JP3684150B2 - ポリヒドロキシアルカノエート - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)、微生物を用いた当該ＰＨＡの製造方法及びそれに用いる微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
長年にわたって、石油由来の合成高分子をプラスチック等として利用してきたが、使用後廃棄されるこれらプラスチック等の処理が大きな社会問題となっている。石油由来の合成高分子は、分解されにくい利点から金属材料、ガラス等の代替えを果たしてきたが、大量に消費され、また大量に廃棄される昨今では、その分解されにくいという性質が逆に災いし廃棄物処理場に蓄積されることとなった。また、焼却処理を行うとＣＯ2 排出量の増加となり、ある場合には、ダイオキシンや環境ホルモン等の有害物質の発生原因ともなる。一方、ポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)に代表される微生物産生ポリエステル(ＰＨＡ)は、従来のプラスチックと同様、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができるとともに、石油由来の合成高分子とは異なり、生物により分解されうるという特性を有している。従って、廃棄した際、微生物産生ポリエステルは生分解されることにより自然界の物質循環に取り込まれるので、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、燃焼処理を行う必要もないため、大気汚染や地球温暖化を防止するという観点でも有効な材料であり、環境保全を可能とするプラスチックとして利用することができる。加えて、微生物産生ポリエステルは医療用軟質部材への応用などが検討されている(特開平５-１５９号公報、特開平６-１６９９８０号公報、特開平６-１６９９８８号公報、特開平６-２２５９２１号公報 など)。
【０００３】
これまで、多くの微生物がＰＨＢあるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されている(「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、(株)エヌ・ティー・エス発行、P178-197、(1995))。このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス Ｈ16株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸(３ＨＢ)と３-ヒドロキシ吉草酸(３ＨＶ)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特表平６-１５６０４号公報、特表平７-１４３５２号公報、特表平８-１９２２７号公報等)。
【０００５】
特開平５-７４４９２号公報では、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００６】
特開平５-９３０４９号公報、及び、特開平７-２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸(３ＨＨx)の２成分共重合体が生産されることが開示されている。
【０００７】
特開平９-１９１８９３号公報では、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、グルコン酸及び１,４-ブタンジオールを炭素源として用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットとして持つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００８】
また、近年、炭素数が１２程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length:ｍclと略記)の３-ヒドロキシアルカノエート(３ＨＡ)からなるＰＨＡについての研究が精力的に行われている。このようなＰＨＡの合成経路は大きく２つに分類することが可能であり、その具体例を下記(１)および(２)に示す。
【０００９】
(１)β酸化を利用した合成:
特許公報第２６４２９３７号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Pseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３-ヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。また、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,５８(２),746 (1992)には、シュードモナス・レジノボランス(Pseudoｍonas resinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 １：15：75：９)をモノマーユニットとするポリエステルを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 ８：62：23：７)をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３ＨＡモノマーユニットは(２)で説明する脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００１０】
(２)脂肪酸合成経路を利用した合成
Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,１６(３)、119 (1994)には、シュードモナス sp.61-3株(Pseudoｍonas sp.61-3 strain)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシアルカン酸及び、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸、３-ヒドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシアルケン酸をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。
【００１１】
ところで、通常、ＰＨＡの生合成は、細胞内の様々な代謝経路の中間体として生じる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」を基質とし、ＰＨＡシンターゼ(ＰＨＡ synthase)により行われる。
【００１２】
ここで、「ＣoＡ」とは「補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)」のことである。そして上記(１)の先行技術に記載されている様に、オクタン酸やノナン酸等の脂肪酸を炭素源とした場合、ＰＨＡの生合成は、「β酸化サイクル」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行われるとされている。
【００１３】
以下に、「β酸化サイクル」を経由してＰＨＡが生合成されるまでの反応を示す。
【００１４】
【化５５】
【００１５】
一方、上記(２)の先行技術に記載されている様に、グルコース等の糖類を基質とし、ＰＨＡを生合成する場合は、「脂肪酸合成経路」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」から変換された「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行われるとされている。
ここで、「ＡＣＰ」とは「アシルキャリアプロテイン(acyl carrier protein)」のことである。
【００１６】
ところで、先に述べたとおり、上記(１)および(２)で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡである。しかし、このような微生物産性ＰＨＡのより広範な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、多様な置換基(例えば、フェニル基など)を側鎖に導入したＰＨＡが極めて有用であることが期待されている。そのようなＰＨＡの合成に関しては、β酸化を利用した合成について、例えば、Ｍacroｍolecules,２４,p5256-5260 (1991)に、アリール基等を側鎖に導入したＰＨＡに関する報告がある。具体的には、シュードモナス・オレオボランス(Pseudononas oleovorans)が５-フェニル吉草酸とノナン酸(モル比２:１、総濃度１０ｍｍol/L)を基質とし、３-ヒドロキシ吉草酸、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシウンデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(量比 0.6：16.0：41.1：1.7：40.6)をユニットとするポリエステルを、培養液１Lあたり 160ｍg(菌体に対する乾燥重量比 31.6％)生産し、また、５-フェニル吉草酸とオクタン酸(モル比１:１、総濃度１０ｍｍol/L)を基質とし、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(量比 7.3：64.5：3.9：24.3)をユニットとするポリエステルを、培養液１Lあたり 200ｍg(菌体に対する乾燥重量比 39.2％)生産することが報告されている。この報告におけるＰＨＡは、ノナン酸やオクタン酸が用いられていることからも主にβ酸化経路を経て合成されているものと考えられる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、微生物産生ＰＨＡにおいては、その製造に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、各種の組成・構造のものが得られているが、プラスチックとしての応用を考えた場合、物性的に未だ十分であるとは言えない。微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためにはさらに多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００１８】
一方、前述のような、置換基を側鎖に導入したタイプのＰＨＡは、導入した置換基を所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待でき、そのような機能性と生分解性とを両立可能であるような優れたＰＨＡと、その製造方法、ならびに、所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索もまた重要な課題である。
【００１９】
このような置換基を側鎖に導入したＰＨＡの他の例としては、前記したフェニル基、さらにはフェノキシ基を側鎖に有するＰＨＡが挙げられる。
【００２０】
フェニル基の他の例としては、Ｍacroｍolecules,２９,1762-1766 (1996)に、シュードモナス・オレオボランスが、５-(４-トリル)吉草酸(５-(４-メチルフェニル)吉草酸)を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(４-トリル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２１】
更には、Ｍacroｍolecules,３２,2889-2895 (1999)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸とノナン酸を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４-ニトロフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２２】
また、フェノキシ基の例としては、Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,１９５,1665-1672 (1994)に、シュードモナス・オレオボランスが１１-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２３】
また、Ｍacroｍolecules,２９,3432-3435 (1996)には、シュードモナス・オレオボランスを用いて、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸及び３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸及び３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、１１-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。この報告におけるポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。
【００２４】
【表１】
【００２５】
更に、Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,４１,32-43(1995)では、シュードモナス・オレオボランスＡＴＣＣ29347株及びシュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)ＫＴ2442株を用いて、オクタン酸と p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは p-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産に成功している。
【００２６】
特許第２９８９１７５号公報には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造方法が記載されている。
【００２７】
これらの生産は以下の様な「二段階培養」で行われている。
培養時間： 一段目、２４時間 ； 二段目、９６時間
各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。
(１)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(２)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
(３)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(４)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００２８】
また、シクロヘキシル基をモノマーユニット中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボランスによる生産の例が報告されている(Ｍacroｍolecules,３０,1611-1615 (1997))。
【００２９】
この報告によれば、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸(以下、ＮＡと記載する)とシクロヘキシル酪酸(以下、ＣＨＢＡと記載する)あるいはシクロヘキシル吉草酸(以下、ＣＨＶＡと記載する)の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている(各割合は不明)。
【００３０】
その収率等に関しては、ＣＨＢＡに対して、基質濃度トータル２０ｍｍol/L の条件で、ＣＨＢＡとＮＡの量比を変化させ、表２に示すような結果を得たと報告されている。
【００３１】
【表２】
【００３２】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)、
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)、
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。
【００３３】
このように、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡを微生物により生産しようとする場合、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に見られるように、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【００３４】
しかしながら、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチル-ＣoＡの生成に基づくエネルギー源の供給が期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチル-ＣoＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまう点が大きな課題である。また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。前述の報告例では、基質である８-フェノキシオクタン酸由来の３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。さらに、β酸化によるアセチル-ＣoＡの生成に基づいたエネルギー源の供給を前提とした方法では、微生物の増殖が遅く、ＰＨＡの合成に時間がかかる点、合成されたＰＨＡの収率が低くなりがちな点も大きな課題である。
【００３５】
このため、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が有効と考えられ、一般的に用いられている。
【００３６】
しかしながら、本発明者らの検討によれば、上記のようにオクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を増殖用炭素源とし、β-酸化経路を経て合成されたＰＨＡは、その純度が低く、得られるポリマーの５０％以上が、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット(例えば、３-ヒドロキシオクタン酸や３-ヒドロキシノナン酸等)であるｍcl-３ＨＡモノマーユニットである。これらのｍcl-３ＨＡユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、本発明の目的とするＰＨＡに多量に混在した場合、ポリマーのガラス転移温度(Ｔg)を著しく降下させる。このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は大きな課題である。この課題の解決手段としては、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍcl-３ＨＡモノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離/除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍcl-３ＨＡモノマーユニット除去は極めて困難である。
【００３７】
本発明は前記の課題を解決するものであり、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡの提供、ならびに、当該ＰＨＡを微生物を利用して製造する方法の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とするＰＨＡを高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法を提供することにある。また本発明は、当該ＰＨＡを高純度で効率的に合成することのできる菌株を提供することも目的とする。
【００３８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、特に、デバイス材料や医用材料等として有用な、置換あるいは無置換のフェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を側鎖上に有するＰＨＡの開発を目指して、ＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する能力を有する新規な微生物の探索、ならびに、新規な微生物を用いて、所望のＰＨＡを製造する方法について、鋭意研究を進め、本発明を完成した。
【００３９】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、少なくとも、下記式 (14)
【化４】
で表される３ - ヒドロキシ - ４ - フェノキシ酪酸をモノマーユニットとして含み、かつ全体として下記式(49)で表されるモノマーユニット組成を有することを特徴とする。
ＡmＢ(1-m) (49)
(ただし、Ａは下記式(２)で表され、Ｂは下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１以上であり、ｍは0.01以上、１未満である)
【００４０】
【化５６】
【００４１】
(上記式中、n は０〜10であり、k は３または５であり、Ｒは下記式 ( ６ ) で表される少なくとも１以上の基を含み、他に下記式(５)および(７)で表される基から選択される少なくとも１以上の基を含むことができる)
【００４２】
【化５７】
【００４３】
(式(５)中、Ｒ１は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、qは、１〜８の整数から選択される;式(６)中、Ｒ２は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、rは、１〜８の整数から選択される;式(７)中、Ｒ３は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、sは、１〜８の整数から選択される)
ここで、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは式(２)で表されるモノマーユニットを複数種含み得るが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を含むように設計すると良い。一般には５種類程度までの目的モノマーユニットに対応したアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10種類程度までの式(２)で表されるモノマーユニットが含まれるようになり、本発明の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのモノマーユニットで構成することも可能である。
【００４４】
また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れについても、またＲ3のシクロヘキシル基の場合は１位についても、対応するモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの構成が可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体で構成するのが有利である。
【００４５】
また、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、下記式(１)で表されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、アルカノエートとともに微生物を培養し、微生物菌体からポリヒドロキシアルカノエートを抽出して、下記式(１)で表されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを取得することを特徴とする製造方法である。
ＡmＢ(1-m) (１)
(ただし、Ａは下記式(２)で表され、Ｂは下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１以上であり、ｍは0.01以上、１未満である)
【００４６】
【化５８】
【００４７】
(上記式中、n は０〜10 であり、k は３または５であり、Ｒは下記式(５)から(７)で表わされる基から選択される少なくとも１以上の基である)
【００４８】
【化５９】
【００４９】
(式(５)中、Ｒ１は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、q は、１〜８の整数から選択される;式(６)中、Ｒ２は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、r は、１〜８の整数から選択される;式(７)中、Ｒ３は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、s は、１〜８の整数から選択される;但し、上記一般式(２)におけるＲとして、
一種の基を選択する際には、
式(５)において、Ｒ１＝Ｈで q＝２の基、Ｒ１＝Ｈで q＝３の基、Ｒ１＝Ｈで q ＝４の基、Ｒ１＝-ＮＯ2で q＝２の基、
式(６)において、Ｒ２＝ハロゲン原子で r＝２の基、Ｒ２＝ - ＣＮで r ＝２の基、Ｒ２＝-ＣＮで r＝３の基、Ｒ２＝-ＮＯ2で r＝３の基、
式(７)において、Ｒ３＝Ｈで s＝１の基、Ｒ３＝Ｈで s＝２の基は、選択肢からは除外され、
二種以上の基を選択する際には、
式(６)において、Ｒ２＝Ｈで r ＝２及び４の二種の基の組み合わせ、Ｒ２＝Ｈで r ＝２及び６の二種の基の組み合わせ、Ｒ２＝ハロゲン原子で r＝２及び４の二種の基の組み合わせ [ 但し、上記Ｂとして上記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) から１成分が選択される場合に限る ] は選択肢からは除外され、
三種の基を選択する際には、式 ( ６ ) において、Ｒ２＝Ｈで r ＝２及び４及び６の三種の基の組み合わせ、は選択肢からは除外される)
ここで、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは式(２)で表されるモノマーユニットを複数種含み得るが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を含むように合成すると良い。一般には５種類程度までの目的モノマーユニットに対応したアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの式(２)で表されるモノマーユニットが含まれるようになり、本発明の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのモノマーユニットを含むように培養することも可能である。
【００５０】
また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れについても、またＲ3のシクロヘキシル基の場合は１位についても、対応するモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの合成が可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を含むように培養するのが有利である。
【００５１】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え、原料アルカノエート以外の炭素源として糖類のみを添加した培地で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００５２】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の製造方法は、下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、
下記一般式(２２)で表されるアルカノエートから下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(２２)で表されるアルカノエートと下記式(２２)で表されるアルカノエート以外の炭素源として糖類のみを含む培地で培養する工程を有することを特徴とする。
【００５３】
【化６０】
【００５４】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００５５】
【化６１】
【００５６】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００５７】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００５８】
また、糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノースなどを好適に用いることができる。
【００５９】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え、原料アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加した培地で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００６０】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の製造方法は、下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、
下記式(２２)で表されるアルカノエートから下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(２２)で表されるアルカノエートと下記式(２２)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを含む培地で培養する工程を有することを特徴とする。
【００６１】
【化６２】
【００６２】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００６３】
【化６３】
【００６４】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００６５】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００６６】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え、原料アルカノエート以外の炭素源としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加した培地で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出した。
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の生産方法は、下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による生産方法であって、
下記一般式(22)で表されるアルカノエートから下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(22)で表されるアルカノエートと下記式(22)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを含む培地で培養する工程を有することを特徴とする。
【００６７】
【化６４】
【００６８】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００６９】
【化６５】
【００７０】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００７１】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００７２】
また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸としては、ＴＣＡサイクルそのものに存在する有機酸、例えば、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸及びその塩など、さらにはＴＣＡサイクルへのメインフラックス上に存在する有機酸、例えば、乳酸、ピルビン酸及びその塩などを好適に用いることができる。
【００７３】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え原料アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを含む培地による培養と、当該アルカノエートと当該アルカノエート以外の炭素源としてピルビン酸あるいはその塩のみとを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出した。
【００７４】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の製造方法は、下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、
下記一般式(22)で表されるアルカノエートから下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(22)で表されるアルカノエートと下記式(22)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを含む培地による培養と、下記式(22)で表されるアルカノエートと下記式(22)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてピルビン酸あるいはその塩のみとを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で培養する工程を有することを特徴とする。
【００７５】
【化６６】
【００７６】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００７７】
【化６７】
【００７８】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００７９】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００８０】
また、本発明にかかる新規菌株は、下記式(２２)で表されるアルカノエートから下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの合成系を有することを特徴とする。
【００８１】
【化６８】
【００８２】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００８３】
【化６９】
【００８４】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 等が挙げられる。
【００８５】
以下、本発明に属する、もしくは関連する新規なポリヒドロキシアルカノエートについて詳述する。
【００８６】
本発明に関連する新規なポリヒドロキシアルカノエートは、下記式(８):
【００８７】
【化７０】
【００８８】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 ( ８ ) の３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - フルオロフェニル ) 吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【００８９】
【化１２２】
さらに、下記式(９):
【００９０】
【化７１】
【００９１】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 ( ９ ) の３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - トリフルオロメチルフェニル ) 吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【００９２】
【化１２３】
また、本発明の新規なＰＨＡを微生物を用いて生産する際の原料基質は、下記化学式(21):
【００９３】
【化７２】
【００９４】
で表される５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸であり、この原料基質自体も新規な化合物である。
【００９５】
さらに、下記式(１０):
【００９６】
【化７３】
【００９７】
で表される３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (10) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ４ - ニトロフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【００９８】
【化１２４】
さらに、下記式(11):
【００９９】
【化７４】
【０１００】
で表される３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (11) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ４ - シアノフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１０１】
【化１２５】
さらに、下記式(12):
【０１０２】
【化７５】
【０１０３】
で表される３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (12) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ４ - フルオロフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１０４】
【化１２６】
さらに、下記式(13):
【０１０５】
【化７６】
【０１０６】
で表される３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (13) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ３ - フルオロフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１０７】
【化１２７】
さらに、下記式(14):
【０１０８】
【化７７】
【０１０９】
で表される３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１４)の３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１１０】
【化７８】
【０１１１】
さらに、下記式(１５):
【０１１２】
【化７９】
【０１１３】
で表される３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１５)の３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１１４】
【化８０】
【０１１５】
さらに、下記式(１６):
【０１１６】
【化８１】
【０１１７】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。ここで、上記式(１６)の３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸以外のモノマーユニットとして、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含み、かつ、モノマーユニットが３成分系であるものを除いたポリヒドロキシアルカノエートである。
【０１１８】
【化８２】
【０１１９】
さらに、下記式(８)及び(１６):
【０１２０】
【化８３】
【０１２１】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸と３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 ( ８ ) 及び (16) の３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - フルオロフェニル ) 吉草酸と３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - フルオロフェノキシ ) 吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１２２】
【化１２８】
さらに、下記式(15)及び(17):
【０１２３】
【化８４】
【０１２４】
で表される３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１５)及び(１７)の３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１２５】
【化８５】
【０１２６】
さらに、下記式(１４)、(１８)及び(１９):
【０１２７】
【化８６】
【０１２８】
【化８７】
【０１２９】
で表される３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１４)、(１８)及び(１９)の３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１３０】
【化８８】
【０１３１】
さらに、下記式(１５)、(１７)及び(２０):
【０１３２】
【化８９】
【０１３３】
【化９０】
【０１３４】
で表される３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１５)、(１７)及び(２０)の３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１３５】
【化９１】
【０１３６】
以下、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法について詳述する。
【０１３７】
本発明者らは、下記式(２５)で表される５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(８)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１３８】
【化９２】
【０１３９】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(25)で表されるＦＰＶＡを含む培地で、ＦＰＶＡを利用して上記式(８)で表される３ＨＦＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１４０】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４１】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２５)で表されるＦＰＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１４４】
本発明者らは、下記式(２１)で表される５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸(ＣＦ3ＰＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(９)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸(３ＨＣＦ3ＰＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１４５】
【化９３】
【０１４６】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(21)で表されるＣＦ3ＰＶＡを含む培地で、ＣＦ3ＰＶＡを利用して上記式(９)で表される３ＨＣＦ3ＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１４７】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４８】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１５１】
本発明者らは、下記式(２６)で表される４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸(ＮＯ2ＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１０)からなる３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸(３ＨＮＯ2ＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１５２】
【化９４】
【０１５３】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(26)で表されるＮＯ2ＰxＢＡを含む培地で、ＮＯ2ＰxＢＡを利用して上記式(10)で表される３ＨＮＯ2ＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１５４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１５８】
本発明者らは、下記式(２７)で表される４-(４-シアノフェノキシ)酪酸(ＣＮＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１１)からなる３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸(３ＨＣＮＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１５９】
【化９５】
【０１６０】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(27)で表されるＣＮＰxＢＡを含む培地で、ＣＮＰxＢＡを利用して上記式(11)で表される３ＨＣＮＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１６１】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６４】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１６５】
本発明者らは、下記式(２８)で表される４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(ＦＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１２)からなる３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨＦＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１６６】
【化９６】
【０１６７】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(28)で表されるＦＰxＢＡを含む培地で、ＦＰxＢＡを利用して上記式(12)で表される３ＨＦＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１６８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７１】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２８)で表されるＦＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１７２】
本発明者らは、下記式(２９)で表される４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(ｍＦＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１３)からなる３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨｍＦＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１７３】
【化９７】
【０１７４】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡを含む培地で、ｍＦＰxＢＡを利用して上記式(１３)で表される３ＨｍＦＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１７５】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７８】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１７９】
本発明者らは、下記式(３１)で表される５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(３０)からなる３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１８０】
【化９８】
【０１８１】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(３１)で表されるＰＶＡと糖類とを含む培地で、ＰＶＡを利用して上記式(３０)で表される３ＨＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１８２】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３１)で表されるＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１８３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３１)で表されるＰＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１８４】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３１)で表されるＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３１)で表されるＰＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１８５】
本発明者らは、下記式(３３)で表される６-フェニルヘキサン酸(ＰＨxＡ)を含む培地で培養することで、下記式(３２)からなる３-ヒドロキシ-６-フェニルヘキサン酸(３ＨＰＨx)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１８６】
【化９９】
【０１８７】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(33)で表されるＰＨxＡと糖類とを含む培地で、ＰＨxＡを利用して上記式(32)で表される３ＨＰＨxモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１８８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３３)で表されるＰＨxＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１８９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３３)で表されるＰＨxＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３３)で表されるＰＨxＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３３)で表されるＰＨxＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１９１】
本発明者らは、下記式(３４)で表される４-フェノキシ酪酸(ＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１４)からなる３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１９２】
【化１００】
【０１９３】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(34)で表されるＰxＢＡを含む培地で、ＰxＢＡを利用して上記式(14)で表される３ＨＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１９４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３４)で表されるＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１９８】
本発明者らは、下記式(３５)で表される５-フェノキシ吉草酸(ＰxＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１５)からなる３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１９９】
【化１０１】
【０２００】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(35)で表されるＰxＶＡを含む培地で、ＰxＶＡを利用して上記式(15)で表される３ＨＰxＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２０１】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０４】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３５)で表されるＰxＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２０５】
本発明者らは、下記式(３６)で表される５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１６)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２０６】
【化１０２】
【０２０７】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(36)で表されるＦＰxＶＡと糖類とを含む培地で、ＦＰxＶＡを利用して上記式(16)で表される３ＨＦＰxＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２０８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３６)で表されるＦＰxＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２１０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３６)で表されるＦＰxＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２１１】
本発明者らは、下記式(３８)で表される４-シクロヘキシル酪酸(ＣＨＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(３７)からなる３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸(３ＨＣＨＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２１２】
【化１０３】
【０２１３】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(38)で表されるＣＨＢＡと糖類とを含む培地で、ＣＨＢＡを利用して上記式(37)で表される３ＨＣＨＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２１４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３８)で表されるＣＨＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２１５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３８)で表されるＣＨＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２１６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３８)で表されるＣＨＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３８)で表されるＣＨＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２１７】
本発明者らは、下記式(２５)で表される５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ)及び下記式(３６)で表される５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(８)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)及び下記式(１６)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２１８】
【化１０４】
【０２１９】
【化１０５】
【０２２０】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(25)で表されるＦＰＶＡ及び上記式(36)で表されるＦＰxＶＡと糖類とを含む培地で、ＦＰＶＡ及びＦＰxＶＡを利用して上記式(８)で表される３ＨＦＰＶ及び上記式(16)で表される３ＨＦＰxＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２２１】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２２２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２２３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２２４】
本発明者らは、下記式(３９)で表される７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１５)からなる３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)及び下記式(１７)からなる３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２２５】
【化１０６】
【０２２６】
【化１０７】
【０２２７】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(39)で表されるＰxＨpＡと糖類とを含む培地で、ＰxＨpＡを利用して上記式(15)で表される３ＨＰxＶ及び上記式(17)で表される３ＨＰxＨpモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２２８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３９)で表されるＰxＨpＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２２９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３９)で表されるＰxＨpＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２３０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３９)で表されるＰxＨpＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３９)で表されるＰxＨpＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２３１】
本発明者らは、下記式(４０)で表される８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１４)からなる３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、下記式(１８)からなる３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び下記式(１９)からなる３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２３２】
【化１０８】
【０２３３】
【化１０９】
【０２３４】
【化１１０】
【０２３５】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(40)で表されるＰxＯＡと糖類とを含む培地で、ＰxＨpＡを利用して上記式(14)で表される３ＨＰxＢ、上記式(18)で表される３ＨＰxＨx及び上記式(19)で表される３ＨＰxＯモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２３６】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４０)で表されるＰxＯＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２３７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４０)で表されるＰxＯＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２３８】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４０)で表されるＰxＯＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(４０)で表されるＰxＯＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２３９】
本発明者らは、下記式(４１)で表される１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１５)からなる３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、下記式(１７)からなる３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び下記式(２０)からなる３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２４０】
【化１１１】
【０２４１】
【化１１２】
【０２４２】
【化１１３】
【０２４３】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(41)で表されるＰxＵＤＡと糖類とを含む培地で、ＰxＵＤＡを利用して上記式(15)で表される３ＨＰxＶ、上記式(17)で表される３ＨＰxＨp及び上記式(20)で表される３ＨＰxＮモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２４４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４１)で表されるＰxＵＤＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２４５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４１)で表されるＰxＵＤＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２４６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４１)で表されるＰxＵＤＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(４１)で表されるＰxＵＤＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２４７】
さらに、本発明は、上記のポリヒドロキシアルカノエートの生産に好適に利用し得る、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株(Pseudoｍonas putida Ｐ91、ＦＥＲＭ ＢＰ-7373)及びシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)の４種の新規菌株に関連する。
【０２４８】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＨＡはデバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡであり、より具体的には、前述した置換あるいは無置換のフェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を側鎖上に有するＰＨＡである。また、本発明のＰＨＡの製造方法は、微生物を利用して高純度かつ高収率に所望とするＰＨＡを製造することを可能とするものである。さらに本発明は、当該ＰＨＡを高純度で効率的に合成することのできる菌株の提供を可能とするものである。なお、本発明のＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２４９】
＜糖類ならびにＴＣＡサイクルに関与する有機酸 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えて、当該アルカノエート以外の炭素源として糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカノエート以外の炭素源として糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することにより得られている。
【０２５０】
すなわち、発明者らは、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を共存基質として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと共に培養せしめたところ、ノナン酸やオクタン酸といったｍcl-アルカノエートを共存基質として用いた従来の方法に比べ、目的とするＰＨＡが格段に優れた収率および純度で得られること、そしてこのような効果が、微生物の炭素源ならびにエネルギー源であるアセチルＣoＡをβ酸化に拠らない方法により生成することが可能な培養方法であることにより得られるものであるとの知見を得て本発明に至ったものである。
【０２５１】
本発明の方法においては、糖類化合物、例えばグルコースやフルクトース、マンノース等は、微生物の増殖基質として利用されることになり、生産されるＰＨＡは、糖類に共存させている所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートから構成され、グルコース等の糖類に由来するモノマーユニットが全く含まれないか、極めて少量しか含まれない。このような点で、本発明の方法は、従来のグルコースなどの糖類そのものをＰＨＡに導入するモノマーユニットの原料基質として用いるＰＨＡ微生物生産方法とは構成及び効果ともに根本的に異なるものである。
【０２５２】
＜ポリペプトン 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に原料の所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えて、当該アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加することにより得られている。
【０２５３】
なお、微生物によるＰＨＡの生産にポリペプトンを利用する例として、特開平５-４９４８７号公報、特開平５-６４５９１号公報、特開平５-２１４０８１号公報、特開平６-１４５３１１号公報、特開平６-２８４８９２号公報、特開平７-４８４３８号公報、特開平８-８９２６４号公報、特開平９-１９１８９３号公報、特開平１１-３２７８９号公報等に、ＰＨＡを微生物に生産させる際に、培地中にポリペプトンを含有させていることが開示されているが、いずれも前培養、つまり菌体を単に増殖させる段階で用いており、前培養時にＰＨＡのモノマーユニットとなる基質は含まれていない。また、菌体にＰＨＡを生産させる段階でポリペプトンを用いた例はない。これに対して、本発明は所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと当該アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを共存させることで増殖とともにＰＨＡの産生・蓄積を行うものであり、本発明のポリペプトンを用いた製造方法は、従来のポリペプトンを利用する例とは構成及び効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、フェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示していない。
【０２５４】
以下に、本発明のＰＨＡ、製造方法、微生物についてより詳しく説明する。
【０２５５】
＜ＰＨＡモノマーユニット供給系＞
先ず、目的とするＰＨＡに混在してくるｍcl-３ＨＡモノマーユニットの供給系の１つである「脂肪酸合成経路」について詳細に説明する。
グルコース等の糖類を基質とした場合、細胞成分として必要なアルカノエートは、糖類から「解糖系」を経て生産されるアセチルＣoＡを出発物質とした「脂肪酸合成経路」から生合成される。なお、脂肪酸合成には新規(de novo)合成経路と炭素鎖延長経路があり、以下にこれらについて説明する。
【０２５６】
１)新規(de novo)合成経路
アセチルＣoＡカルボキシラーゼ(ＥＣ ６.４.１.２)と脂肪酸合成酵素(ＥＣ ２.３.１.８５)の２つの酵素で触媒される。なお、アセチルＣoＡカルボキシラーゼは、ビオチンを介在し、最終的に以下の反応を触媒し、アセチルＣoＡからマロニルＣoＡを生成する酵素であり、反応は下記式で表わされる。
アセチルCoA＋ATP＋HCO3 -⇔マロニルCoA＋ADP＋Pi
また、脂肪酸合成酵素は、転移-縮合-還元-脱水-還元の反応サイクルを触媒する酵素であり、全反応は次の反応式で示される。
アセチルCoA＋nマロニルCoA＋2nNADPH＋2nH+ ⇒CH3(CH2)2nCOOH＋nCO2＋2nNADP+＋(n-1)CoA
なお、酵素の種類によって、反応産物が遊離酸、ＣoＡ誘導体、あるいはＡＣＰ誘導体の場合がある。
【０２５７】
ここで、アセチルＣoＡ及びマロニルＣoＡは以下の化学式(４２)及び(４３)で示される。
【０２５８】
【化１１４】
【０２５９】
【化１１５】
【０２６０】
また、ＣoＡとは補酵素Ａ(co-enzyｍeＡ)の略称であり、以下の化学式(４４)で示される。
【０２６１】
【化１１６】
【０２６２】
本反応経路のうち、以下に示す経路により、ＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が中間体として供給される。また、以下の反応式に示すように経路は炭素を２個ずつ付加しながら最終的にはパルミチン酸まで延長される。それゆえＰＨＡ生合成のモノマー基質としては「Ｄ-３-ヒドロブチリル-ＡＣＰ」から「Ｄ-３-ヒドロキシパルミチル-ＡＣＰ」の炭素数が偶数の７種類の「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が供給されることになる。
【０２６３】
【化１１７】
【０２６４】
２)炭素鎖延長経路
この経路は、アシル-ＡＣＰにマロニルＡＣＰが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシル-ＡＣＰ(及びＣＯ2)となる経路(経路Ａとする)と、アシル-ＣoＡにアセチルＣoＡが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシル-ＣoＡとなる経路(経路Ｂとする)の２経路に大別される。以下に各経路について説明する。
Ａ,Ｂいずれの系も、中間体として「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」あるいは「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が生じ、「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」はそのままＰＨＡ合成のモノマー基質として利用され、「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」はＡＣＰ-ＣoＡ転移酵素により「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」に変換された後に、ＰＨＡ合成のモノマー基質として利用されると考えられる。
【０２６５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、微生物細胞中では以上のような「解糖系」及び「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸を基質とした場合、ピルビン酸からはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより直接アセチルＣoＡが生成する。ＴＣＡサイクル上の有機酸からは、例えば、リンゴ酸からはリンゴ酸デヒドロゲナーゼによりピルビン酸が生成し、さらに上記の反応によりアセチルＣoＡが生成する。オキサロ酢酸からはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによりホスホエノールピルビン酸が生成し、ホスホエノールピルビン酸がピルビン酸キナーゼにより触媒されピルビン酸が生成、さらに上記反応によりアセチルＣoＡが生成する。これらの反応により生成したアセチルＣoＡが「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。
【０２６６】
ここで、例えばオクタン酸、ノナン酸等のｍcl-アルカノエート、あるいは、例えば、５-フェニル吉草酸、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸、６-フェニルヘキサン酸、４-フェノキシ酪酸、４-シクロヘキシル酪酸といった、末端に直鎖脂肪族アルキル以外の官能基が付加されたアルカノエートはＣoＡリガーゼ(ＥＣ ６.２.１.３等)によりＣoＡ誘導体となり、β酸化系を担う酵素群により直接的にＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」となると考えられる。
【０２６７】
つまり、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸から生成するｍcl-３ＨＡモノマーユニットが、きわめて多段階の酵素反応を経て(つまり間接的に)生成されるのに比較し、ｍcl-アルカノエートからはきわめて直接的にｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されてくることになる。
【０２６８】
ここで、微生物の増殖を担うアセチルＣoＡの生成について説明する。目的とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えてｍcl-アルカノエートを共存させる方法では、これらのアルカノエートがβ酸化系を経由することによりアセチルＣoＡが生成する。一般にバルキーな置換基を有するアルカノエート(フェニル基、フェノキシ基、シクロヘキシル基等の置換基を有するアルカノエート)に比較し、ｍcl-アルカノエートはβ酸化系の酵素群との基質親和性に優れていると考えられ、ｍcl-アルカノエートの共存により効果的にアセチルＣoＡが生成される。このため、アセチルＣoＡをエネルギー源及び炭素源として用いる微生物の増殖には有利となる。
【０２６９】
しかしながら、β酸化系を経由するｍcl-アルカノエートが直接的にＰＨＡのモノマーユニットとなるために、生産されるＰＨＡは、目的のモノマーユニットに加えてｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在が多いものとなってしまうことが大きな課題である。
【０２７０】
この課題を解決するためには、ｍcl-アルカノエート以外で、効果的にアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得るような基質を選択し、目的とするアルカノエートと共存させる方法が望ましい。前述のように、アセチルＣoＡは脂肪酸合成経路を経ることによりＰＨＡのモノマーユニットとなり得るが、ｍcl-アルカノエートに比較すればより多段階の反応を経由する必要がある間接的なものであり、また、アセチルＣoＡを生成し得るような基質の濃度等、培養条件を適宜選択することにより、実質的にはｍcl-３ＨＡの混在のない、あるいは少ない製造方法の実現が可能である。
【０２７１】
また、１段階目で微生物の増殖のみを目的に培養し、２段階目においては炭素源として目的とするアルカノエートのみを培地に加える製造方法が汎用されている。ここで、当該アルカノエートをアシルＣoＡ化するベータ酸化系の初発酵素であるアシルＣoＡリガーゼがＡＴＰを要求することから、発明者らの検討によれば２段階目においても微生物がエネルギー源として利用し得る基質を共存させる製造方法がより効果的であるとの結果を得て、本発明を完成した。
【０２７２】
本発明の方法におけるアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を効果的に供給し得る基質としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸やガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等の糖類のほか、乳酸、ピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸及びその塩等のＴＣＡサイクルに関与する有機酸、さらにはポリペプトン、ビーフエキス、カザミノ酸などの天然物由来の培地用成分など、β酸化系を経ずにアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得る化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０２７３】
＜微生物＞
従来技術の説明等に述べたように、例えば、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-５-フルオロフェノキシ吉草酸、３-ヒドロキシ-６-シアノフェノキシヘキサン酸、３-ヒドロキシ-６-ニトロフェノキシヘキサン酸、３-ヒドロキシ-７-フルオロフェノキシヘプタン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する微生物の報告例として、Ｍacroｍolecules，２９，3432-3435 (1996)、Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.，４１，32-43 (1995)あるいは特許第２９８９１７５号公報等に記載の、シュードモナス・オレオボランスあるいはシュードモナス・プチダがある。しかしながら、フッ素、シアノ基、ニトロ基等で置換された３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する微生物の報告例はなかった。また、Ｍacroｍolecules，３２，2889-2895 (1999)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸とノナン酸を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４-ニトロフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。しかしながら、フッ素、トリフルオロメチル基等で置換された３-ヒドロキシ-フェニルアルカノエートをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する微生物の報告例はなかった。従って、本発明は、これらの新規なモノマーユニットをＰＨＡに取り込むことが可能な微生物を見出すことでなされた。
【０２７４】
本発明の新規微生物は、アルカノエートを基質として用いて、当該アルカノエート由来の新規なモノマーユニットを含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積するという、従来知られていない能力を有する微生物である。このような新規な酵素反応性を示す微生物は、本発明者らの探索により見出されたものである。すなわち、本発明の新規微生物は、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株(Pseudoｍonas putida Ｐ91、ＦＥＲＭ ＢＰ-7373)及びシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)である。なお、これらの菌株以外のものでも、当該アルカノエートを基質とした培養によって、例えば Pseudoｍonas 属に属する細菌のスクリーニングを行うことで、本発明のＰＨＡの製造方法に利用し得る微生物を得ることも可能である。
【０２７５】
以下にＹＮ2株、Ｈ45株、Ｐ91株及びＰ161株についての詳細を示す。
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型(非発酵性)
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性(＊)
Ｔｗeen８０の加水分解 :陽性
＊ nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
以上の菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻(Ｂergeys Ｍanual of Ｓysteｍatic Ｂacteriology，Ｖoluｍe１)(1984年)及びバージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー(Ｂergeys Ｍanual of Ｄeterｍinative Ｂacteriology)第９版(1994年)に基づいて検索したところ、ＹＮ2株及びＨ45株は、シュードモナス・チコリアイ(Pseudoｍonas cichorii)に、また、Ｐ91株は、シュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)に、それぞれ属すると判明した。従って、これらの菌株をシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株とそれぞれ命名した。
【０２７６】
一方、Ｐ161株は、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)に属すると判明したものの、その菌学的性質から分類学上の位置を確定するには至らなかった。そこで、遺伝的性質からの分類を試みるために、Ｐ161株の16Ｓ rＲＮＡの塩基配列を決定し(配列番号:１、cＤＮＡ to rＲＮＡ)、公知のシュードモナス属微生物の16Ｓ rＲＮＡの塩基配列との相同性を調べた。その結果、Ｐ161株とシュードモナス・ジェッセニイ(Pseudoｍonas jessenii)との間で、塩基配列の相同性が極めて高いことが判明した。さらに、Ｓysteｍ.Ａppl.Ｍicrobiol.，２０，137-149(1997)、及び、Ｓysteｍ.Ａppl.Ｍicrobiol.，２２，45-58(1999)に記載されたシュードモナス・ジェッセニイの菌学的性質と、Ｐ161株の菌学的性質との間で高い類似性も認められた。以上の結果から、Ｐ161株はシュードモナス・ジェッセニイに属せしめるのが妥当と判断されたため、Ｐ161株をシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株と命名した。
【０２７７】
なお、ＹＮ2株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7375」として、Ｈ45株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7374」として、Ｐ91株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7373」として、Ｐ161株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7376」として、通商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所(特許微生物寄託センター)にそれぞれ寄託されている。
【０２７８】
＜培養 一般＞
これらの微生物を所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと本発明の増殖用基質を含む培地で培養することで、目的とするＰＨＡを生産することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２７９】
本発明のＰＨＡの生産方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、菌数や活性状態の確保のための培養などには、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地や栄養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、撹拌などの培養条件は用いる微生物に応じて適宜選択する。
【０２８０】
一方、微生物を用いてＰＨＡを生産・蓄積させる場合は、ＰＨＡ生産用の培地として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを含む無機培地などが用いられる。
【０２８１】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(Ｊ.Ｂiol.Ｃheｍ.，２１８，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【０２８２】
なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【０２８３】
Ｎa2ＨＰＯ4： ６.２g
ＫＨ2ＰＯ4 ： ３.０g
ＮaＣl ： ０.５g
ＮＨ4Ｃl ： １.０g
(培地１リットル中、pＨ７.０)
培養条件としては、例えば１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃で、好気条件下での振盪培養や撹拌培養が挙げられる。
【０２８４】
培養工程は、バッチ式、流動バッチ式、半連続培養、連続培養、リアクター形式など、通常の微生物の培養に用いるいかなる方法をも用いることができ、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０２８５】
以下、本発明の増殖基質それぞれについて、具体的な培養工程を説明する。
＜培養 ｍcl-アルカノエート＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法としては、１段階目では、増殖用基質として、例えばオクタン酸やノナン酸等の炭素数６〜１２のアルカノエートを 0.1重量％から 0.2 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２８６】
また、例えばオクタン酸やノナン酸等の炭素数６〜１２のアルカノエートを 0.1 重量％から 0.2 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２８７】
ここで、これら増殖用基質として、ｍcl-アルカノエートを培地に添加する方法では、取得されるＰＨＡは、増殖用基質として添加したｍcl-アルカノエートに由来するモノマーユニットが多量に混在しているＰＨＡとなっている。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２８８】
＜培養 糖類＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法としては、１段階目では、増殖用基質として糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、増殖用基質として糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２８９】
また、増殖用基質として糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２９０】
このように、培地に添加する糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)の濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)と当該アルカノエートとを含む培地で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９１】
＜培養 ポリペプトン＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法として、１段階目では、増殖用基質としてポリペプトンを 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２９２】
また、ポリペプトンを 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２９３】
このように、培地に添加するポリペプトン濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。また、ポリペプトンは微生物の培養などに汎用される市販のポリペプトン何れについても好適に用いることが可能である。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、ポリペプトンと当該アルカノエートとを含む培地で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９４】
＜培養 ＴＣＡサイクルに関与する有機酸＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法として、１段階目では、増殖用基質としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、増殖用基質としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２９５】
また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２９６】
このように、培地に添加するＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)の濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)と当該アルカノエートとを含む培地で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９７】
＜培養 ポリペプトン＋ピルビン酸あるいはその塩＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法として、１段階目では、増殖用基質としてポリペプトンを 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、増殖用基質としてピルビン酸あるいはその塩を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２９８】
このように、培地に添加するポリペプトン濃度及びピルビン酸あるいはその塩の濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を何れにおいても 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、ポリペプトンと当該アルカノエートとを含む培地及びピルビン酸あるいはその塩と当該アルカノエートとを含む培地の２段階で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９９】
＜ＰＨＡの回収＞
本発明の方法における菌体からのＰＨＡの回収は、通常行われているクロロホルム等の有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０３００】
＜分子量＞
上記の方法を利用することで、本発明のＰＨＡを得ることができる。このＰＨＡの数平均分子量はポリマーとしての安定した物性、例えば、ポリマーを構成するモノマーユニットにより規定されるガラス転移温度、軟化点、融点、結晶性、配向性などを一定のものとするためには少なくとも１万程度以上であることが望ましく、本発明におけるＰＨＡの数平均分子量はおおよそ２万以上であり、ポリマーとしての安定した物性の発現を十分に期待できるものである。一方、溶解操作などの処理の簡便性から、ＰＨＡの数平均分子量は 20万程度までが好ましく、さらに 10万以下とするのがより好ましい。また前記のように、このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０３０１】
なお、微生物の培養、微生物によるＰＨＡの生産と菌体内への蓄積、並びに、菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。例えば、本発明にかかるＰＨＡの生産方法に利用される微生物は上記の４種の菌株以外でも、これら４種の菌株と同様の本発明にかかるＰＨＡ生産の生産能を有する微生物を用いることができる。
【０３０２】
これらのＰＨＡは、例えば、一般的なプラスチックが使用される用途の他、デバイス材料や医療用材料等に有用と考えられる。特に、置換基としてフッ素原子、トリフルオロメチル基等を導入したものは、生体適合性に優れていると予想され、医療用途への応用が期待される。更には、フッ素原子、トリフルオロメチル基等を含むことから撥水効果を有することが予測され、様々な分野での撥水処理への応用も考えられる。特には、脂肪族ポリエステルであることによる生分解性を利用した一時的な撥水処理等への応用も考えられる。
【０３０３】
【実施例】
[実施例１]
まず、Ｍacroｍolecules,２９,1762-1766(1996)及び同,２７,45-49(1994)の方法に従って、グリニャール反応により基質であるＦＰＶＡを合成した。即ち、５-ブロモ吉草酸を無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)に溶解させ、−20℃、アルゴン雰囲気下で３ｍol/L メチルマグネシウムクロリドＴＨＦ溶液を滴下しながら加えた。約15分間攪拌した後、１-ブロモ-４-フルオロベンゼンとマグネシウムのＴＨＦ溶液を更に滴下し、0.1ｍol/L Ｌi2ＣuＣl4のＴＨＦ溶液を加えた(温度は−20℃に保持)。この反応液を室温まで戻し、更に一晩攪拌した。その後溶液を氷冷した 20％硫酸水溶液に注加し、攪拌して、水層を採取して食塩で飽和し、エーテルで抽出した。更に抽出液を 50gの水酸化カリウムを加えた 100ｍLの脱イオン水で抽出した後、20％硫酸水溶液で酸性化して、沈殿部分を回収した。
【０３０４】
この沈殿部分を核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、以下の条件で分析した。測定核種:1Ｈ、13Ｃ、使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り)。その結果を図１及び表３に示す。
【０３０５】
【表３】
【０３０６】
[実施例２]
ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＦＰＶＡ 0.2％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３０７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表４に示す。
【０３０８】
【表４】
【０３０９】
[実施例３]
ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＦＰＶＡ 0.2％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３１０】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表５に示す。
【０３１１】
【表５】
【０３１２】
[実施例４]
ノナン酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＰ91株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３１３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表６に示す。
【０３１４】
【表６】
【０３１５】
[実施例５]
ノナン酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３１６】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表７に示す。
【０３１７】
【表７】
【０３１８】
[実施例６]
Ｈ45株由来のＰＨＡ 100ｍgをクロロホルム１ｍLに溶解し、次にノルマルヘキサンを白濁するまで添加した。これを遠心分離して沈殿部分を回収し、真空乾燥した。これを再びクロロホルム１ｍLに溶解し、ノルマルヘキサンを添加し、沈殿部分を回収する操作を３回繰返して行った。
【０３１９】
得られた沈殿部分は常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表８に示す通り、沈殿部分は３ＨＦＰＶモノマーユニットを唯一のモノマーユニットとするＰＨＡであった。
【０３２０】
【表８】
【０３２１】
さらに、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、以下の条件で分析した。測定核種:1Ｈ、13Ｃ、使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り)。その結果を図２、表９、図３、表１０に示す。
【０３２２】
【表９】
【０３２３】
ｍ:ｍultiplet
t:triplet
s:singlet
【０３２４】
【表１０】
【０３２５】
[実施例７](ＦＰxＶＡの合成)
三つ口丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、ヨウ化ナトリウム(0.06モル)、炭酸カリウム(0.11モル)及び４-フルオロフェノール(0.07モル)を加え、十分に攪拌した。この溶液中に、５-ブロモ吉草酸エチルエステル(0.06モル)を、窒素雰囲気下で滴下し、60±5℃で還流し、24時間反応させた。反応終了後、反応液をエバポレーターで濃縮乾固させ、塩化メチレンに再溶解し、水を加えて分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水した後エバポレーターで濃縮乾固した。
【０３２６】
得られた反応物に、熱メタノールを加えて溶解させ、溶液をゆっくり冷却して再沈殿させ、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸エチルエステルを得た。この時点での、５-ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、68 モル％であった。
【０３２７】
得られた反応物(エステル)を５重量％になるようにエタノール-水(９:１(v/v))に溶解し、10倍モル量の水酸化カリウムを加えて、０〜４℃で４時間反応させ、エステルの加水分解を行った。
【０３２８】
この反応液を 10倍量の 0.1ｍol/L塩酸水溶液に注加し、沈殿物をろ過により回収した。回収した沈澱物(反応物)は室温で 36時間減圧乾燥した。得られた乾燥物を少量の熱エタノールに溶解させ、溶液を徐々に冷却して再沈殿させて室温で 24時間減圧乾燥し、目的の化合物である５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を得た。この化合物の５-ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、49モル％であった。
【０３２９】
得られた化合物を以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
＜使用機器＞
ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400
1Ｈ共鳴周波数:400ＭＨz
＜測定条件＞
測定核種:1Ｈ
使用溶媒:ＣＤＣl3
reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3
測定温度:室温
図４にスペクトルチャートを、表１１に同定結果を示す。
【０３３０】
【表１１】
【０３３１】
以上の結果から、確かに所望のＦＰxＶＡが合成されている事が確認された。
【０３３２】
[実施例８](Ｐ91株によるＰＨＡの製造)
ノナン酸 0.1重量％と、ＦＰxＶＡ 0.1重量％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ91株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ノナン酸 0.1重量％、ＦＰxＶＡ 0.1重量％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３３３】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、秤量した。各収率を表１２に示す。
【０３３４】
得られたＰＨＡをゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により分子量を測定した。分子量を表１３に示す。
【０３３５】
更に、得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ＧＣ-ＭＳで分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。ＴIＣ及び各ピークのマススペクトルを図５〜７に示す。ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３３６】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３３７】
[実施例９](ＹＮ2株によるＰＨＡの製造その１)
実施例８のＰ91株をＹＮ2株とした以外は実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを製造させ、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に、ＧＣ-ＭＳのＴIＣを図８に示す。ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３３８】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３３９】
[実施例１０](Ｐ161株によるＰＨＡの製造)
実施例８のＰ91株をＰ161株とした以外は実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを製造させ、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に、ＧＣ-ＭＳのＴIＣを図９に示す。 ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３４０】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３４１】
[実施例１１](Ｈ45株によるＰＨＡの製造)
実施例８のＰ91株をＨ45株とした以外は実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを製造させ、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に、ＧＣ-ＭＳのＴIＣを図１０に示す。ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３４２】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３４３】
[実施例１２](ＹＮ2株によるＰＨＡの製造その２)
ヘキサン酸 0.1重量％、ＦＰxＶＡ 0.1重量％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。72時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ヘキサン酸 0.1重量％、ＦＰxＶＡ 0.1重量％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。30時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３４４】
実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを抽出し、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に示す。ＧＣ-ＭＳ分析の結果から、本方法で得られたＰＨＡは以下のような組成を持つことがわかった。
３-ヒドロキシ酪酸： 8.1％
３-ヒドロキヘキサン酸： 51.2％
３-ヒドロキオクタン酸： 1.3％
３-ヒドロキデカン酸： 7.0％
３-ヒドロキドデカン酸： 10.6％
未同定物質： 9.9％
3-ヒドロキシ-4-(4-フルオロフェノキシ)吉草酸:11.9％
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３４５】
【表１２】
【０３４６】
【表１３】
【０３４７】
[実施例１３](ＴＦＭＰＶＡの合成)
まず、Ｍacroｍolecules,２９,1762-1766(1996)及び同２７,45-49(1994)の方法に従って、グリニャール反応により基質であるＴＦＭＰＶＡを合成した。即ち、５-ブロモ吉草酸を無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)に溶解させ、−20℃、アルゴン雰囲気下で３ｍol/LメチルマグネシウムクロリドＴＨＦ溶液を滴下しながら加えた。約 15分間攪拌した後、１-ブロモ-４-トリフルオロメチルベンゼンとマグネシウムのＴＨＦ溶液を更に滴下し、0.1ｍol/L Ｌi2ＣuＣl2のＴＨＦ溶液を加えた(温度は−20℃に保持)。この反応液を室温まで戻し、更に一晩攪拌した。その後溶液を氷冷した 20％硫酸水溶液に注加し、攪拌して、水層を採取して食塩で飽和し、エーテルで抽出した。更に、抽出液を 50gの水酸化カリウムを加えた 100ｍLの脱イオン水で抽出した後、20％硫酸水溶液で酸性化して、沈殿部分を回収した。
【０３４８】
回収した化合物を定法によりメチルエステル化し、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＧＣ-ＭＳ ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(30ｍ×0.32ｍｍ×0.5μｍ)(Ｊ&Ｗ社製))。ＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)及びマススペクトルを図１１(a)及び(b)に示す。この結果より、目的とするＴＦＭＰＶＡが合成されていることが示された。
【０３４９】
[実施例１４](Ｈ45株によるポリマーの生産)
ノナン酸 0.1％、ＴＦＭＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＴＦＭＰＶＡ 0.2％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３５０】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、秤量した。収率を表１４に示す。
【０３５１】
【表１４】
【０３５２】
得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝64000、Ｍｗ＝110000であった。
【０３５３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(30ｍ×0.32ｍｍ×0.5μｍ))で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。ＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)及び目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルを図１２(a)及び(b)にそれぞれ示す。また、ＰＨＡの各ユニットのＴIＣエリア比を表１５に示す。
【０３５４】
【表１５】
【０３５５】
以上の結果より本発明の一方法により３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡが生産されることが示された。
【０３５６】
[実施例１５](Ｐ91株によるポリマーの生産)
ノナン酸 0.1％、ＴＦＭＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ91株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。30時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＴＦＭＰＶＡ 0.1％及びノナン酸 0.05％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。30時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３５７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、秤量した。
収率を表１６に示す。
【０３５８】
【表１６】
【０３５９】
得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝69000、Ｍｗ＝120000であった。
【０３６０】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(30ｍ×0.32ｍｍ×0.5μｍ))で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。ＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)及び目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルを図１３(a)及び(b)にそれぞれ示す。また、ＰＨＡの各ユニットのＴIＣエリア比を表１７に示す。
【０３６１】
【表１７】
【０３６２】
以上の結果より本発明の一方法により３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡが生産されることが示された。
【０３６３】
[実施例１６]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥して凍結乾燥ペレットを得た。
【０３６４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 28時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行った後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１８に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。
【０３６５】
【表１８】
【０３６６】
[実施例１７]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３６７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１９に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３６８】
【表１９】
【０３６９】
[実施例１８]
Ｄ-マンノース 0.5％またはＤ-フルクトース 0.5％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。Ｄ-マンノース系は 100時間、Ｄ-フルクトース系は 40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-マンノース 0.5％またはＤ-フルクトース 0.5％と、ＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７０】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２０に示す通り、Ｄ-マンノース及びＤ-フルクトースを増殖用炭素源として培養した場合においてもＤ-グルコースを用いた場合と同様に、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡを、高収率で得ることが可能であった。
【０３７１】
【表２０】
【０３７２】
[実施例１９]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２１に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３７４】
【表２１】
【０３７５】
[実施例２０]
Ｄ-グルコース 0.5％またはn-ノナン酸 0.1％と、ＦＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＦＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２２に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＦＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３７７】
【表２２】
【０３７８】
[実施例２１]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＨxＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＨxＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、EI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２３に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＨxＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-６-フェニルヘキサン酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８０】
【表２３】
【０３８１】
[実施例２２]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３８２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２４に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰxＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８３】
【表２４】
【０３８４】
[実施例２３]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３８５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２５に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰxＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８６】
【表２５】
【０３８７】
[実施例２４]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３８８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２６に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰxＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８９】
【表２６】
【０３９０】
[実施例２５]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％とＣＨＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥して凍結乾燥ペレットを得た。
【０３９１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 28時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルタで濾過した後、ロータリーエバポレータで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、情報に従ってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー質慮分析装置(ＣＧ-ＭＳ、商品名:ＱＰ-5050；島津製作所製、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表２７に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＣＨＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＣＨＢの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。
【０３９２】
【表２７】
【０３９３】
[実施例２６]
(ＹＮ2株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸の生産)
ノナン酸(以下ＮＡと記載する)0.1％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ2株のコロニーを、▲１▼酵母エキス(ＤIＦＣＯ社、以下ＹＥと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ビーフエキス(ＤIＦＣＯ社、以下ＢＥと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲３▼カザミノ酸(ＤIＦＣＯ社、以下ＣＡと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲４▼ポリペプトン(和光純薬工業、以下ＰＰと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３９４】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表２８に示す。
【０３９５】
【表２８】
【０３９６】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。すなわち、約 10ｍgのＰＨＡを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍLに溶解させ、３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍLを加えて、100℃で還流しながら 3.5時間反応させた。反応終了後、脱イオン水 10ｍLを加えて激しく 10分間振盪した後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウムで脱水したのち、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸ(Ｊ&Ｗ社、0.32ｍｍ×30ｍ)、ＥI法)にかけて、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、96％が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸であり、４％が３-ヒドロキシ酪酸のユニットであった。
【０３９７】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０３９８】
[実施例２７]
(ＹＮ2株によるポリ ３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸の生産)
ＮＡを 0.1％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ2株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、４-シクロヘキシル酪酸を 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ＰＰを 0.5％、４-シクロヘキシル酪酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３９９】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表２９に示す。
【０４００】
【表２９】
【０４０１】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例２６と同様の方法で分析した結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、97％が３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸であり、３％が３-ヒドロキシ酪酸のユニットであった。
【０４０２】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４０３】
[実施例２８]
(ＹＮ2株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸の生産)
ＮＡを 0.1％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ2株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、５-フェノキシ吉草酸を 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ＰＰを 0.5％、５-フェノキシ吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。26時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４０４】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表３０に示す。
【０４０５】
【表３０】
【０４０６】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例２６と同様の方法で分析した結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、95％が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸であり、５％が３-ヒドロキシ酪酸のユニットであった。
【０４０７】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４０８】
[実施例２９](Ｈ45株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸の生産)
ＮＡを 0.1％含むＭ９寒天培地上のＨ45株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼グルタミン酸ナトリウム(キシダ化学、以下ＳＧと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲３▼ＣＡを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲４▼ＰＰを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。28時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４０９】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表３１に示す。
【０４１０】
【表３１】
【０４１１】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例２６と同様の方法で分析した結果、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸のほぼホモポリマーであった。
【０４１２】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４１３】
[実施例３０](Ｐ161株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸の生産)
ＮＡを 0.1％含むＭ９寒天培地上のＰ161株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ＳＧを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲３▼ＢＥを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲４▼ＰＰを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４１４】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表３２に示す。
【０４１５】
【表３２】
【０４１６】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例１と同様の方法で分析した結果、97％が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットであり、３％が３-ヒドロキシ酪酸ユニットであった。
【０４１７】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４１８】
[実施例３１]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、あらかじめＤ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した２ｍLを加え、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４１９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４２０】
得られたＰＨＡは、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
【０４２１】
1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図１４に、その帰属結果を表３３に、ＰＨＡに含まれる３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸のモノマーユニットの割合を表３４にそれぞれ示す。表３３に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含む、化学式(４５)で表されるＰＨＡであることが確認された。
【０４２２】
【化１１８】
【０４２３】
【０４２４】
【表３３】
【０４２５】
【表３４】
【０４２６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３４に示した。
【０４２７】
また、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ;東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；(クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝81900、Ｍｗ＝226200 であった。
【０４２８】
[実施例３２]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４２９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４３０】
得られたＰＨＡは、実施例３１で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表３５に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４３１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３５に示した。
【０４３２】
【表３５】
【０４３３】
[実施例３３]
ポリペプトン 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。21時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４３４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４３５】
得られたＰＨＡは、実施例３１で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表３６に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４３６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３６に示した。
【０４３７】
【表３６】
【０４３８】
[実施例３４]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、あらかじめＤ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した２ｍLを加え、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４３９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４４０】
得られたＰＨＡは、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
【０４４１】
1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図１５に、その帰属結果を表３７に、ＰＨＡに含まれる３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸のモノマーユニットの割合を表３８にそれぞれ示す。表３７に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含む、化学式(４６)で表されるＰＨＡであることが確認された。
【０４４２】
【化１１９】
【０４４３】
【０４４４】
【表３７】
【０４４５】
【表３８】
【０４４６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３８に示した。
【０４４７】
また、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ;東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；(クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝58200、Ｍｗ＝108100 であった。
【０４４８】
[実施例３５]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、あらかじめＤ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した２ｍLを加え、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４４９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４５０】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表３９に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４５１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３９に示した。
【０４５２】
【表３９】
【０４５３】
[実施例３６]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４５４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４５５】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４０に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４５６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４０に示した。
【０４５７】
【表４０】
【０４５８】
[実施例３７]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４５９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４６０】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４１に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４６１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４１に示した。
【０４６２】
【表４１】
【０４６３】
[実施例３８]
ポリペプトン 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。23時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４６４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４６５】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４２に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４６６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４２に示した。
【０４６７】
【表４２】
【０４６８】
[実施例３９]
ポリペプトン 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。23時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４６９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４７０】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４３に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４７１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４３に示した。
【０４７２】
【表４３】
【０４７３】
[実施例４０] ４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の合成
新規化合物である４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸を下記する合成法で調製した。
【０４７４】
四つ口の丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、炭酸カリウム 15.2g(0.11ｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液にヨウ化ナトリウム 9.0g(0.06ｍol)、４-フルオロフェノール 7.9g(0.07ｍol)を加えて、室温、窒素雰囲気下で十分に攪拌した。次いで、４-ブロモ酪酸エチル 11.7g(0.06ｍol)を添加し、65℃、24時間加熱還流した。
【０４７５】
前記の反応終了後、溶媒アセトンをロータリーエバポレーターにより留去し、残渣をクロロホルムに再溶解した。水を加えて分液し、有機層を分取した。この有機層を無水硫酸マグネシウムにて脱水した後、クロロホルムをロータリーエバポレーターにより留去した。さらに、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸エチル 14.0g(ガスクロマトグラフィー-質量分析装置:ＧＣ-ＭＳ 島津ＱＰ-5050、ＥI法によるＧＣ-ＭＳピーク比純度 65.2％)を得た。得られた粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸エチルは、精製を加えず、次のエステル加水分解反応に用いた。
【０４７６】
得られた粗製物４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸エチルをエタノール-水(１:９(Ｖ/Ｖ))混合液 300ｍLに溶解し、およそ 10倍モル当量の水酸化カリウムを加えて、氷冷下(０〜４℃で)４時間反応させた。この反応液を 0.1ｍol/L塩酸水溶液３L中に注ぎ入れ、沈澱化した。沈澱を濾過・分離し、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。
【０４７７】
得られた粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(沈澱物)を、少量の熱メタノールに溶解し、徐々に冷却して再結晶した。濾別した再結晶物を真空ポンプにより乾燥し、目的化合物である４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。この一連の工程において、原料の４-ブロモ酪酸エチルを基準として、得られた４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の全収率は 52.7％であった。
【０４７８】
得られた化合物が、目的の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸であることを検証するため、以下の測定機器、測定条件でＮＭＲ分析を行い構造の同定を行った。
【０４７９】
測定された1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャート、13Ｃ-ＮＭＲスペクトルチャートをそれぞれ図１６、図１７に示す。表４４、表４５に、図１６、図１７に示すＮＭＲスペクトルの各信号の解析結果(帰属)を示す。この解析結果(帰属)により、得られた化合物は、目的の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸であることが確認された。
【０４８０】
【表４４】
【０４８１】
【表４５】
【０４８２】
[実施例４１]
予めシュードモナス チコリアイ ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)は、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない)200ｍLに加え、引き続き 125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４８３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４８４】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。図１８に、測定されたＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す。図１８の上は、ＧＣスペクトル、下は、前記ＧＣスペクトル上の主ピークに対するＭＳスペクトルである。この結果から、得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨpＦＰxＢ)をモノマーユニット主成分として含み、それ以外に、６種のモノマーユニットを少量含み、下記の化学式(４７)で表記可能なＰＨＡであることが判る。
【０４８５】
【化１２０】
【０４８６】
また、このＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０４８７】
表４６に、同定結果、平均分子量、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨpＦＰxＢ)をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢユニットを主成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸、３-ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。評価された平均分子量は、数平均分子量はＭn＝42400、一方、重量平均分子量はＭｗ＝90600であった。
【０４８８】
【表４６】
【０４８９】
また、このＰＨＡについて、実施例４０に記載したと同じ測定装置と同様の測定条件でＮＭＲ分析を行った。測定された1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図１９に示す。表４７に、図１９に示すＮＭＲスペクトルの主要ピーク各信号の解析結果(帰属)を示す。この解析結果(帰属)によって、得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢユニットを主成分とすることが確認された。
【０４９０】
【表４７】
【０４９１】
[実施例４２]
予めシュードモナス チコリアイ Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45；ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)を、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、 Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに加え、引き続き30℃、125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４９２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４９３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表４８に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢユニットを主要な成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸、３-ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。
【０４９４】
【表４８】
【０４９５】
[実施例４３]
シュードモナス チコリアイ ＹＮ2株を、Ｄ-グルコース 0.5％とpＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。96時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４９６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４９７】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表４９に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０４９８】
【表４９】
【０４９９】
[実施例４４]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、Ｄ-グルコース 0.5％とpＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。96時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５００】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５０１】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５０に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５０２】
【表５０】
【０５０３】
[実施例４５]
シュードモナス チコリアイ ＹＮ2株を、ポリペプトン 0.5％とpＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５０４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５０５】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５１に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５０６】
【表５１】
【０５０７】
[実施例４６]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、ポリペプトン 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５０８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５０９】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５２に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５１０】
【表５２】
【０５１１】
[実施例４７] ４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の合成
新規化合物である４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸を下記する合成法で調製した。
【０５１２】
四つ口の丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、炭酸カリウム 15.2g(0.11ｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液にヨウ化ナトリウム 9.0g(0.06ｍol)、３-フルオロフェノール 7.9g(0.07ｍol)を加えて、室温、窒素雰囲気下で十分に攪拌した。次いで、４-ブロモ酪酸エチル 11.7g(0.06ｍol)を添加し、65℃、24時間加熱還流した。
【０５１３】
前記の反応終了後、溶媒アセトンをロータリーエバポレーターにより留去し、残渣をクロロホルムに再溶解した。水を加えて分液し、有機層を分取した。この有機層を無水硫酸マグネシウムにて脱水した後、クロロホルムをロータリーエバポレーターにより留去した。さらに、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸エチル 14g(ガスクロマトグラフィー-質量分析装置:ＧＣ-ＭＳ 島津ＱＰ-5050、ＥI法によるＧＣ-ＭＳピーク比純度 87.9％)を得た。得られた粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸エチルは、精製を加えず、次のエステル加水分解反応に用いた。
【０５１４】
得られたエステル粗製物 3.0gをエタノール-水(１:９(Ｖ/Ｖ))混合液 100ｍLに溶解し、およそ 10倍モル当量の水酸化カリウムを加えて、室温で４時間反応させた。この反応液を 0.1ｍol/L塩酸水溶液約 200ｍL中に注ぎ入れ、沈澱化した。沈澱を濾過・分離し、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。
【０５１５】
得られた粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(沈澱物)を、少量の熱メタノールに溶解し、徐々に冷却して再結晶した。濾別した再結晶物を真空ポンプにより乾燥し、目的化合物である４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。
【０５１６】
エステル粗製物 3.0gから得られた４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の収量は、2.4gであった。従って、原料の４-ブロモ酪酸エチルを基準とした、全工程の収率は、93.2％となった。
【０５１７】
得られた化合物が、目的の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸であることを検証するため、以下の測定機器、測定条件でＮＭＲ分析を行い構造の同定を行った。
【０５１８】
測定された1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャート、13Ｃ-ＮＭＲスペクトルチャートをそれぞれ図２０、図２１に示す。表５３、表５４に、図２０、図２１に示すＮＭＲスペクトルの各信号の解析結果(帰属)を示す。この解析結果(帰属)により、得られた化合物は、目的の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸であることが確認された。
【０５１９】
【表５３】
【０５２０】
【表５４】
【０５２１】
[実施例４８]
予めシュードモナス チコリアイ ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)は、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、 Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに加え、引き続き125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５２２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５２３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。図２２に、測定されたＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す。図２２の上は、ＧＣスペクトル、下は、前記ＧＣスペクトル上の主ピークに対するＭＳスペクトルである。この結果から、得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨｍＦＰxＢ)をモノマーユニット主成分として含み、それ以外に、６種のモノマーユニットを少量含み、下記の化学式(４８)で表記可能なＰＨＡであることが判る。
【０５２４】
【化１２１】
【０５２５】
また、このＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５２６】
表５５に、同定結果、平均分子量、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨｍＦＰxＢ)をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢユニットを主成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸、３-ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。評価された平均分子量は、数平均分子量はＭn＝34500、一方、重量平均分子量はＭｗ＝75200であった。
【０５２７】
【表５５】
【０５２８】
また、このＰＨＡについて、実施例４７に記載したと同じ測定装置と同様の測定条件でＮＭＲ分析を行った。測定された1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図２３に示す。表５６に、図２３に示すＮＭＲスペクトルの主要ピーク各信号の解析結果(帰属)を示す。この解析結果(帰属)によって、得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢユニットを主成分とすることが確認された。
【０５２９】
【表５６】
【０５３０】
[実施例４９]
予めシュードモナス チコリアイ Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45；ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)を、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、 Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに加え、引き続き30℃、125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５３１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５３２】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５７に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢユニットを主要な成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。
【０５３３】
【表５７】
【０５３４】
[実施例５０]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。96時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５３５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５３６】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５８に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５３７】
【表５８】
【０５３８】
[実施例５１]
シュードモナス チコリアイ ＹＮ2株を、ポリペプトン 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５３９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５４０】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５９に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５４１】
【表５９】
【０５４２】
[実施例５２]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、ポリペプトン 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５４３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５４４】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表６０に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５４５】
【表６０】
【０５４６】
[実施例５３]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰxＶコポリマーの生産(ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％と、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ) 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。27時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５４７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５４８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５４９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、分子量、及びモノマーユニットの分析結果を表Ａに示す。なお、モノマーユニットの割合はＧＣ-ＭＳトータルイオンクロマト(ＴIＣ)のエリア比から計算した。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図２４及び図２５に示す。
【０５５０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５５１】
【表６１】
【０５５２】
[実施例５４]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰＶコポリマーの生産(ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％と、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ) 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。27時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５５３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５５４】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、分子量、及びモノマーユニットの分析結果を表６２に示す。なお、モノマーユニットの割合はＧＣ-ＭＳトータルイオンクロマト(ＴIＣ)のエリア比から計算した。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図２６及び図２７に示す。
【０５５５】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５５６】
【表６２】
【０５５７】
[実施例５５]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰxＶコポリマーの生産(グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＦＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。６２時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５５８】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５５９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６３に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図２８〜図３０に示す。
【０５６０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５６１】
【表６３】
【０５６２】
[実施例５６]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰＶコポリマーの生産(グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＦＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。６２時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５６３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５６４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５６５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６４に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図３１〜図３３に示す。
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５６６】
【表６４】
【０５６７】
[実施例５７]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＦＰＶ/ＦＰxＶ)コポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地及びグルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地をそれぞれ 200ｍL用意し、ＹＮ2株をそれぞれに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。94時間後、菌体を遠心分離によって回収し、２本分の菌体全てを、グルコース 0.5％、ＦＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５６８】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５６９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６５に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図３４〜図３７に示す。
【０５７０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸及び５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)ユニット及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５７１】
【表６５】
【０５７２】
[実施例５８]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＮ/ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５７３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのアセトンに懸濁し、室温(23℃)で 72時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５７４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５７５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６６に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図３８〜図４３に示す。
【０５７６】
この結果から、ＹＮ2株により、１１-フェノキシウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５７７】
【表６６】
【０５７８】
[実施例５９]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＮ/ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＵＤＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５７９】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５８０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５８１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６７に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図４４〜図５２に示す。
【０５８２】
この結果から、ＹＮ2株により、１１-フェノキシウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５８３】
【表６７】
【０５８４】
[実施例６０]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＮ/ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＵＤＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５８５】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５８６】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５８７】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６８に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図５３〜図６１に示す。
【０５８８】
この結果から、Ｈ45株により、１１-フェノキシウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５８９】
【表６８】
【０５９０】
[実施例６１]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５９１】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５９２】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５９３】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６９に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図６２〜図６５に示す。
【０５９４】
この結果から、ＹＮ2株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５９５】
【表６９】
【０５９６】
[実施例６２]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５９７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５９８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５９９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７０に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図６６〜図６９に示す。
【０６００】
この結果から、Ｈ45株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６０１】
【表７０】
【０６０２】
[実施例６３]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＯＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６０３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６０４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６０５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７１に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図７０〜図７５に示す。
【０６０６】
この結果から、ＹＮ2株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６０７】
【表７１】
【０６０８】
[実施例６４]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＯＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６０９】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６１０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６１１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７２に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図７６〜図８４に示す。
【０６１２】
この結果から、Ｈ45株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６１３】
【表７２】
【０６１４】
[実施例６５]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６１５】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６１６】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６１７】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７３に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図８５〜図８９に示す。
【０６１８】
この結果から、ＹＮ2株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６１９】
【表７３】
【０６２０】
[実施例６６]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６２１】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６２２】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６２３】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７４に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図９０〜図９２に示す。
【０６２４】
この結果から、Ｈ45株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６２５】
【表７４】
【０６２６】
[実施例６７]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＨpＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６２７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６２８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６２９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７５に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図９３〜図１００に示す。
【０６３０】
この結果から、ＹＮ2株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６３１】
【表７５】
【０６３２】
[実施例６８]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＨpＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６３３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６３４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６３５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７６に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１０１〜図１０７に示す。
【０６３６】
この結果から、Ｈ45株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６３７】
【表７６】
【０６３８】
[実施例６９]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰxＶユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸ナトリウム二段階培養)＞
リンゴ酸ナトリウム 0.5％、５-フェノキシ吉草酸(ＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。60時間後、菌体を遠心分離によって回収し、リンゴ酸ナトリウム 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６３９】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６４０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６４１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７７に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１０８〜図１１４に示す。
【０６４２】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェノキシ吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６４３】
【表７７】
【０６４４】
[実施例７０]
＜Ｈ45株によるＰＨＰxＶユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸ナトリウム二段階培養)＞
リンゴ酸ナトリウム 0.5％、５-フェノキシ吉草酸(ＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。60時間後、菌体を遠心分離によって回収し、リンゴ酸ナトリウム 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６４５】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６４６】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６４７】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７８に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１１５〜図１２０に示す。
【０６４８】
この結果から、Ｈ45株により、５-フェノキシ吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６４９】
【表７８】
【０６５０】
[実施例７１]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰＶユニットを含むポリマーの生産 (フルクトース二段階培養)＞
フルクトース 0.5％、５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分離によって回収し、フルクトース 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。50時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６５１】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６５２】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６５３】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７９に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１２１〜図１２３に示す。
【０６５４】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェニル吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６５５】
【表７９】
【０６５６】
[実施例７２]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰＶユニットを含むポリマーの生産 (マンノース二段階培養)＞
マンノース 0.5％、５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、マンノース 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。91時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６５７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６５８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６５９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表８０に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１２４及び図１２５に示す。
【０６６０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェニル吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６６１】
【表８０】
【０６６２】
[実施例７３]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰＶユニットを含むポリマーの生産 (乳酸ナトリウム二段階培養)＞
乳酸ナトリウム 0.5％、５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、乳酸ナトリウム 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。28時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６６３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６６４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６６５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表８１に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１２６〜図１２９に示す。
【０６６６】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェニル吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６６７】
【表８１】
【０６６８】
[実施例７４]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰxＢユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸二ナトリウム二段階培養)＞
リンゴ酸二ナトリウム・0.5水和物、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム・１水和物、Ｄ(+)-グルコース、n-ノナン酸、または、ポリペプトン(日本製薬) 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸(ＰxＢＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０６６９】
この乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、約60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表８２に示す通り、リンゴ酸二ナトリウムを増殖用炭素源として培養した場合に、４-フェノキシ-n-酪酸に由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸(３ＨＰxＢ)ユニットの比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。更に、表８３に、リンゴ酸二ナトリウムで培養した場合の菌体及びポリマーの収量、ポリマーの組成を示す。
【０６７０】
【表８２】
【０６７１】
【表８３】
【０６７２】
[実施例７５]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰxＢユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸二ナトリウム二段階培養:大量培養)＞
酵母エキス(オリエンタル酵母工業) 0.5％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で８時間、振盪培養して種菌とした。容量 10Lのジャーファーメンターに、リンゴ酸二ナトリウム・0.5水和物 0.5％と４-フェノキシ-n-酪酸 0.1％とを含むＭ９培地５Lを調製し、集菌を 50ｍL接種し、30℃、80回転/分、通気量 2.5L/分で通気攪拌培養した。39時間後、菌体を遠心分離によって回収した。
このペレットを約1.7％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液 120ｍLに懸濁し、約４℃で２時間振盪してＰＨＡを抽出した。遠心分離によりＰＨＡを回収し乾燥した結果、培地液量１L当たり 56ｍgのＰＨＡが得られた。
【０６７３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、４-フェノキシ-n-酪酸に由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸ユニットの組成比(ＧＣ-ＭＳ,ピークエリア比)は 99.７％であった。
【０６７４】
【発明の効果】
本発明、並びに本願明細書中に記載の関連発明により、新規なポリヒドロキシアルカノエートと、その原料となる新規な置換アルカン酸、当該新規ポリヒドロキシアルカノエートを生産し菌体内に蓄積する能力を有する新規微生物、及び、このような微生物を用いた当該ポリヒドロキシアルカノエートの生産方法が提供される。これにより、機能性ポリマーとしても有用な、各種官能基を導入したポリヒドロキシアルカノエートが極めて効率的に、且つ高い純度で製造することができ、デバイス材料や医用材料等の各分野への応用が期待できる。
【０６７５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で合成した３ＨＦＰＶの核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図２】実施例６で得られたＰＨＡの1Ｈ核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図３】実施例６で得られたＰＨＡの13Ｃ核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図４】実施例７で得られた５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸に関する核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図５】実施例８で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＧＣ-ＭＳのトータルイオンクロマトグラフィー(ＴIＣ)を示す図である。
【図６】 (a)及び(b)は、実施例８で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣにおけるピークのマススペクトルを示す図である。
【図７】 (a)及び(b)は、実施例８で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣにおけるピークのマススペクトルを示す図である。
【図８】実施例９で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣを示す図である。
【図９】実施例１０で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣを示す図である。
【図１０】実施例１１で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣを示す図である。
【図１１】 (a)は５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸のＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)を、(b)はそのマススペクトルを示す図である。
【図１２】実施例１４で得られたＰＨＡコポリマーのメチル化物の分析結果を示す図であり、(a)はＰＨＡコポリマーのメチル化物のＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)であり、(b)はＴIＣにおける目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルである。
【図１３】実施例１５で得られたＰＨＡコポリマーのメチル化物の分析結果を示す図であり、(a)はＰＨＡコポリマーのメチル化物のＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)であり、(b)はＴIＣにおける目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルである。
【図１４】実施例３０で得られたＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスぺクトルを示す図である。
【図１５】実施例３４で得られたＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスぺクトルを示す図である。
【図１６】４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１７】４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１８】実施例４１において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡにつき、メタノリシス後に測定したＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す図である。
【図１９】実施例４１において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２０】４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２１】４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】実施例４７において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡにつき、メタノリシス後に測定したＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す図である。
【図２３】実施例４７において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２４】実施例５３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２５】実施例５３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２６】実施例５４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２７】実施例５４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２８】実施例５５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２９】実施例５５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３０】実施例５５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３１】実施例５６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３２】実施例５６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３３】実施例５６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３４】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３５】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３６】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３７】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３８】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３９】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４０】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４１】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４２】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４３】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４４】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４５】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４６】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４７】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４８】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４９】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５０】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５１】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５２】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５３】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５４】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５５】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５６】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５７】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５８】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５９】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６０】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６１】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６２】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６３】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６４】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６５】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６６】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６７】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６８】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６９】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７０】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７１】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７２】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７３】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７４】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７５】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７６】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７７】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７８】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７９】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８０】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８１】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８２】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８３】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８４】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８５】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８６】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８７】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８８】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８９】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９０】実施例６６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９１】実施例６６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９２】実施例６６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９３】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９４】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９５】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９６】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９７】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルメチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９８】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９９】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１００】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)エステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０１】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０２】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０３】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０４】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０５】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０６】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０７】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０８】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０９】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１０】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１１】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１２】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１３】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１４】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１５】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１６】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１７】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１８】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１９】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２０】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２１】実施例７１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２２】実施例７１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２３】実施例７１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２４】実施例７２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２５】実施例７２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２６】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２７】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２８】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２９】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)、微生物を用いた当該ＰＨＡの製造方法及びそれに用いる微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
長年にわたって、石油由来の合成高分子をプラスチック等として利用してきたが、使用後廃棄されるこれらプラスチック等の処理が大きな社会問題となっている。石油由来の合成高分子は、分解されにくい利点から金属材料、ガラス等の代替えを果たしてきたが、大量に消費され、また大量に廃棄される昨今では、その分解されにくいという性質が逆に災いし廃棄物処理場に蓄積されることとなった。また、焼却処理を行うとＣＯ2 排出量の増加となり、ある場合には、ダイオキシンや環境ホルモン等の有害物質の発生原因ともなる。一方、ポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)に代表される微生物産生ポリエステル(ＰＨＡ)は、従来のプラスチックと同様、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができるとともに、石油由来の合成高分子とは異なり、生物により分解されうるという特性を有している。従って、廃棄した際、微生物産生ポリエステルは生分解されることにより自然界の物質循環に取り込まれるので、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、燃焼処理を行う必要もないため、大気汚染や地球温暖化を防止するという観点でも有効な材料であり、環境保全を可能とするプラスチックとして利用することができる。加えて、微生物産生ポリエステルは医療用軟質部材への応用などが検討されている(特開平５-１５９号公報、特開平６-１６９９８０号公報、特開平６-１６９９８８号公報、特開平６-２２５９２１号公報 など)。
【０００３】
これまで、多くの微生物がＰＨＢあるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されている(「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、(株)エヌ・ティー・エス発行、P178-197、(1995))。このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス Ｈ16株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸(３ＨＢ)と３-ヒドロキシ吉草酸(３ＨＶ)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特表平６-１５６０４号公報、特表平７-１４３５２号公報、特表平８-１９２２７号公報等)。
【０００５】
特開平５-７４４９２号公報では、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００６】
特開平５-９３０４９号公報、及び、特開平７-２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸(３ＨＨx)の２成分共重合体が生産されることが開示されている。
【０００７】
特開平９-１９１８９３号公報では、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、グルコン酸及び１,４-ブタンジオールを炭素源として用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットとして持つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００８】
また、近年、炭素数が１２程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length:ｍclと略記)の３-ヒドロキシアルカノエート(３ＨＡ)からなるＰＨＡについての研究が精力的に行われている。このようなＰＨＡの合成経路は大きく２つに分類することが可能であり、その具体例を下記(１)および(２)に示す。
【０００９】
(１)β酸化を利用した合成:
特許公報第２６４２９３７号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Pseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３-ヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。また、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,５８(２),746 (1992)には、シュードモナス・レジノボランス(Pseudoｍonas resinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 １：15：75：９)をモノマーユニットとするポリエステルを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 ８：62：23：７)をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３ＨＡモノマーユニットは(２)で説明する脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００１０】
(２)脂肪酸合成経路を利用した合成
Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,１６(３)、119 (1994)には、シュードモナス sp.61-3株(Pseudoｍonas sp.61-3 strain)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシアルカン酸及び、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸、３-ヒドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシアルケン酸をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。
【００１１】
ところで、通常、ＰＨＡの生合成は、細胞内の様々な代謝経路の中間体として生じる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」を基質とし、ＰＨＡシンターゼ(ＰＨＡ synthase)により行われる。
【００１２】
ここで、「ＣoＡ」とは「補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)」のことである。そして上記(１)の先行技術に記載されている様に、オクタン酸やノナン酸等の脂肪酸を炭素源とした場合、ＰＨＡの生合成は、「β酸化サイクル」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行われるとされている。
【００１３】
以下に、「β酸化サイクル」を経由してＰＨＡが生合成されるまでの反応を示す。
【００１４】
【化５５】
一方、上記(２)の先行技術に記載されている様に、グルコース等の糖類を基質とし、ＰＨＡを生合成する場合は、「脂肪酸合成経路」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」から変換された「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行われるとされている。
ここで、「ＡＣＰ」とは「アシルキャリアプロテイン(acyl carrier protein)」のことである。
【００１６】
ところで、先に述べたとおり、上記(１)および(２)で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡである。しかし、このような微生物産性ＰＨＡのより広範な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、多様な置換基(例えば、フェニル基など)を側鎖に導入したＰＨＡが極めて有用であることが期待されている。そのようなＰＨＡの合成に関しては、β酸化を利用した合成について、例えば、Ｍacroｍolecules,２４,p5256-5260 (1991)に、アリール基等を側鎖に導入したＰＨＡに関する報告がある。具体的には、シュードモナス・オレオボランス(Pseudononas oleovorans)が５-フェニル吉草酸とノナン酸(モル比２:１、総濃度１０ｍｍol/L)を基質とし、３-ヒドロキシ吉草酸、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシウンデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(量比 0.6：16.0：41.1：1.7：40.6)をユニットとするポリエステルを、培養液１Lあたり 160ｍg(菌体に対する乾燥重量比 31.6％)生産し、また、５-フェニル吉草酸とオクタン酸(モル比１:１、総濃度１０ｍｍol/L)を基質とし、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(量比 7.3：64.5：3.9：24.3)をユニットとするポリエステルを、培養液１Lあたり 200ｍg(菌体に対する乾燥重量比 39.2％)生産することが報告されている。この報告におけるＰＨＡは、ノナン酸やオクタン酸が用いられていることからも主にβ酸化経路を経て合成されているものと考えられる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、微生物産生ＰＨＡにおいては、その製造に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、各種の組成・構造のものが得られているが、プラスチックとしての応用を考えた場合、物性的に未だ十分であるとは言えない。微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためにはさらに多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００１８】
一方、前述のような、置換基を側鎖に導入したタイプのＰＨＡは、導入した置換基を所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待でき、そのような機能性と生分解性とを両立可能であるような優れたＰＨＡと、その製造方法、ならびに、所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索もまた重要な課題である。
【００１９】
このような置換基を側鎖に導入したＰＨＡの他の例としては、前記したフェニル基、さらにはフェノキシ基を側鎖に有するＰＨＡが挙げられる。
【００２０】
フェニル基の他の例としては、Ｍacroｍolecules,２９,1762-1766 (1996)に、シュードモナス・オレオボランスが、５-(４-トリル)吉草酸(５-(４-メチルフェニル)吉草酸)を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(４-トリル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２１】
更には、Ｍacroｍolecules,３２,2889-2895 (1999)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸とノナン酸を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４-ニトロフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２２】
また、フェノキシ基の例としては、Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,１９５,1665-1672 (1994)に、シュードモナス・オレオボランスが１１-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２３】
また、Ｍacroｍolecules,２９,3432-3435 (1996)には、シュードモナス・オレオボランスを用いて、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸及び３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸及び３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、１１-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。この報告におけるポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。
【００２４】
【表１】
更に、Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,４１,32-43(1995)では、シュードモナス・オレオボランスＡＴＣＣ29347株及びシュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)ＫＴ2442株を用いて、オクタン酸と p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは p-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産に成功している。
【００２６】
特許第２９８９１７５号公報には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造方法が記載されている。
【００２７】
これらの生産は以下の様な「二段階培養」で行われている。
培養時間： 一段目、２４時間 ； 二段目、９６時間
各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。
(１)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(２)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐホモポリマー
一段目の基質:クエン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
(３)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸
(４)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐコポリマー
一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸
その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００２８】
また、シクロヘキシル基をモノマーユニット中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボランスによる生産の例が報告されている(Ｍacroｍolecules,３０,1611-1615 (1997))。
【００２９】
この報告によれば、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸(以下、ＮＡと記載する)とシクロヘキシル酪酸(以下、ＣＨＢＡと記載する)あるいはシクロヘキシル吉草酸(以下、ＣＨＶＡと記載する)の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている(各割合は不明)。
【００３０】
その収率等に関しては、ＣＨＢＡに対して、基質濃度トータル２０ｍｍol/L の条件で、ＣＨＢＡとＮＡの量比を変化させ、表２に示すような結果を得たと報告されている。
【００３１】
【表２】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)、
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)、
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。
【００３３】
このように、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡを微生物により生産しようとする場合、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に見られるように、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【００３４】
しかしながら、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチル-ＣoＡの生成に基づくエネルギー源の供給が期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチル-ＣoＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまう点が大きな課題である。また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。前述の報告例では、基質である８-フェノキシオクタン酸由来の３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。さらに、β酸化によるアセチル-ＣoＡの生成に基づいたエネルギー源の供給を前提とした方法では、微生物の増殖が遅く、ＰＨＡの合成に時間がかかる点、合成されたＰＨＡの収率が低くなりがちな点も大きな課題である。
【００３５】
このため、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が有効と考えられ、一般的に用いられている。
【００３６】
しかしながら、本発明者らの検討によれば、上記のようにオクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を増殖用炭素源とし、β-酸化経路を経て合成されたＰＨＡは、その純度が低く、得られるポリマーの５０％以上が、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット(例えば、３-ヒドロキシオクタン酸や３-ヒドロキシノナン酸等)であるｍcl-３ＨＡモノマーユニットである。これらのｍcl-３ＨＡユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、本発明の目的とするＰＨＡに多量に混在した場合、ポリマーのガラス転移温度(Ｔg)を著しく降下させる。このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は大きな課題である。この課題の解決手段としては、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍcl-３ＨＡモノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離/除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍcl-３ＨＡモノマーユニット除去は極めて困難である。
【００３７】
本発明は前記の課題を解決するものであり、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡの提供、ならびに、当該ＰＨＡを微生物を利用して製造する方法の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とするＰＨＡを高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法を提供することにある。また本発明は、当該ＰＨＡを高純度で効率的に合成することのできる菌株を提供することも目的とする。
【００３８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、特に、デバイス材料や医用材料等として有用な、置換あるいは無置換のフェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を側鎖上に有するＰＨＡの開発を目指して、ＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する能力を有する新規な微生物の探索、ならびに、新規な微生物を用いて、所望のＰＨＡを製造する方法について、鋭意研究を進め、本発明を完成した。
【００３９】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、少なくとも、下記式 (14)
【化４】
ＡmＢ(1-m) (49)
(ただし、Ａは下記式(２)で表され、Ｂは下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１以上であり、ｍは0.01以上、１未満である)
【００４０】
【化５６】
(上記式中、n は０〜10であり、k は３または５であり、Ｒは下記式 ( ６ ) で表される少なくとも１以上の基を含み、他に下記式(５)および(７)で表される基から選択される少なくとも１以上の基を含むことができる)
【００４２】
【化５７】
(式(５)中、Ｒ１は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、qは、１〜８の整数から選択される;式(６)中、Ｒ２は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、rは、１〜８の整数から選択される;式(７)中、Ｒ３は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、sは、１〜８の整数から選択される)
ここで、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは式(２)で表されるモノマーユニットを複数種含み得るが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を含むように設計すると良い。一般には５種類程度までの目的モノマーユニットに対応したアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10種類程度までの式(２)で表されるモノマーユニットが含まれるようになり、本発明の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのモノマーユニットで構成することも可能である。
【００４４】
また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れについても、またＲ3のシクロヘキシル基の場合は１位についても、対応するモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの構成が可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体で構成するのが有利である。
【００４５】
また、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、下記式(１)で表されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、アルカノエートとともに微生物を培養し、微生物菌体からポリヒドロキシアルカノエートを抽出して、下記式(１)で表されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを取得することを特徴とする製造方法である。
ＡmＢ(1-m) (１)
(ただし、Ａは下記式(２)で表され、Ｂは下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１以上であり、ｍは0.01以上、１未満である)
【００４６】
【化５８】
(上記式中、n は０〜10 であり、k は３または５であり、Ｒは下記式(５)から(７)で表わされる基から選択される少なくとも１以上の基である)
【００４８】
【化５９】
(式(５)中、Ｒ１は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、q は、１〜８の整数から選択される;式(６)中、Ｒ２は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、r は、１〜８の整数から選択される;式(７)中、Ｒ３は、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 から選択される基であり、s は、１〜８の整数から選択される;但し、上記一般式(２)におけるＲとして、
一種の基を選択する際には、
式(５)において、Ｒ１＝Ｈで q＝２の基、Ｒ１＝Ｈで q＝３の基、Ｒ１＝Ｈで q ＝４の基、Ｒ１＝-ＮＯ2で q＝２の基、
式(６)において、Ｒ２＝ハロゲン原子で r＝２の基、Ｒ２＝ - ＣＮで r ＝２の基、Ｒ２＝-ＣＮで r＝３の基、Ｒ２＝-ＮＯ2で r＝３の基、
式(７)において、Ｒ３＝Ｈで s＝１の基、Ｒ３＝Ｈで s＝２の基は、選択肢からは除外され、
二種以上の基を選択する際には、
式(６)において、Ｒ２＝Ｈで r ＝２及び４の二種の基の組み合わせ、Ｒ２＝Ｈで r ＝２及び６の二種の基の組み合わせ、Ｒ２＝ハロゲン原子で r＝２及び４の二種の基の組み合わせ [ 但し、上記Ｂとして上記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) から１成分が選択される場合に限る ] は選択肢からは除外され、
三種の基を選択する際には、式 ( ６ ) において、Ｒ２＝Ｈで r ＝２及び４及び６の三種の基の組み合わせ、は選択肢からは除外される)
ここで、本発明のポリヒドロキシアルカノエートは式(２)で表されるモノマーユニットを複数種含み得るが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を含むように合成すると良い。一般には５種類程度までの目的モノマーユニットに対応したアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの式(２)で表されるモノマーユニットが含まれるようになり、本発明の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのモノマーユニットを含むように培養することも可能である。
【００５０】
また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れについても、またＲ3のシクロヘキシル基の場合は１位についても、対応するモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの合成が可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を含むように培養するのが有利である。
【００５１】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え、原料アルカノエート以外の炭素源として糖類のみを添加した培地で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００５２】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の製造方法は、下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、
下記一般式(２２)で表されるアルカノエートから下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(２２)で表されるアルカノエートと下記式(２２)で表されるアルカノエート以外の炭素源として糖類のみを含む培地で培養する工程を有することを特徴とする。
【００５３】
【化６０】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００５５】
【化６１】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００５７】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００５８】
また、糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノースなどを好適に用いることができる。
【００５９】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え、原料アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加した培地で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００６０】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の製造方法は、下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、
下記式(２２)で表されるアルカノエートから下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(２２)で表されるアルカノエートと下記式(２２)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを含む培地で培養する工程を有することを特徴とする。
【００６１】
【化６２】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００６３】
【化６３】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００６５】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００６６】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え、原料アルカノエート以外の炭素源としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加した培地で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出した。
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の生産方法は、下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による生産方法であって、
下記一般式(22)で表されるアルカノエートから下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(22)で表されるアルカノエートと下記式(22)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを含む培地で培養する工程を有することを特徴とする。
【００６７】
【化６４】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００６９】
【化６５】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００７１】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００７２】
また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸としては、ＴＣＡサイクルそのものに存在する有機酸、例えば、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸及びその塩など、さらにはＴＣＡサイクルへのメインフラックス上に存在する有機酸、例えば、乳酸、ピルビン酸及びその塩などを好適に用いることができる。
【００７３】
さらに発明者らは、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がない、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、ポリマー原料のアルカノエートに加え原料アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを含む培地による培養と、当該アルカノエートと当該アルカノエート以外の炭素源としてピルビン酸あるいはその塩のみとを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは混在がないＰＨＡを生産できることを見出した。
【００７４】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)の製造方法は、下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物による製造方法であって、
下記一般式(22)で表されるアルカノエートから下記式(23)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、下記式(22)で表されるアルカノエートと下記式(22)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを含む培地による培養と、下記式(22)で表されるアルカノエートと下記式(22)で表されるアルカノエート以外の炭素源としてピルビン酸あるいはその塩のみとを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で培養する工程を有することを特徴とする。
【００７５】
【化６６】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００７７】
【化６７】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
ここで、式(２２)で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いうるが、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、適当数を用いると良い。一般には５種類程度までの式(２２)で表されるアルカノエートを原料として用いると、その一部から前記のようにβ酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった「副次的な」基質が新たに生成する。これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、10 種類程度までの、例えば式(２)で表されるようなモノマーユニットが含まれるようになり、上の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くのアルカノエートを用いることも可能である。
【００７９】
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 等が挙げられる。Ｒ4の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても、またシクロヘキシル基の場合は１位においても、対応するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することが可能であるが、機能性、物性などが何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【００８０】
また、本発明にかかる新規菌株は、下記式(２２)で表されるアルカノエートから下記式(２３)で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの合成系を有することを特徴とする。
【００８１】
【化６８】
(上記式中、Ｒは下記式(２４)で表される基の少なくとも１つ以上の基であり、Ｒ'は上記式(２２)で選択された基、選択された基において t−２である基、選択された基において t−４である基、選択された基において t−６である基から選択される少なくとも１つ以上の基である。ここで、t−２、t−４、t−６は１以上の整数値のみを取り得る)
【００８３】
【化６９】
(上記式中、Ｒ4は、置換もしくは未置換のフェニル基、置換もしくは未置換のフェノキシ基、置換もしくは未置換のシクロヘキシル基を表し、t はそれぞれ独立して１〜８の整数を表す)
上記のＲ4の基における置換基としては、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7 等が挙げられる。
【００８５】
以下、本発明に属する、もしくは関連する新規なポリヒドロキシアルカノエートについて詳述する。
【００８６】
本発明に関連する新規なポリヒドロキシアルカノエートは、下記式(８):
【００８７】
【化７０】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 ( ８ ) の３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - フルオロフェニル ) 吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【００８９】
【化１２２】
【００９０】
【化７１】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 ( ９ ) の３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - トリフルオロメチルフェニル ) 吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【００９２】
【化１２３】
【００９３】
【化７２】
で表される５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸であり、この原料基質自体も新規な化合物である。
【００９５】
さらに、下記式(１０):
【００９６】
【化７３】
で表される３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (10) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ４ - ニトロフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【００９８】
【化１２４】
【００９９】
【化７４】
で表される３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (11) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ４ - シアノフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１０１】
【化１２５】
【０１０２】
【化７５】
で表される３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (12) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ４ - フルオロフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１０４】
【化１２６】
【０１０５】
【化７６】
で表される３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 (13) の３ - ヒドロキシ - ４ -( ３ - フルオロフェノキシ ) 酪酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１０７】
【化１２７】
【０１０８】
【化７７】
で表される３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１４)の３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１１０】
【化７８】
さらに、下記式(１５):
【０１１２】
【化７９】
で表される３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１５)の３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１１４】
【化８０】
さらに、下記式(１６):
【０１１６】
【化８１】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。ここで、上記式(１６)の３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸以外のモノマーユニットとして、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含み、かつ、モノマーユニットが３成分系であるものを除いたポリヒドロキシアルカノエートである。
【０１１８】
【化８２】
さらに、下記式(８)及び(１６):
【０１２０】
【化８３】
で表される３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸と３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式 ( ８ ) 及び (16) の３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - フルオロフェニル ) 吉草酸と３ - ヒドロキシ - ５ -( ４ - フルオロフェノキシ ) 吉草酸以外のモノマーユニットには、下記式 ( ３ ) あるいは ( ４ ) で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１２２】
【化１２８】
【０１２３】
【化８４】
で表される３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１５)及び(１７)の３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１２５】
【化８５】
さらに、下記式(１４)、(１８)及び(１９):
【０１２７】
【化８６】
【化８７】
で表される３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１４)、(１８)及び(１９)の３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１３０】
【化８８】
さらに、下記式(１５)、(１７)及び(２０):
【０１３２】
【化８９】
【化９０】
で表される３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートである。なお、上記式(１５)、(１７)及び(２０)の３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸以外のモノマーユニットには、下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットのうち少なくとも１種以上を含む。
【０１３５】
【化９１】
以下、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法について詳述する。
【０１３７】
本発明者らは、下記式(２５)で表される５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(８)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１３８】
【化９２】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(25)で表されるＦＰＶＡを含む培地で、ＦＰＶＡを利用して上記式(８)で表される３ＨＦＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１４０】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４１】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２５)で表されるＦＰＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１４４】
本発明者らは、下記式(２１)で表される５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸(ＣＦ3ＰＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(９)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸(３ＨＣＦ3ＰＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１４５】
【化９３】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(21)で表されるＣＦ3ＰＶＡを含む培地で、ＣＦ3ＰＶＡを利用して上記式(９)で表される３ＨＣＦ3ＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１４７】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４８】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１４９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２１)で表されるＣＦ3ＰＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１５１】
本発明者らは、下記式(２６)で表される４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸(ＮＯ2ＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１０)からなる３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸(３ＨＮＯ2ＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１５２】
【化９４】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(26)で表されるＮＯ2ＰxＢＡを含む培地で、ＮＯ2ＰxＢＡを利用して上記式(10)で表される３ＨＮＯ2ＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１５４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１５７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２６)で表されるＮＯ2ＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１５８】
本発明者らは、下記式(２７)で表される４-(４-シアノフェノキシ)酪酸(ＣＮＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１１)からなる３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸(３ＨＣＮＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１５９】
【化９５】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(27)で表されるＣＮＰxＢＡを含む培地で、ＣＮＰxＢＡを利用して上記式(11)で表される３ＨＣＮＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１６１】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６４】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２７)で表されるＣＮＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１６５】
本発明者らは、下記式(２８)で表される４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(ＦＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１２)からなる３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨＦＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１６６】
【化９６】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(28)で表されるＦＰxＢＡを含む培地で、ＦＰxＢＡを利用して上記式(12)で表される３ＨＦＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１６８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１６９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７１】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２８)で表されるＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２８)で表されるＦＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１７２】
本発明者らは、下記式(２９)で表される４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(ｍＦＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１３)からなる３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨｍＦＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１７３】
【化９７】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡを含む培地で、ｍＦＰxＢＡを利用して上記式(１３)で表される３ＨｍＦＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１７５】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１７８】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２９)で表されるｍＦＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１７９】
本発明者らは、下記式(３１)で表される５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(３０)からなる３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１８０】
【化９８】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(３１)で表されるＰＶＡと糖類とを含む培地で、ＰＶＡを利用して上記式(３０)で表される３ＨＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１８２】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３１)で表されるＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１８３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３１)で表されるＰＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１８４】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３１)で表されるＰＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３１)で表されるＰＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１８５】
本発明者らは、下記式(３３)で表される６-フェニルヘキサン酸(ＰＨxＡ)を含む培地で培養することで、下記式(３２)からなる３-ヒドロキシ-６-フェニルヘキサン酸(３ＨＰＨx)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１８６】
【化９９】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(33)で表されるＰＨxＡと糖類とを含む培地で、ＰＨxＡを利用して上記式(32)で表される３ＨＰＨxモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１８８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３３)で表されるＰＨxＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１８９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３３)で表されるＰＨxＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３３)で表されるＰＨxＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３３)で表されるＰＨxＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１９１】
本発明者らは、下記式(３４)で表される４-フェノキシ酪酸(ＰxＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１４)からなる３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１９２】
【化１００】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(34)で表されるＰxＢＡを含む培地で、ＰxＢＡを利用して上記式(14)で表される３ＨＰxＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０１９４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０１９７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３４)で表されるＰxＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３４)で表されるＰxＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０１９８】
本発明者らは、下記式(３５)で表される５-フェノキシ吉草酸(ＰxＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１５)からなる３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１９９】
【化１０１】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(35)で表されるＰxＶＡを含む培地で、ＰxＶＡを利用して上記式(15)で表される３ＨＰxＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２０１】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡと糖類とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０４】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３５)で表されるＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３５)で表されるＰxＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２０５】
本発明者らは、下記式(３６)で表される５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１６)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２０６】
【化１０２】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(36)で表されるＦＰxＶＡと糖類とを含む培地で、ＦＰxＶＡを利用して上記式(16)で表される３ＨＦＰxＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２０８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２０９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３６)で表されるＦＰxＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２１０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３６)で表されるＦＰxＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２１１】
本発明者らは、下記式(３８)で表される４-シクロヘキシル酪酸(ＣＨＢＡ)を含む培地で培養することで、下記式(３７)からなる３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸(３ＨＣＨＢ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２１２】
【化１０３】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(38)で表されるＣＨＢＡと糖類とを含む培地で、ＣＨＢＡを利用して上記式(37)で表される３ＨＣＨＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２１４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３８)で表されるＣＨＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２１５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３８)で表されるＣＨＢＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２１６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３８)で表されるＣＨＢＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３８)で表されるＣＨＢＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２１７】
本発明者らは、下記式(２５)で表される５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ)及び下記式(３６)で表される５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ)を含む培地で培養することで、下記式(８)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)及び下記式(１６)からなる３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２１８】
【化１０４】
【化１０５】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(25)で表されるＦＰＶＡ及び上記式(36)で表されるＦＰxＶＡと糖類とを含む培地で、ＦＰＶＡ及びＦＰxＶＡを利用して上記式(８)で表される３ＨＦＰＶ及び上記式(16)で表される３ＨＦＰxＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２２１】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２２２】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２２３】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(２５)で表されるＦＰＶＡ及び式(３６)で表されるＦＰxＶＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２２４】
本発明者らは、下記式(３９)で表される７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１５)からなる３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)及び下記式(１７)からなる３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２２５】
【化１０６】
【化１０７】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(39)で表されるＰxＨpＡと糖類とを含む培地で、ＰxＨpＡを利用して上記式(15)で表される３ＨＰxＶ及び上記式(17)で表される３ＨＰxＨpモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２２８】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３９)で表されるＰxＨpＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２２９】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３９)で表されるＰxＨpＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２３０】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(３９)で表されるＰxＨpＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(３９)で表されるＰxＨpＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２３１】
本発明者らは、下記式(４０)で表される８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１４)からなる３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、下記式(１８)からなる３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び下記式(１９)からなる３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２３２】
【化１０８】
【化１０９】
【化１１０】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(40)で表されるＰxＯＡと糖類とを含む培地で、ＰxＨpＡを利用して上記式(14)で表される３ＨＰxＢ、上記式(18)で表される３ＨＰxＨx及び上記式(19)で表される３ＨＰxＯモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２３６】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４０)で表されるＰxＯＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２３７】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４０)で表されるＰxＯＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２３８】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４０)で表されるＰxＯＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(４０)で表されるＰxＯＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２３９】
本発明者らは、下記式(４１)で表される１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ)を含む培地で培養することで、下記式(１５)からなる３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、下記式(１７)からなる３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び下記式(２０)からなる３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０２４０】
【化１１１】
【化１１２】
【化１１３】
すなわち、本発明に関連するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記式(41)で表されるＰxＵＤＡと糖類とを含む培地で、ＰxＵＤＡを利用して上記式(15)で表される３ＨＰxＶ、上記式(17)で表される３ＨＰxＨp及び上記式(20)で表される３ＨＰxＮモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする。
【０２４４】
また、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４１)で表されるＰxＵＤＡとポリペプトンとを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２４５】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４１)で表されるＰxＵＤＡとＴＣＡサイクルに関与する有機酸とを含む培地による培養で行うことを特徴とする。
【０２４６】
さらに、製造方法の別の一つとしては、微生物の培養を、式(４１)で表されるＰxＵＤＡとポリペプトンとを含む培地による培養と、これに続く式(４１)で表されるＰxＵＤＡとピルビン酸あるいはその塩とを含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする。
【０２４７】
さらに、本発明は、上記のポリヒドロキシアルカノエートの生産に好適に利用し得る、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株(Pseudoｍonas putida Ｐ91、ＦＥＲＭ ＢＰ-7373)及びシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)の４種の新規菌株に関連する。
【０２４８】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＨＡはデバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡであり、より具体的には、前述した置換あるいは無置換のフェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を側鎖上に有するＰＨＡである。また、本発明のＰＨＡの製造方法は、微生物を利用して高純度かつ高収率に所望とするＰＨＡを製造することを可能とするものである。さらに本発明は、当該ＰＨＡを高純度で効率的に合成することのできる菌株の提供を可能とするものである。なお、本発明のＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２４９】
＜糖類ならびにＴＣＡサイクルに関与する有機酸 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えて、当該アルカノエート以外の炭素源として糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカノエート以外の炭素源として糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することにより得られている。
【０２５０】
すなわち、発明者らは、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を共存基質として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと共に培養せしめたところ、ノナン酸やオクタン酸といったｍcl-アルカノエートを共存基質として用いた従来の方法に比べ、目的とするＰＨＡが格段に優れた収率および純度で得られること、そしてこのような効果が、微生物の炭素源ならびにエネルギー源であるアセチルＣoＡをβ酸化に拠らない方法により生成することが可能な培養方法であることにより得られるものであるとの知見を得て本発明に至ったものである。
【０２５１】
本発明の方法においては、糖類化合物、例えばグルコースやフルクトース、マンノース等は、微生物の増殖基質として利用されることになり、生産されるＰＨＡは、糖類に共存させている所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートから構成され、グルコース等の糖類に由来するモノマーユニットが全く含まれないか、極めて少量しか含まれない。このような点で、本発明の方法は、従来のグルコースなどの糖類そのものをＰＨＡに導入するモノマーユニットの原料基質として用いるＰＨＡ微生物生産方法とは構成及び効果ともに根本的に異なるものである。
【０２５２】
＜ポリペプトン 従来技術との差異＞
本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に原料の所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えて、当該アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを添加することにより得られている。
【０２５３】
なお、微生物によるＰＨＡの生産にポリペプトンを利用する例として、特開平５-４９４８７号公報、特開平５-６４５９１号公報、特開平５-２１４０８１号公報、特開平６-１４５３１１号公報、特開平６-２８４８９２号公報、特開平７-４８４３８号公報、特開平８-８９２６４号公報、特開平９-１９１８９３号公報、特開平１１-３２７８９号公報等に、ＰＨＡを微生物に生産させる際に、培地中にポリペプトンを含有させていることが開示されているが、いずれも前培養、つまり菌体を単に増殖させる段階で用いており、前培養時にＰＨＡのモノマーユニットとなる基質は含まれていない。また、菌体にＰＨＡを生産させる段階でポリペプトンを用いた例はない。これに対して、本発明は所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと当該アルカノエート以外の炭素源としてポリペプトンのみを共存させることで増殖とともにＰＨＡの産生・蓄積を行うものであり、本発明のポリペプトンを用いた製造方法は、従来のポリペプトンを利用する例とは構成及び効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、フェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示していない。
【０２５４】
以下に、本発明のＰＨＡ、製造方法、微生物についてより詳しく説明する。
【０２５５】
＜ＰＨＡモノマーユニット供給系＞
先ず、目的とするＰＨＡに混在してくるｍcl-３ＨＡモノマーユニットの供給系の１つである「脂肪酸合成経路」について詳細に説明する。
グルコース等の糖類を基質とした場合、細胞成分として必要なアルカノエートは、糖類から「解糖系」を経て生産されるアセチルＣoＡを出発物質とした「脂肪酸合成経路」から生合成される。なお、脂肪酸合成には新規(de novo)合成経路と炭素鎖延長経路があり、以下にこれらについて説明する。
【０２５６】
１)新規(de novo)合成経路
アセチルＣoＡカルボキシラーゼ(ＥＣ ６.４.１.２)と脂肪酸合成酵素(ＥＣ ２.３.１.８５)の２つの酵素で触媒される。なお、アセチルＣoＡカルボキシラーゼは、ビオチンを介在し、最終的に以下の反応を触媒し、アセチルＣoＡからマロニルＣoＡを生成する酵素であり、反応は下記式で表わされる。
アセチルCoA＋ATP＋HCO3 -⇔マロニルCoA＋ADP＋Pi
また、脂肪酸合成酵素は、転移-縮合-還元-脱水-還元の反応サイクルを触媒する酵素であり、全反応は次の反応式で示される。
アセチルCoA＋nマロニルCoA＋2nNADPH＋2nH+ ⇒CH3(CH2)2nCOOH＋nCO2＋2nNADP+＋(n-1)CoA
なお、酵素の種類によって、反応産物が遊離酸、ＣoＡ誘導体、あるいはＡＣＰ誘導体の場合がある。
【０２５７】
ここで、アセチルＣoＡ及びマロニルＣoＡは以下の化学式(４２)及び(４３)で示される。
【０２５８】
【化１１４】
【化１１５】
また、ＣoＡとは補酵素Ａ(co-enzyｍeＡ)の略称であり、以下の化学式(４４)で示される。
【０２６１】
【化１１６】
本反応経路のうち、以下に示す経路により、ＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が中間体として供給される。また、以下の反応式に示すように経路は炭素を２個ずつ付加しながら最終的にはパルミチン酸まで延長される。それゆえＰＨＡ生合成のモノマー基質としては「Ｄ-３-ヒドロブチリル-ＡＣＰ」から「Ｄ-３-ヒドロキシパルミチル-ＡＣＰ」の炭素数が偶数の７種類の「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が供給されることになる。
【０２６３】
【化１１７】
２)炭素鎖延長経路
この経路は、アシル-ＡＣＰにマロニルＡＣＰが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシル-ＡＣＰ(及びＣＯ2)となる経路(経路Ａとする)と、アシル-ＣoＡにアセチルＣoＡが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシル-ＣoＡとなる経路(経路Ｂとする)の２経路に大別される。以下に各経路について説明する。
【０２６５】
グルコース等の糖類を基質とした場合、微生物細胞中では以上のような「解糖系」及び「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸を基質とした場合、ピルビン酸からはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより直接アセチルＣoＡが生成する。ＴＣＡサイクル上の有機酸からは、例えば、リンゴ酸からはリンゴ酸デヒドロゲナーゼによりピルビン酸が生成し、さらに上記の反応によりアセチルＣoＡが生成する。オキサロ酢酸からはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによりホスホエノールピルビン酸が生成し、ホスホエノールピルビン酸がピルビン酸キナーゼにより触媒されピルビン酸が生成、さらに上記反応によりアセチルＣoＡが生成する。これらの反応により生成したアセチルＣoＡが「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。
【０２６６】
ここで、例えばオクタン酸、ノナン酸等のｍcl-アルカノエート、あるいは、例えば、５-フェニル吉草酸、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸、６-フェニルヘキサン酸、４-フェノキシ酪酸、４-シクロヘキシル酪酸といった、末端に直鎖脂肪族アルキル以外の官能基が付加されたアルカノエートはＣoＡリガーゼ(ＥＣ ６.２.１.３等)によりＣoＡ誘導体となり、β酸化系を担う酵素群により直接的にＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」となると考えられる。
【０２６７】
つまり、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸から生成するｍcl-３ＨＡモノマーユニットが、きわめて多段階の酵素反応を経て(つまり間接的に)生成されるのに比較し、ｍcl-アルカノエートからはきわめて直接的にｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されてくることになる。
【０２６８】
ここで、微生物の増殖を担うアセチルＣoＡの生成について説明する。目的とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えてｍcl-アルカノエートを共存させる方法では、これらのアルカノエートがβ酸化系を経由することによりアセチルＣoＡが生成する。一般にバルキーな置換基を有するアルカノエート(フェニル基、フェノキシ基、シクロヘキシル基等の置換基を有するアルカノエート)に比較し、ｍcl-アルカノエートはβ酸化系の酵素群との基質親和性に優れていると考えられ、ｍcl-アルカノエートの共存により効果的にアセチルＣoＡが生成される。このため、アセチルＣoＡをエネルギー源及び炭素源として用いる微生物の増殖には有利となる。
【０２６９】
しかしながら、β酸化系を経由するｍcl-アルカノエートが直接的にＰＨＡのモノマーユニットとなるために、生産されるＰＨＡは、目的のモノマーユニットに加えてｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在が多いものとなってしまうことが大きな課題である。
【０２７０】
この課題を解決するためには、ｍcl-アルカノエート以外で、効果的にアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得るような基質を選択し、目的とするアルカノエートと共存させる方法が望ましい。前述のように、アセチルＣoＡは脂肪酸合成経路を経ることによりＰＨＡのモノマーユニットとなり得るが、ｍcl-アルカノエートに比較すればより多段階の反応を経由する必要がある間接的なものであり、また、アセチルＣoＡを生成し得るような基質の濃度等、培養条件を適宜選択することにより、実質的にはｍcl-３ＨＡの混在のない、あるいは少ない製造方法の実現が可能である。
【０２７１】
また、１段階目で微生物の増殖のみを目的に培養し、２段階目においては炭素源として目的とするアルカノエートのみを培地に加える製造方法が汎用されている。ここで、当該アルカノエートをアシルＣoＡ化するベータ酸化系の初発酵素であるアシルＣoＡリガーゼがＡＴＰを要求することから、発明者らの検討によれば２段階目においても微生物がエネルギー源として利用し得る基質を共存させる製造方法がより効果的であるとの結果を得て、本発明を完成した。
【０２７２】
本発明の方法におけるアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を効果的に供給し得る基質としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸やガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等の糖類のほか、乳酸、ピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸及びその塩等のＴＣＡサイクルに関与する有機酸、さらにはポリペプトン、ビーフエキス、カザミノ酸などの天然物由来の培地用成分など、β酸化系を経ずにアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得る化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０２７３】
＜微生物＞
従来技術の説明等に述べたように、例えば、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸、３-ヒドロキシ-５-フルオロフェノキシ吉草酸、３-ヒドロキシ-６-シアノフェノキシヘキサン酸、３-ヒドロキシ-６-ニトロフェノキシヘキサン酸、３-ヒドロキシ-７-フルオロフェノキシヘプタン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する微生物の報告例として、Ｍacroｍolecules，２９，3432-3435 (1996)、Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.，４１，32-43 (1995)あるいは特許第２９８９１７５号公報等に記載の、シュードモナス・オレオボランスあるいはシュードモナス・プチダがある。しかしながら、フッ素、シアノ基、ニトロ基等で置換された３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する微生物の報告例はなかった。また、Ｍacroｍolecules，３２，2889-2895 (1999)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸とノナン酸を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４-ニトロフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。しかしながら、フッ素、トリフルオロメチル基等で置換された３-ヒドロキシ-フェニルアルカノエートをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する微生物の報告例はなかった。従って、本発明は、これらの新規なモノマーユニットをＰＨＡに取り込むことが可能な微生物を見出すことでなされた。
【０２７４】
本発明の新規微生物は、アルカノエートを基質として用いて、当該アルカノエート由来の新規なモノマーユニットを含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積するという、従来知られていない能力を有する微生物である。このような新規な酵素反応性を示す微生物は、本発明者らの探索により見出されたものである。すなわち、本発明の新規微生物は、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株(Pseudoｍonas putida Ｐ91、ＦＥＲＭ ＢＰ-7373)及びシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)である。なお、これらの菌株以外のものでも、当該アルカノエートを基質とした培養によって、例えば Pseudoｍonas 属に属する細菌のスクリーニングを行うことで、本発明のＰＨＡの製造方法に利用し得る微生物を得ることも可能である。
【０２７５】
以下にＹＮ2株、Ｈ45株、Ｐ91株及びＰ161株についての詳細を示す。
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型(非発酵性)
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性(＊)
Ｔｗeen８０の加水分解 :陽性
＊ nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
ＫingsＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
以上の菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻(Ｂergeys Ｍanual of Ｓysteｍatic Ｂacteriology，Ｖoluｍe１)(1984年)及びバージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー(Ｂergeys Ｍanual of Ｄeterｍinative Ｂacteriology)第９版(1994年)に基づいて検索したところ、ＹＮ2株及びＨ45株は、シュードモナス・チコリアイ(Pseudoｍonas cichorii)に、また、Ｐ91株は、シュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)に、それぞれ属すると判明した。従って、これらの菌株をシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株とそれぞれ命名した。
【０２７６】
一方、Ｐ161株は、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)に属すると判明したものの、その菌学的性質から分類学上の位置を確定するには至らなかった。そこで、遺伝的性質からの分類を試みるために、Ｐ161株の16Ｓ rＲＮＡの塩基配列を決定し(配列番号:１、cＤＮＡ to rＲＮＡ)、公知のシュードモナス属微生物の16Ｓ rＲＮＡの塩基配列との相同性を調べた。その結果、Ｐ161株とシュードモナス・ジェッセニイ(Pseudoｍonas jessenii)との間で、塩基配列の相同性が極めて高いことが判明した。さらに、Ｓysteｍ.Ａppl.Ｍicrobiol.，２０，137-149(1997)、及び、Ｓysteｍ.Ａppl.Ｍicrobiol.，２２，45-58(1999)に記載されたシュードモナス・ジェッセニイの菌学的性質と、Ｐ161株の菌学的性質との間で高い類似性も認められた。以上の結果から、Ｐ161株はシュードモナス・ジェッセニイに属せしめるのが妥当と判断されたため、Ｐ161株をシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株と命名した。
【０２７７】
なお、ＹＮ2株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7375」として、Ｈ45株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7374」として、Ｐ91株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7373」として、Ｐ161株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7376」として、通商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所(特許微生物寄託センター)にそれぞれ寄託されている。
【０２７８】
＜培養 一般＞
これらの微生物を所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと本発明の増殖用基質を含む培地で培養することで、目的とするＰＨＡを生産することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２７９】
本発明のＰＨＡの生産方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、菌数や活性状態の確保のための培養などには、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地や栄養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、撹拌などの培養条件は用いる微生物に応じて適宜選択する。
【０２８０】
一方、微生物を用いてＰＨＡを生産・蓄積させる場合は、ＰＨＡ生産用の培地として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを含む無機培地などが用いられる。
【０２８１】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(Ｊ.Ｂiol.Ｃheｍ.，２１８，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【０２８２】
なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【０２８３】
Ｎa2ＨＰＯ4： ６.２g
ＫＨ2ＰＯ4 ： ３.０g
ＮaＣl ： ０.５g
ＮＨ4Ｃl ： １.０g
(培地１リットル中、pＨ７.０)
培養条件としては、例えば１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃で、好気条件下での振盪培養や撹拌培養が挙げられる。
【０２８４】
培養工程は、バッチ式、流動バッチ式、半連続培養、連続培養、リアクター形式など、通常の微生物の培養に用いるいかなる方法をも用いることができ、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０２８５】
以下、本発明の増殖基質それぞれについて、具体的な培養工程を説明する。
＜培養 ｍcl-アルカノエート＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法としては、１段階目では、増殖用基質として、例えばオクタン酸やノナン酸等の炭素数６〜１２のアルカノエートを 0.1重量％から 0.2 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２８６】
また、例えばオクタン酸やノナン酸等の炭素数６〜１２のアルカノエートを 0.1 重量％から 0.2 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２８７】
ここで、これら増殖用基質として、ｍcl-アルカノエートを培地に添加する方法では、取得されるＰＨＡは、増殖用基質として添加したｍcl-アルカノエートに由来するモノマーユニットが多量に混在しているＰＨＡとなっている。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２８８】
＜培養 糖類＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法としては、１段階目では、増殖用基質として糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、増殖用基質として糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２８９】
また、増殖用基質として糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２９０】
このように、培地に添加する糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)の濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、糖類(例えばグルコース、マンノース、フルクトース等)と当該アルカノエートとを含む培地で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９１】
＜培養 ポリペプトン＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法として、１段階目では、増殖用基質としてポリペプトンを 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２９２】
また、ポリペプトンを 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２９３】
このように、培地に添加するポリペプトン濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。また、ポリペプトンは微生物の培養などに汎用される市販のポリペプトン何れについても好適に用いることが可能である。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、ポリペプトンと当該アルカノエートとを含む培地で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９４】
＜培養 ＴＣＡサイクルに関与する有機酸＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法として、１段階目では、増殖用基質としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、増殖用基質としてＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２９５】
また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度与えて培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０２９６】
このように、培地に添加するＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)の濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)と当該アルカノエートとを含む培地で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９７】
＜培養 ポリペプトン＋ピルビン酸あるいはその塩＞
例えば、２段階の培養工程を含む方法として、１段階目では、増殖用基質としてポリペプトンを 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、及び、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、２段階目では、１段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、増殖用基質としてピルビン酸あるいはその塩を 0.1 重量％から 2.0 重量％程度、当該アルカノエートを 0.01 重量％から 0.5 重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０２９８】
このように、培地に添加するポリペプトン濃度及びピルビン酸あるいはその塩の濃度は、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を何れにおいても 0.1 重量％から 2.0 重量％程度に選択して、添加するとよい。一方、原料となる当該アルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01 重量％から 0.5 重量％程度に選択して、添加するとよい。このように、ポリペプトンと当該アルカノエートとを含む培地及びピルビン酸あるいはその塩と当該アルカノエートとを含む培地の２段階で微生物を培養することによって、目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０２９９】
＜ＰＨＡの回収＞
本発明の方法における菌体からのＰＨＡの回収は、通常行われているクロロホルム等の有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０３００】
＜分子量＞
上記の方法を利用することで、本発明のＰＨＡを得ることができる。このＰＨＡの数平均分子量はポリマーとしての安定した物性、例えば、ポリマーを構成するモノマーユニットにより規定されるガラス転移温度、軟化点、融点、結晶性、配向性などを一定のものとするためには少なくとも１万程度以上であることが望ましく、本発明におけるＰＨＡの数平均分子量はおおよそ２万以上であり、ポリマーとしての安定した物性の発現を十分に期待できるものである。一方、溶解操作などの処理の簡便性から、ＰＨＡの数平均分子量は 20万程度までが好ましく、さらに 10万以下とするのがより好ましい。また前記のように、このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０３０１】
なお、微生物の培養、微生物によるＰＨＡの生産と菌体内への蓄積、並びに、菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。例えば、本発明にかかるＰＨＡの生産方法に利用される微生物は上記の４種の菌株以外でも、これら４種の菌株と同様の本発明にかかるＰＨＡ生産の生産能を有する微生物を用いることができる。
【０３０２】
これらのＰＨＡは、例えば、一般的なプラスチックが使用される用途の他、デバイス材料や医療用材料等に有用と考えられる。特に、置換基としてフッ素原子、トリフルオロメチル基等を導入したものは、生体適合性に優れていると予想され、医療用途への応用が期待される。更には、フッ素原子、トリフルオロメチル基等を含むことから撥水効果を有することが予測され、様々な分野での撥水処理への応用も考えられる。特には、脂肪族ポリエステルであることによる生分解性を利用した一時的な撥水処理等への応用も考えられる。
【０３０３】
【実施例】
[実施例１]
まず、Ｍacroｍolecules,２９,1762-1766(1996)及び同,２７,45-49(1994)の方法に従って、グリニャール反応により基質であるＦＰＶＡを合成した。即ち、５-ブロモ吉草酸を無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)に溶解させ、−20℃、アルゴン雰囲気下で３ｍol/L メチルマグネシウムクロリドＴＨＦ溶液を滴下しながら加えた。約15分間攪拌した後、１-ブロモ-４-フルオロベンゼンとマグネシウムのＴＨＦ溶液を更に滴下し、0.1ｍol/L Ｌi2ＣuＣl4のＴＨＦ溶液を加えた(温度は−20℃に保持)。この反応液を室温まで戻し、更に一晩攪拌した。その後溶液を氷冷した 20％硫酸水溶液に注加し、攪拌して、水層を採取して食塩で飽和し、エーテルで抽出した。更に抽出液を 50gの水酸化カリウムを加えた 100ｍLの脱イオン水で抽出した後、20％硫酸水溶液で酸性化して、沈殿部分を回収した。
【０３０４】
この沈殿部分を核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、以下の条件で分析した。測定核種:1Ｈ、13Ｃ、使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り)。その結果を図１及び表３に示す。
【０３０５】
【表３】
[実施例２]
ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＦＰＶＡ 0.2％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３０７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表４に示す。
【０３０８】
【表４】
[実施例３]
ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＦＰＶＡ 0.2％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３１０】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表５に示す。
【０３１１】
【表５】
[実施例４]
ノナン酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＰ91株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３１３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表６に示す。
【０３１４】
【表６】
[実施例５]
ノナン酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ノナン酸 0.1％、ＦＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３１６】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表７に示す。
【０３１７】
【表７】
[実施例６]
Ｈ45株由来のＰＨＡ 100ｍgをクロロホルム１ｍLに溶解し、次にノルマルヘキサンを白濁するまで添加した。これを遠心分離して沈殿部分を回収し、真空乾燥した。これを再びクロロホルム１ｍLに溶解し、ノルマルヘキサンを添加し、沈殿部分を回収する操作を３回繰返して行った。
【０３１９】
得られた沈殿部分は常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表８に示す通り、沈殿部分は３ＨＦＰＶモノマーユニットを唯一のモノマーユニットとするＰＨＡであった。
【０３２０】
【表８】
さらに、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、以下の条件で分析した。測定核種:1Ｈ、13Ｃ、使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り)。その結果を図２、表９、図３、表１０に示す。
【０３２２】
【表９】
ｍ:ｍultiplet
t:triplet
s:singlet
【０３２４】
【表１０】
[実施例７](ＦＰxＶＡの合成)
三つ口丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、ヨウ化ナトリウム(0.06モル)、炭酸カリウム(0.11モル)及び４-フルオロフェノール(0.07モル)を加え、十分に攪拌した。この溶液中に、５-ブロモ吉草酸エチルエステル(0.06モル)を、窒素雰囲気下で滴下し、60±5℃で還流し、24時間反応させた。反応終了後、反応液をエバポレーターで濃縮乾固させ、塩化メチレンに再溶解し、水を加えて分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水した後エバポレーターで濃縮乾固した。
【０３２６】
得られた反応物に、熱メタノールを加えて溶解させ、溶液をゆっくり冷却して再沈殿させ、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸エチルエステルを得た。この時点での、５-ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、68 モル％であった。
【０３２７】
得られた反応物(エステル)を５重量％になるようにエタノール-水(９:１(v/v))に溶解し、10倍モル量の水酸化カリウムを加えて、０〜４℃で４時間反応させ、エステルの加水分解を行った。
【０３２８】
この反応液を 10倍量の 0.1ｍol/L塩酸水溶液に注加し、沈殿物をろ過により回収した。回収した沈澱物(反応物)は室温で 36時間減圧乾燥した。得られた乾燥物を少量の熱エタノールに溶解させ、溶液を徐々に冷却して再沈殿させて室温で 24時間減圧乾燥し、目的の化合物である５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を得た。この化合物の５-ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、49モル％であった。
【０３２９】
得られた化合物を以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
＜使用機器＞
ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400
1Ｈ共鳴周波数:400ＭＨz
＜測定条件＞
測定核種:1Ｈ
使用溶媒:ＣＤＣl3
reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3
測定温度:室温
図４にスペクトルチャートを、表１１に同定結果を示す。
【０３３０】
【表１１】
以上の結果から、確かに所望のＦＰxＶＡが合成されている事が確認された。
【０３３２】
[実施例８](Ｐ91株によるＰＨＡの製造)
ノナン酸 0.1重量％と、ＦＰxＶＡ 0.1重量％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ91株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ノナン酸 0.1重量％、ＦＰxＶＡ 0.1重量％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３３３】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、秤量した。各収率を表１２に示す。
【０３３４】
得られたＰＨＡをゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により分子量を測定した。分子量を表１３に示す。
【０３３５】
更に、得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ＧＣ-ＭＳで分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。ＴIＣ及び各ピークのマススペクトルを図５〜７に示す。ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３３６】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３３７】
[実施例９](ＹＮ2株によるＰＨＡの製造その１)
実施例８のＰ91株をＹＮ2株とした以外は実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを製造させ、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に、ＧＣ-ＭＳのＴIＣを図８に示す。ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３３８】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３３９】
[実施例１０](Ｐ161株によるＰＨＡの製造)
実施例８のＰ91株をＰ161株とした以外は実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを製造させ、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に、ＧＣ-ＭＳのＴIＣを図９に示す。 ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３４０】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３４１】
[実施例１１](Ｈ45株によるＰＨＡの製造)
実施例８のＰ91株をＨ45株とした以外は実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを製造させ、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に、ＧＣ-ＭＳのＴIＣを図１０に示す。ピーク▲１▼は３-ヒドロキシヘプタン酸メチルエステル、ピーク▲２▼は３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、ピーク▲３▼は３-ヒドロキシノナン酸メチルエステルであり、ピーク▲４▼が３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのピークであることが示された。
【０３４２】
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシノナン酸及び３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３４３】
[実施例１２](ＹＮ2株によるＰＨＡの製造その２)
ヘキサン酸 0.1重量％、ＦＰxＶＡ 0.1重量％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。72時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ヘキサン酸 0.1重量％、ＦＰxＶＡ 0.1重量％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。30時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３４４】
実施例８と全く同様の方法でＰＨＡを抽出し、各分析を行った。収率を表１２に、分子量を表１３に示す。ＧＣ-ＭＳ分析の結果から、本方法で得られたＰＨＡは以下のような組成を持つことがわかった。
３-ヒドロキシ酪酸： 8.1％
３-ヒドロキヘキサン酸： 51.2％
３-ヒドロキオクタン酸： 1.3％
３-ヒドロキデカン酸： 7.0％
３-ヒドロキドデカン酸： 10.6％
未同定物質： 9.9％
3-ヒドロキシ-4-(4-フルオロフェノキシ)吉草酸:11.9％
以上の結果により、得られたポリマーは、３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸のユニットを含むＰＨＡであることが示された。
【０３４５】
【表１２】
【表１３】
[実施例１３](ＴＦＭＰＶＡの合成)
まず、Ｍacroｍolecules,２９,1762-1766(1996)及び同２７,45-49(1994)の方法に従って、グリニャール反応により基質であるＴＦＭＰＶＡを合成した。即ち、５-ブロモ吉草酸を無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)に溶解させ、−20℃、アルゴン雰囲気下で３ｍol/LメチルマグネシウムクロリドＴＨＦ溶液を滴下しながら加えた。約 15分間攪拌した後、１-ブロモ-４-トリフルオロメチルベンゼンとマグネシウムのＴＨＦ溶液を更に滴下し、0.1ｍol/L Ｌi2ＣuＣl2のＴＨＦ溶液を加えた(温度は−20℃に保持)。この反応液を室温まで戻し、更に一晩攪拌した。その後溶液を氷冷した 20％硫酸水溶液に注加し、攪拌して、水層を採取して食塩で飽和し、エーテルで抽出した。更に、抽出液を 50gの水酸化カリウムを加えた 100ｍLの脱イオン水で抽出した後、20％硫酸水溶液で酸性化して、沈殿部分を回収した。
【０３４８】
回収した化合物を定法によりメチルエステル化し、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＧＣ-ＭＳ ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(30ｍ×0.32ｍｍ×0.5μｍ)(Ｊ&Ｗ社製))。ＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)及びマススペクトルを図１１(a)及び(b)に示す。この結果より、目的とするＴＦＭＰＶＡが合成されていることが示された。
【０３４９】
[実施例１４](Ｈ45株によるポリマーの生産)
ノナン酸 0.1％、ＴＦＭＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＴＦＭＰＶＡ 0.2％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３５０】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、秤量した。収率を表１４に示す。
【０３５１】
【表１４】
得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝64000、Ｍｗ＝110000であった。
【０３５３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(30ｍ×0.32ｍｍ×0.5μｍ))で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。ＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)及び目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルを図１２(a)及び(b)にそれぞれ示す。また、ＰＨＡの各ユニットのＴIＣエリア比を表１５に示す。
【０３５４】
【表１５】
以上の結果より本発明の一方法により３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡが生産されることが示された。
【０３５６】
[実施例１５](Ｐ91株によるポリマーの生産)
ノナン酸 0.1％、ＴＦＭＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ91株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。30時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＴＦＭＰＶＡ 0.1％及びノナン酸 0.05％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。30時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３５７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、秤量した。
収率を表１６に示す。
【０３５８】
【表１６】
得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝69000、Ｍｗ＝120000であった。
【０３６０】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(30ｍ×0.32ｍｍ×0.5μｍ))で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。ＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)及び目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルを図１３(a)及び(b)にそれぞれ示す。また、ＰＨＡの各ユニットのＴIＣエリア比を表１７に示す。
【０３６１】
【表１７】
以上の結果より本発明の一方法により３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡが生産されることが示された。
【０３６３】
[実施例１６]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥して凍結乾燥ペレットを得た。
【０３６４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 28時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行った後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１８に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。
【０３６５】
【表１８】
[実施例１７]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３６７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１９に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３６８】
【表１９】
[実施例１８]
Ｄ-マンノース 0.5％またはＤ-フルクトース 0.5％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。Ｄ-マンノース系は 100時間、Ｄ-フルクトース系は 40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-マンノース 0.5％またはＤ-フルクトース 0.5％と、ＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７０】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２０に示す通り、Ｄ-マンノース及びＤ-フルクトースを増殖用炭素源として培養した場合においてもＤ-グルコースを用いた場合と同様に、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡを、高収率で得ることが可能であった。
【０３７１】
【表２０】
[実施例１９]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２１に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰＶの比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３７４】
【表２１】
[実施例２０]
Ｄ-グルコース 0.5％またはn-ノナン酸 0.1％と、ＦＰＶＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＦＰＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２２に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＦＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３７７】
【表２２】
[実施例２１]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＨxＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰＨxＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３７９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、EI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２３に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰＨxＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-６-フェニルヘキサン酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８０】
【表２３】
[実施例２２]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３８２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２４に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰxＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８３】
【表２４】
[実施例２３]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３８５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２５に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰxＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８６】
【表２５】
[実施例２４]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＰ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％と、ＰxＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３８８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２６に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＰxＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。
【０３８９】
【表２６】
[実施例２５]
Ｄ-グルコース 0.5％または n-ノナン酸 0.1％とＣＨＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。40時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥して凍結乾燥ペレットを得た。
【０３９１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 28時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルタで濾過した後、ロータリーエバポレータで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、情報に従ってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー質慮分析装置(ＣＧ-ＭＳ、商品名:ＱＰ-5050；島津製作所製、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行なった。その結果、表２７に示す通り、Ｄ-グルコースを増殖用炭素源として培養した場合の方が、ＣＨＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＣＨＢの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。
【０３９２】
【表２７】
[実施例２６]
(ＹＮ2株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸の生産)
ノナン酸(以下ＮＡと記載する)0.1％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ2株のコロニーを、▲１▼酵母エキス(ＤIＦＣＯ社、以下ＹＥと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ビーフエキス(ＤIＦＣＯ社、以下ＢＥと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲３▼カザミノ酸(ＤIＦＣＯ社、以下ＣＡと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲４▼ポリペプトン(和光純薬工業、以下ＰＰと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３９４】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表２８に示す。
【０３９５】
【表２８】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。すなわち、約 10ｍgのＰＨＡを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍLに溶解させ、３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍLを加えて、100℃で還流しながら 3.5時間反応させた。反応終了後、脱イオン水 10ｍLを加えて激しく 10分間振盪した後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウムで脱水したのち、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸ(Ｊ&Ｗ社、0.32ｍｍ×30ｍ)、ＥI法)にかけて、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、96％が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸であり、４％が３-ヒドロキシ酪酸のユニットであった。
【０３９７】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０３９８】
[実施例２７]
(ＹＮ2株によるポリ ３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸の生産)
ＮＡを 0.1％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ2株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、４-シクロヘキシル酪酸を 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ＰＰを 0.5％、４-シクロヘキシル酪酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０３９９】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表２９に示す。
【０４００】
【表２９】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例２６と同様の方法で分析した結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、97％が３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸であり、３％が３-ヒドロキシ酪酸のユニットであった。
【０４０２】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-４-シクロヘキシル酪酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４０３】
[実施例２８]
(ＹＮ2株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸の生産)
ＮＡを 0.1％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ2株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、５-フェノキシ吉草酸を 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ＰＰを 0.5％、５-フェノキシ吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。26時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４０４】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表３０に示す。
【０４０５】
【表３０】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例２６と同様の方法で分析した結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、95％が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸であり、５％が３-ヒドロキシ酪酸のユニットであった。
【０４０７】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４０８】
[実施例２９](Ｈ45株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸の生産)
ＮＡを 0.1％含むＭ９寒天培地上のＨ45株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼グルタミン酸ナトリウム(キシダ化学、以下ＳＧと記載する)0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲３▼ＣＡを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲４▼ＰＰを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。28時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４０９】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表３１に示す。
【０４１０】
【表３１】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例２６と同様の方法で分析した結果、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸のほぼホモポリマーであった。
【０４１２】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４１３】
[実施例３０](Ｐ161株によるポリ ３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸の生産)
ＮＡを 0.1％含むＭ９寒天培地上のＰ161株のコロニーを、▲１▼ＹＥを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲２▼ＳＧを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲３▼ＢＥを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地、▲４▼ＰＰを 0.5％、５-フェニル吉草酸 0.1％を含むＭ９液体培地(各 200ｍL)にそれぞれ植菌し、30℃で培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４１４】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、100ｍLのクロロホルムに懸濁し、55℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を 0.45μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。収率を表３２に示す。
【０４１５】
【表３２】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)
ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)
収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)
得られたＰＨＡの組成を実施例１と同様の方法で分析した結果、97％が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットであり、３％が３-ヒドロキシ酪酸ユニットであった。
【０４１７】
本結果より、本発明の一方法により、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが高収率で得られることがわかる。
【０４１８】
[実施例３１]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、あらかじめＤ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した２ｍLを加え、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４１９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４２０】
得られたＰＨＡは、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
【０４２１】
【０４２２】
【化１１８】
【表３３】
【表３４】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３４に示した。
【０４２７】
また、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ;東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；(クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝81900、Ｍｗ＝226200 であった。
【０４２８】
[実施例３２]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４２９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４３０】
得られたＰＨＡは、実施例３１で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表３５に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４３１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３５に示した。
【０４３２】
【表３５】
[実施例３３]
ポリペプトン 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。21時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、ＮＯ2ＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４３４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４３５】
得られたＰＨＡは、実施例３１で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表３６に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４３６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-ニトロフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３６に示した。
【０４３７】
【表３６】
[実施例３４]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、あらかじめＤ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した２ｍLを加え、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４３９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４４０】
得られたＰＨＡは、以下の条件でＮＭＲ分析を行なった。
【０４４１】
【０４４２】
【化１１９】
【表３７】
【表３８】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３８に示した。
【０４４７】
また、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ;東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；(クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝58200、Ｍｗ＝108100 であった。
【０４４８】
[実施例３５]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、あらかじめＤ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した２ｍLを加え、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４４９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４５０】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表３９に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４５１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表３９に示した。
【０４５２】
【表３９】
[実施例３６]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４５４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４５５】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４０に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４５６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４０に示した。
【０４５７】
【表４０】
[実施例３７]
Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、Ｄ-グルコース 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４５９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４６０】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４１に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４６１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４１に示した。
【０４６２】
【表４１】
[実施例３８]
ポリペプトン 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。23時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４６４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４６５】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４２に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４６６】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４２に示した。
【０４６７】
【表４２】
[実施例３９]
ポリペプトン 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。23時間後、菌体を遠心分離により回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％、ＣＮＰxＢＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４６９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブランフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノールで再沈澱させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４７０】
得られたＰＨＡは、実施例３４で示した条件でＮＭＲ分析を行なった。その結果、表４３に示す通り、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０４７１】
更に、得られたＰＨＡは、常法にしたがってメタノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行ない、３-ヒドロキシ-４-(４-シアノフェノキシ)酪酸以外のモノマーユニットの同定を行なった。その結果を表４３に示した。
【０４７２】
【表４３】
[実施例４０] ４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の合成
新規化合物である４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸を下記する合成法で調製した。
【０４７４】
四つ口の丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、炭酸カリウム 15.2g(0.11ｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液にヨウ化ナトリウム 9.0g(0.06ｍol)、４-フルオロフェノール 7.9g(0.07ｍol)を加えて、室温、窒素雰囲気下で十分に攪拌した。次いで、４-ブロモ酪酸エチル 11.7g(0.06ｍol)を添加し、65℃、24時間加熱還流した。
【０４７５】
前記の反応終了後、溶媒アセトンをロータリーエバポレーターにより留去し、残渣をクロロホルムに再溶解した。水を加えて分液し、有機層を分取した。この有機層を無水硫酸マグネシウムにて脱水した後、クロロホルムをロータリーエバポレーターにより留去した。さらに、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸エチル 14.0g(ガスクロマトグラフィー-質量分析装置:ＧＣ-ＭＳ 島津ＱＰ-5050、ＥI法によるＧＣ-ＭＳピーク比純度 65.2％)を得た。得られた粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸エチルは、精製を加えず、次のエステル加水分解反応に用いた。
【０４７６】
得られた粗製物４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸エチルをエタノール-水(１:９(Ｖ/Ｖ))混合液 300ｍLに溶解し、およそ 10倍モル当量の水酸化カリウムを加えて、氷冷下(０〜４℃で)４時間反応させた。この反応液を 0.1ｍol/L塩酸水溶液３L中に注ぎ入れ、沈澱化した。沈澱を濾過・分離し、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。
【０４７７】
得られた粗製の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(沈澱物)を、少量の熱メタノールに溶解し、徐々に冷却して再結晶した。濾別した再結晶物を真空ポンプにより乾燥し、目的化合物である４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。この一連の工程において、原料の４-ブロモ酪酸エチルを基準として、得られた４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の全収率は 52.7％であった。
【０４７８】
得られた化合物が、目的の４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸であることを検証するため、以下の測定機器、測定条件でＮＭＲ分析を行い構造の同定を行った。
【０４７９】
【０４８０】
【表４４】
【表４５】
[実施例４１]
予めシュードモナス チコリアイ ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)は、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない)200ｍLに加え、引き続き 125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４８３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４８４】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。図１８に、測定されたＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す。図１８の上は、ＧＣスペクトル、下は、前記ＧＣスペクトル上の主ピークに対するＭＳスペクトルである。この結果から、得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨpＦＰxＢ)をモノマーユニット主成分として含み、それ以外に、６種のモノマーユニットを少量含み、下記の化学式(４７)で表記可能なＰＨＡであることが判る。
【０４８５】
【化１２０】
【０４８７】
表４６に、同定結果、平均分子量、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨpＦＰxＢ)をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢユニットを主成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸、３-ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。評価された平均分子量は、数平均分子量はＭn＝42400、一方、重量平均分子量はＭｗ＝90600であった。
【０４８８】
【表４６】
また、このＰＨＡについて、実施例４０に記載したと同じ測定装置と同様の測定条件でＮＭＲ分析を行った。測定された1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図１９に示す。表４７に、図１９に示すＮＭＲスペクトルの主要ピーク各信号の解析結果(帰属)を示す。この解析結果(帰属)によって、得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢユニットを主成分とすることが確認された。
【０４９０】
【表４７】
[実施例４２]
予めシュードモナス チコリアイ Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45；ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)を、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、 Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに加え、引き続き30℃、125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４９２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４９３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表４８に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢユニットを主要な成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸、３-ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。
【０４９４】
【表４８】
[実施例４３]
シュードモナス チコリアイ ＹＮ2株を、Ｄ-グルコース 0.5％とpＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。96時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０４９６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０４９７】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表４９に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０４９８】
【表４９】
[実施例４４]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、Ｄ-グルコース 0.5％とpＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。96時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５００】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５０１】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５０に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５０２】
【表５０】
[実施例４５]
シュードモナス チコリアイ ＹＮ2株を、ポリペプトン 0.5％とpＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５０４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５０５】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５１に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５０６】
【表５１】
[実施例４６]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、ポリペプトン 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％と pＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５０８】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５０９】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５２に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨpＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５１０】
【表５２】
[実施例４７] ４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の合成
新規化合物である４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸を下記する合成法で調製した。
【０５１２】
四つ口の丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、炭酸カリウム 15.2g(0.11ｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液にヨウ化ナトリウム 9.0g(0.06ｍol)、３-フルオロフェノール 7.9g(0.07ｍol)を加えて、室温、窒素雰囲気下で十分に攪拌した。次いで、４-ブロモ酪酸エチル 11.7g(0.06ｍol)を添加し、65℃、24時間加熱還流した。
【０５１３】
前記の反応終了後、溶媒アセトンをロータリーエバポレーターにより留去し、残渣をクロロホルムに再溶解した。水を加えて分液し、有機層を分取した。この有機層を無水硫酸マグネシウムにて脱水した後、クロロホルムをロータリーエバポレーターにより留去した。さらに、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸エチル 14g(ガスクロマトグラフィー-質量分析装置:ＧＣ-ＭＳ 島津ＱＰ-5050、ＥI法によるＧＣ-ＭＳピーク比純度 87.9％)を得た。得られた粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸エチルは、精製を加えず、次のエステル加水分解反応に用いた。
【０５１４】
得られたエステル粗製物 3.0gをエタノール-水(１:９(Ｖ/Ｖ))混合液 100ｍLに溶解し、およそ 10倍モル当量の水酸化カリウムを加えて、室温で４時間反応させた。この反応液を 0.1ｍol/L塩酸水溶液約 200ｍL中に注ぎ入れ、沈澱化した。沈澱を濾過・分離し、真空ポンプにより乾燥し、粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。
【０５１５】
得られた粗製の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(沈澱物)を、少量の熱メタノールに溶解し、徐々に冷却して再結晶した。濾別した再結晶物を真空ポンプにより乾燥し、目的化合物である４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸を得た。
【０５１６】
エステル粗製物 3.0gから得られた４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の収量は、2.4gであった。従って、原料の４-ブロモ酪酸エチルを基準とした、全工程の収率は、93.2％となった。
【０５１７】
得られた化合物が、目的の４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸であることを検証するため、以下の測定機器、測定条件でＮＭＲ分析を行い構造の同定を行った。
【０５１８】
【０５１９】
【表５３】
【表５４】
[実施例４８]
予めシュードモナス チコリアイ ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)は、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、 Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに加え、引き続き125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５２２】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５２３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。図２２に、測定されたＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す。図２２の上は、ＧＣスペクトル、下は、前記ＧＣスペクトル上の主ピークに対するＭＳスペクトルである。この結果から、得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨｍＦＰxＢ)をモノマーユニット主成分として含み、それ以外に、６種のモノマーユニットを少量含み、下記の化学式(４８)で表記可能なＰＨＡであることが判る。
【０５２４】
【化１２１】
【０５２６】
表５５に、同定結果、平均分子量、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３-ヒドロキシ-４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸(３ＨｍＦＰxＢ)をモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢユニットを主成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸、３-ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。評価された平均分子量は、数平均分子量はＭn＝34500、一方、重量平均分子量はＭｗ＝75200であった。
【０５２７】
【表５５】
また、このＰＨＡについて、実施例４７に記載したと同じ測定装置と同様の測定条件でＮＭＲ分析を行った。測定された1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図２３に示す。表５６に、図２３に示すＮＭＲスペクトルの主要ピーク各信号の解析結果(帰属)を示す。この解析結果(帰属)によって、得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢユニットを主成分とすることが確認された。
【０５２９】
【表５６】
[実施例４９]
予めシュードモナス チコリアイ Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45；ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)を、Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 10ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で 72時間振盪培養した。この菌培養液２ｍLを、 Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに加え、引き続き30℃、125ストローク/分で振盪培養した。45時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５３１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５３２】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５７に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。なお、抽出されたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢユニットを主要な成分とするが、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸のうち１種以上をモノマーユニットとして含む混合物であると考えられる。
【０５３３】
【表５７】
[実施例５０]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。96時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５３５】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５３６】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５８に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５３７】
【表５８】
[実施例５１]
シュードモナス チコリアイ ＹＮ2株を、ポリペプトン 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５３９】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５４０】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表５９に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５４１】
【表５９】
[実施例５２]
シュードモナス チコリアイ Ｈ45株を、ポリペプトン 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ピルビン酸ナトリウム 0.5％とｍＦＰxＢＡ 0.1％を含むＭ９培地(無機窒素源のＮＨ4Ｃlを含まない) 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５４３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５４４】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表６０に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。得られたＰＨＡは、３ＨｍＦＰxＢを主要なモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが判る。
【０５４５】
【表６０】
[実施例５３]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰxＶコポリマーの生産(ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％と、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ) 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。27時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５４７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５４８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５４９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、分子量、及びモノマーユニットの分析結果を表Ａに示す。なお、モノマーユニットの割合はＧＣ-ＭＳトータルイオンクロマト(ＴIＣ)のエリア比から計算した。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図２４及び図２５に示す。
【０５５０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５５１】
【表６１】
[実施例５４]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰＶコポリマーの生産(ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％と、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ) 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。27時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５５３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５５４】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、分子量、及びモノマーユニットの分析結果を表６２に示す。なお、モノマーユニットの割合はＧＣ-ＭＳトータルイオンクロマト(ＴIＣ)のエリア比から計算した。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図２６及び図２７に示す。
【０５５５】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５５６】
【表６２】
[実施例５５]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰxＶコポリマーの生産(グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＦＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。６２時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５５８】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５５９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６３に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図２８〜図３０に示す。
【０５６０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５６１】
【表６３】
[実施例５６]
＜ＹＮ2株によるＰＨＦＰＶコポリマーの生産(グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＦＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。６２時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５６３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０５６４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５６５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６４に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図３１〜図３３に示す。
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５６６】
【表６４】
[実施例５７]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＦＰＶ/ＦＰxＶ)コポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(ＦＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地及びグルコース 0.5％、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(ＦＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地をそれぞれ 200ｍL用意し、ＹＮ2株をそれぞれに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。94時間後、菌体を遠心分離によって回収し、２本分の菌体全てを、グルコース 0.5％、ＦＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０５６８】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５６９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６５に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図３４〜図３７に示す。
【０５７０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸及び５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)ユニット及び３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５７１】
【表６５】
[実施例５８]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＮ/ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５７３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのアセトンに懸濁し、室温(23℃)で 72時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５７４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５７５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６６に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図３８〜図４３に示す。
【０５７６】
この結果から、ＹＮ2株により、１１-フェノキシウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５７７】
【表６６】
[実施例５９]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＮ/ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＵＤＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５７９】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５８０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５８１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６７に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図４４〜図５２に示す。
【０５８２】
この結果から、ＹＮ2株により、１１-フェノキシウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５８３】
【表６７】
[実施例６０]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＮ/ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、１１-フェノキシウンデカン酸(ＰxＵＤＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＵＤＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５８５】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５８６】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５８７】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６８に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図５３〜図６１に示す。
【０５８８】
この結果から、Ｈ45株により、１１-フェノキシウンデカン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５８９】
【表６８】
[実施例６１]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５９１】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５９２】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５９３】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表６９に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図６２〜図６５に示す。
【０５９４】
この結果から、ＹＮ2株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０５９５】
【表６９】
[実施例６２]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０５９７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０５９８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０５９９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７０に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図６６〜図６９に示す。
【０６００】
この結果から、Ｈ45株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６０１】
【表７０】
[実施例６３]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＯＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６０３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６０４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６０５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７１に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図７０〜図７５に示す。
【０６０６】
この結果から、ＹＮ2株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６０７】
【表７１】
[実施例６４]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＯ/ＰxＨx/ＰxＢ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、８-フェノキシオクタン酸(ＰxＯＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＯＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６０９】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６１０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６１１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７２に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステル、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図７６〜図８４に示す。
【０６１２】
この結果から、Ｈ45株により、８-フェノキシオクタン酸を基質として３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)の３つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６１３】
【表７２】
[実施例６５]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６１５】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６１６】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６１７】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７３に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図８５〜図８９に示す。
【０６１８】
この結果から、ＹＮ2株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６１９】
【表７３】
[実施例６６]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (ポリペプトン一段階培養)＞
ポリペプトン(和光純薬工業製) 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６２１】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６２２】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６２３】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７４に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図９０〜図９２に示す。
【０６２４】
この結果から、Ｈ45株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６２５】
【表７４】
[実施例６７]
＜ＹＮ2株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＨpＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６２７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６２８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６２９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７５に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図９３〜図１００に示す。
【０６３０】
この結果から、ＹＮ2株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６３１】
【表７５】
[実施例６８]
＜Ｈ45株によるＰＨ(ＰxＨp/ＰxＶ)ユニットを含むポリマーの生産 (グルコース二段階培養)＞
グルコース 0.5％、７-フェノキシヘプタン酸(ＰxＨpＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。64時間後、菌体を遠心分離によって回収し、グルコース 0.5％、ＰxＨpＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６３３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６３４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６３５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７６に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステル及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１０１〜図１０７に示す。
【０６３６】
この結果から、Ｈ45株により、７-フェノキシヘプタン酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)の２つのユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６３７】
【表７６】
[実施例６９]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰxＶユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸ナトリウム二段階培養)＞
リンゴ酸ナトリウム 0.5％、５-フェノキシ吉草酸(ＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。60時間後、菌体を遠心分離によって回収し、リンゴ酸ナトリウム 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６３９】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６４０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６４１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７７に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１０８〜図１１４に示す。
【０６４２】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェノキシ吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６４３】
【表７７】
[実施例７０]
＜Ｈ45株によるＰＨＰxＶユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸ナトリウム二段階培養)＞
リンゴ酸ナトリウム 0.5％、５-フェノキシ吉草酸(ＰxＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＨ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。60時間後、菌体を遠心分離によって回収し、リンゴ酸ナトリウム 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６４５】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６４６】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６４７】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７８に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１１５〜図１２０に示す。
【０６４８】
この結果から、Ｈ45株により、５-フェノキシ吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６４９】
【表７８】
[実施例７１]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰＶユニットを含むポリマーの生産 (フルクトース二段階培養)＞
フルクトース 0.5％、５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分離によって回収し、フルクトース 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。50時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６５１】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６５２】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６５３】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表７９に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１２１〜図１２３に示す。
【０６５４】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェニル吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６５５】
【表７９】
[実施例７２]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰＶユニットを含むポリマーの生産 (マンノース二段階培養)＞
マンノース 0.5％、５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、マンノース 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。91時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６５７】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６５８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６５９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表８０に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１２４及び図１２５に示す。
【０６６０】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェニル吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６６１】
【表８０】
[実施例７３]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰＶユニットを含むポリマーの生産 (乳酸ナトリウム二段階培養)＞
乳酸ナトリウム 0.5％、５-フェニル吉草酸(ＰＶＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLにＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、乳酸ナトリウム 0.5％、ＰxＶＡ 0.1％を含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。28時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０６６３】
この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 24時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０６６４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬgel・ＭIＸＥＤ-Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量)により測定した。
【０６６５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍgを 25ｍL容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍL及び硫酸を３％(v/v)含むメタノール２ｍLを加えて 100℃で 3.5時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、カラム:ＤＢ-ＷＡＸＥＴＲ(Ｊ&Ｗ社製)、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表８１に示す。また、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステル、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステル及び３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルをそれぞれ図１２６〜図１２９に示す。
【０６６６】
この結果から、ＹＮ2株により、５-フェニル吉草酸を基質として３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０６６７】
【表８１】
[実施例７４]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰxＢユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸二ナトリウム二段階培養)＞
リンゴ酸二ナトリウム・0.5水和物、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム・１水和物、Ｄ(+)-グルコース、n-ノナン酸、または、ポリペプトン(日本製薬) 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸(ＰxＢＡ) 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０６６９】
この乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、約60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表８２に示す通り、リンゴ酸二ナトリウムを増殖用炭素源として培養した場合に、４-フェノキシ-n-酪酸に由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸(３ＨＰxＢ)ユニットの比率が高いＰＨＡを、高収率で得られた。更に、表８３に、リンゴ酸二ナトリウムで培養した場合の菌体及びポリマーの収量、ポリマーの組成を示す。
【０６７０】
【表８２】
【表８３】
[実施例７５]
＜ＹＮ2株によるＰＨＰxＢユニットを含むポリマーの生産 (リンゴ酸二ナトリウム二段階培養:大量培養)＞
酵母エキス(オリエンタル酵母工業) 0.5％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で８時間、振盪培養して種菌とした。容量 10Lのジャーファーメンターに、リンゴ酸二ナトリウム・0.5水和物 0.5％と４-フェノキシ-n-酪酸 0.1％とを含むＭ９培地５Lを調製し、集菌を 50ｍL接種し、30℃、80回転/分、通気量 2.5L/分で通気攪拌培養した。39時間後、菌体を遠心分離によって回収した。
このペレットを約1.7％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液 120ｍLに懸濁し、約４℃で２時間振盪してＰＨＡを抽出した。遠心分離によりＰＨＡを回収し乾燥した結果、培地液量１L当たり 56ｍgのＰＨＡが得られた。
【０６７３】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、４-フェノキシ-n-酪酸に由来する所望のモノマーユニットである３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸ユニットの組成比(ＧＣ-ＭＳ,ピークエリア比)は 99.７％であった。
【０６７４】
【発明の効果】
本発明、並びに本願明細書中に記載の関連発明により、新規なポリヒドロキシアルカノエートと、その原料となる新規な置換アルカン酸、当該新規ポリヒドロキシアルカノエートを生産し菌体内に蓄積する能力を有する新規微生物、及び、このような微生物を用いた当該ポリヒドロキシアルカノエートの生産方法が提供される。これにより、機能性ポリマーとしても有用な、各種官能基を導入したポリヒドロキシアルカノエートが極めて効率的に、且つ高い純度で製造することができ、デバイス材料や医用材料等の各分野への応用が期待できる。
【０６７５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で合成した３ＨＦＰＶの核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図２】実施例６で得られたＰＨＡの1Ｈ核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図３】実施例６で得られたＰＨＡの13Ｃ核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図４】実施例７で得られた５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸に関する核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図５】実施例８で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＧＣ-ＭＳのトータルイオンクロマトグラフィー(ＴIＣ)を示す図である。
【図６】 (a)及び(b)は、実施例８で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣにおけるピークのマススペクトルを示す図である。
【図７】 (a)及び(b)は、実施例８で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣにおけるピークのマススペクトルを示す図である。
【図８】実施例９で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣを示す図である。
【図９】実施例１０で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣを示す図である。
【図１０】実施例１１で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についてのＴIＣを示す図である。
【図１１】 (a)は５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸のＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)を、(b)はそのマススペクトルを示す図である。
【図１２】実施例１４で得られたＰＨＡコポリマーのメチル化物の分析結果を示す図であり、(a)はＰＨＡコポリマーのメチル化物のＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)であり、(b)はＴIＣにおける目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルである。
【図１３】実施例１５で得られたＰＨＡコポリマーのメチル化物の分析結果を示す図であり、(a)はＰＨＡコポリマーのメチル化物のＴIＣ(トータルイオンクロマトグラフィー)であり、(b)はＴIＣにおける目的ユニットである３-ヒドロキシ-５-(４-トリフルオロメチルフェニル)吉草酸を含むピーク(36.5分付近)のマススペクトルである。
【図１４】実施例３０で得られたＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスぺクトルを示す図である。
【図１５】実施例３４で得られたＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスぺクトルを示す図である。
【図１６】４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１７】４-(４-フルオロフェノキシ)酪酸の13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１８】実施例４１において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡにつき、メタノリシス後に測定したＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す図である。
【図１９】実施例４１において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２０】４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２１】４-(３-フルオロフェノキシ)酪酸の13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】実施例４７において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡにつき、メタノリシス後に測定したＧＣ-ＭＳスペクトルデータを示す図である。
【図２３】実施例４７において、ＹＮ2株の培養菌体から回収したＰＨＡの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２４】実施例５３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２５】実施例５３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２６】実施例５４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２７】実施例５４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２８】実施例５５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図２９】実施例５５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３０】実施例５５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３１】実施例５６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３２】実施例５６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３３】実施例５６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３４】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３５】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３６】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェニル)吉草酸(３ＨＦＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３７】実施例５７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸(３ＨＦＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３８】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図３９】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４０】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４１】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４２】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４３】実施例５８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４４】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４５】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４６】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４７】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４８】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図４９】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５０】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５１】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５２】実施例５９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５３】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５４】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５５】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５６】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５７】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５８】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図５９】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６０】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６１】実施例６０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸(３ＨＰxＮ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６２】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６３】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６４】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６５】実施例６１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６６】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６７】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６８】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図６９】実施例６２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７０】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７１】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７２】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７３】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７４】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸(３ＨＰxＨx)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７５】実施例６３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７６】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７７】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７８】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図７９】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８０】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８１】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８２】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８３】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸(３ＨＰxＢ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８４】実施例６４において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸(３ＨＰxＯ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８５】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８６】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８７】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８８】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図８９】実施例６５において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９０】実施例６６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９１】実施例６６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９２】実施例６６において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９３】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９４】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９５】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９６】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９７】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルメチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９８】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図９９】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１００】実施例６７において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)エステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０１】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０２】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０３】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０４】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０５】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０６】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０７】実施例６８において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸(３ＨＰxＨp)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０８】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１０９】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１０】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１１】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１２】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１３】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１４】実施例６９において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１５】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシヘキサン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１６】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１７】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１８】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１１９】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシドデセン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２０】実施例７０において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェノキ吉草酸(３ＨＰxＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２１】実施例７１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２２】実施例７１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２３】実施例７１において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２４】実施例７２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２５】実施例７２において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２６】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２７】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシオクタン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２８】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシデカン酸メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
【図１２９】実施例７３において、ＧＣ-ＭＳ測定より得られた、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(３ＨＰＶ)メチルエステルのマススペクトルを示す図である。
Claims (1)
- 下記式 (14)
ＡmＢ(1-m) (49)
(ただし、Ａは下記式(２)で表され、Ｂは下記式(３)あるいは(４)で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１以上であり、ｍは0.01以上、１未満である)
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