DE60210374T2

DE60210374T2 - Polyhydroxyalkanoate die (methylsulfanyl) Phenoxystrukturen in der Seitenkette enthalten

Info

Publication number: DE60210374T2
Application number: DE60210374T
Authority: DE
Inventors: Takashi Ohta-ku Kenmoku; Etsuko Ohta-ku Sugawa; Tetsuya Ohta-ku Yano; Takeshi Ohta-ku Imamura
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2022-07-11
Also published as: KR100498221B1; EP1275727B1; EP1275727A3; US20030109015A1; KR20030016161A; US6869782B2; EP1275727A2; DE60210374D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat (PHA), das eine neue Struktureinheit umfaßt, und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues biologisch abbaubares PHA, das 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten umfaßt, die am Ende ihrer Seitenkette eine (Methylsulfanyl)phenoxygruppe aufweisen, und ein Verfahren zur Herstellung der PHA aus einer Alkansäure, die am Ende ihrer Seitenkette eine (Methylsulfanyl)phenoxygruppe aufweist, unter Verwendung eines Mikroorganismus, der PHA produzieren und in der Zelle speichern kann.
Einschlägiger Stand der Technik
Es ist berichtet worden, daß verschiedene Mikroorganismen Poly-3-hydroxybutyrat (hier nachstehend auch als "PHB" abgekürzt) oder ein anderes PHA produzieren und in der Zelle speichern können ("Biodegradable Plastics Handbook", Biodegradable Plastics Society Ed., NTS, S. 178-197 (1995)). Diese Polymere können zum Beispiel wie bei herkömmlichen Kunststoffen durch Verarbeiten aus der Schmelze für die Herstellung verschiedener Produkte verwendet werden, im Gegensatz zu vielen herkömmlichen synthetischen Polymerverbindungen verursachen diese Polymere jedoch keine Umweltverschmutzung, da sie biologisch abbaubar sind, das heißt sie werden von Mikroorganismen in der Natur vollständig abgebaut. Außerdem weisen sie eine gute Biokompatibilität auf, und es läßt sich deren Verwendung als weiche Materialien auf dem Gebiet der Medizin erwarten.
Mikrobielle PHA haben bekanntlich in Abhängigkeit von zum Beispiel der Art des Mikroorganismus, den Zusammensetzungen des Kulturmediums und den Kulturbedingungen, unterschiedliche Zusammensetzungen und/oder Strukturen. Folglich sind Untersuchungen vorgenommen worden, um die Zusammensetzung und Struktur zu regeln, damit die physikalischen Eigenschaften des PHA verbessert werden. Es ist zum Beispiel bekannt, daß Alcaligenes eutrophus H16 (ATCC Nr. 17699) und Mutante davon Copolymere von 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat (hier nachstehend als 3HV abgekürzt) mit unterschiedlichen Zusammensetzungsverhältnissen produzieren (japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-15604 und japanische Patentveröffentlichung Nr. 7-14352 und japanische Patentveröffentlichung Nr. 8-19227).
Das japanische Patent Nr. 2642937 offenbart die Herstellung von PHA mit Monomereinheiten aus C₆-C₁₂-3-Hydroxyalkanoat, indem Pseudomonas oleovorans (ATCC Nr. 29347) acyclische aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen als Substrate zugeführt werden.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-7492 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Copolymers von 3HB und 3HV unter Verwendung eines Mikroorganismus, wie Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp. und Pseudomonas sp. in Kontakt mit einem primären C₃-C₇-Alkohol.
Die offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 5-93049 und 7-265065 offenbaren die Herstellung von Zweikomponenten-Copolymeren von 3HB und 3-Hydroxyhexanat durch Züchten von Aeromonas caviae mit Oleinsäure oder Olivenöl als Substrat.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 9-191893 offenbart, daß Comamonas acidovorans IFO 13852 Polyester produziert, der als Monomereinheiten 3HB und 4-Hydroxybutyrat enthält, wenn er in Gegenwart von Gluconsäure und 1,4-Butandiol als Substrate gezüchtet wird.
Es ist ferner bereits bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen PHA produzieren, in die verschiedene Substituenten eingeführt sind, wie ungesättigte Kohlenwasserstoffe, Estergruppen, Cyanogruppen, Halogenkohlenwasserstoffe und Epoxide. Macromol. Chem., 191, 1957-1965 (1990), Macromolecules, 24, 5256-5260 (1991) und Chirality, 3, 492-494 (1991) berichten zum Beispiel, daß Pseudomonas oleovorans PHA produziert, die als Monomereinheit 3-Hydroxy-5-phenylvalerat (hier nachstehend als 3HPV abgekürzt) enthalten, wobei möglicherweise aufgrund des Vorhandenseins von 3HPV Änderungen der physikalischen Eigenschaften des PHA beobachtet werden.
Von den PHA mit einem Substituenten an ihrer Seitenkette gab es unlängst bei jenen mit einer Phenoxygruppe an der Seitenkette eine rege Entwicklung.
Es ist berichtet worden, daß Pseudomonas oleovorans aus 11-Phenoxyundecansäuren PHA produziert, das mit Monomereinheiten aus 3-Hydroxy-5-phenoxyvalerat und 3-Hydroxy-9-phenoxynonanoat hergestellt ist (Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672 (1994)).
Macromolecules, 29, 3432-3435 (1996) berichtet von der Herstellung von PHA mit Monomereinheiten aus 3-Hydroxy-4-phenoxybutyrat und 3-Hydroxy-6-phenoxyhexanoat aus 6-Phenoxyhexansäuren; von der Herstellung von PHA mit Einheiten aus 3-Hydroxy-4-phenoxybutyrat, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexanoat, 3-Hydroxy-4-phenoxybutyrat, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexanoat und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctanoat aus 8-Phenoxyoctansäure; und von der Herstellung von PHA, das mit Einheiten von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure hergestellt ist, aus 11-Hydroxyundecansäure unter Verwendung von Pseudomonas oleovorans.
Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995) berichtet von der Herstellung von PHA, die als Monomereinheiten 3-Hydroxy-6-(4-cyanophenoxy)hexansäuren oder 3-Hydroxy-6-(4-nitrophenoxy)hexansäure enthalten, durch Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 oder Pseudomonas putida KT 2422, wobei als Substrat Octansäure und 6-(4-Cyanophenoxy)hexansäure oder 6-(p-Nitrophenoxy)hexansäure verwendet werden.
Kürzlich gab es bei PHA mit einer Phenoxygruppe an ihrer Seitenkette, insbesondere jene mit funktionellen Gruppen, wie Fluor, Cyano und Nitro, die in den aromatischen Phenoxyring der Seitenkette eingeführt sind, eine rege Entwicklung. Obwohl es viele Berichte über ein solches PHA gibt, sind die Spezies auf die vorstehend beschriebenen begrenzt, und es gibt keinen Bericht über PHA mit neuen funktionellen Gruppen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues PHA, das eine neue Monomereinheit mit einer funktionellen Gruppe (Methylsulfanylgruppe) am aromatischen Ring der Phenoxygruppe an seiner Seitenkette enthält, und ein Verfahren zu dessen Herstellung bereitzustellen.
Nach einem Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Polyhydroxyalkanoat bereit, das eine Einheit der folgenden chemischen Formel (1) umfaßt:
wobei x eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist.
Nach einer Ausführungsform umfaßt das Polyhydroxyalkanoat ferner eine oder mehrere Einheiten, die aus 3-Hydroxyalkanoaten und 3-Hydroxyalkenoaten ausgewählt sind.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Polyhydroxyalkanoat bereit, das eine 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat-Einheit der chemischen Formel (4) umfaßt:
Nach einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, umfassend den Schritt des Züchtens eines PHA produzierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das die entsprechende ω-[(Methylsulfanyl)phenoxy]alkansäure der folgenden chemischen Formel (5) enthält:
worin x eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist, für die Erzeugung des vorstehend beschriebenen Polyhydroxyalkanoats.
Nach einer Ausführungsform ist die ω-[(Methylsulfanyl)phenoxy]alkansäure eine 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure der folgenden Formel (6):
Das erfindungsgemäße PHA ist als funktionelles Polymer mit der möglichen Verwendbarkeit als Materialien für Geräte und Medikamentenmaterialien vorteilhaft.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von PHA ermöglicht eine effiziente mikrobielle Produktion eines neuen biologisch abbaubaren PHA, das eine 3-Hydroxy-ω-[(methylsulfanyl)phenoxy]alkanoat-Einheit enthält, aus der entsprechenden ω-[(Methylsulfanyl)phenoxy]alkansäure.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum eines in Beispiel 1 erhaltenen Polyhydroxyalkanoats.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das neue erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat hat an der Seitenkette der Hydroxyalkanoat-Einheit eine (Methylsulfanyl)phenoxy-Struktur. Diese Struktur bietet physikalische und chemische Eigenschaften, die sich von denen bekannter mikrobieller Polyhydroxyalkanoate deutlich unterscheiden.
Das erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat enthält eine Einheit der folgenden chemischen Formel (1):
wobei x eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist.
Zusätzlich zur vorstehend beschriebenen Monomereinheit kann das erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat eine oder mehrere Einheiten enthalten, die aus 3-Hydroxyalkanoaten und 3-Hydroxyalkenoaten der folgenden chemischen Formel (2) bzw. (3) ausgewählt sind:
worin y eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist,
worin z die ganze Zahl 3 oder 5 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist.
Das erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat hat typischerweise ein Zahlenmittel des Molekulargewichts von 5.000 bis 300.000.
Das erfindungsgemäße neue Polyhydroxyalkanoat kann durch folgende Schritte hergestellt werden:
Züchten eines PHA produzierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das ein Wachstumssubstrat und eine ω-[(Methylsulfanyl)phenoxy]alkansäure als Einsatzmaterial enthält; und Gewinnen der Polyhydroxyalkanoat enthaltenden Einheiten, die am Ende ihrer Seitenkette eine (Methylsulfanyl)phenoxygruppe aufweisen, die während des Züchtungsschritts vom Mikroorganismus produziert und im Mikroorganismus gespeichert worden sind. Bei den mikrobiellen PHA sind die Kohlenstoffatome in der 3-Position aller 3-Hydroxyalkanoat-Einheiten, einschließlich der mit der chemischen Formel (1) angegebenen, asymmetrische Kohlenstoffatome, deren absolute Konfiguration R ist, was auf deren biologische Abbaubarkeit hinweist.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend ausführlicher beschrieben.
< PHA erzeugende Mikroorganismen >
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von PHA können irgendwelche Mikroorganismen für die Produktion des PHA verwendet werden, das eine Einheit enthält, die am Ende ihrer Seitenkette eine (Methylsulfanyl)phenoxygruppe aufweist, sofern der Mikroorganismus das gewünschte PHA produzieren und in den Zellen speichern kann, wenn er in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das die entsprechende ω-[(Methylsulfanyl)phenoxy]alkansäure der chemischen Formel (5) als Ausgangsverbindung enthält. Die Mikroorganismen können zum Beispiel jene sein, die zur Gattung Pseudomonas gehören, die die Fähigkeit haben, PHA zu produzieren.
Zu Beispielen geeigneter Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas gehören die folgenden drei Stämme: Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375), Pseudomonas cichorii H45 (FERM BP-7374) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-7376). Diese drei Mikroorganismen wurden vom Anmelder zuerst als nationale Hinterlegung hinterlegt und sind gemäß dem Budapester Vertrag unter den vorstehend genannten Zugangsnummern beim International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Independent Administrative Institution, Ministry of Economy, Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, JAPAN (ehemals National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH) of the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry) als internationale Hinterlegung hinterlegt. Sie sind auch in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2002-80571 als neue Stämme beschrieben, die PHA produzieren können.
Die bakteriologischen Eigenschaften der Stämme YN2, H45 und P161 sind nachfolgend aufgeführt.
Bakteriologische Eigenschaften des Stamms YN2 >
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Stäbchen 0,8 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zellen: negativ
Mobilität: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig, vollständiger glatter Rand, wenig konvex, glatte Oberfläche, glänzend, durchscheinend

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ (nicht fermentierend)
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: positiv
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Unease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung von fluoreszierendem Pigment auf King B-Agar: positiv
Wachstum unter 4 % NaCl: positiv (schwaches Wachstum)
Akkumulation von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ
Tween 80-Hydrolyse: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Bakteriologische Eigenschaften des Stamms H45 >
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Stäbchen 0,8 μm × 1,0 bis 1,2 μm
Polymorphie der Zellen: negativ
Mobilität: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig, vollständiger glatter Rand, wenig konvex, glatte Oberfläche, glänzend, cremefarben

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung von fluoreszierendem Pigment auf King B-Agar: positiv
Wachstum unter 4 % NaCl: negativ
Akkumulation von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

< Bakteriologische Eigenschaften des Stamms P161 >
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Sphären ∅ 0,6 μm, Stäbchen 0,6 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zellen: längliche Form
Mobilität: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: Kreis, vollständiger glatter Rand, wenig konvex, glatte Oberfläche, schwach gelb

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: positiv
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: positiv
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung von fluoreszierendem Pigment auf King B-Agar: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Stämmen von Pseudomonas sp. können Stämme verwendet werden, die zur Gattung Aeromonas, zur Gattung Commamonas und zur Gattung Burkholderia gehören, die PHA produzieren können, das eine 3-Hydroxy-ω-[(methylsulfanyl]phenoxy]alkanoat-Einheit enthält, wobei als Einsatzmaterial ω-[(Methylsulfanyl]phenoxy]alkansäure verwendet wird.
Züchtung
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von PHA durch Züchten des vorstehend genannten Mikroorganismus, der PHA produzieren kann, in einem Kulturmedium, das ω-[(Methylsulfanyl]phenoxy]alkansäure der vorstehenden chemischen Formel (5) als Einsatzmaterial enthält, wird ein PHA der chemischen Formel (1), das 3-Hydroxyalkanoat-Einheiten mit einer (Methylsulfanyl)phenoxygruppe am Ende ihrer Seitenkette enthält, erzeugt und in den Zellen gespeichert.
Für die übliche Züchtung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen, um zum Beispiel Vorratsstämme herzustellen oder Zellen zu erhalten oder die Aktivitäten aufrecht zu erhalten, die für die Produktion des PHA erforderlich sind, werden die Kulturmedien so ausgewählt, daß sie die für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen erforderlichen Bestandteile enthalten. Es kann zum Beispiel irgendeines der bekannten Kulturmedien, wie typische natürliche Kulturmedien (zum Beispiel Nährbouillon, Hefeextrakt) und synthetische Kulturmedien, die mit Nährstoffen ergänzt sind, verwendet werden, sofern das Kulturmedium das Wachstum und Überleben der Mikroorganismen nicht nachteilig beeinflußt. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, Belüften und Bewegen, werden in Abhängigkeit von den verwendeten Mikroorganismen geeignet ausgewählt.
Um das gewünschte PHA unter Verwendung des wie vorstehend beschriebenen, PHA produzierenden Mikroorganismus zu produzieren, kann ein anorganisches Kulturmedium verwendet werden, das zumindest ein Wachstumssubstrat für den Mikroorganismus und eine Verbindung der vorstehenden chemischen Formel (5), die der Monomereinheit entspricht, als Einsatzmaterial für die Erzeugung von PHA umfaßt. Es ist wünschenswert, wenn die Verbindung der vorstehenden chemischen Formel (5) in einer Menge von 0,01 bis 1 % (Gew.-/Vol.) und stärker bevorzugt von 0,02 bis 0,2 % (Gew./Vol.) pro Kulturmedium enthalten ist. Die Verbindung der chemischen Formel (5) hat nicht immer eine gute Wasserlöslichkeit. Mit den hier angegebenen Mikroorganismen würde eine Suspension jedoch nicht zu einem Problem führen.
Die Einsatzmaterialverbindung, die dem Kulturmedium zugesetzt werden soll, kann eine oder mehrere Verbindungen der chemischen Formel (5) sein, wie zum Beispiel 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valerat und 6-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]hexansäure.
Die Einsatzmaterialverbindung der chemischen Formel (5) kann dem Kulturmedium in einigen Fällen als Lösung oder Suspension in einem Lösungsmittel, wie 1-Hexadecen oder n-Hexadecen, zugesetzt werden, um das Dispersionsvermögen zu verbessern. In einem solchen Fall muß die Konzentration des Lösungsmittels gleich oder kleiner als 3 % (V./V.), auf die Lösung des Kulturmediums bezogen, sein.
Es ist bevorzugt, dem Kulturmedium ein Wachstumssubstrat für das mikrobielle Wachstum getrennt zuzusetzen. Als Wachstumssubstrat können Nährstoffe, wie Hefeextrakt, Polypepton und Fleischextrakt, verwendet werden. Das Wachstumssubstrat kann auf der Basis der Nützlichkeit als Substrat für den zu verwendenden Stamm aus Sacchariden, im Citratzyklus erzeugten organischen Säuren, organischen Säuren oder Salzen davon, die durch biochemische Reaktionen einen oder zwei Schritte später als der Citratzyklus erzeugt worden sind, Aminosäuren oder Salze davon, geradkettigen C₄-C₁₂-Alkansäuren oder Salzen davon ausgewählt werden.
Ein oder mehrere Saccharide können geeignet verwendet werden, die aus Aldosen, wie Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Fructose; Alditolen, wie Glycerol, Erythritol und Xylitol; Aldonsäuren, wie Gluconsäure; Uronsäure, wie Glucuronsäure und Galacturonsäure; und Disaccharid, wie Maltose, Saccharose und Lactose, ausgewählt sind.
Als organische Säuren oder Salze davon können ein oder mehrere Verbindungen geeignet aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succhinsäure und Salzen davon ausgewählt werden.
Als Aminosäuren oder Salze davon können eine oder mehrere Verbindungen geeignet aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon ausgewählt werden.
Davon sind Polypepton und Saccharide bevorzugt. Zu den bevorzugten Sacchariden gehört zumindest eins, das aus Glucose, Fructose und Mannose ausgewählt ist. Das Substrat ist vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 5 % (Gew.-/Vol.) und stärker bevorzugt von 0,2 bis 2 % (Gew.-/Vol.) im Kulturmedium enthalten.
Gelegentlich wird die mikrobielle Produktivität bezüglich PHA verbessert, wenn der Mikroorganismus vollständig gewachsen ist und dann in ein Kulturmedium übertragen wird, in dem eine Stickstoffquelle, wie Ammoniumchlorid, begrenzt ist und dem eine Verbindung zugesetzt wird, die als Substrat für PHA dient. Es kann zum Beispiel eine Methode mit mehreren Schritten angewendet werden, die nacheinander zwei oder mehrere Schritte bei unterschiedlichen Züchtungsbedingungen vornimmt.
Insbesondere wird ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine Verbindung der chemischen Formel (5) und Polypepton enthält, von der späten logarithmischen Phase bis zur stationären Phase (Schritt 1-1) gezüchtet und dann zum Beispiel durch Zentrifugieren aufgefangen. Dann wird der im Schritt 1-1 gezüchtete Mikroorganismus in einem Kulturmedium weiter gezüchtet, das eine Verbindung der chemischen Formel (5) und eine organische Säure oder ein Salz davon enthält, wie sie vorstehend beschrieben sind (vorzugsweise ohne Stickstoffquelle) (Schritt 1-2). In einer anderen Ausführungsform wird der Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine Verbindung der chemischen Formel (5) und ein wie vorstehend beschriebenes Saccharid enthält, von der späten logarithmischen Phase bis zur stationären Phase gezüchtet (Schritt 1-3) und zum Beispiel durch Zentrifugieren aufgefangen. Dann wird der im Schritt 1-3 gezüchtete Mikroorganismus in einem Kulturmedium weiter gezüchtet, das die Verbindung der chemischen Formel (5) und ein wie vorstehend angegebenes Saccharid enthält (vorzugsweise ohne eine Stickstoffquelle) (Schritt 1-4).
Die Züchtungstemperatur sollte eine Temperatur sein, bei der die vorstehend genannten Stämme ausreichend wachsen können. Die Züchtungstemperatur kann zum Beispiel 15 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 35°C und stärker bevorzugt 20 bis 30°C betragen.
Die Züchtung kann durch irgendwelche geeigneten Züchtungsverfahren, wie eine Flüssig- oder Festkultur, erfolgen, durch die die vorstehend genannten Mikroorganismen wachsen können, um Polyhydroxyalkanoate zu produzieren. Die Art der Züchtung ist ferner nicht begrenzt, sofern Sauerstoff geeignet zugeführt wird. Zu Beispielen gehören die Batch-Kultur, die Fed-batch-Kultur, die halbkontinuierliche Kultur und die kontinuierliche Kultur. Bei der Batch-Flüssigkultur kann Sauerstoff zugeführt werden, indem der Inhalt eines Schüttelkolbens geschüttelt wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Sauerstoff mittels eines Verfahrens aus Bewegen-Belüften unter Verwendung eines Fermentors zugeführt werden.
Als für das vorstehend genannte Züchtungsverfahren zu verwendendes anorganisches Kulturmedium kann irgendein Kulturmedium benutzt werden, das Bestandteile enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind, wie eine Phosphorquelle (zum Beispiel Phosphate) und eine Stickstoffquelle (zum Beispiel Ammoniumsalze, Nitrate). Es können zum Beispiel das Medium MSB und das Medium M9 verwendet werden.
Nachfolgend ist die Zusammensetzung eines anorganischen Kulturmediums (Medium M9) aufgeführt, das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird. (Medium M9)

Na₂HPO₄ 6,2 g

KH₂PO₄ 3,0 g

NaCl 0,5 g

NH₄Cl 1,0 g

(in 1 Liter Kulturmedium, pH = 7,0).
Um ein gutes Wachstum und die Produktion der Polyhydroxyalkanaate zu sichern, muß dem vorstehend genannten anorganischen Kulturmedium eine Lösung von geringfügigen Bestandteilen, die nachstehend angegeben sind, in einer Menge von etwa 0,3 % (V./V.) zugesetzt werden. (Lösung der geringfügigen Bestandteile)

Nitrilotriessigsäure: 1,5 g

MgSO₄: 3,0 g

MnSO₄: 0,5 g

NaCl: 1,0 g

FeSO₄: 0,1 g

CaCl₂: 0,1 g

CoCl₂: 0,1 g

ZnSO₄: 0,1 g

CuSO₄: 0,1 g

AlK(SO₄)₂: 0,1 g

H₃BO₃: 0,1 g

Na₂MoO₄: 0,1 g

NiCl₂: 0,1 g

(in 1 Liter Lösung, pH = 7,0)
< Gewinnung des PHA >
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus erzeugt das gewünschte PHA und speichert es in der Zelle. Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von PHA ist folglich nach der Züchtung ein Schritt vorgesehen, bei dem das gewünschte PHA aus den Zellen gewonnen wird.
Um das PHA aus den Zellen zu gewinnen, wird ein Verfahren zum Herauslösen mit einem Lösungsmittel angewendet, bei dem das löslich gemachte Polyhydroxyalkanoat von unlöslichen Zellkomponenten getrennt wird. Ein übliches Verfahren zum Herauslösen mit Chloroform ist am bequemsten und einfach, es kann jedoch ein von Chloroform verschiedenes Lösungsmittel, wie Dichlormethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril und Aceton, verwendet werden. In Umgebungen, in denen die Verwendung eines organischen Lösungsmittels problematisch ist, werden Komponenten der Stämme, die von den Polyhydroxyalkanoaten verschieden sind, entfernt, indem zum Beispiel mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie SDS, mit einem Enzym, wie Lysozym, oder mit EDTA, behandelt wird und die Zellkomponenten entfernt werden, um nur die Polyhydroxyalkanoate zu gewinnen. In einer anderen Ausführungsform kann eine Behandlung zur Zerstörung der Zellen, wie Aufbrechen mit Ultraschall, Homogenisieren, Aufbrechen mittels Druck, Aufbrechen mittels Glaskügelchen, Pulverisieren, Mahlen und Gefrieren-Auftauen, angewendet werden, um die in den Zellen gespeicherten Polyhydroxyalkanoate abzutrennen und zu gewinnen.
Es sollte selbstverständlich sein, daß die erfindungsgemäße Züchtung der Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Produktion der Polyhydroxyalkanoate durch die Mikroorganismen und das Speichern der Polyhydroxyalkanoate in der Zelle und die Gewinnung der Polyhydroxyalkanoate aus der Zelle nicht auf die vorstehend genannten Techniken und Verfahren begrenzt sind.
Die Polyhydroxyalkanoate, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Mikroorganismen produziert werden, können zusätzlich zu den Einheiten der chemischen Formel (1) 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten der chemischen Formel (2) oder 3-Hydroxyalk-5-ensäure-Einheiten der chemischen Formel (3) enthalten, die durch das Fettsäuresynthesesystem biosynthetisiert wird, wobei ein Wachstumssubstrat verwendet wird, das dem Kulturmedium zugesetzt wird. Die Kohlenstoffatome in der 3-Position aller enthaltenen 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten sind asymmetrische Kohlenstoffatome, deren absolute Konfiguration R ist, was auf deren biologische Abbaubarkeit hinweist.
Das erfindungsgemäße PHA ist neben der Verwendung als übliche Kunststoffe auf verschiedenen Anwendungsgebieten von Vorteil, dazu gehören Materialien für Geräte bzw. Vorrichtungen, Medikamentenmaterialien und medizinische Materialien, wie eine medizinische Folie bzw. ein medizinisches Tuch.
Das Vorhandensein der (Methylsulfanyl)phenoxygruppe in den Einheiten der chemischen Formel (1) und das Vorhandensein der verschiedenen Substituenten, die an deren Benzolring angeordnet sind, versehen die Polymere zudem mit neuen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Es werden Verbesserungen der physikalischen Eigenschaften solcher Polymere erwartet. Die Polymere können auf Gebieten verwendet werden, auf denen sie in der Vergangenheit nicht einsetzbar waren.
< BEISPIELE >
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand ihrer Beispiele besonders beschrieben, sie ist jedoch nicht darauf begrenzt. In den folgenden Beispielen sind die Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, wenn es nicht anders angegeben ist.
(Beispiel 1)
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-(4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 28 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des Polyhydroxyalkanoats wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC; TOSOH HLC-8220, Säule: TOSOH TSK-GEL SuperHM-H (Handelsbezeichnung), Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautet Mn = 15.600 und Mw = 36.000.
Das Polyhydroxyalkanoat wurde ferner der NMR-Analyse unter folgenden Bedingungen unterzogen.
< Spektrometer >
FT-NMR: Bruker DPX 400 bei Spektrometerfrequenzen von 400 MHz für ¹H-NMR. < Bedingungen >

Kernspezies: ¹H

Lösungsmittel: CDCl₃

Temperatur: Raumtemperatur
Die Figur zeigt die ¹H-NMR-Spektren des Polyhydroxyalkanoats. Die Ergebnisse seiner Identifizierung sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 deutlich gezeigt, wurde bestätigt, daß das Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der folgenden chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und 3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält.
Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 23,0 Mol-% 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
(Beispiel 2)
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 11 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und 3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 21,4 Mol-% 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
(Beispiel 3)
Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 9 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und 3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 18,4 Mol-% 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
(Beispiel 4)
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 18 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und 3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 29,6 Mol-% 3-Hydroxy-5- [4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
(Beispiel 5)
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 18 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis der NMR zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und
3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 35,6 Mol-% 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
(Beispiel 6)
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Hefeextrakt (DIFCO) und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60 ° C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 15 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis der NMR zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und
3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 15,1 Mol-% 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
(Beispiel 7)
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Natriumglutamat und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Natriumpyruvat und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 25 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis der NMR zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und
3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 12,2 Mol-% 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
(Beispiel 8)
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-(4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,1 % Nonansäure und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 30 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis der NMR zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das mit der chemischen Formel (7) angegeben wird und als Monomereinheiten 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat und
3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 3,1 Mol-% 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat enthielt.
Tabelle 2 zeigt das Trockengewicht der Zellen, das Trockengewicht des Polymers, das Verhältnis zwischen dem Polymer und den Zellen, auf das Trockengewicht bezogen, und die Menge (Mol-%) der 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valerat-Einheit (als "3HMSPxV" abgekürzt) im entstandenen Polymer der Beispiele 1 bis 8.
Tabelle 2
Tabelle 3 zeigt das Molekulargewicht des entstandenen Polymers der Beispiele 1 bis 8.
Tabelle 3
(Beispiel 9)
Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % Polypepton (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 0,1 % 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure der chemischen Formel (8) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % Pyruvinsäure und 0,1 % 6-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]hexansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 22 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des Polyhydroxyalkanoats wurde durch Gel-Permeationschromatographie bestimmt (GPC, TOSOH HLC-8220, Säule: TOSOH TSK-GEL Super HM-H (Handelsbezeichnung), Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautet Mn = 14.500 und Mw = 33.000.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis der NMR zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-6-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]hexanoat der chemischen Formel (9), 3-Hydroxy-4-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]butyrat der chemischen Formel (10) und 3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat
8,1 Mol-% der 3-Hydroxy-6-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]hexanoat-Einheit und 9,2 Mol-% der 3-Hydroxy-4-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]butyrat-Einheit enthält.
(Beispiel 10)
Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 6-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % 6-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]hexansäure, jedoch keine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthielt, und 46 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min unterzogen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen wurde gemessen (Trockengewicht der Zellen).
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das Polyhydroxyalkanoat herauszulösen. Der Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit kaltem Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und vakuumgetrocknet, wodurch 16 mg Polyhydroxyalkanoat erhalten wurden.
Es wurden eine Bestimmung des Molekulargewichts und die NMR-Analyse des erhaltenen Polyhydroxyalkanoats unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 vorgenommen. Als Ergebnis der NMR zeigte sich, daß dieses Polyhydroxyalkanoat ein solches ist, das als Monomereinheiten 3-Hydroxy-6-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]hexanoat, 3-Hydroxy-4-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]butyrat und 3-Hydroxyalkanoate mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie 3-Hydroxybuttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure, und 3-Hydroxyalkenoat enthält. Die Integration der ¹H-NMR-Spektren zeigte, daß das Polyhydroxyalkanoat 12,4 Mol-% der 3-Hydroxy-6-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]hexanoat-Einheit und 15,1 Mol-% der 3-Hydroxy-4-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]butyrat-Einheit enthält.
Tabelle 4 zeigt das Trockengewicht der Zellen, das Trockengewicht des Polymers, das Verhältnis zwischen dem Polymer und den Zellen, auf das Trockengewicht bezogen, und die Menge (Mol-%) der 3-Hydroxy-6-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]hexanoat-Einheit (3HMSPxHx) und der 3-Hydroxy-4-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]butyrat-Einheit (3HMSPxB) im entstandenen Polymer der Beispiele 9 und 10.
Tabelle 4
Tabelle 5 zeigt das Molekulargewicht des entstandenen Polymers der Beispiele 9 und 10.
Tabelle 5

Claims

Polyhydroxyalkanoat, umfassend eine Einheit der folgenden chemischen Formel (1):
wobei x eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist.
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das ferner eine oder mehrere Einheiten umfaßt, die aus 3-Hydroxyalkanoaten und 3-Hydroxyalkenoaten ausgewählt sind, wobei die 3-Hydroxyalkanoate mit der folgenden chemischen Formel (2) angegeben werden:
worin y eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist; und die 3-Hydroxyalkenoate mit der folgenden chemischen Formel (3) angegeben werden:
worin z die ganze Zahl 3 oder 5 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist.
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyhydroxyalkanoat ein Zahlenmittel des Molekulargewichts von 5.000 bis 300.000 hat.
Polyhydroxyalkanoat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine 3-Hydroxy-5-[4-(methylsulfanyl)phenoxy]valerat-Einheit der folgenden chemischen Formel (4):
Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, umfassend den Schritt der Züchtung eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine Verbindung der folgenden chemischen Formel (5) enthält:
worin x eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist; wobei das Polyhydroxyalkanoat eine Einheit der folgenden chemischen Formel (1):
umfaßt, worin x eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polyhydroxyalkanoat ferner eine oder mehrere Einheiten umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus 3-Hydroxyalkanoaten und 3-Hydroxyalkenoaten der folgenden chemischen Formeln (2) und (3) besteht:
worin y eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist,
worin z die ganze Zahl 3 oder 5 ist und im Polyhydroxyalkanoat gleich oder verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Kulturmedium Polypepton enthält.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Kulturmedium Hefeextrakt enthält.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Kulturmedium ein Saccharid enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Kulturmedium ein oder mehrere Saccharide enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Glycerol, Erythritol, Xylitol, Gluconsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Maltose, Saccharose und Lactose.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Kulturmedium eine organische Säure, die in Zitratzyklus erzeugt worden ist, oder eine organische Säure oder ein Salz davon enthält, die bzw. das durch biochemische Reaktionen einen oder zwei Schritte nach dem Zitratzyklus erzeugt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Kulturmedium eine oder mehrere organische Säuren oder ein Salz davon enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succinsäure und Salzen davon.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Kulturmedium eine Aminosäure oder ein Salz davon enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Kulturmedium eine oder mehrere Aminosäuren oder Salze davon enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Kulturmedium eine geradkettige Alkansäure mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Salz davon enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 15, wobei der Züchtungsschritt zwei oder mehrere Schritte aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Kulturmedium in den Schritten nach dem ersten Schritt keine Stickstoffquelle enthält.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Züchtungsschritt die Schritte umfaßt: (1-1) Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das Polypepton und zumindest eine Verbindung der chemischen Formel (5) enthält; und (1-2) weiteres Züchten des Mikroorganismus vom Schritt 1-1 in einem Kulturmedium, das die Verbindung der chemischen Formel (5) und eine organische Säure oder ein Salz davon enthält.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die organische Säure oder ein Salz davon eine oder mehrere Verbindungen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succinsäure und Salzen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Züchtungsschritt die Schritte umfaßt: (1-3) Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das ein Saccharid und zumindest eine Verbindung der chemischen Formel (5) enthält; und (1-4) weiteres Züchten des Mikroorganismus vom Schritt 1-3 in einem Kulturmedium, das die Verbindung der chemischen Formel (5) und ein Saccharid enthält.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Saccharid eine oder mehrere Verbindungen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Glycerol, Erythritol, Xylitol, Gluconsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Maltose, Saccharose und Lactose.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 21, wobei die Verbindung der chemischen Formel (5) 5-[4-(Methylsulfanyl)phenoxy]valeriansäure der folgenden chemischen Formel (6) ist:
und die Einheit mit der folgenden chemischen Formel (4) angegeben wird:
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 22, das ferner einen Schritt umfaßt, bei dem das Polyhydroxyalkanoat aus den Zellen des im Züchtungsschritt gezüchteten Mikroorganismus abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Schritt des Abtrennens des Polyhydroxyalkanoats einen Schritt umfaßt, bei dem eine Behandlung mit einem Lösungsmittel erfolgt, um das in den Zellen des im Züchtungsschritt gezüchteten Mikroorganismus gespeicherte Polyhydroxyalkanoat löslich zu machen und herauszulösen.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Lösungsmittel eine oder mehrere Lösungsmittel ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Chloroform, Dichlormethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril und Aceton.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Schritt des Abtrennens des Polyhydroxyalkanoats einen Schritt umfaßt, bei dem die Zellen des Mikroorganismus aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Zellen durch Aufbrechen mittels Ultraschall, Homogenisieren, Aufbrechen mittels Druck, Aufbrechen mit Glaskügelchen, Zerreiben, Mahlen oder Gefrieren-Auftauen aufgebrochen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 27, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Pseudomonas gehört.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört, aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375), Pseudomonas cichorii H45 (FERM BP-7374) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-7376).