3-Hydroxy-7-(phenylsulfanyl)heptansäure als Monomereinheiten enthalten, wobei Octansäure und 11-(Phenylsulfanyl)undecansäure als Substrate verwendet werden. In diesem Fall wird Pseudomonas putida 27N01 in einem Kulturmedium vorgezüchtet, das nur Octansäure als Wachstumssubstrat enthält, und dann in ein Kulturmedium übertragen, das nur 11-(Phenylsulfanyl)undecansäure als Substrat enthält.
Polymer Preprints, Japan Bd. 49, Nr. 5, 1034 (2000) berichtet auch von der Produktion von PHA, die zwei Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxy-[(phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure und 3-Hydroxy-7-[(phenylmethyl)sulfanyl]heptansäure enthalten, wobei Pseudomonas putida 27N01 und 11-[(Phenylmethyl)sulfanyl]undecansäure als Substrat verwendet werden. In diesem Fall wird Pseudomonas putida 27N01 ebenfalls in einem Kulturmedium vorgezüchtet, das nur Octansäure als Wachstumssubstrat enthält, und dann in ein Kulturmedium übertragen, das nur 11-[(Phenylmethyllsulfanyl]undecansäure enthält.
Von den unüblichen PHA sind die vorstehend aufgeführten Dokumente zu PHA, die 3-Hydroxy-ω-[(phenylmethyl)sulfanyl]alkansäure als Einheit enthalten, die einzigen Berichte über die Biosynthese solcher PHA. Das zur Verfügung stehende Produktionsverfahren ist zudem begrenzt. Folglich sind die Arten, die Reinheit und die Ausbeute der resultierenden Polymere nicht ausreichend. Beim vorstehend genannten Verfahren zur Produktion der PHA, die eine 3-Hydroxy-ω-[(phenylmethyl)sulfanyl]alkansäure-Einheit enthalten, erfolgt die Produktion des Polymers durch Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das nur ω-[(Phenylmethyl)sulfanyl]alkansäure mit einer langen Kohlenstoffkette als Substrat enthält, wobei die ω-[(Phenylmethyl)sulfanyl]alkansäure auch als Wachstumssubstrat verwendet wird. Folglich ist es problematisch, die Struktur des Polymers zu regeln.
PHA, die eine substituierte 3-Hydroxy-ω-{[(substituierte phenyllmethyl]sulfanyl}alkansäure-Einheit enthalten, die einen Substituenten, wie unterschiedliche funktionelle Gruppen, am Benzolring der (Phenylmethyl)sulfanylgruppe am Ende der Seitenkette aufweist, sind PHA mit neuen Funktionen, und es wird eine Verbesserung der physikalischen Eigenschaften dieser PHA vorhergesagt. Die Verwendung solcher PHA wird auf neue Gebiete ausgedehnt, bei denen herkömmliche PHA nicht verwendet werden konnten. Folglich ist die Weiterentwicklung eines effizienten Verfahrens zur Herstellung solcher PHA erwünscht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde von den hier genannten Erfindern durch intensive Forschungen zur Lösung der vorstehend genannten Probleme erreicht.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen PHA und eines Verfahrens zu dessen Herstellung, wobei das PHA eine neue Einheit mit einer (Phenylmethyl)sulfanyl-Struktur in einer substituierten oder unsubstituierten Seitenkette davon aufweist.
Diese Aufgaben werden durch das Polyhydroxyalkanoat gemäß Anspruch 1 und das Verfahren zur Produktion eines Polyhydroxyalkanoats nach Anspruch 9 gelöst. Die anderen Ansprüche betreffen Weiterentwicklungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das ¹H NMR-Spektrum eines in Beispiel 1 erhaltenen Polyhydroxyalkanoats;
2 zeigt das ¹³C NMR-Spektrum des in Beispiel 1 erhaltenen Polyhydroxyalkanoats;
3 zeigt das ¹H NMR-Spektrum eines in Beispiel 10 erhaltenen Polyhydroxyalkanoats;
4 zeigt das ¹H NMR-Spektrum eines in Beispiel 19 erhaltenen PHA;
5 zeigt das ¹³C NMR-Spektrum des in Beispiel 19 erhaltenen PHA; und
6 zeigt das ¹H NMR-Spektrum eines in Beispiel 29 erhaltenen PHA.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Das neue erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat weist eine substituierte oder unsubstituierte (Phenylmethyl)sulfanyl-Struktur an der Seitenkette einer Hydroxyalkansäure-Einheit auf. Diese Struktur sorgt für physikalische und chemische Eigenschaften, die sich von denen bekannter mikrobieller Polyhydroxyalkanoate deutlich unterscheiden.
Das neue erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat kann durch die folgenden Schritte produziert werden:
Züchten eines PHA produzierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das ein Wachstumssubstrat und eine substituierte oder unsubstituierte ω-[(Phenylmethyl)sulfanyl]alkansäure als Einsatzmaterial enthält; und
Gewinnen des Polyhydroxyalkanoats, das Einheiten mit einer substituierten oder unsubstituierten (Phenylmethyl)sulfanylgruppe am Ende ihrer Seitenkette enthält,
wobei die Polyhydroxyalkanoate während des Züchtungsschritts vom Mikroorganismus produziert und im Mikroorganismus gespeichert werden. Bei den mikrobiellen PHA sind die Kohlenstoffatome in der Position 3 aller 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten, einschließlich jener der chemischen Formel (1), asymmetrische Kohlenstoffatome, deren absolute Konfiguration die R-Konfiguration ist, womit auf deren biologische Abbaubarkeit hingewiesen wird.
Beispiele des Halogenatoms im Substituenten R am Benzolring in den vorstehenden allgemeinen Formeln (1) und (10) schließen Fluor, Chlor und Brom ein.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend ausführlicher beschrieben.
PHA produzierende Mikroorganismen
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von PHA können irgendwelche Mikroorganismen verwendet werden, um ein PHA zu produzieren, das eine Einheit mit einer substituierten oder unsubstituierten (Phenylmethyllsulfanylgruppe am Ende seiner Seitenkette enthält, die mit der chemischen Formel (1) angegeben wird (hier nachfolgend als das betreffende PHA bezeichnet), sofern sie das betreffende PHA produzieren und in den Zellen speichern können, wenn sie in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das eine entsprechende ω-[(Phenylmethyl)sulfanyl]alkansäure der chemischen Formel (10) als Ursprungsverbindung enthält. Die Mikroorganismen können zum Beispiel jene sein, die zur Gattung Pseudomonas gehören, die die Fähigkeiten aufweisen, PHA zu produzieren.
Zu Beispielen geeigneter Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas gehören die folgenden drei Stämme: Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375), Pseudomonas cichorii H45 (FERM BP-7374) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-73761. Diese drei Mikroorganismen wurden vom Anmelder zuerst als nationale Hinterlegung hinterlegt und sind gemäß dem Budapester Vertrag unter den vorstehend genannten Zugangsnummern beim International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Independent Administrative Institution, Ministry of Economy, Trade and Industry 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan (vorher National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH) of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry) als internationale Hinterlegung hinterlegt. Sie sind auch in der japanischen Patentanmeldung Nr. 11-371863 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2001-178484) als neue Stämme beschrieben, die PHA produzieren können.
Die bakteriologischen Eigenschaften der Stämme YN2, H45 und P161 sind nachfolgend aufgeführt.
<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms YN2>
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Stäbchen, 0,8 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie die Zellen: negativ
Mobilität: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; vollständiger glatter Rand; wenig konvex; glatte Oberfläche; glänzend; durchscheinend

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ (nicht fermentierend)
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: positiv
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihyclrolase: negativ
Unease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Produktion eines fluoreszierenden Pigments auf King B-Agar: positiv
Wachstum unter 4 % NaCl: positiv (geringes Wachstum)
Speicherung von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ
Tween 80-Hydrolyse: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms H45>
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Stäbchen, 0,8 μm × 1,0 bis 1,2 μm
Polymorphie der Zellen: negativ
Mobilität: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; vollständiger glatter Rand; wenig konvex; glatte Oberfläche; glänzend; cremefarben

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Unease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Produktion eines fluoreszierenden Pigments auf King B-Agar: positiv
Wachstum unter 4 % NaCl: negativ
Speicherung von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negaativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms P161>
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Grüße der Zellen: Sphäre, ∅ 0,6 μm, Stäbchen 0,6 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zellen: längliche Form
Mobilität: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; vollständiger glatter Rand; wenig konvex; glatte Oberfläche; glänzend; schwachgelb

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: positiv
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihyclrolase: positiv
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Produktion eines fluoreszierenden Pigments auf King B-Agar: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Züchtung
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von PHA durch Züchtung des vorstehend genannten Mikroorganismus, der PHA in einem Kulturmedium produzieren kann, das ω-[(Phenylmethyl)sulfanyl]alkansäure der vorstehenden chemischen Formel (10) als Einsatzmaterial enthält, wird ein PHA der chemischen Formel (1), das 3-Hydroxyalkanat-Einheiten mit einer substituierten oder unsubstituierten (Phenylmethyl)sulfanylgruppe am Ende ihrer Seitenkette enthält, produziert und in den Zellen gespeichert.
Für die übliche Züchtung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen, zum Beispiel für die Herstellung von Vorratsstämmen oder für die Gewinnung von Zellen oder den Erhalt der Aktivitäten, die bei der PHA-Produktion erforderlich sind, werden die Kulturmedien so ausgewählt, daß sie für die Proliferation der verwendeten Mikroorganismen erforderliche Bestandteile enthalten. Es kann zum Beispiel irgendeins der bekannten Kulturmedien, wie typische naturliche Kulturmedien (zum Beispiel Nährbouillon, Hefeextrakt) und synthetische Kulturmedien, die mit Nährstoffen ergänzt sind, verwendet werden, sofern das Kulturmedium das Wachstum und Überleben der Mikroorganismen nicht nachteilig beeinflußt. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, Belüftung und Bewegung, werden in Abhängigkeit von den verwendeten Mikroorganismen geeignet ausgewählt.
Um das betreffende PHA unter Verwendung des wie vorstehend beschriebenen, PHA produzierenden Mikroorganismus zu produzieren, kann ein anorganisches Kulturmedium verwendet werden, das zumindest ein Wachstumssubstrat für den Mikroorganismus und eine Verbindung der vorstehenden chemischen Formel (10), die der Monomereinheit entspricht, als Einsatzmaterial für die PHA-Produktion enthält. Es ist erwünscht, daß die Verbindung der vorstehenden chemischen Formel (10) in einer Menge von 0,01 bis 1 % (Gew./Vol.) und stärker bevorzugt von 0,02 bis 0,2 % pro Kulturmedium enthalten ist. Die Verbindung der chemischen Formel (10) ist nicht immer gut wasserlöslich. Bei den hier angegebenen Mikroorganismen würde jedoch eine Suspension nicht zu Problemen führen.
Die Ausgangsverbindung der chemischen Formel (10) kann dem Kulturmedium in einigen Fällen als Lösung oder Suspension in einem Lösungsmittel, wie 1-Hexadecen oder n-Hexadecan, zugesetzt werden, um das Dispersionsvermögen zu verbessern. In einem solchen Fall muß die Konzentration des Lösungsmittels gleich oder kleiner als 3 % (V./V.) in bezug auf die Lösung des Kulturmediums sein.
Es ist bevorzugt, dem Kulturmedium ein Wachstumssubstrat für die Proliferation der Mikroben getrennt zuzusetzen. Als Wachstumssubstrat können Nährstoffe, wie Hefeextrakt, Polypepton und Fleischextrakt, verwendet werden. Das Wachstumssubstrat kann auf der Basis der Nützlichkeit als Substrat für den zu verwendenden Stamm aus Sacchariden, im TCC-Zyklus erzeugten organischen Säuren, organischen Säuren oder Salzen davon, die durch biochemische Reaktionen einen oder zwei Schritte nach dem TCC-Zyklus erzeugt wurden, Aminosäuren oder Salzen davon, geradkettigen C₄-C₁₂-Alkansäuren oder Salzen davon ausgewählt werden.
Es können ein oder mehrere Saccharide geeignet verwendet werden, die aus Aldosen, wie Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Fructose; Alditolen, wie Glycerol, Erythritol und Xylitol; Aldonsäuren, wie Gluconsäure; Uronsäure, wie Glucuronsäure und Galacturonsäure; und Disaccharid, wie Maltose, Saccharose und Lactose, ausgewählt sind.
Als organische Säuren oder Salze davon können geeignet eine oder mehrere Verbindungen aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succinsäure und Salzen davon ausgewählt werden.
Als Aminosäuren oder Salze davon können geeignet ein oder mehrere Verbindungen aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon ausgewählt werden.
Davon sind Polypepton und Saccharide bevorzugt. Zu bevorzugten Sacchariden gehört zumindest eins, das aus Glucose, Fructose und Mannose ausgewählt ist. Das Substrat ist im Kulturmedium vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 5 % (Gew./Vol.) und vorzugsweise von 0,2 bis 2 % enthalten.
Die Produktivität für das mikrobielle PHA wird gelegentlich verbessert, wenn der Mikroorganismus vollständig gewachsen ist und dann in ein Kulturmedium übertragen wird, in dem eine Stickstoffquelle, wie Ammoniumchlorid, begrenzt ist, und dem eine Verbindung zugesetzt wurde, die als ein Substrat für das PHA dient. Es kann zum Beispiel eine Methode mit mehreren Schritten angewendet werden, bei der zwei oder mehr Schritte nacheinander unter unterschiedlichen Züchtungsbedingungen durchgeführt werden.
Insbesondere wird ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine Verbindung der chemischen Formel (10) und Polypepton enthält, bis zu einer Phase zwischen der späten logarithmischen Phase und der stationären Phase gezüchtet (Schritt 1-1) und dann zum Beispiel durch Zentrifugieren aufgefangen. Danach wird der im Schritt 1 gezüchtete Mikroorganismus in einem Kulturmedium weiter gezüchtet, das eine Verbindung der chemischen Formel (10) und eine organische Säure oder ein Salz davon enthält, wie es vorstehend beschrieben ist (vorzugsweise ohne eine Stickstoffquelle) (Schritt 1-2). Nach einer anderem Ausführungsform wird der Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine Verbindung der chemischen Formel (10) und ein wie vorstehend angegebenes Saccharid enthält, bis zu einer Phase zwischen der späten logarithmischen Phase und der stationären Phase gezüchtet (Schritt 1-3) und zum Beispiel durch Zentrifugieren gewonnen. Danach wird der im Schritt 1 gezüchtete Mikroorganismus in einem Kulturmedium weiter gezüchtet, das die Verbindung der chemischen Formel (10) und ein wie vorstehend angegebenes Saccharid enthält (vorzugsweise ohne eine Stickstoffquelle) (Schritt 1-4). Beim ersten Schritt dieses Züchtungsverfahrens mit zwei Schritten können die Zellen wachsen, wobei das betreffende PHA aus der Ausgangsverbindung mit der vorstehenden allgemeinen Formel (10) produziert wird. Beim zweiten Schritt setzen die ausreichend gewachsenen Zellen die Produktion von PHA im Kulturmedium fort, das keine Stickstoffquelle enthält, so daß die in den Zellen gespeicherte PHA-Menge zunimmt.
Die Züchtungstemperatur sollte eine Temperatur sein, bei der die vorstehend genannten Stämme gut wachsen können. Die Züchtungstemperatur kann zum Beispiel 15 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 35°C und stärker bevorzugt 20 bis 30°C betragen.
Die Züchtung kann nach irgendwelchen geeigneten Züchtungsverfahren, wie als Flüssig- oder Festkultur, durchgeführt werden, durch die die vorstehend genannten Mikroorganismen wachsen können, so daß Polyhydroxyalkanoate produziert werden. Die Art der Kultur ist nicht begrenzt, sofern geeignet Sauerstoff zugeführt wird. Zu Beispielen gehören eine Batch-Kultur, eine Fedbatch-Kultur, eine halbkontinuierliche Kultur und eine kontinuierliche Kultur. Bei der Batch-Flüssigkultur kann Sauerstoff zugeführt werden, indem der Inhalt eines Schüttelkolbens geschüttelt wird. Nach einer anderen Ausführungsform kann der Sauerstoff mit einem Verfahren zum Bewegen-Belüften zugeführt werden, wobei ein Fermentor benutzt wird.
Als anorganisches Kulturmedium, das für das vorstehend genannte Züchtungsverfahren verwendet werden soll, kann irgendein Kulturmedium benutzt werden, das Bestandteile enthält, die für die Proliferation der Mikroorganismen erforderlich sind, wie eine Phosphorquelle (zum Beispiel Phosphate) und eine Stickstoffquelle (zum Beispiel Ammoniumsalze, Nitrate). Es können zum Beispiel das Medium MSB und das Medium M9 verwendet werden.
Nachfolgend ist die Zusammensetzung eines anorganischen Kulturmediums (Medium M9) aufgeführt, das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. (Medium M9)

Na₂HPO₄ 6,2 g

KH₂PO₄ 3,0 g

NaCl 0,5 g

NH₄Cl 1,0 g

(in 1 Liter Kulturmedium; pH = 7,0).
Um eine gute Proliferation und Produktion der Polyhydroxyalkanoate zu sichern, ist es erforderlich, dem vorstehend genannten anorganischen Kulturmedium eine Lösung von Spurenkomponenten, die nachfolgend angegeben ist, in einer Menge von etwa 0,3 % (V./V.) zuzusetzen. (Lösung von Spurenkomponenten)

Nitrilotriessigsäure: 1,5 g

MgSO₄: 3,0 g

MnSO₄: 0,5 g

NaCl: 1,0 g

FeSO₄: 0,1 g

CaCl₂: 0,1 g

CoCl₂: 0,1 g

ZnSO₄: 0,1 g

CuSO₄: 0,1 g

AlK(SO₄)₂: 0,1 g

H₃BO₃: 0,1 g

Na₂MoO₄: 0,1 g

NiCl₂: 0,1 g

(1 Liter Lösung; pH = 7,0)
Gewinnung des PHA
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus produziert das betreffende PHA und speichert es in den Zellen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von PHA ist folglich nach der Züchtung ein Schritt zur Gewinnung des betreffenden PHA aus den Zellen vorgesehen.
Um das PHA aus den Zellen zu gewinnen, wird ein Lösungsmittelextraktionsverfahren angewendet, bei dem das löslichgemachte Polyhydroxyalkanaot von den unlöslichen Zellkomponenten abgetrennt wird. Ein übliches Extraktionsverfahren mit Chloroform ist am bequemsten und einfach, es kann jedoch ein von Chloroform verschiedenes Lösungsmittel, wie Dichlormethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril und Aceton, verwendet werden.
In Umgebungen, in denen die Verwendung eines organischen Lösungsmittels problematisch ist, werden sich von den Polyhydroxyalkanoaten unterscheidende Komponenten der Stämme entfernt, indem zum Beispiel mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie SDS, mit einem Enzym, wie Lysozym, oder mit EDTA behandelt wird, und die Zellkomponenten werden entfernt, so daß nur die Polyhydroxyalkanoate gewonnen werden. Nach einer anderen Ausführungsform kann man eine Behandlung zum Aufbrechen der Zellen, wie das Aufbrechen mittels Ultraschall, Homogenisieren, Aufbrechen mittels Druck, Aufbrechen mit Glaskügelchen, Zerreiben, Mahlen und Gefrieren-Auftauen, anwenden, um die in den Zellen gespeicherten Polyhydroxyalkanoate abzutrennen und zu gewinnen.
Es sollte selbstverständlich sein, daß die erfindungsgemäße Züchtung der Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Produktion der Polyhydroxyalkanoate durch die Mikroorganismen und die Speicherung der Polyhydroxyalkanoate in der Zelle und die Gewinnung der Polyhydroxyalkanoate aus der Zelle nicht auf die vorstehend genannten Techniken und Verfahren begrenzt sind.
Die Polyhydroxyalkanoate, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren von den Mikroorganismen produziert werden, können zusätzlich zu den Einheiten der chemischen Formel (1) 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten der chemischen Formel (4) oder 3-Hydroxyalk-5-ensäure-Einheiten der chemischen Formel (5) enthalten, die über das Fettsäuresynthesesystem biosynthetisiert werden, wobei das dem Kulturmedium zuzusetzende Wachstumssubstrat benutzt wird. Die Kohlenstoffatome in der Position 3 aller enthaltenen 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten sind asymmetrische Kohlenstoffatome, deren absolute Konfiguration die R-Konfiguration ist, was auf deren biologische Abbaubarkeit hinweist. Das Vorhandensein der (Phenylmethyl)sulfanylgruppe in den Einheiten der chemischen Formel (1) und das Vorhandensein der verschiedenen Substituenten, die sich an deren Benzolring befinden, statten die Polymere mit neuen physikalischen und chemischen Eigenschaften aus. Es werden Verbesserungen der physikalischen Eigenschaften solcher Polymere erwartet. Die Verwendung der Polymere kann auf Gebiete ausgedehnt werden, auf denen sie in der Vergangenheit nicht eingesetzt werden konnten.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf deren Beispiele besonders beschrieben, sie sollte jedoch nicht darauf begrenzt sein. In den folgenden Beispielen sind die Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, wenn es nicht anders angegeben ist.
Beispiel 1
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyllsulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 159 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse bei folgenden Bedingungen unterzogen.
<Spektrometer>

FT-NMR: Bruker DPC 400 mit Spektrometerfrequenzen von 400 MHz für ¹H-NMR und 100 MHz für ¹³C.

<Bedingungen>

Kernspezies: ¹H, ¹³C

Lösungsmittel: CDCl³

Temperatur: Raumtemperatur
Die 1 und 2 zeigen die ¹H-NMR-Spektren bzw. die ¹³C-NMR-Spektren des Polyhydroxyalkanoats. Deren Identifizierungsergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
TABELLE 1
TABELLE 2
Wie aus den Tabellen 1 und 2 klar ersichtlich ist, wurde bestätigt, daß das Polyhydroxyalkanoat eines der folgenden chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 85,9 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyllsulfanyl]valerat enthielt.
Das Molekulargewicht des Polyhydroxyalkanoats wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; TOSOH HLC-8220, Säule: TOSOH TSK-GEL SuperHM-H (Handelsbezeichnung), Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Als Ergebnis betrugen das Mn = 14.400 und das Mw = 56.700.
Beispiel 2
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 138 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 95,2 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 3
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 47 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 164 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 96,7 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 4
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 161 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 83,8 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 5
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 113 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 96,2 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyllsulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 6
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 126 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 89,8 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 7
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,1 % Nonansäure und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 90 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 29,2 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 8
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 103 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 96,0 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 9
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Natriumglutamat und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 87 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (16) ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 86,4 Mol-% 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat enthielt.
Tabelle 3 zeigt das Trockengewicht der Zellen, das Trockengewicht des Polymers, das Verhältnis zwischen Polymer und Zellen, auf das Trockengewicht bezogen, und die Menge (Mol-%) der Einheit in Form von 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat (als "3HBzyTV" abgekürzt) im entstandenen Polymer der Beispiele 1 bis 9. TABELLE 3
Beispiel 10
Verfahren zur Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat enthält Pseudomonas cichorii NY2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 Hefeextrakt und 0,1 % 4-[(Phenylmethyl)sulfanyl]buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 39 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des entstandenen PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; TOSOH HLC-8220 (Handelsbezeichnung), Säule: TOSOH TSK-GEL SuperHM-H (Handelsbezeichnung), Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Als Ergebnis betrugen das Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 44.500 und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 106.800.
Um die Struktur des erhaltenen PHA festzustellen, wurde das PHA der NMR-Analyse unter folgenden Bedingungen unterzogen.
<Spektrometer>

FT-NMR: Bruker DPC 400 mit einer Spektrometerfrequenz von 400 MHz für ¹H-NMR

<Bedingungen>

Kernspezies: ¹H

Lösungsmittel: CDCl₃

Bezug: TMS/CDCl₃ in einer Kapillare

Temperatur: Raumtemperatur
3 zeigt die gemessenen ¹H-NMR-Spektren, und deren Identifizierungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 aufgeführt.
TABELLE 4
Die in Tabelle 4 aufgeführten Ergebnisse bestätigen, daß dieses Polyhydroxyalkanoat als Monomereinheiten 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat und 3-Hydroxyalkanoate und/oder 3-Hydroxyalkenoate enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure oder 3-Hydroxyvaleriansäure. Insbesondere hat das PHA eine Struktur, die mit der folgenden chemischen Formel (17) angegeben wird:
Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 85,4 Mol-% 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat enthielt.
Beispiel 11
Pseudomonas cichorii NY2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,1 % Nonansäure und 0,1 % 4-[(Phenylmethyllsulfanyl]buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 68 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (17) ist, das eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten enthält, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure oder 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 27,7 Mol-% 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyllsulfanyl]butyrat enthielt.
Beispiel 12
Pseudomonas cichorii NY2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Natriumglutamat und 0,1 % 4-[(Phenylmethyl)sulfanyl]buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 72 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den Bedingungen von Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (17) ist. Das Polyhydroxyalkanoat umfaßt eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene Polyhydroxyalkanoat 50,3 Mol-% einer 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat-Monomereinheit enthielt.
Beispiel 13
Pseudomonas cichorii NY2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 4-[(Phenylmethyl)sulfanyl]buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 4-[(Phenylmethyl)sulfanyl]buttersäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl), enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Zellen wurden gewogen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 148 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den Bedingungen von Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat das Polyhydroxyalkanoat der chemischen Formel (17) ist. Das Polyhydroxyalkanoat umfaßt eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene Polyhydroxyalkanoat 66,7 Mol-% der 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat-Monomereinheit enthielt.
Beispiel 14
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 20 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den Bedingungen von Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (17) ist. Das Polyhydroxyalkanoat umfaßt eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene Polyhydroxyalkanoat 57,2 Mol-% einer 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyllsulfanyl]butyrat-Monomereinheit enthielt.
Beispiel 15
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl), enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 64 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den Bedingungen von Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (17) ist. Das Polyhydroxyalkanoat umfaßt eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene Polyhydroxyalkanoat 31,6 Mol-% einer 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat-Monomereinheit enthielt.
Tabelle 5 zeigt das Trockengewicht der Zellen, das Trockengewicht des Polymers, das auf das Trockengewicht bezogene Verhältnis zwischen Polymer und Zellen und die Menge (Mol-%) von 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat (als "3HBzyTB"-Einheit abgekürzt) im entstandenen Polymer der Beispiele 10 bis 15.
TABELLE 5
Verfahren zur Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthält
Beispiel 16
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[[(4-Methylphenyl)methyl]sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[[14-Methylphenyl)methyl]sulfanyl]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl), enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 96 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den Bedingungen von Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (18) ist. Das Polyhydroxyalkanoat umfaßt eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-[[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl]valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene Polyhydroxyalkanoat 41,0 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Das Molekulargewicht des entstandenen Polyhydroxyalkanoats wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; TOSOH HLC-8220, Säule: TOSOH TSK-GEL SuperHM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Als Ergebnis betrugen das Mn = 21.500 und das Mw = 83.200.
Beispiel 17
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[[(4-Methylphenyl)methyl]sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[[(4-Methylphenyl)methyl]sulfanyl]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl), enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 82 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den Bedingungen von Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (18) ist. Das Polyhydroxyalkanoat umfaßt eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-[[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl]valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene Polyhydroxyalkanoat 56,2 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-[[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl]valerat enthielt.
Beispiel 18
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[[(4-Methylphenyl)methyl]sulfanyl]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[[(4-Methyllahenyllmethyl]sulfanyl]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl), enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 75 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat wurde der NMR-Analyse unter den Bedingungen von Beispiel 10 unterzogen. Als Ergebnis wurde deutlich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat eines der chemischen Formel (18) ist. Das Polyhydroxyalkanoat umfaßt eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-[((4-methylphenyl)methyl]sulfanyl]valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten, die gesättigten/ungesättigten Fettsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen entsprechen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene Polyhydroxyalkanoat 38,8 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-[[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Tabelle 6 zeigt das Trockengewicht der Zellen, das Trockengewicht des Polymers, das auf das Trockengewicht bezogene Verhältnis zwischen Polymer und Zellen und die Menge (Mol-%) der Einheit in Form von 3-Hydroxy-3-hydroxy-5-{[14-methylphenyllmethyl]sulfanyl}valerat (als "3HMBzyTV" abgekürzt) im entstandenen Polymer der Beispiele 16 bis 18.
TABELLE 6
Beispiel 19
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen festgestellt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der einzige Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 106 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des entstandenen PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; TOSOH HLC-8220, Säule: TOSOH TSK-GEL SuperHM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Als Ergebnis betrugen das Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 32.000 und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 96.000.
Um die Struktur des erhaltenen PHA festzustellen, wurde das PHA der NMR-Analyse unter folgenden Bedingungen unterzogen.
<Spektrometer>

FT-NMR: Bruker DPC 400 mit Spektrometerfrequenzen von 400 MHz für ¹H-NMR und 100 MHz für ¹³C-NMR.

<Bedingungen>

Kernspezies: ¹H, ¹³C

Lösungsmittel: CDCl₃

Temperatur: Raumtemperatur
4 zeigt die gemessenen ¹H-NMR-Spektren. Deren Identifizierungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 7 aufgeführt.
5 zeigt die gemessenen ¹³C-NMR-Spektren. Deren Identifizierungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 8 aufgeführt.
TABELLE 7
TABELLE 8
Laut der in den Tabellen 7 und 8 aufgeführten Ergebnisse umfaßt das PHA eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure. Insbesondere hat das PHA die mit der folgenden chemischen Formel (19) angegeben Struktur:
Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene PHA 76,7 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{((4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 20
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,1 % Nonansäure und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen festgestellt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 89 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Anhand der Ergebnisse der NMR-Analyse wurde deutlich, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 27,0 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 21
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (DIFCO) und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl)sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch in diesem Beispiel 69 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Anhand der Ergebnisse der NMR-Analyse wurde deutlich, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl)sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 76,7 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 22
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Natriumglutamat und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyllmethyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C geführt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch in diesem Beispiel 68 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 19 unterzogen. Anhand der Ergebnisse der NMR-Analyse wurde deutlich, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 90,3 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 23
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NC₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 164 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 85,9 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 24
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl)sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-{[(4-Fluorplhenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NC₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 138 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 90,7 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 25
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NC₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 138 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 88,5 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 26
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NC₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 125 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 89,5 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 27
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NC₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen festgestellt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 154 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 97,9 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Beispiel 28
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NC₄Cl) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 158 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 19 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (19) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 91,6 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat enthielt.
Tabelle 9 zeigt das Trockengewicht der Zellen, das Trockengewicht des Polymers, das auf das Trockengewicht bezogene Verhältnis zwischen Polymer und Zellen und die Menge der Einheit in Form von 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat (als "3HFBzyTV" abgekürzt) im entstandenen PHA-Polymer der Beispiele 19 bis 28 in Mol-%.
TABELLE 9
Verfahren zur Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure umfaßt
Beispiel 29
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (DIFCO) und 0,1 % 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde erfaßt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 41 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden. Das durchschnittliche Molekulargewicht des entstandenen PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; TOSOH HLC-8220, Säule: TOSOH TSK-GEL SuperHM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Als Ergebnis betrugen das Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 15.300 und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 37.100.
Um die Struktur des erhaltenen PHA festzustellen, wurde das PHA der NMR-Analyse unter folgenden Bedingungen unterzogen.
<Spektrometer>

FT-NMR: Bruker DPC 400 mit Spektrometerfrequenzen von 400 MHz für ¹H-NMR

<Bedingungen>

Kernspezies: ¹H

Lösungsmittel: CDCl₃

Bezug: TMS/CDCl₃ in einer Kapillare

Temperatur: Raumtemperatur
6 zeigt die gemessenen ¹H-NMR-Spektren. Deren Identifizierungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 10 aufgeführt.
TABELLE 10
Anhand der in Tabelle 10 aufgeführten Ergebnisse umfaßt das betreffende PHA eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanaoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat. Insbesondere hat das PHA eine Struktur, die mit der folgenden chemischen Formel (20) angegeben wird.
Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das entstandene PHA 89,8 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat enthielt.
Beispiel 30
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,1 % Nonansäure und 0,1 % 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet und gewogen, um das Gewicht der getrockneten Zellen festzustellen.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 45 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 29 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (20) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 10,6 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4- fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat enthielt.
Beispiel 31
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Natriumglutamat und 0,1 % 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet und gewogen.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 11 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 29 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (20) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 84,1 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4- fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat enthielt.
Beispiel 32
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 4-{[[4-Fluormethyl]phenyl]methyl}sulfanyl]buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 4-{[[4-Fluormethyl]phenylyl)methyl}sulfanyl]buttersäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und es wurde das Gewicht der trockenen Zellen bestimmt.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 153 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 29 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (20) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 68,5 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat enthielt.
Beispiel 33
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen bestimmt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 38 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 29 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (20) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 43,1 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat enthielt.
Beispiel 34
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurde das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen bestimmt (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit eine Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 47 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das erhaltene PHA wurde der NMR-Analyse und der Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts unter den Bedingungen von Beispiel 29 unterzogen. Die Ergebnisse der NMR-Analyse zeigen, daß das PHA in diesem Beispiel eine Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat und andere Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxyalkanoaten und/oder 3-Hydroxyalkenoaten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybutyrat oder 3-Hydroxyvalerat, umfaßt, wodurch bestätigt wurde, daß es einen Aufbau aufweist, der mit der chemischen Formel (20) angegeben wird. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das PHA dieses Beispiels 48,7 Mol-% einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat enthielt.
Tabelle 11 zeigt das Trockengewicht der Zellen, das Trockengewicht des Polymers, das auf das Trockengewicht bezogene Verhältnis zwischen Polymer und Zellen und die Menge der Einheit in Form von 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat (als "3HFBzyTB" abgekürzt) im entstandenen PHA-Polymer der Beispiele 29 bis 34 in Mol-%.
TABELLE 11

Claims

Polyhydroxyalkanoat, umfassend eine Einheit der folgenden chemischen Formel (1):
worin R1 ein Substituent eines aromatischen Rings ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus CH₃, C₂H₅, CH₃CH₂CH₂, (CH₃)₂CH, (CH₃)₃C, einem Halogenatom, CN, NO₂, COOR' und SO₂R'', wobei R' aus der Gruppe von H, Na, K, CH₃ und C₂H₅ ausgewählt ist und R'' aus der Gruppe von OH, einem Halogenatom, ONa, OK, OCH₃ und OC₂H₅ ausgewählt ist; und x für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht, die im Polyhydroxyalkanoat gleich oder voneinander verschieden ist, mit der Maßgabe, daß das Polyhydroxyalkanoat nicht aus zwei Einheiten der folgenden chemischen Formel (2) und (3) besteht:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat ferner eine oder mehrere Einheiten umfaßt, die aus der Gruppe von Einheiten der folgenden chemischen Formeln (4) und (5) ausgewählt sind:
worin y eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist und z die ganze Zahl 3 oder 5 ist.
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Einheit aus 3-Hydroxy-5-[(phenylrnethyl)sulfanyl]valerat der folgenden chemischen Formel (2) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Einheit aus 3-Hydroxy-4-[(phenylmethyl)sulfanyl]butyrat der folgenden chemischen Formel (6) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Einheit aus 3-Hydroxy-5-{[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl}valerat der folgenden chemischen Formel (7) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Einheit aus 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat der folgenden chemischen Formel (8) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Einheit aus 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat der folgenden chemischen Formel (9) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat ein Zahlenmittel des Molekulargewichts im Bereich von 5.000 bis 300.000 hat.
Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, das eine Einheit der folgenden chemischen Formel (1) umfaßt:
worin R1 ein Substituent eines aromatischen Rings ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus H, CH₃, C₂H₅, CH₃CH₂CH₂, (CH₃)₂CH, (CH₃)₃C, einem Halogenatom, CN, NO₂, COOR' und SO₂R'', wobei R' aus der Gruppe von H, Na, K, CH₃ und C₂H₅ ausgewählt ist und R'' aus der Gruppe von OH, einem Halogenatom, ONa, OK, OCH₃ und OC₂H₅ ausgewählt ist; und x für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht, die im Polyhydroxyalkanoat gleich oder voneinander verschieden ist, das die folgenden Schritte aufweist: Züchten eines Polyhydroxyalkanoat produzierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das ein Wachstumssubstrat für die mikrobielle Proliferation und eine Verbindung der folgenden chemischen Formel (10) enthält:
worin R2 ein Substituent eines aromatischen Rings ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus H, CH₃, C₂H₅, CH₃CH₂CH₂, (CH₃)₂CH, (CH₃)₃C, einem Halogenatom, CN, NO₂, COOR' und SO₂R'', wobei R' aus der Gruppe von H, Na, K, CH₃ und C₂H₅ ausgewählt ist und R'' aus der Gruppe von OH, einem Halogenatom, ONa, OK, OCH₃ und OC₂H₅ ausgewählt ist; und k für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht, und Abtrennen des Polyhydroxyalkanoats von den Zellen des in diesem Züchtungsschritt gezüchteten Mikroorganismus, wobei sich die Verbindung vom Wachstumssubstrat unterscheidet und das Wachstumssubstrat zumindest eine Verbindung aus der Gruppe von Polypepton, Hefeextrakt, einem Saccharid, einer organischen Säure oder einem Salz davon, einer Aminosäure oder einem Salz davon und einer geradkettigen Alkansäure mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einem Salz davon umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Polyhydroxyalkanoat ferner eine oder mehrere Einheiten umfaßt, die aus der Gruppe von Einheiten der folgenden chemischen Formeln (4) und (5) ausgewählt sind:
worin y eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist und z die ganze Zahl 3 oder 5 ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Kulturmedium Polypepton enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Kulturmedium Hefeextrakt enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Kulturmedium ein Saccharid enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Saccharid eine oder mehrere Verbindungen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Glycerol, Erythritol, Xylitol, Gluconsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Maltose, Saccharose und Lactose besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei das Kulturmedium eine organische Säure oder ein Salz davon enthält und die organische Säure oder das Salz davon eine oder mehrere Verbindungen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succinsäure und Salzen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Kulturmedium eine Aminosäure oder ein Salz davon enthält und die Aminosäure oder das Salz davon eine oder mehrere Verbindungen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei das Kulturmedium eine geradkettige Alkansäure mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Salz davon enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei die Züchtung des Mikroorganismus zwei oder mehr Züchtungsschritte umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Kulturmedium in den Schritten nach dem ersten Schritt keine Stickstoffquelle enthält.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Züchtungsschritt die folgenden Schritte umfaßt: (1-1) Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das zumindest eine Verbindung der chemischen Formel (10) und Polypepton enthält; (1-2) weiteres Züchten des Mikroorganismus vom Schritt 1-1 in einem Kulturmedium, das die Verbindung der chemischen Formel (10) und eine organische Säure oder ein Salz davon enthält.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die organische Säure oder ein Salz davon eine oder mehrere Verbindungen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succinsäure oder Salzen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Züchtungsschritt die folgenden Schritte umfaßt: (1-3) Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das zumindest eine Verbindung der chemischen Formel (10) und ein Saccharid enthält; und (1-4) Züchten des Mikroorganismus vom Schritt 1-3 in einem Kulturmedium, das die Verbindung der chemischen Formel (10) und ein Saccharid enthält.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Saccharid eine oder mehrere Verbindungen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Glycerol, Erythritol, Xylitol, Gluconsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Maltose, Saccharose und Lactose besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 5-[(Phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure der folgenden chemischen Formel (11) enthält, so daß ein Polyhydroxyalkanoat produziert wird, das eine Einheit aus 3-Hydroxy-5-[phenylmethyl)sulfanyl]valerat der folgenden chemischen Formel (2) umfaßt:
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 4-[(Phenylmethyl)sulfanyl]buttersäure der folgenden chemischen Formel (12) enthält, so daß ein Polyhydroxyalkanoat produziert wird, das eine Einheit aus 3-Hydraxy-4-[phenylmethyl)sulfanyl]butyrat der folgenden chemischen Formel (6) umfaßt:
Vefahren nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 5-{[(4-Methylphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure der folgenden chemischen Formel (13) enthält, so daß ein Polyhydroxyalkanoat produziert wird, das eine Einheit aus 3-Hydroxy-5-{[(4-methylphenyl)methyl]sulfanyl}valerat der folgenden chemischen Formel (7) umfaßt:
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 5-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure der folgenden chemischen Formel (14) enthält:
so daß ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das eine Einheit aus 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valerat der folgenden chemischen Formel (8) umfaßt:
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 4-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}buttersäure der folgenden chemischen Formel (15) enthält:
so daß ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das eine Einheit aus 3-Hydroxy-4-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}butyrat der folgenden chemischen Formel (9) umfaßt:
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 28, wobei der Schritt des Abtrennens des Polyhydroxyalkanoats einen Schritt der Behandung mit einem Lösungsmittel umfaßt, so daß das Polyhydroxyalkanoat, das in den Zellen des Mikroorganismus gespeichert wurde, der im Züchtungsschritt gezüchtet worden ist, löslich gemacht und herausgelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Lösungsmittel ein Lösungsmittel oder mehrere Lösungsmittel aus der Gruppe von Chloroform, Dichlormethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril und Aceton ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 30, wobei der Schritt des Abtrennens des Polyhydroxyalkanoats einen Schritt umfaßt, bei dem die Zellen des Mikroorganismus aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zellen durch Aufbrechen mittels Ultraschall, Homogenisieren, Aufbrechen mittels Druck, Aufbrechen mittels Glaskügelchen, Zerreiben, Mahlen oder Gefrieren-Auftauen aufgebrochen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 32, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Pseudomonas gehört.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört, aus der Gruppe von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375), Pseudomonas cichorii N45 (FERM BP-7374) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-7376) ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 19, wobei das Kulturmedium das Wachstumssubstrat in einer Menge von 0,1 bis 5 (Gew./Vol.) enthält.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Kulturmedium das Wachstumssubstrat in einer Menge von 0,2 bis 2 (Gew./Vol.) enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 21, wobei das Kulturmedium die Verbindung der Formel (10) in einer Menge von 0,01 bis 1 % (Gew./Vol.) enthält.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Kulturmedium die Verbindung der Formel (10) in einer Menge von 0,02 bis 0,2 % (Gew./Vol.) enthält.