DE60034543T2

DE60034543T2 - Polyhydroxyalkanoate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung mittels Mikroorganismen

Info

Publication number: DE60034543T2
Application number: DE60034543T
Authority: DE
Inventors: Tsutomu Ohta-ku Honma; Toyoko Ohta-ku Kobayashi; Tetsuya Ohta-ku Yano; Shin Ohta-ku Kobayashi; Takeshi Ohta-ku Imamura; Sakae Ohta-ku Suda; Takashi Ohta-ku Kenmoku
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2020-12-28
Also published as: US6521429B2; JP2001288256A; ATE360657T1; US20030180899A1; KR100487553B1; US20010029039A1; EP1118629A2; KR20010082606A; KR20040010425A; EP1118629A3; DE60034543D1; EP1118629B1; CN1260265C; KR100487554B1; CN1322768A; JP3673711B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polyhydroxyalkanoat (PHA) sowie auch ein Verfahren zur Herstellung eines solchen neuen PHA unter Verwendung von Mikroorganismen.
Einschlägiger Stand der Technik
Von Erdöl stammende synthetische Polymere werden seit langem als Kunststoffe usw. verwendet. Seit kurzem ist die Behandlung dieser gebrauchten Kunststoffe zu einem der ernsthaften gesellschaftlichen Probleme geworden. Diese synthetischen Polymere, die die Vorteile aufweisen, daß sie sich schwer zersetzen lassen, sind anstelle von Metall- oder Glasmaterialien verwendet worden. Beim massenhaften Gebrauch und der massenhaften Entsorgung führt diese Eigenschaft jedoch dazu, daß sie sich schwer zersetzen lassen und sich in den Abfallentsorgungseinrichtungen ansammeln, oder wenn sie verbrannt werden, zunehmend Abgas in Form von Kohlendioxid verursachen, und es können schädliche Substanzen, wie Dioxin und endokrine Spalter, erzeugt werden, so daß es zu einer Umweltverschmutzung kommt.
Andererseits können von Mikroorganismen produzierte Polyester (hier nachfolgend als "mikrobielle Polyester" bezeichnet) biologisch abgebaut werden, so daß sie in das Kreislaufsystem der Natur eingebracht werden. Folglich bleiben sie im Gegensatz zu den zahlreichen üblichen synthetischen Polymerverbindungen nicht in der Umwelt zurück und rufen keine Verschmutzung hervor. Da durch die biologische Abbaubarkeit zudem die Verbrennungsbehandlung entfällt, sind mikrobielle Polyester angesichts der Verhinderung der Luftverschmutzung und der globalen Erwärmung effektiv und als Kunststoffe nützlich, um die Umwelt zu erhalten. Außerdem wurde ihr Potential als weiche Materialien für die medizinische Verwendung untersucht (offengelegte japanische Patentanmeldungen Nr. 5-159, 6-169980, 6-169988, 6-225921 usw.).
Bisher ist von verschiedenen Bakterien berichtet worden, daß sie PHB oder Copolymere von anderen Hydroxyalkansäuren produzieren und in den Zellen speichern (Handbook of Biodegradable Plastics, herausgegeben von Biodegradable Plastics Society, veröffentlicht von N.T.S., S. 178-197 (1995)). Es ist bekannt, daß das so erhaltene mikrobielle PHA in Abhängigkeit von der Klasse der verwendeten Mikroorganismen, der Zusammensetzung des Mediums, den Kulturbedingungen usw. während der Produktion verschiedene Zusammensetzungen und Strukturen aufweisen kann, und es sind viele Untersuchungen bezüglich der Regelung der Zusammensetzung und Struktur von PHA-Produkten durchgeführt worden, um die Eigenschaften des PHA zu verbessern.
Alcaligenes eutropus H16 ATCC Nr. 17699 und dessen Mutanten können zum Beispiel Copolymere von 3-Hydroxybuttersäure (3HB) und 3-Hydroxyvaleriansäure (3HV) mit unterschiedlichem Zusammensetzungsverhältnis produzieren, wenn während der Kultur die Kohlenstoffquellen verändert werden (veröffentlichte japanische Übersetzung der internationalen PCT-Veröffentlichungen Nr. 6-15604, 7-14352, 8-19227 usw.).
Das japanische Patent Nr. 2642937 offenbart, daß Pseudomonas oleovorans ATCC29347, wenn er acyclische aliphatische Kohlenwasserstoffe als eine Kohlenstoffquelle erhält, ein PHA produziert, das eine Monomereinheit aus 3-Hydroxyalkanoat mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen aufweist.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-74492 offenbart ein Verfahren, das den Kontakt eines Mikroorganismus in Form von Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp. oder Pseudomonas sp. mit einem primären Alkohol mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen umfaßt, wodurch er ein Copolymer von 3HB und 3HV produzieren können.
Die offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 5-93049 und 7-265065 offenbaren, daß Aeromonas caviae ein binäres Copolymer von 3HB und 3-Hydroxyhexansäure (3HHx) produzieren kann, wenn Oleinsäure und Olivenöl als Kohlenstoffquellen verwendet werden.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 9-191893 offenbart, daß Comamonas acidovorans IFO13852 einen Polyester mit Monomereinheiten aus 3HB und 4-Hydroxybuttersäure produzieren kann, wenn Gluconsäure und 1,4-Butandiol als Kohlenstoffquelle verwendet werden.
Es ist ferner berichtet worden, daß bestimmte Mikroorganismen ein PHA produzieren, das verschiedene Substituenten, wie Gruppen, die von ungesättigten Kohlenwasserstoffen stammen, eine Estergruppe, Allylgruppe, Cyanogruppe, Nitrogruppe, von einem Halogenwasserstoff stammende Gruppen und Epoxid aufweist. Folglich wurden verschiedene Versuche begonnen, die Eigenschaften eines mikrobiellen PHA unter Anwendung einer solchen Technik zu verbessern. Beispiele eines mikrobiellen Polyesters mit solchen Substituenten sind in FEMS Microbiology Letters, 128 (1995), S. 219-228, detailliert in Makromol. Chem., 191, 1957-1965, 1990, Macromolecules, 24, 5256-5260, 1991 beschrieben, und Chirality, 3, 492-494, 1991 berichtet, daß Pseudomonas oleovorans ein PHA produziert, das eine Monomereinheit aus 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) umfaßt und Änderungen der Polymereigenschaften möglicherweise auf dem Vorhandensein der Monomereinheit aus 3HPV beruhen.
Wie vorstehend festgestellt kann ein mikrobielles PHA mit vielfältigen Zusammensetzungen/Strukturen erhalten werden, wenn der Mikroorganismus, die Zusammensetzung des Mediums, die Züchtungsbedingungen usw. für die Produktion des Polymers geändert werden. Dessen physikalische Eigenschaften sind jedoch für Kunststoffe noch unzureichend. Um den Anwendungsbereich noch stärker zu erweitern, ist es wichtig, die Verbesserung der Eigenschaften noch extensiver zu untersuchen, und es ist folglich wesentlich, ein PHA, das aus strukturell vielfältigen Monomereinheiten erzeugt worden ist, Verfahren zu dessen Herstellung, sowie auch Mikroorganismen, die das gewünschte PHA effizient produzieren können, zu entwickeln und zu erforschen.
Andererseits kann bei jenen PHA mit in die Seitenketten eingeführten Substituenten, wie sie vorstehend beschrieben sind, erwartet werden, daß sie sich zu einem "funktionellen Polymer" entwickeln lassen, das nützliche Funktionen und Eigenschaften aufweist, wenn der einzuführende Substituent entsprechend der gewünschten Eigenschaften usw. ausgewählt wird. Es ist auch von Bedeutung, ein PHA, das sowohl die Funktionalität als auch die biologische Abbaubarkeit erfüllt, Verfahren zu dessen Herstellung sowie auch Mikroorganismen, die das gewünschte PHA effizient produzieren können, zu entwickeln und zu erforschen.
Ein Beispiel eines solchen PHA mit einem in die Seitenketten eingeführten Substituenten ist ein PHA, das in den Seitenketten Phenoxy aufweist.
Macromol. Chem. Phys., 195, 1655-1672 (1994) berichtet zum Beispiel, daß Pseudomonas oleovorans aus 11-Phenoxyundecansäure ein PHA produziert, das Einheiten aus 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure enthält.
Macromolecules, 29, 3432-3435 (1996) berichtet auch, daß Pseudomonas oleovorans verwendet werden kann, um aus 6-Phenoxyhexansäure ein PHA, das 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure- und 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure-Einheiten enthält, aus 8-Phenoxyoctansäure ein PHA, das 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure- und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure-Einheiten enthält, und aus 11-Phenoxyundecansäure ein PHA zu produzieren, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure- und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure-Einheiten enthält. Die Polymerausbeute ist wie folgt.
Außerdem berichtet Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995), daß Pseudomonas oleovorans ATCC29347 oder Pseudomonas putida KT2442, wenn er als Substrate Octansäure und p-Cyanophenoxyhexansäure oder p-Nitrophenoxyhexansäure erhält, ein PHA produzieren kann, das eine Monomereinheit aus 3-Hydroxy-p-cyanophenoxyhexansäure oder 3-Hydroxy-p-nitrophenoxyhexansäure enthält.
Das japanische Patent Nr. 2989175 beschreibt ein Homopolymer, das aus einer 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat-Einheit (3H5(MFP)P-Einheit) oder einer 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat-Einheit (3H5(DFP)P-Einheit) besteht, ein Copolymer, das eine 3H5(MFP)P-Einheit und/oder 3H5(DFP)P-Einheit enthält, Pseudomonas putida, der solche Polymere produzieren kann, und ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend genannten Polymere unter Verwendung von Pseudomonas sp.
Diese Herstellungsverfahren erfolgen durch eine "Züchtung in zwei Schritten", wie sie nachstehend beschrieben ist. Züchtungszeitraum: Schritt 1-24 Stunden, Schritte 2-96 Stunden.
Die Substrate in jedem Schritt und die erhaltenen Polymere sind wie folgt.

(1) Erhaltenes Polymer: 3H5(MFP)P-Homopolymer Substrate im Schritt 1: Citronensäure, Hefeextrakt Substrate im Schritt 2: Monofluorphenoxyundecansäure
(2) Erhaltenes Polymer: 3H5(DFP)P-Homopolymer Substrate im Schritt 1: Citronensäure, Hefeextrakt Substrate im Schritt 2: Difluorphenoxyundecansäure
(3) Erhaltenes Polymer: 3H5(MFP)P-Copolymer Substrate im Schritt 1: Octansäure oder Nonansäure, Hefeextrakt Substrate im Schritt 2: Monofluorphenoxyundecansäure
(4) Erhaltenes Polymer: 3H5(MFP)P-Homopolymer Substrate im Schritt 1: Octansäure oder Nonansäure, Hefeextrakt Substrate im Schritt 2: Difluorphenoxyundecansäure

Es beschreibt, daß der Mikroorganismus substituierte aliphatische Säuren mit mittlerer Kettenlänge assimilieren kann, so daß ein Polymer erzeugt wird, das am Ende der Seitenkette eine Phenoxygruppe aufweist, die mit 1 bis 2 Fluoratomen substituiert ist, und ein solches Polymer Stereoregularität und Wasserabweisevermögen aufweist, wobei ein hoher Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit erhalten bleiben.
Es ist berichtet worden, daß von einem PHA, das in seiner Monomereinheit eine Cyclohexylgruppe enthält, erwartet wird, daß es Polymereigenschaften zeigt, die sich von denen eines PHA unterscheiden, das eine übliche aliphatische Hydroxyalkansäure als eine Einheit enthält, und es ist auch von dessen Produktion durch Pseudomonas oleovorans berichtet worden (Macromolecules, 30, 1611-1615 (1997)).
Laut diesem Dokument wird Pseudomonas oleovorans in einem Medium gezüchtet, das Nonansäure (hier nachstehend als NA bezeichnet) und 4-Cyclohexylbuttersäure (hier nachstehend als CHBA bezeichnet) oder 5-Cyclohexylvaleriansäure (hier nachstehend als CHVA bezeichnet) enthält, wodurch ein PHA erhalten wird, das aus einer Cyclohexyl enthaltenden Einheit und einer Einheit besteht, die von Nonansäure abgeleitet ist (der jeweilige Anteil ist unbekannt).
Als das Verhältnis zwischen CHBA und NA bei derartigen Bedingungen geändert wurde, daß die gesamte Konzentration der Substrate 20 mM betrug, wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse erhalten. In Tabelle 2 sind CDW: Zellmasse (Trockengewicht) (mg/l); PDW: Polymermasse (Trockengewicht) (mg/l); und Ausbeute: PDW/CDW (%).
In diesem Fall war jedoch die Polymerausbeute pro Kultur (Gew./Vol.) unzureichend, und die Einheiten der von Nonansäure stammenden aliphatischen Hydroxyalkansäure waren im resultierenden PHA vorhanden.
Für die Herstellung von PHA mit unterschiedlichen eingeführten Substituenten in der Seitenkette wurde wie beim vorangegangenen Pseudomonas oleovorans wie vorstehend beschrieben ein Alkanoat mit einem einzuführenden Substituenten nicht nur als Ausgangsmaterial des Polymers sondern auch als Kohlenstoffquelle für das Wachstum verwendet.
Bei einem solchen Verfahren, bei dem ein Alkanoat mit einem in das Polymer einzuführenden Substituenten nicht nur als Ausgangsmaterial für das Polymer sondern auch als eine Kohlenstoffquelle für das Wachstum verwendet wird, wird erwartet, daß die Kohlenstoffquelle und Energiequelle als Acetyl-CoA zugeführt wird, das durch β-Oxidation des Alkanoats gebildet wird. Bei einem solchen Verfahren wird jedoch das Acetyl-CoA nicht durch β-Oxidation gebildet, wenn das Substrat nicht eine bestimmte Kettenlänge hat, so daß es ein ernsthaftes Problem darstellt, wenn das als Substrat für das als PHA verfügbare Alkanoat begrenzt ist. Im allgemeinen erzeugt die β-Oxidation ein neues Substrat, dessen Kettenlänge zu diesem Zeitpunkt um zwei Methylen-Einheiten kürzer ist, und diese werden als Monomereinheiten des PHA eingeführt, das synthetisierte PHA ist oft ein Copolymer, das aus Monomereinheiten besteht, die sich in ihrer Kettenlänge jeweils um zwei Methylenketten unterscheiden. Im vorstehend genannten Dokument ist das erzeugte Polymer ein Copolymer, das aus drei Monomereinheiten besteht, und zwar 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure, die vom Substrat 8-Phenoxyoctansäure stammt, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure und 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure, die Stoffwechselnebenprodukte sind. Folglich ist es schwierig, durch dieses Verfahren ein PHA zu erhalten, das aus einer einzigen Monomereinheit besteht. Bei dem Verfahren, das vom durch β-Oxidation gebildeten Acetyl-CoA als Kohlenstoff- und Energiequelle abhängt, bestehen ferner Probleme, wie eine geringe Wachstumsrate des Mikroorganismus, eine langsame Synthese des PHA und eine geringe Ausbeute des PHA.
Der Mikroorganismus wird folglich gewöhnlich in einem Medium gezüchtet, das zusätzlich zum Alkanoat mit dem einzuführenden Substituenten eine aliphatische Säure mit mittlerer Kettenlänge, wie Octansäure und Nonansäure usw., als Kohlenstoffquelle für das Wachstum enthält, und anschließend wird das PHA herausgelöst.
Das nach dem vorstehend genannten Verfahren erzeugte PHA enthält jedoch Monomereinheiten mit einem einzuführenden Substituenten und Monomereinheiten, die von der Kohlenstoffquelle für das Wachstum stammen (zum Beispiel 3-Hydroxyoctansäure und 3-Hydroxynonansäure). Das Polymer mit einer solchen Monomereinheit mit mittlerer Kettenlänge (mcl) ist bei Umgebungstemperatur klebrig, und wenn es mit dem gewünschten PHA gemischt ist, verringert es den Umwandlungspunkt zweiter Ordnung (Tg) deutlich. Um ein Polymer zu erhalten, das bei Raumtemperatur fest ist, ist folglich eine Verunreinigung mit mcl-Monomereinheiten unerwünscht. Außerdem ist bekannt, daß das Vorhandensein von heterogenen Seitenketten die intramolekularen oder intermolekularen Wechselwirkungen aufgrund der Seitenkettenstruktur stört und die Kristallinität und Orientierung deutlich beeinflußt. Für eine Verbesserung der Polymereigenschaften und die Ausbildung von Funktionen stellt ein Gemisch solcher mcl-Monomereinheiten ein ernsthaftes Problem dar. Eine Methode zur Lösung dieses Problems besteht darin, einen Reinigungsschritt hinzuzufügen, um solche "ungewollten" Polymere der mcl-Monomereinheiten, die von die Kohlenstoffquelle für das Wachstum stammen, abzutrennen und zu entfernen und ein PHA zu erhalten, das nur aus einer Monomereinheit besteht, die einen bestimmten Substituenten aufweist. Trotzdem werden die Verfahren problematisch, und eine deutliche Verringerung der Ausbeute ist unvermeidlich. Ein noch wichtiges Problem besteht in der Tatsache, daß es sehr schwierig ist, nur die ungewollten Monomereinheiten zu entfernen, wenn die gewünschten Monomereinheiten mit den ungewollten Monomereinheiten ein Copolymer bilden. Wenn das PHA insbesondere Monomereinheiten mit solchen Gruppen, wie die von ungesättigten Kohlenwasserstoffen stammende Gruppen, Estergruppen, eine Arylgruppe, Cyanogruppe, Nitrogruppe, von Halogenwasserstoffen stammende Gruppen und Epoxid, als Seitenkettenstruktur enthält, bilden die mcl-Monomereinheiten mit der gewünschten Monomereinheit oft ein Copolymer, so daß es sehr schwierig ist, nach der Synthese des PHA die mcl-Monomereinheiten zu entfernen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann die vorstehend genannten Probleme lösen. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein PHA bereitzustellen, das Monomereinheiten mit unterschiedlichen Strukturen mit Substituenten in den Seitenketten enthält, das für Materialien für Vorrichtungen bzw. Geräte, medizinische Materialien usw. nützlich sind. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen PHA unter Ausnutzung von Mikroorganismen, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines PHA mit einer geringen Verunreinigung der Monomereinheiten und mit hoher Ausbeute anzugeben. Weiterhin betrifft eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines neuen PHA, das nur aus den gewünschten Monomereinheiten ohne Verunreinigung mit ungewollten Monomereinheiten besteht, sowie auch eines Verfahrens zur Herstellung eines solchen PHA unter Ausnutzung von Mikroorganismen.
Um die vorstehend genannten Probleme zu lösen, insbesondere um ein PHA zu entwickeln, das in den Seitenketten eine substituierte oder unsubstituierte Phenoxygruppe, Phenylgruppe und Cyclohexylgruppe enthält und als Material für Vorrichtungen bzw. Geräte, medizinische Materialien usw. vorteilhaft ist, haben die hier genannten Erfinder extensiv nach neuen Mikroorganismen, die das PHA produzieren und in der Zelle speichern können, und einem Verfahren zur Herstellung des gewünschten PHA unter Verwendung der neuen Mikroorganismen geforscht.
Um ein Verfahren zu entwickeln, mit dem das gewünschte PHA ohne Einmischung unerwünschter Monomereinheiten wirksam erhalten werden kann, haben die hier genannten Erfinder ferner extensive Untersuchungen durchgeführt und festgestellt, daß durch die Züchtung des Mikroorganismus in einem Medium, das zusätzlich zu einem Alkanoat mit einer gewünschten Atomgruppe mit Hefeextrakt ergänzt ist, nur das gewünschte PHA ohne Einmischung unerwünschter Monomereinheiten oder mit kleinerer Einmischung unerwünschter Monomereinheiten selektiv produziert werden kann, und gelangten damit zur vorliegenden Erfindung.
Diese Aufgaben werden durch Polyhydroxyalkanoate gemäß der Ansprüche 1 bis 3 und das Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats gemäß Anspruch 5 gelöst. Die anderen Ansprüche betreffen Weiterentwicklungen.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat an, das eine ω-substituierte geradkettige Alkansäure, die am Ende der Seitenkette mit irgendeiner Gruppe mit einem Ring aus 6 Kohlenstoffatomen in Form einer substituierten oder unsubstituierten Phenylgruppe, einer substituierten oder unsubstituierten Phenoxygruppe und einer substituierten oder unsubstituierten Cyclohexylgruppe substituiert ist, als Material verwendet und das auch die entsprechende ω-substituierte 3-Hydroxyalkansäure als Monomereinheiten enthält, und gibt auch Mikroorganismen an, die für die selektive Produktion von Polyhydroxyalkanoat geeignet sind, das am Ende dieser Seitenketten eine Gruppe aus einem Ring mit 6 Kohlenstoffatomen aufweist. Für verschiedene Polyhydroxyalkanoate, deren Produktion durch Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal möglich wird, wird zum Beispiel ein Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört, in einem anorganischen Kulturmedium gezüchtet, das den Hefeextrakt und die ω-substituierte geradkettig Alkansäure als Material enthält, so daß er auf die ω-substituierte geradkettige Alkansäure als Material einwirkt, womit eine wirksame Produktion möglich ist. Folglich kann für ein Polyhydroxyalkanoat, das als funktionales Polymer mit biologischer Abbaubarkeit nützlich ist, die Verwendung auf verschiedenen Gebieten, wie als Material für Vorrichtungen bzw. Geräte und als Material für eine medizinische Behandlung, erwartet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist das ¹H-NMR-Spektrum eines PHA, das in Beispiel A-2 aus den gezüchteten Zellen des Stamms P91 aufgefangen worden ist;
2 ist das NMR-Spektrum der in Beispiel B-1 erhaltenen 5-Phenoxyvaleriansäure;
3A ist das Gesamtionenchromatogramm (TIC) der GC-MS-Messung der mit Methyl veresterten Verbindung der Monomereinheit, die das in Beispiel B-2 erhaltene PHA bildet, und 3B ist das Massenspektrum des Hauptpeaks in diesem TIC;
4 ist das NMR-Spektrum des in Beispiel B-2 erhaltenen PHA;
5A ist das Gesamtionenchromatogramm (TIC) der GC-MS-Messung der mit Methyl veresterten Verbindung der Monomereinheit, die das in Beispiel B-3 erhaltene PHA bildet, und 5B ist das Massenspektrum des Hauptpeaks in diesem TIC;
6 ist das NMR-Spektrum der in Beispiel C-1 erhaltenen 5-(4-Fluorphenoxy)valeriansäure;
7A ist das Gesamtionenchromatogramm (TIC) der GC-MS-Messung der mit Methyl veresterten Verbindung der Monomereinheit, die das in Beispiel C-2 erhaltene PHA bildet, und 7B ist das Massenspektrum des Hauptpeaks in diesem TIC;
8 ist das NMR-Spektrum des in Beispiel C-2 erhaltenen PHA;
9A ist das Gesamtionenchromatogramm (TIC) der GC-MS-Messung der mit Methyl veresterten Verbindung der Monomereinheit, die das in Beispiel C-3 erhaltene PHA bildet, und 9B ist das Massenspektrum des Hauptpeaks in diesem TIC;
10 ist das ¹H-NMR-Spektrum der Poly-3-hydroxy-5-phenylvaleriansäure, die in Beispiel D-5 vom Stamm H45 produziert worden ist;
11 ist das ¹³C-NMR-Spektrum der Poly-3-hydroxy-5-phenylvaleriansäure, die in Beispiel D-5 vom Stamm H45 produziert worden ist;
12 ist die DNA-Sequenz einer 16s rRNA codierenden Region von Pseudomonas jessenii P161; FERM BP-7376;
13 ist das NMR-Spektrum von FPVA, die als Alkanoat in Beispiel E-1 als Material biosynthetisiert wurde;
14 ist das ¹H-NMR-Spektrum des PHA, das in Beispiel E-5 durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren unter Verwendung von FPVA als Material erhalten wurde;
15 ist das ¹³C-NMR-Spektrum des PHA, das in Beispiel E-5 unter Verwendung von FPVA als Material erhalten worden ist;
16 ist das ¹H-NMR-Spektrum des PHA, das aus einer 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure-Einheit besteht, das in Beispiel F-3 gereinigt worden ist;
17 ist das ¹³C-NMR-Spektrum des PHA, das aus einer 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure-Einheit besteht, das in Beispiel F-3 gereinigt worden ist;
18 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS des in Beispiel G-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
19 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp), das durch GC-MS des in Beispiel G-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
20 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS des in Beispiel G-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
21 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp), das durch GC-MS des in Beispiel G-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
22 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), das durch GC-MS des in Beispiel H-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
23 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx), das durch GC-MS des in Beispiel H-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
24 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO), das durch GC-MS des in Beispiel H-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
25 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), das durch GC-MS des in Beispiel H-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
26 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx), das durch GC-MS des in Beispiel H-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
27 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO), das durch GC-MS des in Beispiel H-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
28 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS des in Beispiel I-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
29 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-7- phenoxyheptansäure (3HPxHp), das durch GC-MS des in Beispiel I-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
30 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN), das durch GC-MS des in Beispiel I-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
31 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS des in Beispiel I-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
32 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp), das durch GC-MS des in Beispiel I-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
33 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN), das durch GC-MS des in Beispiel I-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
34 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx), das durch GC-MS des in Beispiel J-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
35 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure (3HPB), das durch GC-MS des in Beispiel J-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
36 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx), das durch GC-MS des in Beispiel J-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
37 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV), das durch GC-MS des in Beispiel K-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
38 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS des in Beispiel K-1 erzeugten Polymers erhalten wurde;
39 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV), das durch GC-MS des in Beispiel K-2 erzeugten Polymers erhalten wurde;
40 ist das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS des in Beispiel K-2 erzeugten Polymers erhalten wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polyhydroxyalkanoat (PHA) und ein Verfahren zur Herstellung des PHA.
Die erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von PHA ist ein Herstellungsverfahren, das durch folgendes gekennzeichnet ist: Inkubieren eines Mikroorganismus in einem Medium, das Hefeextrakt und ein Alkanoat der Formel (12) enthält:
worin R zumindest ein Rest oder mehrere Reste ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die mit irgendeiner der folgenden allgemeinen Formeln (2), (3) oder (4) angegeben wird,
Herauslösen des Polyhydroxyalkanoats (PHA) aus den Zellen des Mikroorganismus und
Gewinnen des PHA mit einer Monomereinheit der Formel (13)
worin R' zumindest ein Rest oder mehrere Reste ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die als R in der Formel (12) ausgewählt wurden;
eine Gruppe mit dem entsprechenden R1, wobei q = q₀ – 2, q = q₀ – 4 oder q = q₀ – 6, mit der Maßgabe, daß der als R ausgewählte Rest die Formel (2) hat, worin q = q₀ ist;
ein Rest mit dem entsprechenden R2, wobei r = r₀ – 2, r = r₀ – 4 oder r = r₀ – 6, mit der Maßgabe, daß der als R ausgewählte Rest die Formel (3) hat, worin r = r₀ ist; und
ein Rest mit dem entsprechenden R3, wobei s = s₀ – 2, s = s₀ – 4 oder s = s₀ – 6, mit der Maßgabe, daß der als R ausgewählte Rest die Formel (4) hat, worin s = s₀ ist,
mit der Maßgabe, daß q₀ – 2, r₀ – 2 oder s₀ – 2, q₀ – 4, r₀ – 4 oder s₀ – 4, q₀ – 6, r₀ – 6 oder s₀ – 6 nur die ganze Zahl 1 oder größer sein können),
worin R1 ein Rest ist, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅, -C₃F₇ ausgewählt ist, und q aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt ist;
in der Formel (3) R2 ein Rest ist, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅, -C₃F₇ ausgewählt ist, und r aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt ist; und
in der Formel (4) R3 ein Rest ist, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅, -C₃F₇ ausgewählt ist, und s aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt ist).
Insbesondere ist das Herstellungsverfahren dadurch gekennzeichnet, daß ein Polyhydroxyalkanoat erhalten wird, das aus einer Monomereinheit besteht, die mit der vorstehenden allgemeinen Formel (13) angegeben wird.
Bei diesem Verfahren kann ein PHA produziert werden, das die entsprechende Monomereinheit sowie auch in einigen Fällen eine begleitende zweite Monomereinheit mit eine kürzeren Kohlenstoffkette enthält, wobei eine einzige Art eines Alkanoats der Formel (12) als Ausgangsmaterial verwendet wird. Wie vorstehend erwähnt kann auch eine Vielzahl von Alkanoaten der Formel (12) als Ausgangsmaterial verwendet werden, und dabei ist es angesichts der Funktion und der Eigenschaften, die das herzustellende Polymer haben soll, bevorzugt, eine geeignete Anzahl von Alkanoaten zu verwenden. Im allgemeinen ist zu erwarten, daß das vorstehend genannte Ziel vollkommen erreicht werden kann, wenn als Ausgangsmaterial bis zu etwa fünf unterschiedliche Alkanoate der Formel (12) verwendet werden. Um die Funktionen und Eigenschaften genau zu steuern, können ferner fünf oder mehr unterschiedliche Ausgangsmaterialien verwendet werden. Es können zum Beispiel insgesamt mehr als fünf unterschiedliche Ausgangsmaterialien verwendet werden, die aus bis zu etwa drei unterschiedlichen Alkanoaten bestehen, die jeweils aus der Gruppe von Alkanoaten ausgewählt sind, die mit den vorstehenden allgemeinen Formeln (2), (3) und (4) angegeben werden.
Der Substituent R1 am Benzolring in der allgemeinen Formel (2) und der Substituent R2 am Benzolring in der allgemeinen Formel (3) können aus irgendeiner der folgenden Positionen ausgewählt werden: der ortho-Position (2- oder 6-Position), der meta-Position (3- oder 5-Position) oder der para-Position (4-Position). Das entstehende Polyhydroxyalkanoat enthält eine Monomereinheit mit dem entspechenden substituierten Benzolring. Welches Isomer als Ausgangsmaterial ausgewählt wird, wird in Abhängigkeit von den gewünschten Funktionen und Eigenschaften geeignet bestimmt. Wenn Unterschiede bei den vorstehend genannten Funktionen und Eigenschaften kein kritisches Problem darstellen, läßt sich vorteilhafter ein Alkanoat mit einem Substituenten in der para-Position (4-Position) am Benzolring verwenden, das bezüglich der Ausbeute und der einfachen Einführung in das Polymer einem unsubstituierten Alkanoat ähnlich ist. In ähnlicher Weise kann die Position des Substituenten R3 am Cyclohexylring der allgemeinen Formel (4) aus irgendeiner der folgenden Positionen ausgewählt werden: der 1-, der 2- (oder 6-), der 3- (oder 5-) und der 4-Position, und es können sowohl die cis- als auch die trans-Konfiguration gewählt werden. Das entstehende Polyhydroxyalkanoat enthält eine Monomereinheit mit dem entsprechenden substituierten Cyclohexylring. Welches Isomer als Ausgangsmaterial verwendet wird, wird in Abhängigkeit von den gewünschten Funktionen und Eigenschaften geeignet bestimmt. Wenn Unterschiede bei den vorstehend genannten Funktionen und Eigenschaften kein kritisches Problem darstellen, läßt sich vorteilhafter ein Alkanoat mit Substituenten in der 4-Position am Cyclohexylring verwenden, das in bezug auf die Ausbeute und einfache Einführung in das Polymer einem unsubstituierten Alkanoat ähnlich ist. Das von Mikroorganismen produzierte Polyhydroxyalkanoat, das das chirale Zentrum der Monomereinheit am Kohlenstoffatom in der 3-Position aufweist, ist im allgemeinen ein Polymer, das nur aus dem R-Körper bzw. der R-Konfiguration besteht, das heißt ein isotaktisches Polymer. Als Ergebnis wird das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte PHA ein Polymer, das biologisch abbaubar ist.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können Mikroorganismen durch zwei Schritte gezüchtet werden, die eine erste Kultur in einem Medium, das ein Alkanoat der Formel (12) und Hefeextrakt enthält, und danach eine Kultur im Medium umfaßt, das das Alkanoat und eine eingeschränkte Stickstoffquelle enthält. Der Mikroorganismus kann auch in einem Schritt in dem Medium gezüchtet werden, das ein Alkanoat der Formel (12) und Hefeextrakt enthält. Außerdem wird der verwendete Mikroorganismus vorzugsweise aus jenen ausgewählt, die zu Pseudomonas sp. gehören. Als Beispiele von vorteilhaft verfügbaren Stämmen, die zu Pseudomonas sp. gehören, können Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375), Pseudomonas cichorii H45 (FERM BP-7374), Pseudomonas putida P91 (FERM BP-7373) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-7376) aufgeführt werden, und es ist stärker bevorzugt, irgendeinen der vorstehend genannten vier Stämme auszuwählen.
Nachfolgend wird das bevorzugte Verfahren dieser Erfindung anhand der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat einzeln und genauer beschrieben.
Den hier genannten Erfindern ist es gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Poly-3-hydroxy-4-phenoxybuttersäure-Homopolymer (PHPxB-Homopolymer) produzieren kann, das aus einer Monomereinheit aus 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB) der Formel (5) besteht:
wenn er in einem Medium gezüchtet wird, das Hefeextrakt und 4-Phenoxybuttersäure (PxBA) der Formel (14) enthält.
Folglich besteht ein Verfahren, das in der vorstehend genannten ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten eingeschlossen ist, in einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Prozeß vorliegt, bei dem ein Mikroorganismus, der ein PHPxB-Homopolymer produzieren kann, das aus Struktureinheiten in Form einer 3HPxB-Monomereinheit der Formel (5) besteht, unter Verwendung von PxBA in dem Medium inkubiert wird, das PxBA der Formel (14) und Hefeextrakt enthält.
Zur Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit in Form von 3HPxB enthält, durch Mikroorganismen unter Verwendung von PxBA als Substrat sowie auch die Produktion von Polyhydroxyalkanoat aus einem PHPxB-Homopolymer durch Mikroorganismen gibt es keine Dokumente. Folglich ist das durch das vorstehend genannte Verfahren erhaltene PHPxB neu und in der Erfindung der neuen Polyhydroxyalkanoate eingeschlossen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
Den hier genannten Erfindern ist es auch gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Homopolymer produzieren kann, das aus einer 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure-Monomereinheit (3HPxV-Monomereinheit) der Formel (6) besteht:
wenn er in einem Medium gezüchtet wird, das Hefeextrakt und 5-Phenoxyvaleriansäure (PxVA) der Formel (15) enthält.
Ein weiteres Verfahren, das in der vorstehend genannten ersten Ausführungsform eingeschlossen ist, ist folglich ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Prozeß vorliegt, bei dem ein Mikroorganismus, der ein Poly-3-hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure-Homopolymer (PHPxV-Homopolymer) produzieren kann, das aus Struktureinheiten in Form einer 3HPxV-Monomereinheit der Formel (6) besteht, unter Verwendung von PxVA in einem Medium inkubiert wird, das PxVA der Formel (15) und Hefeextrakt enthält.
Zur Produktion von Polyhydroxyalkanoaten, die eine Monomereinheit in Form von 3HPxV enthalten, durch Mikroorganismen unter Verwendung von PxVA als Substrat sowie auch die Produktion von Polyhydroxyalkanoaten in Form eines PHPxV-Homopolymers durch Mikroorganismen gibt es keine Dokumente. Das durch das vorstehend genannte Verfahren erhaltene PHPxV ist folglich neu und in der Erfindung der neuen Polyhydroxyalkanoate eingeschlossen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
Den hier genannten Erfindern ist es auch gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Homopolymer produzieren kann, das aus einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-5-(fluorphenoxy)valeriansäure (3HFPxV) der Formel (16) besteht:
wenn er in einem Medium gezüchtet wird, das Hefeextrakt und 5-(4-Fluorphenoxy)valeriansäure (FPxVA) der Formel (17) enthält.
Folglich besteht ein weiter Verfahren, das in der vorstehend genannten ersten Ausführungsform enthalten ist, in einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Prozeß vorliegt, bei dem ein Mikroorganismus, der ein Poly-3-hydroxy-5-(fluorphenoxy)valeriansäure-Homopolymer (PHFPxV-Homopolymer), das aus Struktureinheiten einer 3HFPxV-Monomereinheit der Formel (16) besteht, unter Verwendung von FPxVA produzieren kann, in einem Medium inkubiert wird, das FPxVA der Formel (17) und Hefeextrakt enthält.
Den hier genannten Erfindern ist es auch gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Copolymer produzieren kann, das aus 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) der Formel (16) bzw. (22) besteht:
wenn er in einem Medium gezüchtet wird, das Hefeextrakt und 7-Phenoxyheptansäure (PxHpA) der Formel (23) enthält.
Ein weiteres Verfahren, das in der vorstehend genannten ersten Ausführungsform enthalten ist, besteht folglich in einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Prozeß vorliegt, bei dem ein Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat-Copolymer, das aus 3HPxV- und 3HPxHp-Monomereinheiten der Formel (6) bzw. (22) besteht, unter Verwendung von PxHpA produzieren kann, in dem Medium inkubiert wird, das PxHpA der Formel (23) und Hefeextrakt enthält.
Den hier genannten Erfindern ist es auch gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Copolymer produzieren kann, das aus 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx) und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO) der Formel (5), (24) bzw. (25) besteht:
wenn er in einem Medium gezüchtet wird, das Hefeextrakt und 8-Phenoxyoctansäure (PxOA) der Formel (26) enthält.
Folglich besteht ein weiteres Verfahren, das in der vorstehend genannten ersten Ausführungsform enthalten ist, in einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Prozeß vorliegt, bei dem ein Mikroorganismus, der ein Polyhydroxyalkanoat-Copolymer, das aus 3HPxB-, 3HPxHx- und 3HPxO-Monomereinheiten der Formel (5), (24) bzw. (25) besteht, unter Verwendung von PxOA produzieren kann, in dem Medium inkubiert wird, das PxOA der Formel (26) und Hefeextrakt enthält.
Es gelang, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Copolymer produzieren kann, das aus Einheiten in Form von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN) besteht, die mit der Formel angegeben werden.
Ein weiteres Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform eingeschlossen ist, besteht in einem Verfahren, das einen Schritt aufweist, bei dem Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das PxUDA der vorstehend angegebenen Formel (28) und Hefeextrakt enthält, gezüchtet werden, so daß unter Verwendung von PxUDA ein Polyhydroxyalkanoat-Copolymer produziert wird, das aus 3HPxV-, 3HPxHp- und 3HPxN-Monomereinheiten der vorstehend angegebenen Formeln (6), (22) und (27) besteht.
Zusätzlich zu den Verfahren, die in der vorstehend angegebenen Reihe bestimmter Ausführungsformen ausführlich beschrieben sind, wobei ein Alkanoat der Formel (12) verwendet wird, bei dem eine Seitenkette mit einer Phenoxygruppe durch eine gewünschte Gruppe als ein Material der Monomerkomponente ersetzt worden ist, kann ferner unter Verwendung von Mikroorganismen selektiv ein PHA produziert werden, das verschiedene entsprechende Seitenketten aufweist. Ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung eines Alkanoats der Formel (12) als Material und mit der Zusammensetzung der Monomereinheit, die mit der Formel (13) angegeben wird, ist ebenfalls in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat eingeschlossen.
(wobei R zumindest ein Rest oder mehrere Reste ist, die aus Resten der Formel (3) ausgewählt sind);
(worin R' der Rest ist, der aus der vorstehend beschriebenen Formel (12) als R ausgewählt ist),
und wenn er mit der folgenden Formel (3) angegeben wird und der Rest mit r = r₀ ist, hat der als R ausgewählte Rest einen entsprechenden Rest R2 und zumindest einen Rest oder mehrere Reste, die aus der Gruppe von r = r₀ – 2, q = r₀ – 4 oder
r = r₀ – 6 ausgewählt sind.
r₀ – 2, r₀ – 4 oder r₀ – 6 kann die ganze Zahl 1 oder größer sein;
(wobei R2 ein Rest ist, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und r aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt ist).
Wenn das PHA so produziert wird, das eine Art eines Alkanoats der Formel (12) als Material und in einigen Fällen eine entsprechende Monomereinheit enthält, ist das in vielen Fällen eine als Nebenprodukt erzeugte Monomereinheit, deren zugehörige Kohlenstoffkette kürzer ist. Andererseits kann wie vorstehend beschrieben für die Kultur als Alkanoat als Material der Formel (12) eine Vielzahl von Arten verwendet werden. Angesichts der Funktion und der physikalischen Eigenschaften, die das erzeugte Polymer aufweisen soll, ist es bevorzugt, eine geeignete Anzahl von Arten zu verwenden. Im allgemeinen wird erwartet, daß der vorstehend angegebene Zweck bei Verwendung von höchstens drei Arten eines Alkanoats der Formel (12) als Material ausreichend erfüllt werden kann. Außerdem können zum Zwecke der Feinabstimmung der Funktionalität und der physikalischen Eigenschaften viele Arten von Materialien, mehr als drei, verwendet werden.
Für das Material kann irgendeine Substitutionsposition von R2 am Benzolring der Formel (3) aus der ortho-Position (Position 2 oder Position 6), der meta-Position (Position 3 oder Position 5) oder der para-Position (Position 4) ausgewählt werden. Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat ist ein solches, das die Monomereinheit mit einer entsprechenden substituierten Phenoxygruppe enthält. Das als Material auszuwählende Isomer wird entsprechend der gewünschten Funktionalität und physikalischen Eigenschaften geeignet ausgewählt. Wenn eine Abweichung bei der vorstehend angegebenen Funktionalität und den physikalischen Eigenschaften nicht zu einem Problem wird, kann angesichts der Ausbeute oder der einfachen Aufnahme im Polymer normalerweise das mit dem Substituenten in der para-Position (Position 4) am Benzolring im Vergleich mit dem stärker bevorzugt verwendet werden, das nicht substituiert ist. Im von solchen Mikroorganismen erzeugten Polyhydroxyalkanoat hat ein Kohlenstoffatom in der Position 3 der Monomereinheit die Dissymmetrie in der Mitte, und im allgemeinen ist es ein Polymer, das nur aus dem R-Körper besteht und somit ein isotaktisches Polymer. Folglich ist ein durch ein solches Verfahren erzeugtes PHA ein biologisch abbaubares Polymer.
Außerdem ist es den Erfindern gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Homopolymer produzieren kann, das aus einer 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure-Monomereinheit (3HPV-Monomereinheit) der Formel (9) besteht, wenn er in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 5-Phenylvaleriansäure (PVA) der Formel (18) und Hefeextrakt enthält.
Mit anderen Worten ist ein alternatives Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform eingeschlossen ist, ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Schritt aufweist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von PVA ein Poly-3-hydroxy-5-phenylvaleriansäure-Homopolymer (PHPV-Homopolymer) produzieren kann, das aus Struktureinheiten von 3HPV-Monomereinheiten der vorstehend angegebenen Formel (9) besteht, in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das PVA der Formel (18) und Hefeextrakt enthält.
Den Erfindern ist es auch gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Homopolymer produzieren kann, das aus einer 3-Hydroxy-5-14-fluorphenyl)valeriansäure-Monomereinheit (3HFPV-Monomereinheit) der Formel (7) besteht, wenn er in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure (FPVA) der Formel (19) und Hefeextrakt enthält.
Mit anderen Worten ist ein alternatives Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform eingeschlossen ist, ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Schritt aufweist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von FPVA ein Poly-3-hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure-Homopolymer (PHFPV-Homopolymer) produzieren kann, das aus Struktureinheiten von 3HFPV-Monomereinheiten der Formel (7) besteht, in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das FPVA der Formel (19) und Hefeextrakt enthält.
Bisher ist noch nicht von der Produktion von Polyhydroxyalkanoat durch Mikroorganismen berichtet worden, bei dem 3HFPV die Monomereinheit darstellt, wobei FPVA als Substrat verwendet wird. Es gibt auch kein Dokument über die Produktion von Polyhydroxyalkanoat durch Mikroorganismen, das das Homopolymer von PHFPV ist. Folglich ist das durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhaltene PHFPV ein neues Produkt und in der Erfindung als neues Polyhydroxyalkanoat eingeschlossen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird.
Den Erfindern ist es auch gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Copolymer produzieren kann, das aus 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure-Einheiten (3HPB-Einheiten) und 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure-Einheiten (3NPHx-Einheiten) der Formeln (10) und (11) besteht, wenn er in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 6-Phenylhexansäure (PHxA) der Formel (21) und Hefeextrakt enthält.
Mit anderen Worten ist ein alternatives Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform eingeschlossen ist, ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Schritt aufweist, bei dem ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das PHxA der vorstehend angegebenen Formel (21) und Hefeextrakt enthält, so daß er unter Verwendung von PHxA ein Polyhydroxyalkanoat-Copolymer produziert, das aus 3HPB- und 3HPNx-Monomereinheiten der vorstehend angegebenen Formel (10) und (11) besteht.
Bisher ist noch nicht von der Produktion von Polyhydroxyalkanoat durch Mikroorganismen berichtet worden, das 3HPB- und 3HPHx-Monomereinheiten enthält, wobei PHxA als Substrat verwendet wird. Es gibt auch kein Dokument über die Produktion eines Polyhydroxyalkanoats durch Mikroorganismen, das aus 3HPB- und 3HPHx-Monomereinheiten besteht. Folglich ist das Polyhydroxyalkanoat, das aus 3HPB- und 3HPHx-Monomereinheiten besteht und durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wird, ein neues Produkt und in diese Erfindung als neues Polyhydroxyalkanoat eingeschlossen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird.
Zusätzlich zu dem Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen Reihe von bestimmten Ausführungsformen ausführlich beschrieben ist, wobei ein Alkanoat der Formel (12) verwendet wird, bei dem eine Seitenkette mit einer Phenylgruppe durch die gewünschte Gruppe als Material der Monomerkomponente ersetzt worden ist, kann ferner unter Verwendung von Mikroorganismen selektiv ein PHA produziert werden, das verschiedene entsprechende Seitenketten aufweist. Ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung von Alkanoat der Formel (12) als Material und mit der Zusammensetzung der Monomereinheiten, die mit der Formel (13) angegeben wird, ist ebenfalls in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat eingeschlossen.
(In der Formel (12) ist R zumindest ein Rest oder mehrere Reste, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die mit der folgenden allgemeinen Formel (2) angegeben werden.)
(In der Formel (13) ist R' der Rest, der in der vorstehend angegebenen Formel (12) als R ausgewählt worden ist,
und wenn der als R ausgewählte Rest mit der Formel (2) angegeben wird und der Rest mit q = q₀ ist, hat er den entsprechenden R1 und zumindest einen Rest oder mehrere Reste, die aus q = q₀ – 2, q = q₀ – 4 oder q = q₀ – 6 ausgewählt sind. q₀ – 2, q₀ – 4 oder q₀ – 6 können die ganze Zahl 1 oder größer sein.)
(Bei der Formel (2) ist R1 ein Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und q ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt.)
Wenn das PHA so erzeugt wird, daß es eine Art eines Alkanoats der Formel (12) als Material und in einigen Fällen eine entsprechende Monomereinheit enthält, ist das in vielen Fällen eine als Nebenprodukt erzeugte Monomereinheit, deren zugehörige Kohlenstoffkette kürzer ist. Wie vorstehend beschrieben kann andererseits für die Kultur als Alkanoat als Material der Formel (12) eine Vielzahl von Arten verwendet werden. Angesichts der Funktion und der physikalischen Eigenschaften, die das erzeugte Polymer haben soll, ist es bevorzugt, eine geeignete Anzahl von Arten zu verwenden. Es ist im allgemeinen zu erwarten, daß durch die Verwendung von höchstens drei Arten des Alkanoats der Formel (12) als Material der vorstehend angegebene Zweck ausreichend erfüllt wird. Um die Funktionalität und die physikalischen Eigenschaften genau abzustimmen, können außerdem viele Arten von Materialien, mehr als drei, verwendet werden.
Für das Material kann irgendeine Substitutionsposition von R1 am Benzolring der Formel (2) aus der ortho-Position (Position 2 oder Position 6), der meta-Position (Position 3 oder Position 5) oder der para-Position (Position 4) ausgewählt werden. Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat ist ein solches, das die Monomereinheit enthält, die die entsprechende substituierte Phenylgruppe aufweist. Das als Material auszuwählende Isomer wird entsprechend der gewünschten Funktionalität und physikalischen Eigenschaften geeignet bestimmt. Wenn eine Abweichung bei der vorstehend angegebenen Funktionalität und den physikalischen Eigenschaften nicht zu einem Problem wird, kann angesichts der Ausbeute und der einfachen Aufnahme im Polymer im Vergleich mit dem nicht substituierten normalerweise das mit dem Substituenten in der para-Position (Position 4) am Benzolring stärker bevorzugt werden. Beim von solchen Mikroorganismen produzierten Polyhydroxyalkanoat hat das Kohlenstoffatom der Position 3 der Monomereinheit die Dissymmetrie in der Mitte und ist im allgemeinen ein Polymer, das nur aus dem R-Körper besteht und folglich ein isotaktisches Polymer. Somit ist das durch ein solches Verfahren erzeugte PHA ein biologisch abbaubares Polymer.
Außerdem haben die Erfinder festgestellt, daß, wenn 4-Cyclohexylbuttersäure (CHBA) als Substrat verwendet wird und Mikroorganismen im Kulturmedium gezüchtet werden, das CHBA und Hefeextrakt enthält, so daß das Polyhydroxyalkanoat produziert und in den Zellen gespeichert wird, die Monomereinheit des Polyhydroxyalakanoats 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure (3HCHB) in einem hohen Anteil enthält und eine ausreichend hohe Ausbeute aufweist, und bei dem erzielten Polyhydroxyalkanoat, das 3HCHB enthält, wurde festgestellt, daß das PHCHB-Hompolymer, das aus der Struktureinheit von 3HCHB-Monomereinheiten besteht, abgetrennt werden kann, wenn eine Reinigungsbehandlung durchgeführt wird.
Mit anderen Worten ist ein alternatives Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform eingeschlossen ist, ein Verfahren, bei dem Poly-3-hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure (PHCHB) erzeugt wird, das aus 3HCHB-Monomereinheiten besteht,
und das Verfahren, bei dem ein PHCHB-Homopolymer erzeugt wird, das aus 3HCHB-Monomereinheiten der Formel (8) besteht, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Schritt aufweist, bei dem Mikroorganismen in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das CHBA der Formel (20) und Hefeextrakt enthält.
Bisher gibt es kein Dokument zur Produktion von Polyhydroxyalkanoat durch Mikroorganismen, das ein PHCHB-Homopolymer ist. Folglich stellt das durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhaltene PHCHB ein neues Produkt dar und ist in der Erfindung als neues Polyhydroxyalkanoat eingeschlossen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird.
Zusätzlich zu dem Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen Reihe von bestimmten Formen ausführlich beschrieben ist, wobei als Material der Monomerkomponente ein Alkanoat der Formel (12) verwendet wird, bei dem eine Seitenkette mit einer Cyclohexylgruppe durch den gewünschten Rest substituiert ist, kann ferner unter Verwendung von Mikroorganismen ein PHA selektiv produziert werden, das verschiedene entsprechende Seitenketten aufweist. Ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung eines Alkanoats der Formel (12) als Material und mit einer Zusammensetzung der Monomereinheit, wie sie in der Formel (13) angegeben ist, ist ebenfalls in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat eingeschlossen.
(In der Formel (12) ist R zumindest ein Rest oder mehrere Reste, die aus Resten ausgewählt sind, die mit der folgenden allgemeinen Formel (4) angegeben werden).
(In der Formel (13) ist R' der Rest, der in der vorstehend angegebenen Formel (12) als R ausgewählt ist),
und wenn der Rest, der als R ausgewählt ist, mit der Formel (4) angegeben wird und der Rest mit s = s₀ ist, weist er den entsprechenden R3 und zumindest einen oder mehrere Reste auf, die aus s = s₀ – 2, s = s₀ – 4 oder s = s₀ – 6 ausgewählt sind. s₀ – 2, s₀ – 4 oder s₀ – 6 können die ganze Zahl 1 oder größer sein).
(In der Formel (4) ist R3 ein Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und s ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt.)
Wenn das PHA so erzeugt wird, daß es eine Art eines Alkanoats der Formel (12) als Material und in einigen Fällen eine entsprechende Monomereinheit enthält, ist das in vielen Fällen eine als Nebenprodukt erzeugte Monomereinheit, deren zugehörige Kohlenstoffkette kürzer ist. Andererseits kann wie vorstehend beschrieben für die Züchtung als Alkanoat als Material der Formel (12) eine Vielzahl von Arten verwendet werden. Angesichts der Funktion und der physikalischen Eigenschaften, die das erzeugte Polymer haben soll, ist es bevorzugt, die geeignete Anzahl von Arten zu verwenden. Es wird allgemein erwartet, daß durch die Verwendung von höchstens drei Arten des Alkanoats der Formel (12) als Material der vorstehend beschriebene Zweck ausreichend erfüllt werden kann. Außerdem können zur Feinabstimmung der Funktionalität und der physikalischen Eigenschaften viele Arten von Materialien, mehr als drei, verwendet werden.
Für das Material kann irgendeine der Substitutionspositionen von R3 am Cyclohexylring der Formel (4) aus der Position 1, der Position 2 (oder der Position 6), der Position 3 (oder der Position 5) und der Position 4 ausgewählt werden. Außerdem kann entweder die cis-Konfiguration oder die trans-Konfiguration gewählt werden. Das erzielte Polyhydroxyalkanoat ist ein solches, das eine Monomereinheit mit dem entsprechenden substituierten Cyclohexylring enthält. Das als Material auszuwählende Isomer wird entsprechend der gewünschten Funktionalität und physikalischen Eigenschaften geeignet ausgewählt. Wenn eine Abweichung bei der vorstehend angegebenen Funktionalität und den physikalischen Eigenschaften nicht zu einem Problem wird, kann in Hinblick auf die Ausbeute oder die einfache Einführung in das Polymer im Vergleich mit dem nichtsubstituierten normalerweise stärker bevorzugt das ausgewählt werden, das den Substituenten in der 4-Position am Cyclohexylring aufweist. Beim von solchen Mikroorganismen produzierten Polyhydroxyalkanoat hat das Kohlenstoffatom in der Position 3 der Monomereinheit die Dissymmetrie in der Mitte und ist im allgemeinen ein Polymer, das nur aus dem R-Körper besteht und folglich ein isotaktisches Polymer. Somit ist das nach einem solchen Verfahren produzierte PHA ein biologisch abbaubares Polymer.
Außerdem ist es den Erfindern gelungen, einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein Copolymer produzieren kann, das aus einer 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure-Monomereinheit (3HPxV-Monomereinheit) der Formel (6) und einer 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure-Monomereinheit (HPV-Monomereinheit) der Formel (9) besteht, wenn er in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das Hefeextrakt und 5-Phenoxyvaleriansäure (PxVA) der Formel (15)
und 5-Phenylvaleriansäure (PVA) der Formel (18) enthält.
Mit anderen Worten ist ein alternatives Verfahren, das in der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform eingeschlossen ist, ein Verfahren, bei dem unter Verwendung von PxVA und PVA ein Poly-(3-hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure/3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure)-Copolymer produziert wird, das aus Struktureinheiten der 3HPxV-Monomereinheit und den 3HPV-Monomereinheiten der vorstehend angegebenen Formeln (6) und (9) besteht, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Schritt aufweist, bei dem Mikroorganismen in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das PxVA und PVA der vorstehenden Formeln (15), (18) und Hefeextrakt enthält.
Bisher gibt es kein Dokument zur Produktion von Polyhydroxyalkanoat durch Mikroorganismen, das 3HPxV- und 3HPV-Monomereinheiten enthält, wobei PxVA und PVA als Substrat verwendet werden. Es gibt auch kein Dokument zur Produktion von Polyhydroxyalkanoat durch Mikroorganismen, das aus 3HPxV- und 3HPV-Monomereinheiten besteht. Folglich ist das Polyhydroxyalkanoat, das aus 3HPxV- und 3HPV-Monomereinheiten besteht und nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten worden ist, ein neues Produkt und in der Erfindung als neues Polyhydroxyalkanoat eingeschlossen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird.
Zusätzlich zu dem Verfahren, das in den vorstehend angegebenen bestimmten Ausführungsformen ausführlich dargelegt ist, kann ferner unter Verwendung einer Vielzahl von Arten des Alkanoats als Material, das aus dem folgenden Alkanoat der Formel (12) ausgewählt ist, unter Verwendung von Mikroorganismen selektiv ein Polyhydroxyalkanoat produziert werden, das eine Vielzahl von Arten von Monomereinheiten mit vielfältigen entsprechenden Seitenketten enthält. Mit anderen Worten schließt die erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat die bestimmte Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat ein, das eine Vielzahl von Arten von Monomereinheiten mit vielfältigen entsprechenden Seitenketten enthält, wobei eine Vielzahl von Arten des Alkanoats als Material verwendet wird.
Mit anderen Worten ist das Herstellungsverfahren dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das Hefeextrakt und das Alkanoat der Formel (12) enthält:
(In der Formel (12) ist R zumindest ein Rest oder mehrere Reste, die aus Resten ausgewählt sind, die mit irgendeiner der folgenden allgemeinen Formel (2), (3) oder (4) angegeben werden), und der Mikroorganismus wird herausgelöst, so daß ein Polyhydroxyalkanoat erhalten wird, das mit der Formel (13) angegeben wird und zumindest eine der Monomereinheiten der Formel (13) enthält:
(In der Formel (13) ist R' der Rest, der in der vorstehend angegebenen Formel (12) als R ausgewählt ist),
und zumindest ein Rest oder mehrere Reste, die aus folgenden Resten ausgewählt sind,
mit dem entsprechenden R1 und q = q₀ – 2, q = q₀ – 4 oder q = q₀ – 6, wenn der als R ausgewählte Rest mit der Formel (2) angegeben wird und der Rest mit q = q₀ ist,
mit dem entsprechenden R2 und r = r₀ – 2, r = r₀ – 4 oder r = r₀ – 6, wenn der als R ausgewählte Rest mit der Formel (3) angegeben wird und der Rest mit r = r₀ ist, und
mit dem entsprechenden R3 und s = s₀ – 2, s = s₀ – 4 oder s = s₀ – 6, wenn der als R ausgewählte Rest mit der Formel (4) angegeben wird und der Rest mit s = s₀ ist.
q₀ – 2, r₀ – 2 oder s₀ – 2 oder g0 – 4, r₀ – 4 oder s₀ – 4 oder go – 6, r₀ – 6 oder s₀ – 6 können die ganze Zahl 1 oder größer sein.)
(Bei der Formel (2) ist R1 der Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und q ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt; bei der Formel (3) ist R2 der Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und r ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt; bei der Formel (4) ist R3 der Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und s ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt.)
Insbesondere ist das Herstellungsverfahren dadurch gekennzeichnet, daß ein Polyhydroxyalkanoat erhalten wird, das aus Monomereinheiten besteht, die Seitenketten aufweisen, die zumindest einem Alkanoat als Material entsprechen. Mit anderen Worten ist das Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat mit Monomereinheiten, die dadurch gekennzeichnet sind, das sie zumindest eine oder mehrere Seitenkettenstrukturen haben, wobei die Seitenkettenstruktur der Monomereinheiten dem jeweiligen Alkanoat entspricht, wobei es insbesondere aus den jeweiligen Monomereinheiten besteht, die von jedem Alkanoat abgeleitet sind, ein solches, bei dem eine Vielzahl von Arten des Alkanoats als Material verwendet wird, da Monomereinheiten, die im Polyhydroxyalkanoat aufgenommen werden können, entsprechend einer Vielzahl von Arten des Alkanoats der Formel (12) ausgewählt werden.
Bei diesem Verfahren kann unter Verwendung einer Art des Alkanoats der Formel (12) als Material ein PHA erzeugt werden, das die entsprechende Monomereinheit, und in einigen Fällen die als Nebenprodukt erzeugte Monomereinheit enthält, deren zugehörige Kohlenstoffkette kürzer ist. Andererseits kann wie vorstehend beschrieben für die Züchtung als Alkanoat der Formel (12) als Material eine Vielzahl von Arten verwendet werden. Angesichts der Funktion und der physikalischen Eigenschaft, die das erzeugte Polymer haben soll, ist es bevorzugt, die geeignete Anzahl von Arten zu verwenden. Durch die Verwendung von höchstens etwa fünf Arten des Alkanoats der Formel (12) als Material läßt sich allgemein erwarten, daß der vorstehend beschriebene Zweck ausreichend erfüllt werden kann. Außerdem können für die Feinabstimmung der Funktionalität und der physikalischen Eigenschaften viele Arten von Materialien, mehr als fünf, verwendet werden. Es ist zum Beispiel möglich, daß alle drei der vorstehend beschriebenen allgemeinen Formeln (2), (3) oder (4) enthalten sind, höchstens diese drei Arten ausgewählt werden und summiert werden, so daß mehr als fünf Arten von Materialien verwendet werden.
Der Substituent R1 am Benzolring in der allgemeinen Formel (2) und der Substituent R2 am Benzolring in der allgemeinen Formel (3) kann aus irgendeiner Position aus der ortho-Position (Position 2 oder Position 6), der meta-Position (Position 3 oder Position 5) und der para-Position (Position 4) ausgewählt werden. Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat ist ein solches, das die Monomereinheit mit dem entsprechenden substituierten Benzolring enthält. Das als Material auszuwählende Isomer wird entsprechend der gewünschten Funktionalität und physikalischen Eigenschaft geeignet bestimmt. Wenn eine Abweichung bei der vorstehend beschriebenen Funktionalität und den physikalischen Eigenschaften nicht zu einem Problem wird, kann angesichts der Ausbeute oder der einfachen Aufnahme in das Polymer im Vergleich mit dem nichtsubstituierten normalerweise stärker bevorzugt das verwendet werden, das den Substituenten in der para-Position (Position 4) am Benzolring aufweist. In ähnlicher Weise kann der Substituent R3 am Cyclohexylring in der allgemeinen Formel (4) aus irgendeiner der Positionen 1, 2 (oder 6), 3 (oder 5) und 4 ausgewählt werden. Außerdem kann entweder die cis-Konfiguration oder die trans-Konfiguration gewählt werden. Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat ist ein solches, das die Monomereinheit mit dem entsprechenden substituierten Cyclohexylring enthält. Das als Material auszuwählende Isomer wird entsprechend der gewünschten Funktionalität und physikalischen Eigenschaft geeignet bestimmt. Wenn eine Abweichung bei der vorstehend beschriebenen Funktionalität und den physikalischen Eigenschaften nicht zu einem Problem wird, kann in Hinblick auf die Ausbeute und die einfache Aufnahme in das Polymer im Vergleich mit dem nichtsubstituierten normalerweise das stärker bevorzugt verwendet werden, das den Substituenten in der Position 4 am Cyclohexylring aufweist. Im von solchen Mikroorganismen produzierten Polyhydroxyalkanoat hat das Kohlenstoffatom in der Position 3 der Monomereinheit die Dissymmetrie in der Mitte und ist im allgemeinen ein Polymer, das nur aus dem R-Körper besteht und folglich ein isotaktisches Polymer. Folglich ist das durch ein solches Verfahren produziert PHA ein biologisch abbaubares Polymer.
Wie ausführlich beschrieben, wobei repräsentative spezifische Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat dargestellt wurden, kann das Polyhydroxyalkanoat mit vielfältigen entsprechenden Seitenketten als Monomerkomponenten unter Verwendung von Mikroorganismen selektiv produziert werden, wobei ein Derivat, das durch Substitution der Seitenkette des Alkanoats mit der gewünschten Gruppe erhalten wird, als Material verwendet wird, und deshalb stellt die vorliegende Erfindung auch ein erfindungsgemäßes Polyhydroxyalkanoat bereit, das durch ein solches Verfahren erzeugt wird und eine Monomerzusammensetzung aufweist, die mit der folgenden allgemeinen Formel (1) angeben wird. Mit anderen Worten ist das neue erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat ein Polyhydroxyalkanoat, das aus Monomereinheiten der Formel (1) besteht.
(In der Formel (1) ist R zumindest ein Rest oder mehrere Reste, die aus Resten ausgewählt sind, die mit irgendeiner der folgenden allgemeinen Formeln (2), (3) oder (4) angegeben werden.)
(Bei der Formel (2) ist R1 der Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und q ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt; bei der Formel (3) ist R2 der Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und r ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt; bei der Formel (4) ist R3 der Rest, der aus einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist, und s ist aus den ganzen Zahlen 1 bis 8 ausgewählt.
Als R in der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (1) werden hier, wenn eine Art des Restes ausgewählt wird,
in der Formel (2) der Rest mit q = 2 in R1 = H und der Rest mit q = 3 in R1 = H
in der Formel (3) der Rest mit r = 2 in R2 = einem Halogenatom, der Rest mit r = 3 in R2 = -CN und der Rest mit r = 3 in R2 = -NO₂
als Möglichkeiten ausgenommen,
wenn zwei Arten des Restes ausgewählt werden,
in der Formel (2) eine Kombination der zwei Reste mit q = 3 und 5 in R1 = H,
in der Formel (3) die Kombination der zwei Reste mit r = 1 und 3 in R2 = H, die Kombination der zwei Reste mit r = 2 und 6 in R2 = H, die Kombination der zwei Reste mit r = 2 und 6 in R2 = H und die Kombination der zwei Reste mit r = 2 und 4 in R2 = einem Halogenatom
als Möglichkeiten ausgeschlossen,
wenn drei Arten des Restes ausgewählt werden,
in der Formel (2) die Kombination der drei Reste mit q = 3, 5 und 7 in R1 = H,
in der Formel (3) die Kombination der drei Reste mit r = 1, 3 und 5 in R2 = H und die Kombination der drei Reste mit r = 2, 4 und 6 in R2 = H
als Möglichkeiten ausgeschlossen.)
Das erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat, wie es vorstehend beschrieben ist, kann eine Art einer Monomereinheit enthalten, die mit der allgemeinen Formel (1) angegeben wird, und auch eine Vielzahl von Arten enthalten. Angesichts der Funktion und der physikalischen Eigenschaften, die für das gewünschte Polymer erforderlich sind, ist es bevorzugt, eine geeignete Anzahl von Arten der Monomereinheiten zu verwenden. Es wird allgemein erwartet, daß bei der Auswahl von insgesamt zehn Arten von Monomereinheiten der Formel (1) der vorstehend angegebene Zweck ausreichend erfüllt werden kann. Um die Funktionalität und die physikalischen Eigenschaften genau abzustimmen, können außerdem in der Anordnung viele Arten von Monomereinheiten, mehr als zehn, enthalten sein.
Wenn das Polyhydroxyalkanoat zum Beispiel so erzeugt wird, daß es zusätzlich zu den Monomereinheiten, die dem Alkanoat als Material entsprechen, mehrere Arten von Monomereinheiten dieser allgemeinen Formel (1) enthält, wird in einigen Fällen als Nebenprodukt eine Monomereinheit erzeugt, deren zugehörige Kohlenstoffkette kürzer ist. Die vorliegende Erfindung schließt folglich ein, daß selbst wenn das Alkanoat als Material selbst etwa fünf Arten aufweist, jede eine Monomereinheit aus zwei Arten oder mehr ergibt, wobei die als Nebenprodukt erzeugte Monomereinheit eingeschlossen ist, und als Ergebnis enthält das PHA insgesamt zehn Arten von Monomereinheiten oder mehr. Die vorliegende Erfindung schließt außerdem zum Beispiel ein, daß alle drei Arten der vorstehend angegebenen allgemeinen Formeln (2), (3) und (4) enthalten sind, von denen jeweils höchstens etwa drei Arten ausgewählt werden, und es insgesamt etwa zehn Arten des Alkanoats als Material werden, so daß ein PHA erhalten wird, das zehn Arten von Monomereinheiten oder mehr enthält, die eine geringe Anzahl der als Nebenprodukt erzeugten Monomereinheiten enthalten.
Irgendeine der Substitutionspositionen von R1 am Benzolring der Formel (2) und der Substitutionspositionen von R2 am Benzolring der Formel (3) kann aus einer ortho-Position (Position 2 oder Position 6), der meta-Position (Position 3 oder Position 5) und der para-Position (Position 4) ausgewählt werden. Das erhaltene Polyhydroxyalkanoat ist ein solches, das die Monomereinheit mit einer entsprechenden substituierten Benzolgruppe enthält. Ein als Material auszuwählendes Isomer wird entsprechend der gewünschten Funktionalität und physikalischen Eigenschaften geeignet bestimmt. Wenn Abweichungen bei der vorstehend angegebenen Funktionalität und den physikalischen Eigenschaften nicht zu einem Problem werden, kann angesichts der Ausbeute und der leichten Aufnahme im Polymer im Vergleich mit dem nichtsubstituierten normalerweise das stärker bevorzugt verwendet werden, das den Substituenten in der para-Position (Position 4) am Benzolring aufweist. In ähnlicher Weise kann für die Substitutionsposition von R3 am Cyclohexylring der allgemeinen Formel (4) irgendeiner aus der Position 1, der Position 2 (oder der Position 6), der Position 3 (oder der Position 5) und der Position 4 ausgewählt werden, und außerdem kann entweder die cis-Konfiguration oder die trans-Konfiguration gewählt werden. Das erzeugte Polyhydroxyalkanoat ist ein solches, das die Monomereinheit mit dem entsprechend substituierten Cyclohexylring enthält. Das auszuwählende Isomer wird entsprechend der gewünschten Funktionalität und den gewünschten physikalischen Eigenschaften geeignet bestimmt. Wenn eine Abweichung bei der vorstehend angegebenen Funktionalität und den physikalischen Eigenschaften nicht zu einem Problem wird, kann angesichts der Ausbeute und der leichten Aufnahme im Polymer im Vergleich mit dem nicht substituierten normalerweise stärker bevorzugt das verwendet werden, das den Substituenten in der Position 4 am Cyclohexylring aufweist. Bei dem von solchen Mikroorganismen produzierten Polyhydroxyalkanoat hat das Kohlenstoffatom in der Position 3 der Monomereinheit die Dissymmetrie in der Mitte und ist im allgemeinen ein Polymer, das nur aus dem R-Körper besteht, und somit ein isotaktisches Polymer. Folglich ist ein PHA, das nach einem solchen Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen produziert werden kann, ein Polymer, das biologisch abbaubar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von PHA ist dadurch gekennzeichnet, daß bei der Züchtung von Mikroorganismen durch die Zugabe von Hefeextrakt zum Alkanoat der Formel (12) als Material im Kulturmedium der Anteil der enthaltenen gewünschten Monomereinheit im PHA sehr stark erhöht wird oder das PHA, das von dieses speichernden Mikroorganismen produziert wurde, nur aus der gewünschten Monomereinheit besteht. Der Effekt, daß eine bestimmte Monomereinheit stärker bevorzugt wird, wird dadurch erreicht, daß dem Kulturmedium als Kohlenstoffquelle, die vom als Material des PHA verwendeten Alkanoat verschieden ist, nur Hefeextrakt zugesetzt wird.
Als ein Beispiel der Verwendung von Hefeextrakt im Kulturmedium bei der Produktion von PHA durch Mikroorganismen wird das Verfahren genannt, das in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-49487 beschrieben ist und Mikroorganismen verwendet, die zur Gattung Rhodobacter gehört. Dieses herkömmliche Verfahren ist jedoch ein Verfahren zur Produktion von üblichem PHB und PHV unter Verwendung von Hydroxyalkansäure ohne Substituenten als Monomereinheit. Es ist bekannt, daß der Biosyntheseweg zum gewünschten erfindungsgemäßen PHA ein Weg ist, der vom Biosyntheseweg für die Produktion von PHB und PHV unabhängig ist. In der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-49487 wird der Effekt von Hefeextrakt beim Biosyntheseweg für PHA nicht erwähnt, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Außerdem ist der Effekt von Hefeextrakt deutlich beschrieben worden, daß bei gewöhnlich von Mikroorganismen erzeugtem PHB und PHV die Zugabe von Hefeextrakt die Wirkung zeigt, daß einfach die Speicherung von PHA in den Zellen zunimmt und der Hefeextrakt nicht für das Wachstum der Zellen zugesetzt wird. Bei der vorliegenden Erfindung erfolgen die Produktion und die Speicherung von PHA sowie auch das Wachstum, indem ein Alkanoat der Formel (12) zusammen mit Hefeextrakt vorliegt, und somit zeigt der Hefeextrakt einen ganz anderen Effekt. Außerdem ist die Bevorzugung einer bestimmten Monomereinheit, die ein Effekt der vorliegenden Erfindung ist, noch nicht erwähnt worden, und folglich ist der in der vorliegenden Erfindung auftretende Effekt noch nicht aufgeführt worden, daß in der Zusammensetzung des von Mikroorganismen produzierten PHA die bestimmte Monomereinheit mit einer Phenoxygruppe, Phenylgruppe und Cyclohexylgruppe als Substituenten bevorzugt ist.
Als ein Beispiel der Verwendung von Hefeextrakt für die Produktion von PHA durch Mikroorganismen wird das Verfahren genannt, das im vorstehend angegebenen japanischen Patent Nr. 2989175 beschrieben ist, das Pseudomonas putida verwendet. Das Verfahren zur Herstellung von PHA, das in diesem Patent offenbart ist, wendet eine Züchtung mit zwei Schritten an, und es wird offenbart, daß das Speichern des PHA nur im zweiten Schritt der Kultur bei einer eingeschränkten Nährstoffquelle erfolgt, die von der Kohlenstoffquelle verschieden ist. In diesem Zusammenhang unterscheidet sich dieses Verfahren bezüglich des Aufbaus und der Wirkung deutlich vom erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Kultur nur ein Schritt in einem Kulturmedium ist, das ein Alkanoat der Formel (12) und den Hefeextrakt enthält, um die Biosynthese und die Speicherung des gewünschten PHA vorzunehmen. Der Effekt des Hefeextraktes in dem japanischen Patent Nr. 2989175 zielt in der Kultur im ersten Züchtungsschritt einfach auf die Proliferation von Mikroorganismen, die für die Kultur im zweiten Schritt verwendet werden, wenn eine Kultur mit zwei Schritten verwendet wird, und es wird ausdrücklich beschrieben, daß der erste Züchtungsschritt unter nährstoffreichen Bedingungen erfolgt. Das Substrat des PHA existiert hier nicht zusammen mit der Kultur des ersten Schrittes. Der Effekt des Hefeextraktes in der erfindungsgemäßen Kultur mit zwei Schritten besteht darin, daß die Produktion und Speicherung des PHA sowie auch die Proliferation der Zellen im ersten Züchtungsschritt erfolgen, indem ein Alkanoat der Formel (12) und der Hefeextrakt im ersten Züchtungsschritt gleichzeitig vorliegen, und der Effekt, den der Hefeextrakt im ersten Züchtungsschritt zeigt, ist vollkommen anders. Außerdem liegt im japanischen Patent Nr. 2989175 irgendeine Verbindung aus Citronensäure, Octansäure, Nonansäure in der Kultur des ersten Schrittes gleichzeitig als Kohlenstoffquelle vor, und somit unterscheidet sich der Aufbau ebenfalls von der vorliegenden Erfindung, bei der ein Alkanoat der Formel (12) und der Hefeextrakt gleichzeitig vorhanden sind.
Als ein Beispiel eines Dokumentes zu einem Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung ein PHA produzieren kann, das 3HPxB als Monomereinheit enthält, so daß es in den Zellen gespeichert wird, gibt es ein Verfahren unter Verwendung von Pseudomonas oleovorans, das in Macromolecules 29, 3432- 3435, 1996 beschrieben ist. Das Verfahren unter Verwendung von Pseudomonas oleovorans verwendet jedoch nur 8-Phenoxyoctansäure (PxOA) als Substrat und hat folglich zum Beispiel gegenüber der vorliegenden Erfindung den wesentlichen Unterschied, daß es durch β-Oxidation kein Acetyl-CoA produzieren kann, und es unterscheidet sich völlig von dem Verfahren, das PxBA als Substrat zusammen mit dem Hefeextrakt verwendet. Als biosynthetisiertes PHA wird ein Copolymer erzeugt, das aus drei Arten von Monomeren aus 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure, die vom PxOA als Substrat stammt, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure, die das von einem Stoffwechselprodukt stammende Nebenprodukt ist, und 3HPxB besteht. Demgegenüber ermöglicht die Verwendung von Hefeextrakt in der vorliegenden Erfindung die Produktion eines PHA, das als die Phenoxygruppe enthaltende Monomereinheit nur 3HPxB enthält, das von der PxBA stammt. Beim produzierten PHA gibt es einen deutlichen Unterschied zwischen dem im vorstehend beschriebenen Dokument und dem der vorliegenden Erfindung. Außerdem gibt es kein Dokument zur Produktion von PHA, das 3HPxB als Monomereinheit enthält, durch Mikroorganismen unter Verwendung von PxBA als Substrat. Außerdem gibt es kein Dokument zur Produktion von PHA, das nur 3HPxB als Monomereinheit enthält, die die Phenoxygruppe aufweist, durch Mikroorganismen unter Verwendung von PxBA als Substrat.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ausführlich beschrieben.
Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Mikroorganismen können irgendwelche Mikroorganismen sein, wobei diese Mikroorganismen in der Lage sind, PHA aus dem Alkanoat zu produzieren und es zu speichern, wobei das Alkanoat der Formel (12) als Substrat verwendet wird. Gemäß der Untersuchungen der Erfinder sind Pseudomonas-Bakterien gut, und wir haben festgestellt, daß von diesen Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375; Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374; Pseudomonas putida P91, FERM BP-7373 und Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376 die bevorzugten Mikroorganismen darstellen. Wenn eine Prüfung von Bakterien vorgenommen wird, die zum Beispiel zur Gattung Pseudomonas gehören, können bei Verwendung von von diesen Stämmen verschiedenen Zellen durch die Züchtung unter Verwendung des Alkanoats als Substrat Mikroorganismen erhalten werden, die für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von PHA verwendet werden können. Als Bakterien, die zur Gattung Pseudomonas gehören, ist zum Beispiel die Verwendung von Pseudomonas oleovorans möglich. Zusätzlich zu Mikroorganismen, die zur Gattung Pseudomonas gehören, ist die Verwendung von Mikroorganismen möglich, die zu den Gattungen Aeromonas, Comamonas und Burkholderia gehören, und die unter Verwendung des Alkanoats als Material (Substrat) ein PHA produzieren, das das entsprechende 3-Hydroxyalkanoat als Monomereinheit enthält. Angesichts der Produktivität können jedoch die vorstehend angegebenen vier Stämme als besonders bevorzugte Stämme empfohlen werden.
Nachfolgend sind Einzelheiten der Stämme YN2, H45, P91 und P161 aufgeführt.
<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms YN2>

Züchtungstemperatur: 30°C

Morphologie:

Zellform: Stäbchen, 0,8 μm × (1,5 bis 2,0) μm
Gramfärbung: negativ
Sporenbildung: negativ
Mobilität: beweglich
Kolonieform: kreisförmig, vollständiger glatter Rand, wenig konvex, glatte Oberfläche, glänzend, durchscheinend

Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: nicht fermentierbar
Nitratreduktion: negativ
Indolerzeugung: positiv
Glucose-Ansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ

Substratassimilation:

D-Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv
Erzeugung einer Fluoreszenz auf King B-Agar: positiv
Wachstum in 4 % NaCl: positiv (schwach)
Speicherung von Poly-β-hydroxybuttersäure: negativ (durch Färben einer auf einem Nähragar gewachsenen Kolonie mittels Sudanschwarz bestimmt)
Hydrolyse von Tween 80: positiv

<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms H45>

Morphologische Eigenschaften:
Zellform und Größe: Stäbchen, 0,8 μm × (1,0 bis 1,2) μm
Polymorphie der Zellen: fehlt
Mobilität: positiv
Sporenbildung: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig, vollständiger glatter Rand, wenig konvex, glatte Oberfläche, glänzend und cremefarben

Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: negativ
Indolerzeugung: negativ
Glucose-Ansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung einer Fluoreszenz auf King B-Agar: positiv
Wachstum in 4 % NaCl: negativ
Speicherung von Poly-β-hydroxybuttersäure: negativ

Substratassimilation:

D-Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms P91>
Morphologische Eigenschaften:

Zellform und Größe: Stäbchen, 0,6 μm × 1,5 μm
Polymorphie der Zellen: fehlt
Mobilität: positiv
Sporenbildung: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig, vollständiger glatter Rand, wenig konvex, glatte
Oberfläche, glänzend, cremefarben

Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: negativ
Indolerzeugung: negativ
Glucose-Ansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: positiv
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung einer Fluoreszenz auf King B-Agar: positiv:

Substratassimilation:

D-Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms P161>
Morphologische Eigenschaften:

Zellform und Größe: Kokken, Durchmesser 0,6 μm oder Bazillen 0,6 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zellen: Elongation
Mobilität: positiv
Sporenbildung: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig, vollständiger glatter Rand, wenig konvex, glatte
Oberfläche und hellgelb

Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: positiv
Indolerzeugung: negativ
Glucose-Ansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: positiv
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung einer Fluoreszenz auf King B-Agar: positiv

Substratassimilation:

D-Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Anhand der vorstehend beschriebenen bakteriologischen Eigenschaften wurde entsprechend der Identifizierung, die auf dem Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 1 (1984) und dem Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9. Aufl. (1994) basiert, für die Stämme YN2 und H45 festgestellt, daß sie zu Pseudomonas cichorii gehören und der Stamm P91 zu Pseudomonas putida. Folglich haben wir diesen Stämmen die Bezeichnungen Pseudomonas cichorii YN2, Pseudomonas cichorii H45 und Pseudomonas putida P91 gegeben.
Obwohl für den Stamm P161 festgestellt wurde, daß er zur Gattung Pseudomonas gehört, war andererseits eine taxonome Identifizierung auf der Basis der bakteriologischen Eigenschaften unmöglich. Um eine Identifizierung auf der Basis von genetischen Kriterien zu versuchen, wurde dann die DNA-Sequenz aus 16s rRNA von P161 bestimmt (Sequenzidentifizierungsnummer: 1), wie sie in 12 gezeigt ist, um die Homologie mit DNA-Sequenzen von 16s rRNA bekannter Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas zu testen. Als Ergebnis wurde zwischen den Sequenzen des Stamms P161 und Pseudomonas jessenii eine sehr starke Homologie festgestellt. Außerdem wurde zwischen den bakteriologischen Eigenschaften von Pseudomonas jessenii, die in System. Appl. Microbiol. 20:137-149 (1997) und System. Appl. Microbiol. 22:45-58 (1999) beschrieben sind, und den bakteriologischen Eigenschaften des Stamms P161 eine starke Ähnlichkeit festgestellt. Anhand der vorstehend beschriebenen Ergebnisse kann der Stamm P161 berechtigt als Pseudomonas jessenii identifiziert werden, und folglich haben wir den Stamm P161 als Pseudomonas jessenii P161 bezeichnet.
Die Stämme YN2, H45, P91 und P161 sind beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japanese Ministry of International Trade and Industry hinterlegt, wobei wir den Identifizierungscode FERM BP-7375, FERM BP-7374, FERM BP-7373 bzw. FERM BP-7376 erhalten haben.
Durch Züchtung dieser Mikroorganismen unter Verwendung eines Materials für die Einführung der gewünschten Monomereinheit in einem Kulturmedium, das ein Alkanoat der allgemeinen Formel (12) und Hefeextrakt enthält, kann das gewünschte PHA produziert werden.
Für die normale Züchtung von Mikroorganismen, die für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von PHA verwendet werden, zum Beispiel die Züchtung zum Präparieren einer Konservierung eines Zellstamms und zur Beibehaltung der Anzahl der Zellen und des aktiven Zustandes, womit ein negativer Einfluß auf das Wachstum und Überleben der Mikroorganismen ausgeschlossen wird, können irgendwelche Arten eines Kulturmediums, zum Beispiel ein allgemeines Kulturmedium und ein synthetisches Kulturmedium, verwendet werden, dem eine Nährstoffquelle zugesetzt worden ist. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, Belüftung und Bewegen, werden entsprechend des verwendeten Mikroorganismus geeignet eingestellt.
Andererseits kann in dem Fall, in dem die Produktion und Speicherung des PHA durch Mikroorganismen durchgeführt wird, als Kulturmedium für die Produktion von PHA ein anorganisches Kulturmedium verwendet werden, das zumindest ein Alkanoat der entsprechenden allgemeinen Formel (12) enthält. Es stellt ein Merkmal dar, das in diesem Fall als Kohlenstoff- oder Energiequelle, die vom Alkanoat als Material des PHA verschieden ist, nur Hefeextrakt zugesetzt wird.
Als anorganisches Kulturmedium, das für das vorstehend beschriebene Züchtungsverfahren verwendet wird, kann irgendeins verwendet werden, das die für die Proliferation der Mikroorganismen erforderlichen Komponenten, wie eine Phosphorquelle (zum Beispiel ein Phosphatsalz) und eine Stickstoffquelle (zum Beispiel ein Ammoniumsalz und ein Nitratsalz) enthält. Als repräsentatives anorganisches Kulturmedium können zum Beispiel das Medium MSB, das Medium E (J. Biol. Chem. 218: 97-106 (1956)) und das Medium M9 verwendet werden.
Die Zusammensetzung des Kulturmediums M9, das in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist wie folgt.
Na₂HPO₄: 6,2 g
KH₂PO₄: 3,0 g
NaCl: 0,5 g
NH₄Cl: 1,0 g
(auf 1 Liter Kulturmedium, pH = 7,0).
Als Beispiel der Züchtungsbedingungen werden eine Schüttelkultur und eine bewegte Kultur bei 15 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 35°C und aerobe Bedingungen genannt.
Für die Züchtungsschritte kann irgendein Verfahren, das für normale Mikroorganismen angewendet wird, wie ein Batch-System, ein verwirbeltes Batch-System, eine halbkontinuierliche Kultur, eine kontinuierliche Kultur und ein Reaktortyp verwendet werden. Es kann ein System mit mehreren Schritten verwendet werden, bei dem eine Vielzahl dieser Schritte verbunden wird.
Beim Verfahren, das eine Züchtung in zwei Schritten einschließt, wird zum Beispiel im ersten Schritt als Kohlenstoffquelle für die Zellproliferation das anorganische Kulturmedium verwendet, das etwa 0,1 bis 1,0 Gew.-% Hefeextrakt und etwa 0,01 bis 0,5 Gew.-% Alkanoat der Formel (12) enthält, die Züchtung erfolgt von der späten Stufe der logarithmischen Wachstumsperiode bis zum Zeitpunkt der Periode des ruhenden Zustands, und im zweiten Schritt werden die Zellen nach Abschluß der Züchtung im ersten Schritt durch Zentrifugieren aufgefangen, darauf folgt eine weitere Züchtung im anorganischen Kulturmedium, das als Material etwa 0,01 bis 0,5 Gew.-% Alkanoat der Formel (12) enthält und dem irgendeine Stickstoffquelle fehlte, und nach Abschluß der Züchtung werden die Zellen aufgefangen, um das gewünschte PHA herauszulösen.
Es gibt ein Verfahren, bei dem die Züchtung in einem anorganischen Kulturmedium durchgeführt wird, dem etwa 0,1 bis 1,0 Gew.-% Hefeextrakt und etwa 0,01 bis 0,5 Gew.-% Alkanoat der Formel (12) zugesetzt werden, und zum Zeitpunkt der späten Stufe der logarithmischen Wachstumsperiode bis zur Periode des ruhenden Zustands werden die Zellen aufgefangen, um das gewünschte PHA herauszulösen.
In diesem Fall wird die Konzentration des Hefeextrakts, der dem Kulturmedium zugesetzt werden soll, entsprechend der Art des Alkanoats der Formel (12), der Spezies und Gattung des Mikroorganismus, der Dichte der Zellen oder des Züchtungsverfahrens geeignet ausgewählt. Es ist normalerweise bevorzugt, bei der Zugabe einen im Kulturmedium enthaltenen Anteil von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.-% auszuwählen. Als Hefeextrakt kann andererseits vorzugsweise irgendein handelsüblicher Hefeextrakt verwendet werden, der allgemein für die Züchtung von Mikroorganismen verwendet wird. Als Ersatz für den Hefeextrakt kann außerdem auch ein solcher verwendet werden, der durch Pulverisieren eines gefriergetrockneten Hefeproduktes hergestellt wurde, der natürlich die Komponenten des Hefeextrakts enthält. Andererseits wird die Konzentration des Alkanoats der Formel (12) als Material entsprechend der Spezies und Gattung des Mikroorganismus, der Dichte der Zellen oder des Züchtungsverfahrens geeignet ausgewählt. Es ist normalerweise bevorzugt, bei der Zugabe einen im Kulturmedium enthaltenen Anteil im Bereich von etwa 0,01 bis 0,5 Gew.-% auszuwählen.
Wenn irgendeiner der Stämme YN2, H45, P91 und P161, die bereits beschrieben worden sind, beim Ersatz für den Hefeextrakt verwendet wird, wird als Kohlenstoffquelle für die Zellproliferation zum Beispiel eine Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge mit C₆ bis C₁₂ (zum Beispiel Octansäure, Nonansäure und dergleichen) verwendet, das erhaltene PHA ist ein solches, bei dem die von der zugesetzten Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge stammende Monomereinheit eingemischt ist. Insbesondere wird als Beispiel der Fall genannt, bei dem ein Verfahren angewendet wird, bei dem das anorganische Kulturmedium benutzt wird, in das als Kohlenstoffquelle für die Zellproliferation die Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge, wie Octansäure, Nonansäure und dergleichen, und auch das Alkanoat der Formel (12) als Material gegeben wird, die Züchtung von der späten Stufe der logarithmischen Wachstumsperiode bis zum Zeitpunkt der Periode des ruhenden Zustands erfolgt, die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen werden, und dann die Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge und das Alkanoat der Formel (12) zugesetzt werden, um eine weitere Züchtung im anorganischen Kulturmedium vorzunehmen, dem die Stickstoffquelle fehlt. Andererseits wird der Fall als Beispiel genannt, der ein Verfahren anwendet, bei dem die Konzentration der Stickstoffquelle im anorganischen Kulturmedium auf 1/10 eingeschränkt ist, die Züchtung in dem Kulturmedium erfolgt, dem die Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge und das Alkanoat der Formel (12) zugesetzt wurden, die Zellen im Zeitraum von der späten Stufe der logarithmischen Wachstumsperiode bis zum Zeitpunkt der Periode des ruhenden Zustands gezüchtet werden, um das gewünschte PHA herauszulösen. Wenn diese Verfahren angewendet werden, bei denen die Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge dem Kulturmedium als Kohlenstoffquelle für die Zellproliferation zugesetzt wird, wird das erhaltene PHA ein PHA, bei dem die Monomereinheit eingemischt ist, die von der als Kohlenstoffquelle für die Zellproliferation zugesetzten Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge stammt.
Andererseits wird in der vorliegenden Erfindung wie vorstehend beschrieben durch die Züchtung der vorstehend angegebenen Mikroorganismen im Kulturmedium, das den Hefeextrakt, ein Alkanoat der Formel (12) und keine andere Kohlenstoffquelle enthält, das gewünschte PHA erzeugt und gespeichert, das eine geringe Menge oder keine Menge irgendeiner unnötigen Monomereinheit enthält, die von der Monomereinheit verschieden ist, die vom gewünschten Alkanoat der Formel (12) stammt.
Das Auffangen des PHA aus den Zellen erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren am bequemsten durch Extraktion unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wobei normalerweise Chloroform verwendet wird. In einer Umgebung, in der die Verwendung des organischen Lösungsmittels problematisch ist, kann jedoch ein Verfahren zum Auffangen des PHA angewendet werden, bei dem die vom PHA verschiedenen Zellkomponenten durch Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie SDS, durch Behandlung mit einem Enzym, wie Lysozym, und durch Behandlung mit einem Reagenz, wie EDTA, Natriumhypochlorit und Ammonium, entfernt werden.
Die Züchtung der Mikroorganismen, die Produktion von PHA durch Mikroorganismen und die Speicherung in den Zellen und das Auffangen des PHA aus den Zellen sind nicht auf die vorstehend beschriebenen Verfahren beschränkt.
Als Mikroorganismen, die für das erfindungsgemäße Verfahren zur Produktion von PHA verwendet werden, können zum Beispiel Mikroorganismen verwendet werden, die von den vorstehend beschriebenen vier Bakterienstämmen verschieden sind, wobei sie gemäß der vorliegenden Erfindung eine Produktivität zur Erzeugung von PHA aufweisen, und die diesen vier Bakterienstämmen ähnlich sind.
Durch Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren kann ein PHA erhalten werden, das Struktureinheiten der Formel (1) enthält. Es ist bevorzugt, daß das Zahlenmittel des Molekulargewichts dieses PHA mindestens 10.000 oder mehr beträgt, und ein Bereich von 10.000 bis 200.000 ist stärker bevorzugt. Mit anderen Worten ist es, um die gewünschten Eigenschaften als Polymer konstant zu erhalten, insbesondere bevorzugt, daß das PHA eine Wiederholungszahl aufweist, damit das Zahlenmittel des Molekulargewichts mindestens etwa 10.000 beträgt, so daß die Eigenschaften, wie Umwandlungspunkt zweiter Ordnung, Erweichungspunkt, Schmelzpunkt, Kristallinität und Orientierung, die durch die Struktur der das Monomer bildenden Monomereinheit hervorgerufen werden, in einem bestimmten Bereich liegen. Für die Verarbeitung und dergleichen liegt das Zahlenmittel des Molekulargewichts angesichts einer bequemen Verarbeitung, wie des Verfahrens zum Auflösen, andererseits vorzugsweise unter etwa 200.000. Gewöhnlich ist ein Bereich von 10.000 bis 100.000 stärker bevorzugt. Das Zahlenmittel des Molekulargewichts des durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren erhaltenen PHA beträgt 10.000 oder mehr und etwa 20.000 oder mehr und liegt in einem Bereich, bei dem hinlänglich zu erwarten ist, daß die physikalischen Eigenschaften des vorstehend beschriebenen Polymers konstant auftreten.
[Beispiele]
Nachfolgend werden bestimmte Beispiele aufgeführt, und die vorliegende Erfindung wird ausführlicher erläutert. Diese bestimmten Beispiele sind Beispiele der besten Art und Weise der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die folgenden bestimmten Beispiele beschränkt.
A:
Es wird ein Beispiel aufgeführt, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat bei der Produktion des folgenden Polyhydroxyalkanoats angewendet wird:
Poly-3-hydroxy-4-phenoxybuttersäure (PHPxB), die aus der Monomereinheit besteht, die von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB) der Formel (5) stammt, wobei als Material 4-Phenoxybuttersäure (PxBA) der Formel (14) verwendet wird.
[Beispiel A-1]
Der Stamm P91 wurde in 200 ml des Kulturmediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % PxBA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, erneut in 200 ml des Kulturmediums M9 suspendiert, das 0,1 % PxBA enthielt und dem die Stickstoffquelle (NH₄Cl) fehlte, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert, und das PHA wurde herausgelöst, indem 20 Stunden bei 60°C gerührt wurde. Das herausgelöste Fluid wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert, darauf folgte das Einengen mit einem Rotationsverdampfer, und danach wurde das konzentrierte Fluid erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen, darauf folgte die Analyse mit einem Gerät für die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), und es wurde das mit Methyl veresterte Produkt der PHA-Monomereinheit identifiziert. Andererseits wurde das Molekulargewicht dieses PHA durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (GPC; Toso, HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel-MIXED-C (5 μm), Lösungsmittel: Chloroform, auf Polystyrol umgerechnetes Molekulargewicht).
Tabelle 3 zeigt das Ergebnis der Identifizierung und das durchschnittlich Molekulargewicht. Es ist ersichtlich, daß das erhaltene PHA nur eine Monomereinheit, die von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure der Formel (5) stammt, als Monomereinheit enthält und Poly-3-hydroxy-4-phenoxybuttersäure ist.
[Beispiel A-2]
Der Stamm P91 wurde in 200 ml des Kulturmediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt und 0,2 % PxBA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert, und das PHA wurde herausgelöst, indem 20 Stunden bei 60°C gerührt wurde. Das herausgelöste Fluid wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert, darauf folgte das Einengen mit einem Rotationsverdampfer, und danach wurde das konzentrierte Fluid erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen, darauf folgte die Analyse mit einem Gerät für die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), und es wurde das mit Methyl veresterte Produkt der PHA-Monomereinheit identifiziert. Tabelle 4 zeigt das Ergebnis der Identifizierung. Es ist ersichtlich, daß das erhaltene PHA nur eine Monomereinheit, die von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure der Formel (5) stammt, als Monomereinheit enthält und Poly-3-hydroxy-4-phenoxybuttersäure ist.
[Beispiel A-3]
Das aus den gezüchteten Zellen des Stamms P91 gewonnene PHA wurde unter folgenden Bedingungen mit einem Gerät für die magnetische Kernresonanz analysiert (FT-NMR: Bruker DPX400).
Kernspezies für die Messung: ¹H,
verwendetes Lösungsmittel: schweres Chloroform (enthält TMS).
1 zeigt das Ergebnis der Messung und Tabelle 5 führt das Ergebnis der Analyse (Zuordnung) jedes Signals auf. Tabelle 5 zeigt das Ergebnis der nachfolgend beschriebenen 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure. Laut diesem Ergebnis enthält das PHA nur eine Monomereinheit, die von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure der Formel (5) stammt, und es wird bestätigt, daß es Poly-3-hydroxy-4-phenoxybuttersäure ist.
B:
Es wird ein Beispiel aufgeführt, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat bei der Produktion des folgenden Polyhydroxyalkanoats angewendet wird:
Poly-3-hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (PHPxV), die aus der Monomereinheit besteht, die von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (HPxVA) der Formel (6) stammt, wobei als Material 5-Phenoxyvaleriansäure (PxVA) der Formel (15) verwendet wird.
[Beispiel B-1]
Synthese von PxVA
240 ml dehydratisiertes Aceton wurden in einen 3-Hals-Rundkolben gegeben, Kaliumiodid (0,06 Mol), Kaliumcarbonat (0,11 Mol) und Phenol (0,07 Mol) wurden zugesetzt, und es wurde ausreichend gerührt. In diese Lösung ließ man unter einer Stickstoffatmosphäre 5-Bromvaleriansäureethylester (0,06 Mol) tropfen, und für die Reaktion wurde 24 Stunden bei 60 ± 5°C unter Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionslösung getrocknet, wobei für die Kondensation ein Verdampfer verwendet wurde, und erneut in Methylenchlorid gelöst, und für die Trennung wurde der Lösung Wasser zugesetzt, und die organische Schicht wurde unter Verwendung von Magnesiumsulfatanhydrid dehydatisiert, darauf folgte das Trocknen, wobei zum Verdampfen der Verdampfer benutzt wurde. Dem erhaltenen getrockneten Material (Reaktant) wurde heißes Methanol zugegeben, damit es sich löst, und es wurde langsam abgekühlt, so daß es erneut gefällt wurde, womit 5-Phenoxyvaleriansäureethylester (PxVA) erhalten wurde. Zu diesem Zeitpunkt betrug das Ausbeuteverhältnis dieses Esters zum 5-Bromvaleriansäureethylester 72 Mol-%.
Der erhaltene Reaktant (Ester) wurde in Ethanol-Wasser (9:1 (V./V.)) gelöst, um 5 Gew.-% zu erhalten, es wurde die 10fache molare Menge Kaliumhydioxid zugesetzt, um eine vierstündige Reaktion bei 0 bis 4°C vorzunehmen, so daß die Hydrolyse des Esters erfolgt. Diese Reaktionslösung wurde zu einer wäßrigen 0,1 m Salzsäurelösung mit dem 10fachen Volumen gegeben, und danach wurde der Niederschlag durch Filtration aufgefangen. Der aufgefangene Niederschlag (Reaktant) wurde 36 Stunden bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck getrocknet. Das erhaltene getrocknete Material wurde in einem geringen Volumen von heißem Methanol gelöst, die Lösung wurde allmählich abgekühlt, so daß es zu einer erneuten Fällung kam, und der Niederschlag wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck getrocknet, womit die gewünschte Verbindung 5-Phenoxyvaleriansäure erhalten wurde. Das Ausbeuteverhältnis dieser gewünschten Verbindung zum 5-Bromvaleriansäureethylester betrug 53 Mol-%.
Die Analyse der erhaltenen Verbindung erfolgte bei folgenden Bedingungen mit einem Gerät für die magnetische Kernresonanz (NMR).
<Verwendete Geräte>

FT-NMR: Bruker DPX400
¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz

<Meßbedingungen>

Kernspezies für Messung: ¹H
Verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃
Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃
Meßtemperatur: Raumtemperatur.

2 zeigt das Spektrum und Tabelle 6 das Ergebnis der Identifizierung.
Anhand dieses Ergebnisses wurde die Synthese des gewünschten PxVA bestätigt.
[Beispiel B-2]
Produktion des PHPxV-Homopolymers durch den Stamm P91
Der Stamm P91 wurde in 200 ml des Kulturmediums M9 geimpft, das 0,5 Gew.-% Hefeextrakt (von DIFCO hergestellt) und 0,1 Gew.-% PxVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,1 % PxVA enthielt und dem jegliche Stickstoffquelle (NH₄Cl) fehlte, und ferner bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert, und das PHA wurde herausgelöst, indem 20 Stunden bei 60°C gerührt wurde. Das extrahierte Fluid wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert, darauf folgte das Einengen mit einem Rotationsverdampfer, und danach wurde das konzentrierte Fluid erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, um das PHA zu erhalten und zu wiegen. Tabelle 7 zeigt die Ausbeute von Zellen und Polymer.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde nach folgenden Schritten analysiert. Eine PHA-Probe mit 5 mg wurde in einen auberginenförmigen Kolben mit einem Volumen von 25 ml gegeben, 2 ml Methanol, das 2 ml Chloroform und 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, wurde zugegeben, es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt, und für die Trennung wurde Wasser zugegeben, und danach wurde die organische Schicht mit einem Gerät für die Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, DB-WAXETR (von J & W Co. hergestellt), EI-Methode), und es wurde das mit Methyl veresterte Produkt der PHA-Monomereinheit identifiziert. Als Ergebnis gab es einen einzigen Hauptpeak. Anhand ihres Massenspektrums wurde sie als mit Methyl veresterte Verbindung von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure erkannt. Außerdem hatten andere geringfügige Komponenten keinen Zusammenhang mit der Monomereinheit des PHA. Die 3A und 3B zeigen das Gesamtionen-Chromatogramm (TIC) der GC-MS und das Massenspektrum des Hauptpeaks.
Das erhaltene Polymer wurde unter folgenden Bedingungen der NMR-Analyse unterzogen.
<Verwendete Geräte>

FT-NMR: Bruker DPX400
¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz

<Meßbedingungen>

4 zeigt das Spektrum und Tabelle 8 das Ergebnis der Identifizierung.
Außerdem wurde das Molekulargewicht des erhaltenen PHA durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (GPC; Toso, HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel-MIXED-C (5 μm), Lösungsmittel: Chloroform, Umrechnung auf Polystyrol). Das Ergebnis lautete Mn = 70.000 und Mw = 121.000.
Als vorstehend beschriebenes Ergebnis wurden das Homopolymer von Poly-3-hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure unter Verwendung von PxVA als Material und das Verfahren zu dessen Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung aufgezeigt.
[Beispiel B-3]
Produktion des PHPxV-Homopolymers durch den Stamm H45
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Kulturmediums M9 geimpft, das 0,5 Gew.-% Hefeextrakt (von DIFCO hergestellt) und 0,1 Gew.-% PxVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert, und das PHA wurde herausgelöst, indem 20 Stunden bei 60°C gerührt wurde. Das extrahierte Fluid wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert, darauf folgte das Einengen mit einem Rotationsverdampfer, und danach wurde das konzentrierte Fluid erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, um das PHA zu erhalten und zu wiegen. Tabelle 9 zeigt die Ausbeute von Zellen und Polymer.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde nach folgenden Schritten analysiert. Eine PHA-Probe mit 5 mg wurde in einen auberginenförmigen Kolben mit einem Volumen von 25 ml gegeben, 2 ml Methanol, das 2 ml Chloroform und 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, wurden zugegeben, es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt, und für die Trennung wurde Wasser zugegeben, und danach wurde die organische Schicht mit einem Gerät für die Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, DB-WAXETR (von J & W Co. hergestellt), EI-Methode), und es wurde das mit Methyl veresterte Produkt der PHA-Monomereinheit identifiziert. Als Ergebnis gab es einen einzigen Hauptpeak. Anhand ihres Massenspektrums wurde sie als mit Methyl veresterte Verbindung von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure erkannt. Außerdem hatten andere geringfügige Komponenten keinen Zusammenhang mit der Monomereinheit des PHA. Die 5A und 5B zeigen das Gesamtionen-Chromatogramm (TIC) der GC-MS und das Massenspektrum des Hauptpeaks.
Außerdem wurde das Molekulargewicht des erhaltenen PHA durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (GPC; Toso, HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel-MIXED-C (5 μm), Lösungsmittel: Chloroform, Umrechnung auf Polystyrol). Das Ergebnis lautete Mn = 64.000 und Mw = 116.000.
Als vorstehend beschriebenes Ergebnis wurden das Homopolymer von Poly-3-hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure unter Verwendung von PxVA als Material und das Verfahren zu dessen Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung aufgezeigt.
C:
Es wird ein Beispiel aufgeführt, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat bei der Produktion des folgenden Polyhydroxyalkanoats angewendet wird:
Poly-3-hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriansäure (PHFPxV), die aus der Monomereinheit besteht, die von 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriansäure (HFPxVA) der Formel (16) stammt, wobei als Material 5-(4-Fluorphenoxy)valeriansäure (FPxVA) der Formel (17) verwendet wird.
[Beispiel C-1]
Synthese von FPxVA
Natriumiodid (0,06 Mol), Kaliumcarbonat (0,11 Mol) und 4-Fluorphenol (0,07 Mol) wurden zu 240 ml dehydratisiertem Aceton in einem 3-Hals-Rundkolben gegeben, und das Gemisch wurde vollständig gerührt. In die Lösung ließ man unter einer Stickstoffatmosphäre 5-Bromvaleriansäureethylester (0,06 Mol) tropfen, und das Gemisch wurde bei 60 ± 5°C unter Rückfluß erhitzt und konnte 24 Stunden reagieren. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktantenlösung mit einem Verdampfer bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde erneut in Methylchlorid gelöst, und es wurde Wasser zugegeben, darauf folgte die Trennung. Die abgetrennte Schicht des organischen Lösungsmittels wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert und mit einem Verdampfer bis zur Trockne eingeengt, wodurch der Reaktant erhalten wurde.
Es wurde heißes Wasser zugesetzt, um den erhaltenen Reaktanten zu lösen, und die Lösung wurde allmählich abgekühlt, um den 5-(4-Fluorphenoxy)valeriansäureethylester erneut zu fällen. Die Ausbeute der Verbindung betrug im Verhältnis zum 5-Bromvaleriansäureethylester 68 Mol-%.
Der erhaltene Reaktant (Ester) wurde in Ethanol-Wasser (9:1 (V./V.)) gelöst, um eine Lösung mit 5 Gew.-% herzustellen, es wurde die 10fache molare Menge Kaliumhydroxid zugegeben, und das Gemisch konnte 4 Stunden bei 0 bis 4°C reagieren, wodurch der Ester hydrolysiert wurde.
Die Reaktantenlösung wurde in das 10fache Volumen von 0,1 m Salzsäure gegeben, und der Niederschlag wurde durch Filtration aufgefangen. Der aufgefangene Niederschlag (der Reaktant) wurde 36 Stunden bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck getrocknet. Der getrocknete Reaktant wurde in einer geringen Menge von heißem Ethanol gelöst, und die Lösung wurde für die erneute Fällung allmählich abgekühlt. Der Niederschlag wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur unter reduziertem Druck getrocknet, wodurch die gewünschte Verbindung 5-(4-Fluorphenoxy)valeriansäure der Formel (17) erhalten wurde. Die Ausbeute dieser Verbindung betrug im Verhältnis zum 5-Bromvaleriansäureethylester 49 Mol-%.
Die erhaltene Verbindung wurde unter folgenden Bedingungen durch NMR analysiert.
<Gerät>

FT-NMR: Bruker DPX400
¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz

<Meßbedingungen>

Nuclid: ¹H
Lösungsmittel: CDCl₃
Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃
Temperatur: Raumtemperatur.

6 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum und Tabelle 10 das Ergebnis der Identifizierung.
Anhand der vorstehend aufgeführten Ergebnisse wurde bestätigt, daß das gewünschte FPxVA synthetisiert worden war.
[Beispiel C-2]
Herstellung des PHFPxV-Homopolymers unter Verwendung des Stamms P91
Der Stamm P91 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 Gew.-% Hefeextrakt (DIFCO) und 0,1 Gew.-% FPxVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen und erneut in 200 ml des Mediums M9 suspendiert, das 0,1 Gew.-% FPxVA ohne eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde gewogen. Tabelle 11 zeigt die Ausbeuten von Bakterienzellen und Polymer.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde wie folgt analysiert: 5 mg der PHA-Probe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugegeben, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, das Gemisch wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt, und für die Trennung wurde Wasser zugesetzt. Nach der Trennung wurde die Schicht des organischen Lösungsmittels durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (J&W Co.) EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Folglich wurde nur ein Hauptpeak deutlich und durch Massenspektrometrie als Methylester von 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriansäure identifiziert. Die anderen Spurenkomponenten standen nicht mit der PHA-Monomereinheit in Zusammenhang. Die 7A und 7B zeigen das TIC und das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriansäure.
Das Molekulargewicht des erhaltenen PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 μm), Lösungsmittel: Chloroform, Umrechnung auf Polystyrol): Mn = 68.000 und Mw = 120.000.
Außerdem wurde die Struktur des erhaltenen PHA unter folgenden Bedingungen durch magnetische Kernresonanz (NMR) analysiert.
<Gerät>

FT-NMR: Bruker DPX400
¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz

<Meßbedingungen>

8 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum und Tabelle 12 das Ergebnis der Identifizierung.
Somit wurden das Poly-3-hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriat-Homopolymer unter Verwendung von FPxVA als Material und das Verfahren zu dessen Herstellung gemäß dieser Erfindung aufgezeigt.
[Beispiel C-3]
Herstellung des PHFPxV-Homopolymers unter Verwendung des Stamms H45
Die Zellen des Stamms H45 wurden in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 Gew.-% Hefeextrakt (DIFCO) und 0,1 Gew.-% FPxVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der Extrakt wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, um das PHA zu erhalten und zu wiegen. Tabelle 13 zeigt die Ausbeuten von Bakterienzellen und Polymer.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde wie folgt analysiert: 5 mg der PHA-Probe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugegeben, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, das Gemisch wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt, und für die Trennung wurde Wasser zugesetzt. Nach der Trennung wurde die Schicht des organischen Lösungsmittels durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (J&W Co.) EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Folglich wurde nur ein Hauptpeak deutlich und durch Massenspektrometrie als Methylester von 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriansäure identifiziert. Die 9A und 9B zeigen das Gesamtionen-Chromatogramm (TIC) bei der GC-MS und das Massenspektrum des Hauptpeaks.
Das Molekulargewicht des erhaltenen PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 μm), Lösungsmittel: Chloroform, Umrechnung auf Polystyrol): Mn = 67.000 und Mw = 119.000.
Somit wurden das Poly-3-hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriat-Homopolymer unter Verwendung von FPxVA als Material und das Verfahren zu dessen Herstellung gemäß dieser Erfindung aufgezeigt.
D:
Es werden Beispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat aufgeführt, die bei der Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats angewendet werden, das aus der Monomereinheit besteht, die von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (HPVA) der Formel (9) stammt, wofür 5-Phenylvaleriansäure (PVA) der Formel (18) das Material darstellt: Poly-3-hydroxy-5-phenylvaleriat (PHPV).
[Beispiel D-1]
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (Difco Co.) und 0,05 % PVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen und durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Das Molekulargewicht des PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory·PLgel·MIXED-C·5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, auf Polystyrol umgerechnetes Molekulargewicht). Tabelle 14 zeigt die Ergebnisse der Identifizierung, das durchschnittliche Molekulargewicht und die Ausbeute und die Ausbeute des gefriergetrockneten Pellets und des aufgefangenen Polymers.
Wie in Tabelle 14 aufgeführt, ist bestätigt worden, daß das aus den Bakterienzellen herausgelöste und gewonnene Polymer nur die Monomereinheit als PHA-Monomereinheit enthält, die von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure der Formel (9) stammt.
[Beispiel D-2]
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (Difco Co.) und 0,1 % PVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen und erneut in 200 ml des Mediums M9 suspendiert, das 0,2 % PVA ohne eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen und unter Anwendung der Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Das Molekulargewicht des PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory·PLgel·MIXED-C·5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, auf Polystyrol umgerechnetes Molekulargewicht). Tabelle 15 zeigt die Ergebnisse der Identifizierung, das durchschnittliche Molekulargewicht und die Ausbeute und die Ausbeute des gefriergetrockneten Pellets und des aufgefangenen Polymers.
Wie in Tabelle 15 aufgeführt, ist bestätigt worden, daß das aus den Bakterienzellen herausgelöste und gewonnene Polymer nur die Monomereinheit als PHA-Monomereinheit enthält, die von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure der Formel (9) stammt.
[Beispiel D-3]
Der Stamm P91 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (Difco Co.) und 0,1 % PVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen und erneut in 200 ml des Mediums M9 suspendiert, das 0,1 % PVA ohne eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das getrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen und unter Anwendung der Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Tabelle 16 zeigt die Ergebnisse der Identifizierung und die Ausbeute und die Ausbeute des gefriergetrockneten Pellets und des aufgefangenen Polymers.
Wie in Tabelle 16 aufgeführt, ist bestätigt worden, daß das aus den Bakterienzellen herausgelöste und gewonnene Polymer nur die Monomereinheit als PHA-Monomereinheit enthält, die von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure der Formel (9) stammt.
[Beispiel D-4]
Der Stamm P161 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (Difco Co.) und 0,1 % PVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen, erneut in 200 ml des Mediums M9 suspendiert, das 0,1 % PVA ohne eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen und unter Anwendung der Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Das Molekulargewicht des erhaltenen PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory·PLgel·MIXED-C·5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, auf Polystyrol umgerechnetes Molekulargewicht). Tabelle 17 zeigt die Ergebnisse der Identifizierung, das durchschnittliche Molekulargewicht und die Ausbeute und die Ausbeute des gefriergetrockneten Pellets und des aufgefangenen Polymers.
Wie in Tabelle 17 aufgeführt, ist bestätigt worden, daß das aus den Bakterienzellen herausgelöste und gewonnene Polymer nur die Monomereinheit als PHA-Monomereinheit enthält, die von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure der Formel (9) stammt.
[Beispiel D-5]
Das vom Stamm H45 produzierte PHPV wurde unter folgenden Bedingungen durch magnetische Kernresonanz analysiert (FT-NMR: Bruker DPX400):
Nuclid: ¹H und ¹³C, Lösungsmittel: schweres Chloroform (enthält TMS).
10 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum, und Tabelle 18 führt die Identifizierung jedes Peaks auf. 11 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum und Tabelle 19 führt die Identifizierung jedes Peaks auf.
Somit wurde nachgewiesen, daß das aus den Bakterienzellen herausgelöste und aufgefangene Polymer Poly-3-hydroxy-5-phenylvaleriansäure ist, die als PHA-Monomereinheit nur die Monomereinheit enthält, die von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure der Formel (9) stammt.
E:
Es werden Beispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat aufgeführt, die bei der Herstellung von Polyhydroxyalkanoat angewendet werden, das aus der Monomereinheit besteht, die von 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure (HFPVA) der Formel (7) stammt, für die 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure (FPVA) der Formel (19) das Material darstellt: Poly-3- hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriat (PHFPV).
[Beispiel E-1]
Zuerst wurde das Substrat FPVA durch eine Grignard-Reaktion synthetisiert, wie sie in Macromolecules, 29, 1762-1766 (1996) und 27, 45-49 (1994) aufgeführt ist: 5-Bromvaleriansäure wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst, und eine 3 m Lösung von Methylmagnesiumchlorid in THF wurde unter einer Argonatmosphäre bei –20°C tropfenweise zugegeben. Nachdem 15 Minuten gerührt worden war, wurde ferner eine THF-Lösung von 1-Brom-4-fluorbenzol und Magnesium tropfenweise zugegeben, und es wurde eine 0,1 m Lösung von Li₂CuCl₄ in THF zugegeben (die Temperatur wurde bei –20°C gehalten). Die Temperatur der Reaktionslösung erreichte wieder Raumtemperatur. Die Lösung wurde über Nacht gerührt, dann in 20 %ige eisgekühlte Schwefelsäure gegossen und gerührt. Die wäßrige Schicht wurde aufgefangen und mit Natriumchlorid gesättigt, danach wurde mit Ether extrahiert. Der Extrakt wurde ferner mit 100 ml deionisiertem Wasser extrahiert, das 50 g Kaliumhydroxid enthielt, und mit 20 %iger Schwefelsäure oxidiert, danach wurde der Niederschlag aufgefangen.
Dieser Niederschlag wurde unter folgenden Bedingungen durch magnetische Kernresonanz (FT-NMR: Bruker DPX400) analysiert:
Nuclid: ¹H und ¹³C, Lösungsmittel: schweres Chloroform (enthält TMS).
13 und Tabelle 20 zeigen die Ergebnisse der Analyse.
[Beispiel E-2]
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (Difco Co.) und 0,1 % FPVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen und unter Anwendung der Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Tabelle 21 zeigt die Ergebnisse.
[Beispiel E-3]
Der Stamm P91 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (Difco Co.) und 0,1 % FPVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml des Mediums M9 suspendiert, das 0,1 % FPVA ohne eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen und unter Anwendung der Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Tabelle 22 zeigt die Ergebnisse.
[Beispiel E-4]
Der Stamm P161 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (Difco Co.) und 0,1 % FPVA enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml des Mediums M9 suspendiert, das 0,1 % FPVA ohne eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Die Extraktlösung wurde mit einem 0,45 μm Membranfilter filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde. Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem üblichen Verfahren unterzogen und unter Anwendung der Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode), um den Methylester der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Tabelle 23 zeigt die Ergebnisse.
[Beispiel E-5]
Wir haben die vom Stamm N45 stammende PHFPV unter den folgenden Bedingungen mit einem NMR-Spektrometer analysiert (FT-NMR: Bruker DPX400): gemessene Nuclide: ¹H, ¹³C, verwendetes Lösungsmittel: schweres Chloroform (enthält TMS). Die Ergebnisse sind in 14, Tabelle 24, 15 und Tabelle 25 aufgeführt.
F:
Es folgt ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat, das aus einer Monomereinheit in Form von 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure (3-HCHBA) (Formel 8) besteht, wobei 4-Cyclohexylbuttersäure (CHBA, Formel 20) als Ausgangsmaterial verwendet wird.
[Beispiel F-1]
Produktion von PHA, das 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure als Monomereinheit enthält, durch den Stamm YN2 (Kultur mit einem Schritt)
Kolonien des Stamms YN2, die auf dem Agarmedium M9 gezüchtet worden waren, das mit 0,1 % Hefeextrakt ergänzt worden war, wurden in 200 ml des flüssigen Mediums M9 geimpft, das mit 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % 4-Cyclohexylbuttersäure ergänzt worden war, und danach bei 30°C gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, mit Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Nach dem Wiegen wurde das gefriergetrocknete Pellet 20 Stunden bei 60°C durch Mischen in 100 ml Chloroform suspendiert, um das PHA herauszulösen.
Dann wurde Das Gemisch durch einen 0,45 μm Filter filtriert, das Filtrat wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Dem Konzentrat wurde kaltes Methanol zugesetzt, um das Polymermaterial erneut zu fällen. Danach wurde das Polymer bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet und gewogen. Tabelle 26 zeigt das Gewicht des erhaltenen gefriergetrockneten Pellets und des aufgefangenen Polymers und der Ausbeute des Polymers (CDW: Zellmasse (Trockengewicht), PDW: Polymer (Trockengewicht)).
Im vorstehend genannten Stand der Technik (Tabelle 2) betrug die Ausbeute an PHA, das aus 3-HCHBA bestand, 89,1 mg/l der Kultur. Andererseits zeigt das Ergebnis des vorstehenden Beispiels dieser Erfindung, daß die Ausbeute 2,5 mal höher als diese ist. Außerdem war die Ausbeute pro getrockneter Zellmasse deutlich besser.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde wie folgt analysiert:
Etwa 10 mg PHA wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben und in 2 ml Chloroform gelöst, danach wurden der Lösung 2 ml Methanol zugegeben, das 3 % Schwefelsäure enthielt, und die Reaktion erfolgte 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß. Nach Abschluß der Reaktion wurden der Lösung 10 ml deionisiertes Wasser zugegeben, und es wurde 10 Minuten kräftig geschüttelt. Anschließend wurde die abgetrennte untere Chloroformschicht entnommen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die mit Methyl veresterten PHA-Komponenten in der Chloroformschicht wurden unter Anwendung eines Gaschromatographen-Massenspektrometers identifiziert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode). Als Ergebnis waren 98 % der PHA-Monomereinheiten 3-HCHBA der Formel (8), und 2 % davon waren 3-Hydroxybuttersäure. Es war auch eine geringe Menge Cyclohexylmethanol vorhanden.
Wie vorstehend angegeben, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren PHA erhalten werden, das 3-HCHBA in einer deutlich größeren Menge enthält. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wurde der Effekt der Zugabe von Hefeextrakt bestätigt. Das Herstellungsverfahren war ein sehr effizientes Verfahren mit hoher Ausbeute pro Volumeneinheit der Kultur oder Gewicht der Zellmasse. Somit wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren sowohl bei einem hohen Gehalt der 3-HCHBA-Einheit als auch einer hohen Ausbeute sehr wirksam ist.
Herstellung von PHA, das 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure als Monomereinheit enthält, durch den Stamm H45 (Kultur mit einem Schritt)
Kolonien des Stamms H45, die auf dem Agarmedium M9 gezüchtet worden waren, das mit 0,1 % Hefeextrakt ergänzt worden war, wurden in 200 ml des flüssigen Mediums M9 geimpft, das mit 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % 4-Cyclohexylbuttersäure ergänzt worden war, und danach bei 30°C gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, mit Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Nach dem Wiegen wurde das gefriergetrocknete Pellet 20 Stunden bei 60°C durch Mischen in 100 ml Chloroform suspendiert, um das PHA herauszulösen. Dann wurde Das Gemisch durch einen 0,45 μm Filter filtriert, das Filtrat wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Dem Konzentrat wurde kaltes Methanol zugesetzt, um das Polymermaterial erneut zu fällen. Danach wurde das Polymer bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet und gewogen. Tabelle 27 zeigt das Gewicht des erhaltenen gefriergetrockneten Pellets (CDW) und des aufgefangenen Polymers (PDW) und der Ausbeute des Polymers.
Im vorstehend genannten Stand der Technik (Tabelle 2) betrug die Ausbeute an PHA, das aus 3-HCHBA bestand, 89,1 mg/l der Kultur. Andererseits zeigt das Ergebnis des vorstehenden Beispiels dieser Erfindung, daß die Ausbeute 1,3 mal höher als diese ist. Außerdem war die Ausbeute pro Einheit der getrockneten Zellmasse deutlich besser.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde wie folgt analysiert:
Etwa 10 mg PHA wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben und in 2 ml Chloroform gelöst, danach wurden der Lösung 2 ml Methanol zugegeben, das 3 % Schwefelsäure enthielt, und die Reaktion erfolgte 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß. Nach Abschluß der Reaktion wurden der Lösung 10 ml deionisiertes Wasser zugegeben, und es wurde 10 Minuten kräftig geschüttelt. Anschließend wurde die abgetrennte untere Chloroformschicht entnommen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die mit Methyl veresterten PHA-Komponenten in der Chloroformschicht wurden unter Anwendung eines Gaschromatographen-Massenspektrometers identifiziert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode). Als Ergebnis waren 97 % der PHA-Monomereinheiten 3-HCHBA der Formel (8), und 3 % davon waren 3-Hydroxybuttersäure. Es war auch eine geringe Menge Cyclohexylmethanol vorhanden.
Wie vorstehend angegeben, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren auch durch den Stamm H45 ein PHA erhalten werden, das 3-HCHBA in einer deutlich größeren Menge enthält.
Herstellung von PHA, das 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure als Monomereinheit enthält, durch den Stamm P161 (Kultur mit einem Schritt)
Kolonien des Stamms H45, die auf dem Agarmedium M9 gezüchtet worden waren, das mit 0,1 % Hefeextrakt ergänzt worden war, wurden in 200 ml des flüssigen Mediums M9 geimpft, das mit 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % 4-Cyclohexylbuttersäure ergänzt worden war, und danach bei 30°C gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, mit Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Nach dem Wiegen wurde das gefriergetrocknete Pellet 20 Stunden bei 60°C durch Mischen in 100 ml Chloroform suspendiert, um das PHA herauszulösen. Dann wurde Das Gemisch durch einen 0,45 μm Filter filtriert, das Filtrat wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Dem Konzentrat wurde kaltes Methanol zugesetzt, um das Polymermaterial erneut zu fällen. Danach wurde das Polymer bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet und gewogen. Tabelle 28 zeigt das Gewicht des erhaltenen gefriergetrockneten Pellets und des aufgefangenen Polymers und der Ausbeute des Polymers.
Im vorstehend genannten Stand der Technik (Tabelle 2) betrug die Ausbeute an PHA, das aus 3-HCHBA bestand, 89,1 mg/l der Kultur. Andererseits zeigt das Ergebnis des vorstehenden Beispiels dieser Erfindung, daß die Ausbeute 1,5 mal höher als diese ist. Außerdem war die Ausbeute pro getrockneter Zellmasse deutlich verbessert.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde wie folgt analysiert:
Etwa 10 mg PHA wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben und in 2 ml Chloroform gelöst, danach wurden der Lösung 2 ml Methanol zugegeben, das 3 % Schwefelsäure enthielt, und die Reaktion erfolgte 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß. Nach Abschluß der Reaktion wurden der Lösung 10 ml deionisiertes Wasser zugegeben, und es wurde 10 Minuten kräftig geschüttelt. Anschließend wurde die abgetrennte untere Chloroformschicht entnommen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die mit Methyl veresterten PHA-Komponenten in der Chloroformschicht wurden unter Anwendung eines Gaschromatographen-Massenspektrometers identifiziert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode). Als Ergebnis waren 94 % der PHA-Monomereinheiten 3-HCHBA der Formel (8), und 6 % davon waren 3-Hydroxybuttersäure. Es war auch eine geringe Menge Cyclohexylmethanol vorhanden.
Wie vorstehend angegeben, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren auch durch den Stamm P161 ein PHA erhalten werden, das 3-HCHBA in einer deutlich größeren Menge enthält.
[Beispiel F-2]
Produktion von PHA, das 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure-Einheiten enthält, unter Verwendung des Stamms YN2 (Züchtung mit zwei Schritten)
Kolonien des Stamms YN2, die auf dem Agarmedium M9 gezüchtet worden waren, das 0,1 % Hefeextrakt enthielt, wurden in das flüssige Medium M9 (200 ml) geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % 4-Cyclohexylbuttersäure enthielt, und danach bei 30°C gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen. Anschließend wurden die Zellen in frisches Medium M9 gebracht, das 0,1 % 4-Cyclohexylbuttersäure enthielt, jedoch frei von NaCl und NH₄Cl war, und 21 Stunden bei 30°C gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen einmal mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde gewogen, und danach wurde das Polymer nach dem gleichen Verfahren aufgefangen, wie es in Beispiel F-1 aufgeführt ist. Dieses Polymer wurde bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet und gewogen. Die erhaltenen Mengen des gefriergetrockneten Pellets (CDW) und des aufgefangenen Polymers (PDW) und die Ausbeute sind in Tabelle 29 angegeben.
Obwohl die Menge von PHA, das Einheiten enthält, die von 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure stammen, die im vorstehend genannten üblichen Dokument erreicht worden waren (Tabelle 2), 89,1 mg pro Liter Kulturmedium betrug, führte das Beispiel dieser Erfindung dazu, daß etwa die 3,2fache Menge erzielt wurde. Auch die Ausbeute pro Trockenmasse der Zellen wird deutlich verbessert.
Die Zusammensetzung des erhaltenen PHA wurde nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel F-1 dieser Erfindung ausgewertet. Folglich waren 99 % davon Einheiten, die von 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure der Formel (8) stammen, und 1 % davon waren Einheiten von 3-Hydroxybuttersäure. Es lag auch eine geringe Menge Cyclohexylmethanol vor.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde mit Mn = 49.000 und Mw = 100.000 bestimmt, wobei die GPC angewendet wurde (TOSOH HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5 μm), Lösungsmittel: Chloroform, Umrechnung in Polystyrol).
Die vorstehend aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß es das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ermöglicht, ein PHA zu erhalten, das eine deutlich große Menge von Einheiten enthält, die von 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure der Formel (8) stammen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wurde der Effekt der Zugabe von Hefeextrakt bestätigt. Außerdem waren die Ausbeute pro Einheit des Mediums und die Ausbeute pro Einheit der Zellmasse deutlich besser. Somit wird bestätigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren sowohl für den hohen Gehalt an 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure-Einheiten im Polymer als auch für die hohe Ausbeute ein sehr effizientes Herstellungsverfahren darstellt.
Das Beispiel F-1 und dieses Beispiel wurde verglichen, und danach wurde bestätigt, daß das erhaltene PHA auch eine deutlich große Menge einer 3- Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure-Einheit enthalten kann, wenn ein Verfahren angewendet wird, bei dem die Zellen in einem mineralischen Medium gezüchtet werden, das Hefeextrakt und 4-Cyclohexylbuttersäure enthält, und dann in ein mineralisches Medium übertragen und darin gezüchtet werden, das keinen Hefeextrakt enthält.
[Beispiel F-3]
Reinigung und NMR-Analyse von PHA, das aus 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure-Einheiten besteht
Das folgende Reinigungsverfahren wurde durchgeführt, um die Komponente in Form von PHB (Poly-3-hydroxybuttersäure), die eingemischt war, und die Komponente, die als Cyclohexylmethanol angesehen wird, aus dem im Beispiel F-2 erhaltenen Polymer zu entfernen.
Das Polymer wurde in Aceton suspendiert, und die Extraktion erfolgte für 24 Stunden bei 60°C. Der flüssige Überstand wurde durch Zentrifugieren aufgefangen, und die Extraktion aus dem gefällten Teil wurde erneut mit Aceton durchgeführt. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt, und dann wurde der aufgefangene flüssige Überstand kondensiert und mit einem Verdampfer gründlich getrocknet. Die gründlich getrocknete Probe wurde in einer geringen Menge Chloroform gelöst und dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt, und danach wurde das erhaltene Polymer vakuumgetrocknet. Das gewonnene getrocknete Polymer wurde mit 281 mg gewogen.
Es wurden die ¹H-NMR- und die ¹³C-NMR-Analyse des Polymers durchgeführt (FT-NMR: Bruker DPX400, verwendetes Lösungsmittel: schweres Chloroform (enthält TMS). Das ¹H-NMR-Spektrum ist in 16 gezeigt, die Zuordnungen in Tabelle 30, und das ¹³C-NMR-Spektrum ist in 17 gezeigt, und die Zuordnungen in Tabelle 31.
Anhand dieser Auswertung wird eingeschätzt, daß die Komponente in Form von PHB (Poly-3-hydroxybuttersäure), die eingemischt war, und die als Cyclohexylmethanol angesehene Komponente entfernt worden waren und ein PHA aufgefangen worden war, das aus 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure bestand.
G:
Ein Beispiel, bei dem das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat bei der Produktion der folgenden Verbindungen angewendet wird: ein Polyhydroxyalkanoat, das aus den Monomereinheiten besteht, die 3-Hydoxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) einschließen, wobei 7-Phenoxyheptansäure als Material verwendet wird, das ein Copolymer ist, das aus 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) besteht.
[Beispiel G-1]
Produktion des Polymers P(HPxV/HPxHp) unter Verwendung des Stamms YN2 (Hefeextrakt – Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco hergestellt) und 0,1 % 7-Phenoxyheptansäure (PxHpA) enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 64 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde herausgelöst, indem es 72 Stunden bei Raumtemperatur (23°C) gemischt wurde. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und dann mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Anschließend wurde das Konzentrat erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen. Das erhaltene Polymer wurde vakuumgetrocknet und gewogen.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory·PLgel·MIXED-C·5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der erhaltenen Polymereinheit wurde nach folgendem Verfahren analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, der Lösung wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Die Trennung erfolgte, indem der Lösung Wasser zugesetzt wurde. Danach wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W hergestellt) EI-Methode), und es erfolgte eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Verbindungen der PHA-Monomereinheit. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und die Ergebnisse der Analyse der Monomereinheiten sind in Tabelle 32 aufgeführt. Die Massenspektren des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) und des Methylesters von 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp), die unter Anwendung der GC-MS erhalten worden waren, sind in den 18 bzw. 19 dargestellt.
Somit wird angenommen, daß bei Verwendung des Stamms YN2 ein PHA-Copolymer produziert werden kann, das nur aus zwei Einheiten aus 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) besteht, wobei 7-Phenoxyheptansäure als Substrat dient.
[Beispiel G-2]
Produktion des Polymers P(HPxV/HPxHp) unter Verwendung des Stamms H45 (Hefeextrakt – Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt) und 0,1 % 7-Phenoxyheptansäure (PxHpA) enthielt, und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Nach 64 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde herausgelöst, indem es 72 Stunden bei Raumtemperatur (23°C) gemischt wurde. Der flüssige Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das kondensierte Fluid wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiedende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C , 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde wie folgt analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nachdem für die Phasentrennung Wasser zugesetzt worden war, wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterten Verbindungen der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheit sind in Tabelle 33 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) und des Methylesters von 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp), das durch GC-MS-Messung erhalten worden war, ist in den 20 bzw. 21 dargestellt.
Anhand des vorstehenden Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm H45 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus zwei Einheiten aus 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) besteht, wobei 7-Phenoxyheptansäure als Substrat dient.
H:
Hier wird ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung von 8-Phenoxyoctansäure (PxOA) als Ausgangsmaterial aufgeführt, wobei dieses Verfahren bei der Herstellung von Polyhydroxyalkanoat angewendet wird, das aus Monomereinheiten besteht, die von drei Arten von Substanzen stammen, wozu 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx) und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO) gehören, und ein Copolymer ist, das aus 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx) und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO) besteht.
[Beispiel H-1]
Produktion des Polymers P(HPxB/HPxHx/HPxO) unter Verwendung des Stamms YN2 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt) und 0,1 % 8-Phenoxyoctansäure (PxOA) enthielt, und es erfolgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23 ° C) herausgelöst. Der flüssige Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde wie folgt analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser für die Phasentrennung wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindung der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheiten sind in Tabelle 34 aufgeführt. Die Massenspektren des Methylesters von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), der 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx) und des Methylesters von 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO), die durch GC-MS-Messung erhalten worden waren, sind in den 22, 23 bzw. 24 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm YN2 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus drei Einheiten in Form von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx) und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO) besteht, wenn 8-Phenoxyoctansäure als Substrat verwendet wird.
[Beispiel H-2]
Produktion des Polymers P(HPxB/HPxHx/HPxO) unter Verwendung des Stamms H45 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm H45 wurde in das Medium M9 mit einem Volumen von 200 ml geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt) und 0,1 % 8-Phenoxyoctansäure (PxOA) enthielt, und es erfolgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23°C) herausgelöst. Der flüssige Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das kondensierte Fluid wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde wie folgt analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser für die Phasentrennung wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindung der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheit sind in Tabelle 35 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), der 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx) und des Methylesters von 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO), das durch GC-MS-Messung erhalten worden war, ist in den 25, 26 bzw. 27 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm H45 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus drei Einheiten in Form von 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure (3HPxB), 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure (3HPxHx) und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure (3HPxO) besteht, wenn 8-Phenoxyoctansäure als Substrat verwendet wird.
I:
Hier wird ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung von 11-Phenoxyundecansäure (PxUDA) als Ausgangsmaterial aufgeführt, wobei dieses Verfahren bei der Herstellung von Polyhydroxyalkanoat angewendet wird, das aus Monomereinheiten besteht, die von drei Arten von Substanzen stammen, wozu 3-Hydroxy-4-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN) gehören, und ein Copolymer ist, das aus 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN) besteht.
[Beispiel I-1]
Produktion des Polymers P(HPxN/HPxHp/HPxV) unter Verwendung des Stamms YN2 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt) und 0,1 % 11-Phenoxyundecansäure (PxUDA) enthielt, und in einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C gezüchtet. Nach 64 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23°C) herausgelöst. Der Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das Kondensat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde wie folgt analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser für die Phasentrennung wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindunge der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheiten sind in Tabelle 36 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), der 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und des Methylesters von 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN), das unter Anwendung der GC-MS erhalten worden war, ist in den 28, 29 bzw. 30 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm YN2 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus drei Einheiten in Form von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN) besteht, wenn 11-Phenoxyundecansäure als Substrat verwendet wird.
[Beispiel I-2]
Produktion des Polymers P(HPxN/HPxHp/HPxV) unter Verwendung des Stamms H45 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt) und 0,1 % 11-Phenoxyundecansäure (PxUDA) enthielt, und in einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C gezüchtet. Nach 64 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23°C) herausgelöst. Der Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das kondensierte Fluid wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde wie folgt analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser für die Phasentrennung wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindung der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheiten sind in Tabelle 37 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), der 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und des Methylesters von 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN), das unter Anwendung der GC-MS erhalten worden war, ist in den 31, 32 bzw. 33 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm H45 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus drei Einheiten in Form von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure (3HPxHp) und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure (3HPxN) besteht, wenn 11-Phenoxyundecansäure als Substrat verwendet wird.
J:
Hier wird ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung von 6-Phenylhexansäure (PHxA) als Ausgangsmaterial aufgeführt, wobei dieses Verfahren bei der Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, das aus Monomereinheiten besteht, die von 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx) abgeleitet sind, das heißt von Poly-3-hydroxy-6-phenylhexansäure (PHPHx), oder bei der Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats angewendet wird, das aus Monomereinheiten besteht, die von 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx) und 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure (3HPB) stammen, und ein Copolymer ist, das aus 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx) und 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure (3HPB) besteht.
[Beispiel J-1]
Produktion des Polymers PHPHx unter Verwendung des Stamms YN2 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt) und 0,1 % 6-Phenylhexansäure (PHxA) enthielt, und in einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C gezüchtet. Nach 27 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23°C) herausgelöst. Der Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das kondensierte Fluid wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde allein der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde wie folgt analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser und der fraktionierten Trennung des Fluids wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindung der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheit sind in Tabelle 38 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx), das durch GC-MS-Messung erhalten wurde, ist in 34 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm YN2 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das allein aus 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx) besteht, wenn 6-Phenylhexansäure als Substrat verwendet wird.
[Beispiel J-2]
Produktion des Polymers P(HPXx/HPB) unter Verwendung des Stamms H45 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt) und 0,1 % 6-Phenylhexansäure (PHxA) enthielt, und in einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C gezüchtet. Nach 27 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23°C) herausgelöst. Der Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das kondensierte Fluid wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde wie folgt analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser für die Phasentrennung wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindung der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheit sind in Tabelle 39 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure (3HPB) und der 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx), das durch GC-MS-Messung erhalten wurde, ist in 35 bzw. 36 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm H45 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure (3HPB) und 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure (3HPHx) besteht, wenn 6-Phenylhexansäure als Substrat verwendet wird.
K:
Hier wird ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung von sowohl 5-Phenylvaleriansäure (PVA) als auch 5-Phenoxyvaleriansäure (PxVA) als Ausgangsmaterialien aufgeführt, wobei dieses Verfahren bei der Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats angewendet wird, das aus Monomereinheiten in Form von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) und 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) besteht und ein Copolymer ist, das aus 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) und 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) besteht.
[Beispiel K-1]
Produktion des Polymers P(HPV/HPxV) unter Verwendung des Stamms YN2 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm YN2 wurde in 200 ml des Kulturmediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt), 0,05 % 5-Phenylvaleriansäure (PVA) und 0,05 % 5-Phenoxyvaleriansäure (PxVA) enthielt, und bei 30°C in einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23°C) herausgelöst. Der Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das Kondensat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde nach folgendem Verfahren analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser und der fraktionierten Trennung des Fluids wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindung der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheit sind in Tabelle 40 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) und der 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS-Messung erhalten wurde, ist in 37 bzw. 38 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm YN2 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) und 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) besteht, die der 5-Phenylvaleriansäure und 5-Phenoxyvaleriansäure als Substrate entsprechen.
[Beispiel K-2]
Produktion des Polymers P(HPV/HPxV) unter Verwendung des Stamms H45 (Hefeextrakt, Kultur mit einem Schritt)
Der Stamm H45 wurde in 200 ml des Kulturmediums M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco Co. hergestellt), 0,05 % 5-Phenylvaleriansäure (PVA) und 0,05 % 5-Phenoxyvaleriansäure (PxVA) enthielt, und bei 30°C in einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen, gefriergetrocknet und gewogen.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Aceton suspendiert, und das Polymer wurde durch 72stündiges Mischen bei Raumtemperatur (23°C) herausgelöst. Der Extrakt wurde mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer kondensiert. Das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und danach wurde der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das zu wiegende Polymer erhalten wurde.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC: Toso HLC-8020, Säule: Polymer Laboratory, PLgel MIXED-C, 5 μm, Lösungsmittel: Chloroform, Molekulargewicht auf Polystyrol umgerechnet).
Die Zusammensetzung der Einheiten des erhaltenen Polymers wurde nach folgendem Verfahren analysiert: 5 mg der Polymerprobe wurden in einen auberginenförmigen 25 ml Kolben gegeben, es wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol zugesetzt, das 3 % (V./V.) Schwefelsäure enthielt, und es wurde 3,5 Stunden bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von Wasser für die Phasentrennung wurde die organische Schicht mit einem Gaschromatographen-Massenspektrometer analysiert (GC-MS, Shimadzu QP-5050, Säule: DB-WAXETR (von J&W Co hergestellt) EI-Methode), um die mit Methyl veresterte Verbindung der PHA-Monomereinheit zu identifizieren. Die Ausbeute der Zellen und des Polymers und das Ergebnis der Analyse der Monomereinheit sind in Tabelle 41 aufgeführt. Das Massenspektrum des Methylesters von 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) und der 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV), das durch GC-MS-Messung erhalten wurde, ist in 39 bzw. 40 dargestellt.
Anhand des vorstehend aufgeführten Ergebnisses wird deutlich, daß der Stamm H45 ein PHA-Copolymer produzieren kann, das nur aus 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) und 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure (3HPxV) besteht, die der 5-Phenylvaleriansäure und 5-Phenoxyvaleriansäure als Substrate entsprechen. Tabelle 1
Tabelle 2

CDW: Trockengewicht der Zellen (mg/l)
PDW: Trockengewicht des Polymers (mg/l)
Ausbeute: PDW/CDW (%)

¹

¹

¹

¹

¹

¹

¹³

Tabelle 30 ¹H-Spektrum
Tabelle 31 ¹³C-Spektrum
Tabelle 32
Tabelle 33
Tabelle 34
Tabelle 35
Tabelle 36
Tabelle 37
Tabelle 38
Tabelle 39
Tabelle 40
Tabelle 41

Claims

Polyhydroxyalkanoat, das eine oder mehrere Monomereinheiten aus einer 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure-Einheit der Formel (7) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat, das eine oder mehrere Monomereinheiten aus einer 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure-Einheit der Formel (6) und einer 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure-Einheit der Formel (9) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat, das eine oder mehrere Monomereinheiten aus einer 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure-Einheit der Formel (10) und 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure-Einheiten der Formel (11) umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Zahlenmittel des Molekulargewichts 10 bis 200 Tausend beträgt.
Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, umfassend: einen Schritt, bei dem ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das ein Alkanoat-Ausgangsmaterial und einen Hefeextrakt enthält, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung dieses Alkanoats ein Polyhydroxyalkanoat produziert, und einen Schritt, bei dem das Polyhydroxyalkanoat aus den Zellen des Mikroorganismus herausgelöst wird; wobei das Alkanoat mit der Formel (12) angegeben wird und das Polyhydroxyalkanoat eine oder mehrere Monomereinheiten der Formel (13) aufweist:
wobei in der Formel (12) R unabhängig aus zumindest einem Rest aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Formeln (2), (3) und (4) besteht
wobei in der Formel (2) R1 aus der Gruppe von einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist und q eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist; in der Formel (3) R2 aus der Gruppe von einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist und r eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist; in der Formel (4) R3 aus der Gruppe von einem Wasserstoffatom (H), einem Halogenatom, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅ und -C₃F₇ ausgewählt ist und s eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist;
worin R' das für das Alkanoat ausgewählte R oder eine Gruppe ist, die das gleiche R1, R2 oder R3 als R hat, jedoch q = q₀, q = q₀ – 2, q = q₀ – 4, q = q₀ – 6; oder r = r₀, r = r₀ – 2, r = r₀ – 4 oder r = r₀ – 6; oder s = s₀ oder s = s₀ – 2, s = s₀ – 4 oder s = s₀ – 6; wobei q_0, r₀ und s₀ gleich q, r oder s von R sind und q₀ – 2, r₀ – 2; s₀ – 2, q₀ – 4, r₀ – 4; s₀ – 4, q₀ – 6, r₀ – 6; oder s₀ – 6 nur ganze Zahlen größer als 1 sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formel (5) hat und der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das 4-Phenoxybuttersäure der Formel (14) und einen Hefeextrakt enthält, wobei der Mikroorganismus unter Verwendung von 4-Phenoxybuttersäure Poly-3-hydroxy-4-phenoxybuttersäure produziert
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formel (6) hat und das Kulturmedium 5-Phenoxyvaleriansäure der Formel (15) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 5-Phenoxyvaleriansäure Poly-3-hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure produziert
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formel (16) hat, das Kulturmedium 5-(4-Fluorphenoxy)valeriansäure der Formel (17) und Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 5-(4-Fluorphenoxy)valeriansäure Poly-3-hydroxy-5-(4-fluorphenoxy)valeriansäure produziert
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formel (9) hat, das Kulturmedium 5-Phenylvaleriansäure der Formel (18) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 5-Phenylvaleriansäure Poly-3-hydroxy-5-phenylvaleriansäure produziert
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formel (7) hat, das Kulturmedium 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure der Formel (19) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure Poly-3-hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure produziert
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formel (8) hat, das Kulturmedium 4-Cyclohexylbuttersäure der Formel (20) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 4-Cyclohexylbuttersäure Poly-3-hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure produziert
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formeln (6) und (9) hat, das Kulturmedium 5-Phenoxyvaleriansäure der Formel (15), 5-Phenylvaleriansäure der Formel (18) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 5-Phenoxyvaleriansäure und 5-Phenylvaleriansäure ein Polyhydroxyalkanoat produziert, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure umfaßt
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formeln (10) und (11) hat, das Kulturmedium 6-Phenylhexansäure der Formel (21) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 6-Phenylhexansäure ein Polyhydroxyalkanoat produziert, das 3-Hydroxy-4-phenylbuttersäure und 3-Hydroxy-6-phenylhexansäure umfaßt
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formeln (6) und (22) hat, das Kulturmedium 7-Phenoxyheptansäure der Formel (23) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 7-Phenoxyheptansäure ein Polyhydroxyalkanoat produziert, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure umfaßt
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formeln (5), (24) und (25) hat, das Kulturmedium 8-Phenoxyoctansäure der Formel (26) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 8-Phenoxyoctansäure ein Polyhydroxyalkanoat produziert, das 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure umfaßt
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Monomereinheit die Formeln (6), (22) und (27) hat, das Kulturmedium 11-Phenoxyundecansäure der Formel (28) und einen Hefeextrakt enthält und der Mikroorganismus unter Verwendung von 11-Phenoxyundecansäure ein Polyhydroxyalkanoat produziert, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure, 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure umfaßt
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 16, wobei der Züchtungsschritt eine Züchtung in einem Schritt in einem Kulturmedium ist, das das Alkanoat und einen Hefeextrakt enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 16, wobei der Züchtungsschritt eine Züchtung in zwei Schritten in einem Kulturmedium ist, das das Alkanoat und einen Hefeextrakt enthält, gefolgt von einer Züchtung in einem das Alkanoat enthaltenden Kulturmedium mit eingeschränktem Stickstoff.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 18, das ferner einen Schritt der Abtrennung/Reinigung des Polyhydroxyalkanoats umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 19, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Pseudomonas gehört.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Mikroorganismus zumindest einer aus der Gruppe von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375), Pseudomonas cichorii H45 (FERM BP-7374), Pseudomonas putida P91 (FERM BP-7373) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-7376) ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 17 oder 18, wobei das Alkanoat-Ausgangsmaterial eine einzige Art des Alkanoats der Formel (12) ist und das Polyhydroxyalkanoat ein Homopolymer ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 17 oder 18, wobei das Alkanoat-Ausgangsmaterial nicht mehr als fünf Arten des Alkanoats der Formel (12) ist.