优选具体实施例的详细说明
为了解决上述难题,本发明者等人全力以赴地完成了对能够生产PHA并在细胞中积累它的改进的微生物的研究和用改进的微生物生产希望的PHA的方法的研究,主要的目标是发展在侧链上含有取代或未取代的苯氧基,苯基和环己基的PHA,它可作为设备材料和医疗材料,这些本发明都已经完成。
本发明的聚羟基链烷酸酯,其特征在于具有式(1)所表示的组成的单体单元。
AmB(1-m) (1)
(此处,A代表通式(2),B是从通式(3)或通式(4)所代表的单体单元构成的组中选择的至少一个基团,m的值是0.01或大于或小于1)。
(式中,n的值为0到10,k的值是3或5,R是选自由通式(5)到(7)所表示的基团组成的组中的至少一个或多个基团。)
(在式(5)中,R1是选自由氢原子(H),卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5和-C3F7组成的组中的一个基团;q是选自1到8的整数;
在式(6)中,R2是选自由氢原子(H),卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5和-C3F7组成的组中的一个基团;r是选自1到8的整数;
在式(7)中,R3是选自由氢原子(H),卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5和-C3F7组成的组中的一个基团;s是选自1到8的整数;
其中,当选定一种基团时,
作为通式(2)中的R,
式(5)的基团中R1=H和q=2,R1=H和q=3,以及R1=-NO2和q=2;
式(6)的基团中R2=卤素原子和r=2,[然而,作为上述B,只从通式(3)或(4)提供的二个组中选择],R2是-CN和r=3,以及R2是-NO2和r=3;和
在式(7)中的基团R3=H和s=1,以及R3=H和s=2
被从选择对象中排除,和
当选择二种基团时,
在式(6)中R2=卤素原子和r=2和4的二种基团的组合[然而,作为上述的B,只有从式(3)或(4)中选择一种]
被从选择对象中排除)。
在这里,本发明的聚羟基链烷酸酯可以包括由式(2)所代表的二种以上的单体单元,但是,考虑到聚合物的功能和性质,优选地设计是包括适当数量的单体单元。通常,作为希望的单体单元的原料,使用多达五种的链烷酸酯,通过β-氧化部分链烷酸酯新产生了链长依次减少二个亚甲基单元,新生成的“继代”培养基,正如先前所述,它们被捕获作为PHA的单体单元。这样,由式(2)所代表的大约十种或少一些的单体单元被包括在PHA中,而这足以实现本发明所预期的目的。因此,如果要求精确控制功能和性质,具有更多种单体单元的构型也是可能的。
另外,关于R1,R2,R3的取代位置,对于任意的邻、间或对位,和对于R3在环己基上的第一位置来看,可以构成含有相应的单体单元的聚羟基链烷酸酯,但是如果对于任何异构体在功能和性质上没有显著的差别的话,对产率或在聚合物上容易被俘获来说,有利的构成是取代成分在间位或对位上。
另外,本发明的聚羟基链烷酸酯的生产方法是用微生物生产含有如式(1)所代表的单体单元成分的聚羟基链烷酸酯,其特征在于微生物和链烷酸酯一起培养,而且聚羟基链烷酸酯从有机物细胞中被提取,以得到含有如式(1)所代表的单体单元成分的聚羟基链烷酸酯。
AmB(1-m) (1)
(此处,A代表通式(2),B是从通式(3)或通式(4)所代表的单体单元构成的组中选择的至少一个基团,m的值是0.01或大于或小于1)。
(式中,n的值为0到10,k的值是3或5,R是由通式(5)到(7)所代表的组中的至少一个或多个基团)。
(在式(5)中,R1是选自由氢原子(H),卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5和-C3F7组成的组中的一个基团;q是选自1到8的整数;
在式(6)中,R2是选自由氢原子(H),卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5和-C3F7组成的组中的一个基团;r是选自1到8的整数;
在式(7)中,R3是选自由氢原子(H),卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5和-C3F7组成的组中的一个基团;s是选自1到8的整数;
其中,当选定一种基团时,
作为通式(2)中的R,
式(5)基团中R1=H和q=2,R1=H和q=3,以及R1=-NO2和q=2;
式(6)的基团中R2=卤素原子和r=2,R2是-CN和r=3,以及R2是-NO2和r=3;和
在式(7)中的基团R3=H和s=1,以及R3=H和s=2;
被从选择对象中排除,和
当选择二种基团时,
在式(6)中R2=卤素原子和r=2二种基团的组合
被从选择对象中排除)。
在这里,本发明的聚羟基链烷酸酯可以包括由式(2)所代表的二种以上的单体单元,但是,考虑到所须聚合物的功能和性质,优选的合成应使单体单元的数量适当。通常,当使用至多达五种的链烷酸酯作为希望的培养基的原料时,通过β-氧化部分链烷酸酯新产生了链长依次减少二个亚甲基单元的“继代”培养基,正如先前所述,它们被捕获作为PHA的单体单元。这样,在PHA中包括至多达到十种式(2)所表示的单体单元,而这足以实现本发明所预期的目的。因此,如果要求精确地控制功能和性质,可足以完成培养包括更多种的单体单元。
还有,关于R1,R2,R3的取代位置,对于在任意的邻、间或对位,并且,对于在环己基上的R3的第一的位置而言,可以构成含有相应的单体单元的聚羟基链烷酸酯,但是,如果任何异构体在功能和性质上都没有显著的差别的话,对产率或在聚合物上容易被俘获来说,有利的构成是取代基在间位或对位上。
另外,本发明致力于研究得到希望的PHA的方法,使具有少量或没有与其共存的不希望有的单体,结果,发现当微生物在培养培养基中被培养时,培养培养基中含有作为唯一碳源的链烷酸酯是PHA和糖类的原材料,可以生产出仅有少量或没有与其共存的不希望的单体单元的PHA,这导致本发明的完成。
也就是说,本发明生产聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法是,用微生物生产含有式(23)所表示的单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法,其特征在于,采用一种方法,将能用通式(22)所表示的链烷酸酯合成聚羟基链烷酸酯的微生物在培养培养基中培养,所述的聚羟基链烷酸酯含有式(23)所表示的单体单元,而培养培养基中含有唯一碳源是式(22)所示的链烷酸酯和多糖。
(在上式中,R至少是一个或更多由式(24)所表示的基团,R′是一个或更多选自在式(22)中选出的基团,在选出基团中的t-2基团,在选出基团中的t-4基团,在选出基团中的t-6基团。这里t-2,t-4,t-6可以是1或更大的整数。)
(在上式中,R4代表一个饱和或不饱和的苯基,一个饱和或不饱和的苯氧基,和一个饱和或不饱和的环己基,而t表示一个1到8范围内的独立整数。)
在这里,当进行培养时,可以用多于一种的式(22)所代表的链烷酸酯,但是,考虑到所需聚合物的功能和性质优选使用适当的数量。通常,当将多达五种的由式(22)所表示的链烷酸酯的单体单元作为原材料时,如上所述,通过β-氧化部分链烷酸新产生了链长依次减少二个亚甲基单元的“继代”培养基,它被捕获作为PHA的单体单元。这样,在PHA中就会包括,例如,多达十种由式(2)所表示的链烷酸酯单体单元,而且,这个所希望的上述目的足以实现。因此,如果要求精确地控制功能和性质,可以使用多种链烷酸酯。
在上述R4基团上的取代基包括卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5,-C3F7等。关于R4的取代位置,对于任意的邻位。间位和对位,和对于在环己基的情况下的第一位置,可以得到含有相应的单体单元构成的聚羟基链烷酸酯,但是,如果任何异构体在功能和性质上没有显著的差别的话,对产率或在聚合物上容易被俘获来说,取代基应在间位或对位上。
另外,对于糖类,例如葡萄糖,果糖,甘露糖等均可以使用。
而且,本发明人致力于研究生产希望的PHA的方法,使其仅有少量或没有不希望的单体单元与其共存,结果,发现当微生物在培养培养基中被培养时,培养培养基中只含有作为唯一碳源的链烷酸酯是PHA和聚胨的原材料,可以生产出仅有少量或没有不希望的单体与其共存的的PHA,这导致本发明的完成。
也就是说,本发明生产聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法是,用微生物生产含有式(23)所表示的单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法,其特点在于,采用一种方法,能用通式(22)所表示的链烷酸酯合成聚羟基链烷酸酯的微生物在培养培养基中培养,所述的聚羟基链烷酸酯含有式(23)所表示的单体单元,所述的培养培养基中含有唯一碳源为式(22)所示的链烷酸酯和多糖。
(在上式中,R至少是一个或多个由式(24)所表示的基团,R′是一个或多个选自式(22)中的基团,选出基团中的t-2基团,选出基团中的t-4基团,选出基团中的t-6基团。这里t-2,t-4,t-6可以是1或更大的整数。)
(在上式中,R4代表一个饱和或不饱和的苯基,一个饱和或不饱和的苯氧基,和一个饱和或不饱和的环己基,而t表示一个1到8范围内的整数。)
在这里,当进行培养时,可以用多于一种的式(22)所代表的链烷酸酯,但是,考虑到所须聚合物的功能和性质,优选使用适当的数量。通常,当将至多五种的由式(22)所表示的链烷酸酯用作希望的单体单元的原材料时,如上所述,通过β-氧化部分链烷酸新产生了链长减少二个亚甲基单元的“继代”培养基,它们被捕获作为PHA的单体单元。这样,在PHA中包括,例如,多到十种由式(2)所表示的链烷酸酯单体单元,而且,这个所希望的上述目的足以实现。因此,如果要求精确控制功能和性质,可以使用多种链烷酸酯。
在上述R4基团上的取代基包括卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5,-C3F7等。关于R4的取代位置,在任意的邻位。间位和对位,和,在环己基的情况下的第一位置,可以得到含有相应的单体单元构成的聚羟基链烷酸酯,但是,如果任何异构体在功能和性质上没有显著的差别的话,对产率或在聚合物上容易被俘获来说,取代基应在间位或对位上。
而且,本发明人致力于研究生产希望的PHA的方法,使仅有少量或没有与其共存的不希望的单体单元,结果,发现当微生物在培养培养基中被培养时,培养培养基中含有作为唯一碳源的链烷酸酯是PHA和TCA循环有关的有机酸的原材料,可以生产出仅有少量或没有与其共存的不希望的单体的PHA,这导致本发明的完成。
也就是说,本发明生产聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法是,用微生物生产含有式(23)所表示的单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法,其特征在于,
采用一种方法,将能用式(23)所表示的链烷酸酯合成聚羟基链烷酸酯的微生物,在培养培养基中培养,培养培养基包括链烷酸和只与TCA循环连用的有机酸作为碳源,而不是以下式(22)所表示的链烷酸酯,所述的聚羟基链烷酸酯含有式(23)所示的单体单元。
(在上式中,R至少是一个或多个由式(24)所表示的基团,R′是一个或多个选自式(22)中的基团,选出基团中的t-2基团,选出基团中的t-4基团,选出基团中的t-6基团。这里t-2,t-4,t-6可以是1或更大的整数。)
(在上式中,R4代表一个饱和或不饱和的苯基,一个饱和或不饱和的苯氧基,和一个饱和或不饱和的环己基,而t表示一个1到8范围内的整数。)
在这里,当进行培养时,可以用多于一种的式(22)所代表的链烷酸酯,但是,考虑到所须聚合物的功能和性质,优选使用适当的数量。通常,当将多达五种由式(22)所表示的链烷酸酯用作希望的单体单元的原材料时,如上所述,通过β-氧化部分链烷酸新产生了链长减少二个亚甲基单元的“继代”培养基,它被捕获作为PHA的单体单元。这样,在PHA中就会包括,例如,多到十种由式(2)所表示的链烷酸酯单体单元,而且,这个所希望的上述目的足以实现。因此,如果要求精确控制功能和性质,可以使用多种链烷酸酯。
在上述R4基团上的取代基包括卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5,-C3F7等。关于R4的取代位置,在任意的邻位。间位和对位,和在环己基的情况下的第一位置,可以得到的含有相应的单体单元构成的聚羟基链烷酸酯,但是,如果任何异构体在功能和性质上都没有显著的差别的话,对产率或在聚合物上容易被俘获来说,取代基应在间位或对位上。
还有,对于TCA循环连用有机酸,本身就存在于TCA循环中的有机酸,例如柠檬酸,琥珀酸,富马酸,苹果酸及其盐类,存在于TCA循环的主流中的有机酸,例如乳酸,丙酮酸及其盐类均适宜使用。
而且,本发明人致力于研究生产希望的PHA的方法,使仅有少量或没有与其共存的不希望的单体单元,结果,发现当微生物在培养培养基中被培养时,至少有二个步骤:第一步在含有作为唯一碳源的链烷酸酯是PHA和聚胨的原料的培养培养基中培养,然后在含有链烷酸酯和丙酮酸或其盐类作为底部碳源的培养培养基中并在限氮条件下培养,可以生产出仅有少量或没有与其共存的不希望的单体的PHA。
也就是说,本发明生产聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法是,用微生物生产含有式(23)所表示的单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法,其特点在于,
采用一种方法,将能用式(22)所表示的链烷酸酯合成聚羟基链烷酸酯的微生物,至少用二个步骤培养,第一步在含有作为唯一碳源的是以下面的通式(22)所表示的链烷酸酯和聚胨的培养培养基中培养,然后在含有作为唯一碳源的是用通式(22)所表示的链烷酸酯和丙酮酸及其盐类的培养培养基中并且在限氮的条件下培养。
(在上式中,R至少是一个或多个由式(24)所表示的基团,R′是一个或更多选自式(22)中的基团,选出基团中的t-2基团,选出基团中的t-4基团,选出基团中的t-6基团。这里t-2,t-4,t-6可以是1或更大的整数。)
(在上式中,R4代表一个饱和或不饱和的苯基,一个饱和或不饱和的苯氧基,和一个饱和或不饱和的环己基,而t表示一个1到8范围内的整数。)
在这里,当进行培养时,可以用多于一种的式(22)所代表的链烷酸酯,但是,考虑到所须聚合物的功能和性质,优选使用适当的数量。通常,当将多达五种由式(22)所表示的链烷酸用作希望的单体单元的原材料时,如上所述,通过β-氧化部分链烷酸新产生了链长减少二个亚甲基单元的“继代”培养基,它被捕获作为PHA的单体单元。这样,在PHA中包括,例如,多到十种由式(2)所表示的链烷酸酯单体单元,而且,这个所希望的上述目的足以实现。因此,如果要求精确控制功能和性质,可以使用多种链烷酸酯。
在上述R4基团上的取代基包括卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5,-C3F7等。关于R4的取代位置,(可以是)在任意的邻位、间位和对位,在对于环己基的情况下的第一位置,可以得到的含有相应的单体单元构成的聚羟基链烷酸酯,但是,如果任何异构体在功能和性质上都没有显著的差别的话,对产率或在聚合物上容易被俘获来说,取代基应在间位或对位上。
另外,本发明涉及的新菌株,其特征在于,具有合成含有式(22)所代表的链烷酸酯单体单元的聚羟基链烷酸酯的合成体系。
(在上式中,R至少是一个或多个由式(24)所表示的基团,R′是一个或多个选自式(22)中的基团,选出基团中的t-2基团,选出基团中的t-4基团,选出基团中的t-6基团。这里t-2,t-4,t-6可以是1或更大的整数。)
(在上式中,R4代表一个饱和或不饱和的苯基,一个饱和或不饱和的苯氧基,和一个饱和或不饱和的环己基,而t表示一个1到8范围内的独立整数。)
在上述R4基团上的取代基包括卤素原子,-CN,-NO2,-CF3,-C2F5,-C3F7等。
在下文中,将说明本发明的新型聚羟基链烷酸酯。
本发明的一种新型聚羟基链烷酸酯是式(8)中的任一种:
它含有3-羟基-5-(4-氟代苯基)戊酸单体单元。
此外,还有如式(9)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-5-(4-三氟代甲苯基)戊酸单体单元。
另外,若用微生物生产本发明的新PHA时,培养基材料是5-(4-三氟代甲苯基)戊酸,如下化学式(21)
该培养基材料本身是一个新化合物。
再者,还有式(10)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-4-(4-硝基苯氧基)丁酸单体单元。
再者,还有式(11)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元。
再者,还有式(12)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-4-(4-氟代苯氧基)丁酸单体单元。
再者,还有式(13)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-4-(3-氟代苯氧基)丁酸单体单元。
再者,还有式(14)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-4-苯氧基丁酸单体单元。此处,除了式(14)的3-羟基-4-苯氧基丁酸单体单元外,至少还含有式(3)或式(4)所示的一种或多种的单体单元。
(其中,n为0-10)(k为3或5)
再者,还有式(15)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-5-苯氧基丁酸单体单元。此处,除了式(15)的3-羟基-5-苯氧基戊酸作为单体单元外,至少还含有式(3)或式(4)所示的一种或多种的单体单元。
(其中,n为0-10)(k为3或5)
再者,还有式(16)的聚羟基链烷酸酯。
它含有3-羟基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸单体单元。此处,除了式(16)的3-羟基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸单体单元外,聚羟基链烷酸酯至少还含有式(3)或式(4)所示的一种或多种的单体单元。并且三组分体系单体单元除外。
(其中,n为0-10)(k为3或5)
再者,还有式(8)和(16)的聚羟基链烷酸酯。
它们含有3-羟基-5-(4-氟代苯基)戊酸和3-羟基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸单体单元。
再者,还有式(15)和(17)的聚羟基链烷酸酯。
它们含有3-羟基-5-苯氧基戊酸和3-羟基-7-苯氧基庚酸单体单元。此处除了式(15)和(17)所表示的3-羟基-5-苯氧基戊酸和3-羟基-7-苯氧基庚酸作为单体单元以外,至少还含有式(3)或式(4)所示的一种或多种的单体单元。
(其中,n为0-10)(k为3或5)
再者,还有式(14),(18)和(19)的聚羟基链烷酸酯。
它们含有3-羟基-4-苯氧基丁酸,3-羟基-6-苯氧基己酸和3-羟基-8-苯氧基辛酸单体单元。此处除了式(14),(18)和(19)所表示的3-羟基-4-苯氧基丁酸,3-羟基-6-苯氧基己酸和3-羟基-8-苯氧基辛酸单体单元以外,至少还含有式(3)或式(4)所示的一种或多种的单体单元。
(其中,n为0-10)(k为3或5)
再者,还有式(15),(17)和(20)的聚羟基链烷酸酯。
它们含有3-羟基-5-苯氧基戊酸,3-羟基-7-苯氧基庚酸和3-羟基-9-苯氧基壬酸单体单元。此处除了式(15),(17)和(20)所表示的3-羟基-5-苯氧基戊酸,3-羟基-7-苯氧基庚酸和3-羟基-9-苯氧基壬酸单体单元以外,至少还含有式(3)或式(4)所示的一种或多种的单体单元。
(其中,n为0-10)(k为3或5)
在下文中,将说明聚羟基链烷酸酯的制备方法。
本发明人成功地获得了微生物,用这种微生物可在含有式(25)所示的5-(4-氟代苯基)戊酸(FPVA)的培养培养基中培养,生产含有式(8)所示的3-羟基-5-(4-氟代苯基)戊酸(3HFPV)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明的聚羟基链烷酸酯的生产方法,其特征在于,有一个培养微生物的步骤,用该微生物可以在含有式(25)所示的FPVA培养培养基中使用YFPVA生产含式(8)所示的3HFPV单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种生产方法的特征在于,在含有式(25)所示的FPVA和糖类的培养培养基中培养微生物。
再者,另一种生产方法的特征在于,在含有式(25)所示的FPVA和聚胨的培养培养基中培养微生物。
再者,另一种生产方法的特征在于,在含有式(25)所示的FPVA和TCA循环连用的有机酸的培养培养基中培养微生物。
另外,另一个生产方法的特征在于,微生物的培养至少用二个步骤完成,第一步在含有以式(25)所表示的FPVA和聚胨的培养培养基中培养,然后在含有式(22)所表示的FPVA和丙酮酸及其盐类的培养培养基中并且在限氮的条件下培养。
本发明人已成功地获得了能够生产含有式(9)的3-羟基-5-(4-三氟代甲苯基)戊酸(3HCF3PV)单体单元的聚羟基链烷酸酯的微生物,微生物是在含有式(21)的5-(4三氟代甲苯基)戊酸(CF3PVA)的培养培养基中培养的。
本发明聚羟基链烷酸酯的生产方法包括,在含有CF3PVA的培养培养基中,用式(21)所示的CF3PVA培养能生产的含式(9)3HCF3PV单体单元的聚羟基链烷酸酯的微生物。
另外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(21)的CF3PVA和糖的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(21)的CF3PVA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(21)的CF3PVA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微主物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段培养方法培养微生物:首先在含有结构式(21)的CF3PVA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(21)的CF3PVA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(26)的4-(4-硝基苯氧基)丁酸(NO2PxBA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(10)的3-羟基-4-(4-硝基苯氧基)丁酸(3HNO2PxB)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于在含有结构式(26)的NO2PxBA的培养基中培养微生物,其中该微生物使用NO2PxBA可以制备含有结构式(10)表示的3HNO2PxB单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(26)的NO2PxBA和糖的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(26)的NO2PxBA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(26)的NO2PxBA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段培养方法培养该微生物:首先在含有结构式(26)的NO2PxBA和聚胨的培养基中培养,然后在含有NO2PxBA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(27)的4-(4-氰基苯氧基)丁酸(CNPxBA)的培养基培养该微生物可以制备含有结构式(11)的3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸(3HCNPxB)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有CNPxBA的培养基中培养微生物,其中该微生物可以由结构式(27)的CNPxBA制备含有结构式(11)表示的3HCNPxB单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(27)的CNPxBA和糖的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(27)的CNPxBA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于:在含有结构式(27)的CNPxBA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(27)的CNPxBA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(27)的CNPxBA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(28)的4-(4-氟苯氧基)丁酸(FPxBA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(12)的3-羟基-4-(4-氟苯氧基)丁酸(3HFPxB)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(28)的FPxBA的培养基中培养微生物,其中该微生物使用FPxBA可以制备含有结构式(12)表示的3HFPxB单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其待征在于在含有结构式(28)的FPxBA和糖的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(28)的FPxBA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(28)的FPxBA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(28)的FPxBA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(28)的FPxBA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(29)的4-(3-氟苯氧基)丁酸(mFPxBA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(13)的3-羟基-4-(3-氟苯氧基)丁酸(3HmFPxB)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(29)的mFPxBA的培养基中培养微生物,其中该微生物使用mFPxBA可以制备含有结构式(13)表示的3HmFPxB单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(29)的mFPxBA和糖的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(29)的mFPxBA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(29)的mFPxBA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(29)的mFPxBA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(29)的mFPxBA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(31)的5-苯戊酸(PVA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(30)的3-羟基-5-苯戊酸(3HPV)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(31)的PVA和糖的培养基中培养微生物,其中该微生物使用PVA可以制备含有结构式(30)的3HPV单体单元的聚羟基链烷酸酯。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(31)的PVA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(31)的PVA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(31)的PVA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(31)的PVA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(33)的6-苯基己酸(PHxA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(32)的3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(33)的PHxA和糖的培养基中培养微生物,其中该微生物使用PHxA可以制备含有结构式(32)的3HPHx单体单元的聚羟基链烷酸酯。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(33)的PHxA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(33)的PHxA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(33)的PHZA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(33)的PHxA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(34)的4-苯氧基丁酸(PxBA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(14)的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(34)的PxBA的培养基中培养微生物,其中该微生物使用FPxBA可以制备含有结构式(14)表示的3HPxB单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(34)的PxBA和糖的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(34)的PxBA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(34)的PxBA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(34)的PxBA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(34)的PxBA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(35)的5-苯氧基戊酸(PxVA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(15)的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(35)的PxVA的培养基中培养微生物,其中该微生物使用FxVA可以制备含有结构式(15)表示的3HPxV单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(35)的PxVA和糖的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(35)的PxVA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(35)的PxVA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(35)的PxVA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(35)的PxVA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(36)的5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(16)的3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(36)的FPxVA和糖的培养基中培养微生物,其中该微生物使用FPxVA可以制备含有结构式(16)的3HFPxV单体单元的聚羟基链烷酸酯。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(36)的FPxVA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(36)的FPxVA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段培养方法培养该微生物:首先在含有结构式(36)的FPxVA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(36)的FPxVA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在含有结构式(38)的4-环己基丁酸(CHBA)的培养基中培养该微生物可以制备含有结构式(37)的3-羟基-4-环己基丁酸(3HCHB)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(38)的CHBA和糖的培养基中培养微生物,其中该微生物使用CHBA可以制备含有结构式(37)的3HCHB单体单元的聚羟基链烷酸酯。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(38)的CHRA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于在含有结构式(38)的CHBA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段培养方法培养该微生物:首先在含有结构式(38)的CHBA和聚胨的培养基中培养,接着在含有结构式(38)的CHBA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,其中在分别含有结构式(25)和(36)表示的5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)和5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的培养基中培养该微生物可以制备分别含有结构式(8)和(16)表示的3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)和3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)的单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在分别含有结构式(25)和(36)表示的FPVA和FPxVA以及糖的培养基中培养微生物,其可以制备分别含有结构式(8)和(16)表示的3HFPV和3HFPxV的单体单元的聚羟基链烷酸酯。
此外,另一种制造方法是其特征在于:在分别含有结构式(25)和(36)的FPVA和FPxVA以及聚胨的培养基中培养该微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于:在分别含有结构式(25)和(36)的FPVA和FPxVA,以及与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养该微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在分别含有结构式(25)和(36)表示的FPVA和FPxVA以及聚胨的培养基中培养,然后在分别含有结构式(25)和(36)表示的FPVA和FPxVA以及丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人还成功地获得微生物,当其在含有结构式(39)的7-苯氧基庚酸(PxHpA)的培养基中培养时,可以制备含有分别由结构式(15)和(17)表示的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:微生物在含有结构式(39)的PxHpA和糖的培养基中培养时,使用PxHpA可以制备分别含有结构式(15)和(17)的3HPxV和3HPxHp的单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于:在含有结构式(39)的PxHpA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于:在含有结构式(39)的PxHpA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(39)的PxHpA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(39)的PxHpA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人还成功地获得微生物,当其在含有结构式(40)的8-苯氧基辛酸(PxOA)的培养基中培养时,可以制备分别含有结构式(14)、(18)和(19)表示的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(40)的PxOA和糖的培养基中培养微生物,使用PxOA可以制备分别含有结构式(14)、(18)和(19)表示的3HPxB、3HPxHx和3HPxO的单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于:在含有结构式(40)的PxOA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于:在含有结构式(40)的PxOA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(40)的PxOA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(40)的PxOA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
本发明人成功地获得微生物,当其在含有结构式(41)的11-苯氧基十一酸(PxUDA)的培养基中培养时,可以制备分别含有结构式(15)、(17)和(20)表示的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)、3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)的单体单元的聚羟基链烷酸酯。
本发明聚羟基链烷酸酯的制造方法的特征在于:在含有结构式(41)的PxUDA和糖的培养基中培养微生物,使用PxUDA可以制备分别含有结构式(15)、(17)和(20)表示的3HPxv、3HPxHp和3HPxN的单体单元的聚羟基链烷酸酯。
另外,另一种制造方法是其特征在于:在含有结构式(41)的PxUDA和聚胨的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于:在含有结构式(41)的PxUDA和与三羧酸循环相关的有机酸的培养基中培养微生物。
此外,另一种制造方法是其特征在于通过至少二阶段的培养方法培养微生物:首先在含有结构式(41)的PxUDA和聚胨的培养基中培养,然后在含有结构式(41)的PxUDA和丙酮酸或其盐的培养基中在氮限制条件下培养。
此外,适合用于制备本发明如上所述的聚羟基链烷酸酯的四种新菌株包括菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2、FERM BP-7375、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)H45、FERM BP 7374,恶臭假单胞菌P91、FERMBP-7373,和jessenii假单胞菌P161、FERM BP-7376。
本发明的PHA是那些用作装置和医学材料等等的含有在侧链上带取代基的各种结构的单体单元的PHA,特别是那些在侧链上有上述取代的或未取代的苯氧基、苯基和环己基的PHA。另外,本发明的方法使用微生物能够制备高纯度和高产率的所需的PHA。而且,本发明可以提供能够有效合成高纯度PHA的菌株。通常,本发明的PHA具有R形式且是全同立构聚合物。
<包含在三羧酸循环中的糖和有机酸:不同于常规技术>
制备本发明PHA的一种方法是其特征在于:当培养微生物时,除了加入引入所需单体单元的链烷酸酯外,在培养基中只加入不是链烷酸酯的包含在三羧酸循环中的糖(糖类)或有机酸(有机酸类)作为碳源,所以用微生物制备的和在微生物中积聚的PHA具有极高含量所需的单体单元或者只具有所需的单体单元。除了链烷酸酯,仅仅将包含在三羧酸循环中的糖或有机酸作为碳源加入培养基,达到了易于选择这些特殊的单体单元的效果。
即,发明人发现当使用包含在三羧酸循环中的糖或有机酸作为共存的底物进行培养,并与链烷酸酯一起引入所需的单体单元时,与常规的方法(使用mcl-链烷酸酯例如壬酸酯或辛酸酯作为共存的底物)相比,可以制备特别高产率和纯度的所需PHA,而且还发现使用乙酰辅酶A作制备微生物的碳源和能源的培养法达到了这些效果,所述的微生物制备方法不是β氧化法而且已经达到了本发明的目的。
在本发明的方法中,利用糖化合物例如葡萄糖、果糖、甘露糖等等作为微生物生长的底物,且制备的PHA是与糖共在的用于引入所需的单体单元的链烷酸酯,所以不包含或包含少量的来源于糖例如葡萄糖等等单体单元。在这点上,本发明的方法实质上在结构和效果方面不同于常规的用微生物制备PHA的方法,常规方法中使用糖本身例如葡萄糖等等作为引入PHA的单体单元的原始底物。
<聚胨:不同于常规技术>
制备本发明PHA的一种方法是其特征在于:当培养微生物时,除了加入引入所需单体单元的链烷酸酯原料外,仅仅将作为碳源的聚胨(不同于链烷酸酯)加入培养基中,以便用微生物制备的和在微生物中积聚的PHA具有极高含量所需的单体单元或者只具有所需的单体单元。仅仅将作为碳源的聚胨(不同于链烷酸酯)加入培养基中可以达到易于选择这些特殊单体单元的效果。
在微生物制备PHA中利用聚胨的例子有:日本专利申请公开号5-49487、5-64591、5-214081、6-145311、6-284892、7-48438、8-89264、9-191893和11-32789公开了当用微生物制备PHA时,培养基中允许含有聚胨。然而,在预培养,即细胞生长的初期,所有这些利用了聚胨,并且在预培养过程中没有包含产生PHA单体单元的底物。而且,没有在使用细胞制备PHA的阶段利用聚胨的例子。相反,本发明是与引入所需的单体单元的链烷酸酯一起,并且用仅仅共存的聚胨作为碳源(不同于链烷酸酯)来制备和积聚PHA,以及生长细胞。因此,本发明使用聚胨的制备方法在结构和效果方面完全不同于常规使用聚胨的例子。而且,现有技术也没有提到选择能达到本发明效果的特殊的单体单元,且没有指出在用微生物制备的PHA组成中选择特殊的单体单元如本发明的取代基:苯氧基、苯基和环己基的作用。
以下将更详细说明本发明的PHA、制备方法和微生物。
<提供PHA单体单元的途径>
首先是详细说明“脂肪酸合成途径”,一种提供混入所需的PHA中的mcl-3HA单体单元的途径。
对于糖例如葡萄糖等等是底物的情况,细胞组分所需的链烷酸酯是由“脂肪酸合成途径”生物合成的,其中通过“糖酵解途径”由糖产生的乙酰辅酶A是起动物质。如下所述,脂肪酸合成包括全程合成途径和碳-链延伸途径。
1)全程合成途径
这些途径是用两种酶:乙酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.2)和脂肪酸合酶(E.C.2.3.1.85)催化的。乙酰辅酶A羧化酶是插入辅酶R中的酶,和最终催化作用下列反应由乙酰辅酶A制备丙二酰基辅酶A。这些反应如下:
脂肪酸合酶也是催化迁移-脱碳-还原-脱水-还原的反应循环的酶。整个反应表示如下:
根据酶的类型,反应产物可以是游离酸、辅酶A衍生物或酰基载体蛋白衍生物。
下面,分别用下列化学式(42)和(43)表示乙酰辅酶A和丙二酰基辅酶A。
另外,辅酶A代表辅酶A且由下列化学式(44)表示。
在这些反应途径内,如下所述路径产生“右旋3-羟酰基-酰基载体蛋白(ACP)”,其是用于PHA生物合成的单体底物的中间物。另外如下列化学反应式所示,这些途径最后扩展到重复加入两种碳原子的棕榈酸盐中。因此,用于PHA生物合成的单体底物是七个具有双数碳原子的“右旋3-羟酰基-酰基载体蛋白(ACP)”、从“右旋3-羟丁酰基-酰基载体蛋白(ACP)”到“右旋3-羟棕榈酰基-酰基载体蛋白(ACP)”。
2)碳-链延伸途径
这些途径广泛地分为两种途径:一种途径是将丙二酰基辅酶A加入到酰基酰基载体蛋白中,其最后变为具有延伸两个碳原子(和CO2)的碳链的酰基酰基载体蛋白(称为途径A),而另一个途径是将乙酰辅酶A加入到酰基辅酶A中,其最后变为具有延伸两个碳原子的碳链酰基辅酶A(称为途径B)。以下将说明每个途径。
途径A
途径B
在或者途径A或B中,人们认为生产出的“右旋3-羟酰基-辅酶A”或者“右旋3-羟酰基-ACP”作为中间物,而利用“右旋3-羟酰基-辅酶A”作为用于PHA合成的单体底物,同时利用“右旋3-羟酰基-ACP”作为用于PHA合成的单体底物,之后通过ACP-辅酶A转移酶转换成“右旋3-羟酰基-辅酶A”。
在糖例如葡萄糖等等用作底物的情况下,人们认为在微生物的细胞内经由如上所述“糖酵解途径”和“脂肪酸合成途径”产生mcl-3HA单体单元。在包含在三羧酸循环中的有机酸用作底物的情况下,直接通过丙酮酸酯脱氢酶由丙酮酸生产出乙酰辅酶A。三羧酸循环中的有机酸例如苹果酸通过苹果酸酯脱氢酶,接着由乙酰辅酶A通过上述反应产生丙酮酸。草酰乙酸通过磷酸烯醇丙酮酸羧激酶产生磷酸烯醇丙酮酸,其依次由丙酮酸激酶、接着由乙酰辅酶A催化通过上述反应制备丙酮酸。人们认为这些反应制备的乙酰辅酶A通过“脂肪酸合成途径”制备mcl-3HA单体单元。
在这些情况下,人们认为mcl-链烷酸酯例如辛酸酯、壬酸酯等等,或具有在末端加入的不同于直线脂肪族烷基的官能团的链烷酸酯例如5-苯基戊酸酯、5-(4-氟苯基)戊酸酯、6-苯基己酸酯、4-苯氧基丁酸酯、和4-环己基丁酸酯由辅酶A-连接酶(EC6.2.1.3等等),接着“右旋3-羟酰基-辅酶A”作用转变为它们的辅酶A衍生物,成为由许多引起β氧化作用的酶生物直接合成PHA的单体底物。
简言之,经由很多酶促反应阶段(即间接地)制备由包含在三羧酸循环中的糖或有机酸产生mcl-3HA单体单元,但是mcl-链烷酸酯可完全直接地产生mcl-3HA单体单元。
下面将描述引起微生物生长的乙酰辅酶A的产生。在该方法中,除了引入所需的单体单元的链烷酸酯外,同时存在mcl-链烷酸酯,这些链烷酸酯经过β-氧化作用途径制备乙酰辅酶A。通常,与具有庞大的取代基的链烷酸酯(具有取代基例如苯基、苯氧基、环己基等等的链烷酸酯)比较,认为在β-氧化作用途径中mcl-链烷酸酯对许多酶具有较高的底物亲合力,因此通过与mcl-链烷酸酯同时存在可有效地制备乙酰辅酶A。为此,利用乙酰辅酶A作为能源和碳源有利于微生物生长。
然而,因为mcl-链烷酸酯途径经由β-氧化作用直接变为PHA的单体单元,所以严重的问题是制备的PHA除了所需的单体单元外也含有许多mcl-3HA单体单元。
为了解决这些问题,可取的方法是不选择mcl-链烷酸酯,而是有效地选择可以提供乙酰辅酶A或能源和碳源的这种底物,和允许与所需的链烷酸酯共同存在。如上所述,乙酰辅酶A可以是通过脂肪酸合成途径形成的PHA的单体单元,但是与β-氧化作用中的mcl-链烷酸酯相比较,这些方法是有许多阶段的间接法。因此,通过选择培养条件例如底物浓度以产生乙酰辅酶A,空岩实现在PHA中不惨合或减少mcl-3HA含量的制备方法。
另外,通常使用的制备方法是在第一阶段进行培养使微生物生长,而在第二阶段加入到只有所需的链烷酸酯作为碳源的培养基中。在这种情况下,ATP需要酰基辅酶A连接酶(是使链烷酸酯转化为酰基辅酶A的β-氧化作用途径的起始酶)。因此,本发明人的研究提供了更有效的制备方法的结果:能够用作能源的底物,微生物也共同存在于第二阶段,然后完成本发明。
作为在本发明方法中能有效地提供酰基辅酶A或能源和碳源的底物,只要化合物不经历β-氧化作用途径而产生酰基辅酶A或能源和碳源,根据作为所用菌株的底物的用途。可以使用或适当选择任何一种化合物,例如醛糖包括甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖,糖醇例如甘油、赤藓醇、和木糖醇,醛糖酸例如葡萄糖酸,糖醛酸例如葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸,糖例如包括麦芽糖、蔗糖和乳糖的二醣类,另外包含在三羧酸循环中的有机酸例如乳酸、丙酮酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸和它们的盐,此外来源于天然产物的培养基成分例如聚胨、牛肉浸膏和酪蛋白氨基酸等等。而且,如果它们的组合产生少量的与mcl-3HA的混合物,那么也可以选择使用两种或更种化合物。
<微生物>
在本发明背景中提到:报道了在细胞PHA内制备和积聚的微生物,该PHA含有下列单体单元:例如3-羟基-4-苯氧基丁酸盐、3-羟基-5-氟苯氧基戊酸酯、3-羟基-6-氰基苯氧基己酸酯、3-羟基-6-硝基苯氧基己酸酯、3-羟基-7-氟苯氧基庚酸酯的,例如在高分子,29卷,3432-3435页(1996),Can.J.Microbiol.41卷,32-43页(1995),日本专利号2989175中描述的食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorance)和恶臭假单胞菌等等。然而,没有报道过制备和积聚含有3-羟基-4-苯氧基丁酸盐单体单元的细胞PHA的微生物,其中该单体单元具有取代基例如氟、氰基、硝基、在高分子,32卷,2889-2895页(1999)中报道了在含有5-(2,4-二硝基苯基)戊酸酯和作为底物的壬酸酯(nonanoate)的培养基中培养,食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorance)可以制备含有3-羟基-5-(2,4-二硝基苯基)戊酸酯和3-羟基-5-(4-硝基苯基)戊酸酯的单体单元的PHA。然而,没有报道过在细胞内制备和积聚含有3-羟基-苯基链烷酸酯的单体单元的PHA的微生物,其中该单体单元具有取代基例如氟、三氟甲基。因此,通过筛选能够将这些新单体单元掺入PHA中的微生物可以达到本发明的目的。
以前没有报道过本发明的新型微生物能够在细胞内制备和积聚含有来源于链烷酸酯的新单体单元的PHA(使用链烷酸酯作为底物)。发明人通过筛选发现了具有这种新型酶促反应的微生物。本发明的新型微生物是菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)菌株YN2(FERM BP-7375)、菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)菌株H45(FERM BP-7374)、恶臭假单胞菌菌株P91(FERM BP7373)和jessenii假单胞菌菌株P161(FERM BP-7376)。除了这些微生物外,使用链烷酸酯作为底物,通过培养菌株例如菊苣假单胞菌种可以获得在本发明制备PHA的方法中使用的微生物。
下面将给出有关菌株YN2、H45、P91、和P161的详细资料。
<菌株YN2的细菌学上的性质>
(1)形态学性能
细胞的形状和大小:棒状,0.8μm×1.5-2.0μm
细胞的多形性:阴性
移动性:能动的
孢子形成:阴性
革兰氏染色:阴性
菌落形状:圆形的;整个平滑的边缘;低凸面的;光滑表面;有光泽的;半透明的
(2)生理学的性能
过氧化氢酶;阳性
氧化酶:阳性
O/F试验:氧化(未引起发酵)
硝酸盐还原作用:阴性
吲哚制备:阳性
从葡萄糖产酸:阴性
精氨酸二水解酶:阴性
脲酶:阴性
七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解:阴性
明胶水解:阴性
β-半乳糖苷酶:阴性
在King的B琼脂上荧光颜料的制备:阳性
在4%NaCl中的生长:阳性的(生长差)
聚-β-羟基丁酸酯积聚:阴性(*)
吐温80水解:阳性
(*)用苏丹黑染色在营养琼脂中培养的菌落来测定。
(3)底物同化作用
葡萄糖:阳性
左旋阿拉伯糖:阳性
右旋甘露糖:阴性
右旋甘露糖醇:阴性
正乙酰-右旋葡萄糖胺:阴性
麦芽糖:阴性
葡糖酸钾:阳性
正癸酸盐:阳性
己二酸盐:阴性二苹果酸:阳性
柠檬酸钠:阳性 乙酸苯酯:阳性
<菌株H45的细菌学上的性质>
(1)形态学性能
细胞的形状和大小:棒状,0.8μm×1.0-1.2μm
细胞的多形性:阴性
移动性:能动的
孢子形成:阴性
革兰氏染色:阴性
菌落形状:圆形的;整体平滑的边缘;低凸面的;光滑表面;有光泽的;奶油色的
(2)生理学的性能
过氧化氢酶:阳性
氧化酶:阳性
O/F试验:氧化
硝酸盐还原作用:阴性
吲哚制备:阴性
从葡萄糖产酸:阴性
精氨酸二水解酶:阴性
脲酶:阴性
七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解:阴性
明胶水解:阴性
β-半乳糖苷酶:阴性
在King的B琼脂上制备的荧光颜料:阳性
在4%NaCl中的生长:阴性
聚β-聚羟基丁酸酯积聚:阴性
(3)同化底物的能力
葡萄糖:阳性
左旋阿拉伯糖:阴性
右旋甘露糖:阳性
右旋甘露糖醇:阳性
正乙酰-右旋葡萄糖胺:阳性
麦芽糖:阴性
葡糖酸钾:阳性
正癸酸盐:阳性
己二酸盐:阴性
二苹果酸:阳性
柠檬酸钠:阳性
乙酸苯酯:阳性
<菌株P91的细菌学上的性质>
(1)形态学性能
细胞的形状和大小:棒状,0.6μm×1.5μm
细胞的多形性:阴性
移动性:能动的
孢子形成:阴性
革兰氏染色:阴性
菌落形状:圆形的;整体平滑的边缘;低凸面的;光滑表面;有光泽的;奶油色的
(2)生理学的性能
过氧化氢酶:阳性
氧化酶:阳性
O/F试验:氧化
硝酸盐还原作用:阴性
吲哚制备:阴性
从葡萄糖产酸:阴性
精氨酸二水解酶:阳性
脲酶:阴性
七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解:阴性
明胶水解:阴性
β-半乳糖苷酶:阴性
在King的B琼脂上制备的荧光颜料:阳性
(3)底物同化作用
葡萄糖:阳性
左旋阿拉伯糖:阴性
右旋甘露糖:阴性
右旋甘露糖醇:阴性
正乙酰-右旋葡萄糖胺:阴性
麦芽糖:阴性
葡糖酸钾:阳性
正癸酸盐:阳性
己二酸盐:阴性
消旋苹果酸:阳性柠檬酸钠:阳性
乙酸苯酯:阳性
<菌株P161的细菌学上的性质>
(1)形态学性能
细胞的形状和大小:球状的,Φ0.6μm棒状,0.6μm×1.5-2.0μm
细胞的多形性:细长的形状
移动性:能动的
孢子形成:阴性
革兰氏染色:阴性
菌落形状:圆形的;整体平滑的边缘;低凸面的;光滑表面;浅黄色
(2)生理学的性能
过氧化氢酶:阳性
氧化酶:阳性
O/F试验:氧化
硝酸盐还原作用:阳性
吲哚制备:阴性
从葡萄糖产酸:阴性
精氨酸二水解酶:阳性
脲酶:阴性
七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解:阴性
明胶水解:阴性
β-半乳糖苷酶:阴性
在King的B琼脂上制备的荧光颜料:阳性
(3)底物同化作用
葡萄糖:阳性
左旋阿拉伯糖:阳性
右旋甘露糖:阳性
右旋甘露糖酵:阳性
正乙酰-右旋葡萄糖胺:阳性
麦芽糖:阴性
萄糖酸钾:阳性
正癸酸盐:阳性
己二酸盐:阴性
消旋苹果酸盐:阳性
柠檬酸钠:阳性
乙酸苯酯:阳性
根据这些细菌学上的性质,并参考Bergey细菌分类学手册(1卷(1984))和Bergey细菌学签定手册(第9版本(1994)),显示菌株YN2和H45属于菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii),而菌株P91属于恶臭假单胞菌。因此,这些菌株被称为菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)菌株YN2、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)菌株H45、和恶臭假单胞菌菌株P91。
另一方面,显示菌株P161属于菊苣假单胞菌种(菊苣假单胞菌sp.),但是从它的细菌学上的性质上不能确定它的分类位置。然后,根据遗传学的性质分类,确定了菌株P161的16s核蛋白体编码区域的脱氧核糖核酸顺序(SEQ ID:No:1)以检测与菊苣假单胞菌种的已知微生物的16s核糖核酸编码区域的脱氧核糖核酸顺序的同种性。结果表明在菌株P161和jessenii假单胞菌两者之间的脱氧核糖核酸顺序有非常高的同种性。而且,发现在System.Appl.Microbiol.,20卷,137-149页(1997)和System.Appl.Microbiol.,22卷,45-58页(1999)中描述的jessenii假单胞菌的细菌学上的性质与菌株P161的性质有高的相似性。因为从这些结果可以得出:菌株P161应该属于jessenii假单胞菌是合理的,所以菌株P161被称为jessenii假单胞菌菌株P161。
菌株YN2、H45、P91和P161已经保藏在国家生物科学和人类技术研究院(National Institute of Bioscience and Human-Technology)(专利微生物贮藏中心),工业科学技术代理机构,国际贸易与工业部,保藏号分别为“FERMBP-7375”、“FERM BP-7374”、“FERM BP-7373”和“FERM BP-7376”。
<培养:常规培养>
按照本发明,在含有用于引入所需的单体单元的链烷酸酯和生长的底物的培养基中培养这些微生物可以制备所需的PHA。这些PHA通常是只有R-形式,且是全同立构聚合物。
对于在制备本发明PHA的方法中使用的用于如细胞原种制备培养基来说,为了保持细胞的数量和活性,可以使用任何一种培养基,例如常见的天然培养基和补充有营养物的合成培养基,重要它他们对微生物的生长或存在没有不良影响。根据使用的微生物,适当的选择培养条件例如温度、通风、搅拌等等。
在使用微生物制备和积聚PHA的情况下,含有用于引入所需的单体单元的链烷酸酯的无机培养基或其他培养基等等可以用作制备PHA的培养基。
对于在上述的培养法中使用的无机培养基来说,可以使用任何一种培养基,只要它们含有让微生物生长的成分例如磷源(例如磷酸盐)、氮源(例如铵盐、硝酸盐)等等。例如,无机培养基可以包括MSB培养基、E培养基(J.Biol.Chem.218:97-106(1956))和M9培养基等等。
在本发明实施例中使用的M9培养基的组成如下:
Na2HPO4:6.2g
KH2PO4:3.0g
NaCl:0.5g
NH4Cl:1.0g
(每升培养基,pH7.0)
例如,培养条件可以包括:在15-40℃且优选20-35℃的需氧条件下振荡培养和搅拌培养。
培养步骤可以利用通常微生物培养法使用的任何一种方法,例如分批培养、流动分批培养、半连续培养、连续培养和反应器模式培养,而且可以采取连结这些方法的多个步骤的多步骤方法。
对于各自生长的底物来说,具体的培养步骤描述如下:
<培养基:mcl-链烷酸酯>
例如作为两阶段培养的方法,即第一阶段培养是在含具有6-12个碳原子的第一链烷酸酯(例如辛酸酯和壬酸酯)和第二链烷酸酯的无机培养基等等中进行,直到对数生长期后期到静止期,其中第一链烷酸酯作为生长底物,数量为0.1%-0.2%(按重量计算),而第二链烷酸酯用于引入所需的单体单元,数量为0.01%-0.5%(按重量计算);而在第二阶段,通过离心沉淀等等收集完成第一阶段培养之后的细胞,接着在含有第二链烷酸酯(数量为0.01%-0.5%(按重量计算))和没有氮源的无机培养基中进一步培养它们,并且在完成培养之后,采集细胞以提取所需的PHA。
另外,另一种方法是通过提供数量为0.1%-0.2%(按重量计算)的具有6-12碳原子的第一链烷酸酯例如辛酸酯和壬酸酯,和数量为0.01%-0.5%(按重量计算)的引入所需单体单元的第二链烷酸酯,来进行培养,在对数生长期后期到静止期时收集细胞以提取所需的PHA。
在此方法中,将作为生长底物的mcl-链烷酸酯加入到培养基中,获得的PHA是混有大量单体单元的PHA,该单体单元来源于作为生长底物加入的mcl-链烷酸酯。这种PHA通常是只有R-形式,且是全同立构聚合物。
<培养基:糖>
例如作为两阶段培养的方法,即第一阶段培养是在含有糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)和链烷酸酯的无机培养基等等中进行,直到对数生长期后期到静止期,其中该糖作为生长底物,数量为0.1%-0.2%(按重量计算),而链烷酸酯用于引入所需的单体单元,数量为0.01%-0.5%(按重量计算);而在第二阶段,通过离心沉淀等等收集完成第一阶段培养之后的细胞,接着在含有0.1%-2.0%(按重量计算)的作为生长底物的糖、0.01%-0.5%(按重量计算)的链烷酸酯且没有氮源的无机培养基中进一步培养它们,并且在完成培养之后,收集细胞以提取所需的PHA。
另外,另一种方法是通过提供数量为0.1%-2.0%(按重量计算)的作为生长底物的糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)和数量为0.01%-0.5%(按重量计算)的引入所需单体单元的链烷酸酯来进行培养,在对数生长期后期到静止期期间收集细胞以提取所需的PHA。
在这些情况下,可根据引入所需单体单元的链烷酸酯的类型、微生物的属和种、细胞密度或培养方法合理选择加入到培养基中的糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)的浓度,虽然可以选择加入量,但是培养基中糖的含量通常约为0.1%-2.0%(按重量计算)。另一方面,根据微生物的属和种、细胞密度或培养方法也可合理选择作为原料的链烷酸酯的浓度,虽然可以选择加入的浓度,但是培养基中链烷酸酯的含量通常约为0.01%-0.5%(按重量计算)。因此,在含有糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)和链烷酸酯的培养基中培养微生物,可以制备和积聚所需的PHA,其中除了预期的单体单元外,可引入少量或根本没有其它的单体单元。这些PHA通常是只有R-形式,且是全同立构聚合物。
<培养基:聚胨>
例如作为两阶段培养的方法,即第一阶段是在含有0.1%-2.0%(按重量计算)的作为生长底物的的聚胨和0.1%-0.5%(按重量计算)的引入所需单体单元的链烷酸酯的无机培养基等等中进行培养,直到对数生长期后期到静止期;而在第二阶段,通过离心沉淀等等收集完成第一阶段培养之后的细胞,接着在含有0.01%-0.5%(按重量计算)的链烷酸酯且没有氮源的无机培养基中进一步培养它们,并且在完成培养之后,收集细胞并提取所需的PHA。
另外,另一种方法是通过提供0.1%-0.2%(按重量计算)的聚胨和0.01%-0.5%(按重量计算)的引入所需单体单元的链烷酸酯来进行培养,在对数生长期后期到静止期期间收集细胞并提取所需的PHA。
在这些情况下,可根据引入所需单体单元的链烷酸酯的类型、微生物的属和种、细胞密度或培养方法合理选择加入到培养基中的聚胨的浓度,虽然可以选择加入置,但是培养基中聚胨的含量通常约为0.1%-2.0%(按重量计算)。对于聚胨来说,也可以视情况而定使用任何一种市售的聚胨,也就是说培养微生物通常使用的聚胨等等。另一方面,根据微生物的属和种、细胞密度或培养方法也可合理选择作为原料的链烷酸酯的浓度,虽然可以选择加入的浓度,但是培养基中链烷酸酯的含量通常约为0.01%-0.5%(按重量计算)。因此,通过在含有聚胨和链烷酸酯的培养基中培养微生物,可以制备和积聚所需的PHA,其中除了预期的单体单元外,可引入少量或完全不引入其它单体单元。这些PHA通常是只有R-形式,且是全同立构聚合物。
<培养基:三羧酸循环的有机酸>
例如作为两阶段培养的方法,即第一阶段是在含有0.1%-2.0%(按重量计算)的包含在三羧酸循环中的有机酸(例如乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等等及其盐)和0.01%-0.5%(按重量计算)链烷酸酯的无机培养基等等中进行培养,直到对数生长期后期到静止期,其中有机酸作为生长底物,而链烷酸酯用于引入所需的单体单元,和在第二阶段,通过离心沉淀等等收集第一阶段培养完成之后的细胞,接着在含有0.1%-2.0%(按重量计算)的作为生长底物的三羧酸循环的有机酸(例如乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等等及其盐)、0.01%-0.5%(按重量计算)的链烷酸酯且没有氮源的无机培养基中进一步培养它们,并且在完成培养之后,收集细胞并提取所需的PHA。
另外,另一种方法是通过提供0.1%-2.0%(按重量计算)的三羧酸循环的有机酸(例如乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等等及其盐)和0.01%-0.5%(按重量计算)的用于引入所需单体单元的链烷酸酯来进行培养,在对数生长期后期到静止期期间收集细胞并提取所需的PHA。
在这些情况下,根据用于引入所需单体单元的链烷酸酯的类型、细胞密度或培养方法,合理选择加入到培养基中的三羧酸循环的有机酸(例如乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等等)的浓度,虽然可以选择加入量,但是培养基中有机酸的含量通常约为0.1%-2.0%(按重量计算)。另一方面,根据微生物的属和种、细胞密度或培养方法也可合理选择作为原料的链烷酸酯的浓度,虽然可以选择加入的浓度,但是培养基中链烷酸酯的含量通常约为0.01%-0.5%(按重量计算)。因此,通过在含有三羧酸循环的有机酸(例如乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等等及其盐)和链烷酸酯的培养基中培养微生物,可以制备和积聚所需的PHA,其中除了预期的单体单元外,可引入少量或根本不引入其它单体单元。这些PHA通常是只有R-形式,且是全同立构聚合物。
<培养基:聚胨+丙酮酸及其盐>
例如作为两阶段培养的方法,即第一阶段是在含有0.1%-2.0%(按重量计算)的作为生长底物的的聚胨和0.01%-0.5%(按重量计算)的用于引入所需单体单元的链烷酸酯的无机培养基等等中进行培养,直到对数生长期后期到静止期;而在第二阶段,通过离心沉淀等等收集第一阶段完成培养之后的细胞,接着在含有0.1%-2.0%(按重量计算)的作为生长底物的丙酮酸及其盐、0.01%-0.5%(按重量计算)的链烷酸酯、且没有氮源的无机培养基中进一步培养它们,并且在完成培养之后,收集细胞并提取所需的PHA。
在这些情况下,可根据用于引入所需单体单元的链烷酸酯的类型、微生物的属和种、细胞密度或培养方法,合理选择加入到培养基中的聚胨和丙酮酸或其盐的浓度,虽然可以选择加入量,但是在所有情况下在培养基中聚胨和丙酮酸的含量通常约为0.1%-2.0%(按重量计算)。另一方面,根据微生物的属和种、细胞密度或培养方法也可合理选择作为原料的链烷酸酯的浓度,虽然可以选择加入的浓度,但是培养基中链烷酸酯的含量通常约为0.01%-0.5%(按重量计算)。因此,通过分两阶段利用含有聚胨和链烷酸酯的培养基,以及含有丙酮酸或及其盐和链烷酸酯的培养基培养微生物,可以制备和积聚所需的PHA,其中除了引入预期的单体单元外,可引入或根本不引入其它单体单元。这些PHA通常是只有R-形式,且是全同立构聚合物。
<PHA回收>
为了从本发明方法中的细胞中回收PHA,用有机溶剂例如氯仿进行通常的抽取是最方便的,但是在难以使用有机溶剂的情况下,也可以利用通过除去不是PHA的细胞组分的方法收集PHA,即用去垢剂例如十二烷基磺酸钠(SDS)等等处理,用酶例如溶菌酶等等处理,用化学药品例如乙二胺四乙酸、次氯酸钠、氨等等处理。
<分子量>
利用上述方法可以获得本发明的PHA。为了使聚合物具有稳定的物理性能例如玻璃态转化温度、软化点、熔点、结晶性、取向(这些物理性能是由组成聚合物的单体单元决定的),最好是PHA具有至少大约10,000以上的数均分子量。本发明的PHA具有大约20,000或更高的数均分子量,因此可以充分地表现出聚合物的稳定物理性能。从处理例如溶解方法方便的观点考虑,PHA优选具有最多大约200,000,最优选不超过100,000的数均分子量。如上所述,这些PHA通常是只有R形式,且是全同立构聚合物。
在细胞内培养微生物,通过微生物制备和积聚PHA,和从细胞中回收PHA并不局限于如上所述的方法。例如,除了如上所述四种菌株外,在制备本发明PHA的方法中使用的微生物可以利用具有与这四种菌株有相似制备本发明PHA能力的微生物。
例如这些PHA可以用于装置和医疗材料等等,以及通常的塑料应用中。那些具有氟原子、三氟甲基特别是具有氟原子、三氟甲基等作为取代基引入预计有优良的生物相容性,因此应用于医疗用途。而且,由于含有氟原子、三氟甲基基团等,它们预计有耐水作用,也可以应用于各领域中的耐水处理。特别是利用由脂肪族聚酯得到的可生物降解性也可以应用于临时的耐水处理。
实施例
实施例1
首先根据“大分子”,29,1762-1766(1996)和27,45-49(1994)描述的方法,通过Grignard反应合成培养基FPVA。将5-溴戊酸溶解在无水四氢呋喃(THF)中,在氩气氛下,于-20℃滴加3摩尔/升甲基镁化氯THF溶液。搅拌约15分钟后,再滴加1-溴-4-氟苯和镁的THF溶液并加入0.1摩尔/升Li2CuCl4THF溶液(温度保持在-20℃)。使反应溶液恢复到室温,进一步搅拌过夜。然后将溶液倒入在冰上冷却的20%硫酸溶液中并搅拌。回收水层,用盐饱和,用乙醚萃取。萃取后,再用100毫升脱离子水萃取,向其中加入50克氢氧化钾,用20%硫酸溶液酸化萃取液,回收沉淀物。
用核磁共振设备(FT-NMR:Bruker DPX400)在下列条件下分析沉淀物:核素:1H和13C;溶剂:重质氯仿(含TMS)。结果示于图1和表3中。
实施例2
在200毫升含0.1%壬酸和0.1%FPVA的M9培养基中接种菌株H45细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.2%FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果示于表4中。
实施例3
在200毫升含0.1%壬酸和0.1%FPVA的M9培养基中接种菌株YN2细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.2%FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用直径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果示于表5中。
实施例4
在200毫升含0.1%壬酸的M9培养基中接种菌株P91细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.1%壬酸和0.1%FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用直径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果示于表6中。
实施例5
在200毫升含0.1%壬酸的M9培养基中接种菌株P161细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.1%壬酸和0.1%FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用直径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体的甲基酯。结果示于表7中。
实施例6
将100毫升用菌株H45获得的PHA溶解在1毫升氯仿中,加入正己烷直到它们浑浊。离心浑浊液并回收,真空干燥沉淀物。再将它们溶解在1毫升氯仿中,加入正己烷,重复回收沉淀物的过程3次。
根据常规方法甲醇分解获得的沉淀物后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体的甲基酯。正如表8所示的,结果发现沉淀物是PHA,其单体单元仅由3HFPV组成。
另外,使用核磁共振设备(FT-NMR:Bruker DPX400)在下列条件下进行分析:核素:1H和13C;溶剂:重质氯仿(含TMS)。结果示于图2、表9、图3和表10中。
实施例7
(合成FPxVA)
将240毫升脱水丙酮倒入三颈圆底烧瓶中后,加入碘化钠(0.06摩尔),碳酸钾(0.11摩尔)和4-氟苯酚(0.07摩尔)并彻底搅拌。在氮气氛下,向溶液中滴加5-溴乙基戊酸酯(0.06摩尔),在60±5℃下回流,并反应24小时。反应后,用一个蒸发器浓缩反应溶液至干,并将其再溶解在二氯甲烷中。加入水并分离溶液。用无水硫酸镁脱水有机层,用一个蒸发器浓缩至干。
向反应物中加入热甲醇,使其溶解,缓慢冷却并再沉淀,获得5-(4-氟苯氧基)乙基戊酸酯。此时,5-溴乙基戊酸酯的产率为68摩尔%。
将获得的反应物(酯)溶解在乙醇-水(9.1(v/v))中,结果是5重量%。加入10倍摩尔量的氢氧化钾,使其在0-4℃下反应4小时,水解成酯。
将反应溶液倒入10体积的0.1摩尔/升盐酸溶液中,过滤回收沉淀物。在室温下真空干燥回收的沉淀物(反应物)36小时。将获得的干物质溶解在少量的热乙醇中,逐渐冷却溶液,再沉淀,在室温下真空干燥24小时,获得目的化合物5-(4-氟苯氧基)戊酸。用5-溴乙基戊酸酯获得的该化合物的产率为49摩尔%。
在下列条件下,通过NMR分析获得的化合物:
<设备>
FT-NMR:Bruker DPX400
1H共振频率:400MHZ
<测定条件>
核素:1H
溶剂:CDCl3
参比值:含毛细管的TMS/CDCI3
温度:室温
光谱图示于图4,鉴定结果示于表11。
上述结果证实了一定能合成要求的FPxVA。
实施例8
(用菌株P91制备PHA)
在200毫升含0.1重量%壬酸和0.1重量%FPxVA的M9培养基中接种菌株P91细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.1重量%壬酸和0.1重量%FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
称重冻干的颗粒后,将该颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA并称重。产率示于表12中。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,转化为聚苯乙烯基准)进行测定。分子量示于表13中。
另外,在根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用GC-MS进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。TIC和每个峰的质谱示于图5-图7A和7B中。所示的峰(1)代表3-羟甲基庚酸酯,峰(2)代表3-羟甲基辛酸酯,峰(3)代表3-羟甲基壬酸酯,和峰(4)代表3-羟基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述结果说明:获得的聚合物是含3-羟基庚酸,3-羟基辛酸,3-羟基壬酸和3-羟基-4-(4-氟苯氧基)戊酸单元的PHA。
实施例9
(用菌株YN2(1)制备PHA)
除了用菌株YN2代替菌株P91外,采用与实施例8描述的相同步骤制备PHA,并进行各种分析。产率示于表12中,分子量示于表13中,GC-MS的TIC示于图8中。所示的峰(1)代表3-羟甲基庚酸酯,峰(2)峰代表3-羟甲基辛酸酯,峰(3)代表3-羟甲基壬酸酯,和峰(4)代表3-羟基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述结果说明:获得的聚合物是含3-羟基庚酸,3-羟基辛酸,3-羟基壬酸和3-羟基-4-(4-氟苯氧基)戊酸单元的PHA。
实施例10
(用菌株P161制备PHA)
除了用菌株P161代替菌株P91外,采用与实施例8描述的相同步骤制备PHA,并进行各种分析。产率示于表12中,分子量示于表13中,GC-MS的TIC示于图9中。所示的峰(1)代表3-羟甲基庚酸酯,峰(2)峰代表3-羟甲基辛酸酯,峰(3)代表3-羟甲基壬酸酯,和峰(4)代表3-羟基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述结果说明:获得的聚合物是含3-羟基庚酸,3-羟基辛酸,3-羟基壬酸和3-羟基-4-(4-氟苯氧基)戊酸单元的PHA。
实施例11
(用菌株H45制备PHA)
除了用菌株H45代替菌株P91外,采用与实施例8描述的相同步骤制备PHA,并进行各种分析。产率示于表12中,分子量示于表13中,GC-MS的TIC示于图10中。所示的峰(1)代表3-羟甲基庚酸酯,峰(2)峰代表3-羟甲基辛酸酯,峰(3)代表3-羟甲基壬酸酯,和峰(4)代表3-羟基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述结果说明:获得的聚合物是含3-羟基庚酸,3-羟基辛酸,3-羟基壬酸和3-羟基-4-(4-氟苯氧基)戊酸单元的PHA。
实施例12
(用菌株YN2(2)制备PHA)
在200毫升含0.1重量%己酸和0.1重量%FPxVA的M9培养基中接种菌株YN2细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。72小时后,离心收集细胞,将其悬浮在200毫升含0.1重量%己酸和0.1重量%FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。30小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
按与实施例8描述的相同步骤萃取PHA,并进行各种分析。产率示于表12中,分子量示于表13中。GC-MS分析的结果表明:按该方法获得的PHA具有下列组成:
3-羟基丁酸:8.1%
3-羟基己酸:51.2%
3-羟基辛酸:1.3%
3-羟基癸酸:7.0%
3-羟基十二酸:10.6%
未鉴定的物质:9.9%
3-羟基-4-(4-氟苯氧基)戊酸:11.9%
上述结果说明:获得的聚合物是含3-羟基-4-(4-氟苯氧基)戊酸单元的PHA。
实施例13
(合成TFMPVA)
首先根据“大分子”,29,1762-1766(1996)和27,45-49(1994)描述的方法,合成培养基TFMPVA。将5-溴戊酸溶解在无水四氢呋喃(THF)中,在氩气氛下,于-20℃滴加3摩尔/升甲基镁化氯THF溶液。搅拌约15分钟后,再滴加1-溴-4-三氟苯和镁的THF溶液并加入0.1摩尔/升Li2CuCl4的THF溶液(温度保持在-20℃)。使反应溶液恢复到室温,进一步搅拌过夜。然后将溶液倒入在冰上冷却的20%硫酸溶液中并搅拌。回收水层,用盐饱和,用乙醚萃取。萃取后,再用100毫升脱离子水萃取,向其中加入50克氢氧化钾,用20%硫酸溶液酸化萃取液,回收沉淀物。
用常规方法甲基酯化回收的化合物,并用气相色谱质谱联用计(GC-MC,Shimadzu GC-MS QP-5050,柱:DB-WAXETR(30米×0.32毫米×0.5微米)(J&W股份有限公司制造))。TIC(总离子色谱)和质谱示于图11A和11B中。这些结果表明合成了目的物TFMPVA。
实施例14
(用菌株H45制备聚合物)
在200毫升含0.1%壬酸和0.1%TFMPVA的M9培养基中接种菌株H45细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.2%TFMPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA并称重。产率示于表14中。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,转化为聚苯乙烯基准)进行测定。所示的Mn=64000和Mw=110000。
在根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法,柱:DB-WAXERT(30米×0.32毫米×0.5微米))进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。TIC(总离子色谱)和代表目的物单元3-羟基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸的一个峰(靠近36.5′)的质谱分别示于图12A和12B中。PHA各单元的TIC面积比示于表15中。
上述结果说明:按本发明任一方法制备的PHA是含3-羟基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸单体单元的PHA。
实施例15
(用菌株P91制备聚合物)
在200毫升含0.1%壬酸和0.1%TFMPVA的M9培养基中接种菌株P91细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。30小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.1%TFMPVA和0.05%壬酸但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。30小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA并称重。
产率示于表16中。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLgel MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,转化为聚苯乙烯基准)进行测定。示出的Mn=69000和Mw=120000。
在根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法,柱:DB-WAXERT(30米×0.32毫米×0.5微米))进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。TIC(总离子色谱)和代表目的物单元3-羟基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸的一个峰(靠近36.5′)的质谱分别示于图13A和13B中。PHA各单元的TIC面积比示于表17中。
上述结果说明:按本发明任一方法制备的PHA是含3-羟基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸单体单元的PHA。
实施例16
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PVA的M9培养基中接种菌株YN2细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。40小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干获得一种冻干的颗粒。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌28小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。在根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果,正如表18所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源可以获得高产率的含3HPV(它是由要求的PVA产生的单体单元)的PHA。
实施例17
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PVA的M9培养基中接种菌株YN2细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。48小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。40小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。在根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果,正如表19所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源可以获得高产率的含3HPV(它是由要求的PVA产生的单体单元)的PHA。
实施例18
在200毫升含0.5%D-甘露糖或0.5%D-果糖和0.1%PVA的M9培养基中接种菌株YN2细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。在D-甘露糖体系中100小时和在D-果糖体系中40小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-甘露糖或0.5%D-果糖和0.1%PVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。48小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后回收沉淀物并真空干燥获得PHA。在根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果,正如表20所示的,D-甘露糖和D-果糖作为碳源使用时与D-葡萄糖一样有效,可以获得高产率的3HPV(它是由要求的PVA产生的单体单元)比例高的PHA。
实施例19
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PVA的M9培养基中接种菌株P161细胞,并在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。48小时后,离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟进行摇合培养。40小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器进行过滤,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。在根据常规方法甲醇分解获得的PHA后,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果,正如表21所示的,采用D-葡萄糖作为碳源可以获得高产率的3HPV(它是由要求的PVA产生的单体单元)比例高的PHA。
实施例20
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%FPVA的M9培养基中,在30℃和125转/分钟条件下摇合培养菌株YN2细胞48小时。离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃和125转/分钟条件下摇合培养40小时。离心分离收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩溶液,仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解由此获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果示于表22中。正如表22所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源进行培养可以获得高产率的3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(它是由要求的PVA产生的单体单元)比例高的PHA。
实施例21
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PHxA的M9培养基中,在30℃和125转/分钟条件下摇合培养菌株P161细胞48小时。离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PHxA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃和125转/分钟条件下摇合培养40小时。离心分离收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩溶液,仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解由此获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯。结果示于表23中。正如表23所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源进行培养可以获得高产率的3-羟基-6-苯基己酸(它是由要求的PHxA产生的单体单元)比例高的PHA。
实旋例22
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PxBA的M9培养基中,在30℃和125转/分钟条件下摇合培养菌株YN2细胞48小时。离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃和125转/分钟条件下摇合培养40小时。离心分离收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩溶液,仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解由此获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。结果示于表24中。正如表24所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源进行培养可以获得高产率的3-羟基-4-苯氧基丁酸(它是由要求的PxBA产生的单体单元)比例高的PHA。
实施例23
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PxBA的M9培养基中,在30℃和125转/分钟条件下摇合培养菌株H45细胞48小时。离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃和125转/分钟条件下摇合培养40小时。离心分离收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩溶液,仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解由此获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。结果示于表25中。正如表25所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源进行培养可以获得高产率的3-羟基-4-苯氧基丁酸(它是由要求的PxBA产生的单体单元)比例高的PHA。
实施例24
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PxBA的M9培养基中,在30℃和125转/分钟条件下摇合培养菌株P161细胞48小时。离心收集细胞,将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%PxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃和125转/分钟条件下摇合培养40小时。离心分离收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩溶液,仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解由此获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。结果示于表25中。正如表25所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源进行培养可以获得高产率的3-羟基-4-苯氧基丁酸(它是由要求的PxBA产生的单体单元)比例高的PHA。
实施例25
在200毫升含0.5%D-葡萄糖或0.1%正壬酸和0.1%CHBA的M9培养基中,在30℃和125转/分钟条件下摇合培养菌株YN2细胞40小时。离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌28小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩溶液,仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。根据常规方法甲醇分解由此获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。结果示于表27中。正如表27所示的,采用D-葡萄糖作为生长用的碳源进行培养可以获得高产率的3HCHB(它是由要求的CHBA产生的单体单元)比例高的PHA。
实施例26
(用菌株YN2制备聚-3-羟基-5-苯基戊酸)
将生长在M9琼脂培养基中的菌株YN2的菌落在总共4种类型的培养基中(每种培养基200毫升)接种,并在30℃下培养24小时,琼脂培养基含0.1%壬酸(下文称为NA),所述类型的培养基包括:(1)含0.5%酵母提取物(DIFCO,下文称为YE)和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,(2)含0.5%牛肉提取物(DIFCO,下文称为BE)和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,(3)含0.5%酪蛋白氨基酸(DIFCO,下文称为CA)和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,和(4)含0.5%聚胨(Wako Jun-yaku,下文称为PP)和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基。从每种培养基中离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
称重从每种培养基中收集的冻干颗粒并将其悬浮在100毫升氯仿中,在55℃下搅拌20小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤每种萃取溶液并用蒸发器浓缩。在冷却甲醇中再沉淀浓缩的溶液,获得聚合物,在真空、室温下干燥聚合物并称重。所得产率示于表28中。
按下列方法分析制备的PHA组成。在25毫升的蛋植物型烧瓶中,将大约10毫克的PHA溶解在2毫升的氯仿中,向其中加入2毫升含3%硫酸的甲醇溶液。在100℃下回流加热混合物3.5小时,发生反应。在反应完成后,向流出物中加入10毫升脱离子水,剧烈摇晃10分钟。它们被分成两层,取出较低的氯仿层,用硫酸镁脱水,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI法,0.32毫米×30米柱(J&W,DB-WAX))进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。发现PHA单体单元含有96%3-羟基-5-苯基戊酸单元和4%3-羟基丁酸单元。
结果表明:本发明任一实施方式都能制得高产率的3-羟基-5-苯基戊酸单元比例高的PHA。
实施例27
(用菌株YN2制备聚-3-羟基-4-环己基丁酸)
将生长在M9琼脂培养基中的菌株YN2的菌落在2种类型的培养基中(每种培养基200毫升)接种,并在30℃下培养24小时,琼脂培养基含0.1%NA,所述类型的培养基包括:(1)含0.5%YE和0.1%4-环己基丁酸的M9液态培养基,和(2)含0.5%PP和0.1%4-环己基丁酸的M9液态培养基、从每种培养基中离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
称重从每种培养基中收集的冻干颗粒并将其悬浮在100毫升氯仿中,在55℃下搅拌20小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤每种萃取溶液并用蒸发器浓缩。在冷却甲醇中再沉淀浓缩的溶液,获得聚合物,在真空、室温下干燥聚合物并称重。所得产率示于表29中。
按与实施例26相同的方法分析制备的PHA组成。发现PHA单体单元含有97%3-羟基-4-环己基丁酸单元和3%3-羟基丁酸单元。
结果表明:本发明任一实施方式都能制得高产率的3-羟基-4-环己基丁酸单元比例高的PHA。
实施例28
(用菌株YN2制备聚-3-羟基-5-苯氧基戊酸)
将生长在M9琼脂培养基中的菌株YN2的菌落在2种类型的培养基中(每种培养基200毫升)接种,并在30℃下培养24小时,琼脂培养基含0.1%NA,所述类型的培养基包括:(1)含0.5%YE和0.1%5-苯氧基戊酸的M9液态培养基,和(2)含0.5%PP和0.1%5-苯氧基戊酸的M9液态培养基。从每种培养基中离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
称重从每种培养基中收集的冻干颗粒并将其悬浮在100毫升氯仿中,在55℃下搅拌20小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤每种萃取溶液并用蒸发器浓缩。在冷却甲醇中再沉淀浓缩的溶液,获得聚合物,在真空、室温下干燥聚合物并称重。所得产率示于表30中。
按与实施例26相同的方法分析制备的PHA组成。发现PHA单体单元含有95%3-羟基-5-苯氧基戊酸单元和5%3-羟基丁酸单元。
结果表明:本发明任一实施方式都能制得高产率的3-羟基-5-苯氧基戊酸单元比例高的PHA。
实施例29
(用菌株H45制备聚-3-羟基-5-苯基戊酸)
将生长在M9琼脂培养基中的菌株YN2的菌落在4种类型的培养基中(每种培养基200毫升)接种,并在30℃下培养24小时,琼脂培养基含0.1%NA,所述类型的培养基包括:(1)含0.5%YE和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,和(2)含0.5%谷氨酸钠(Kishida Kagaku,下文称为SG)和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,(3)含0.5%CA和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,和(4)含0.5%PP和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基。从每种培养基中离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
称重从每种培养基中收集的冻干颗粒并将其悬浮在100毫升氯仿中,在55℃下搅拌20小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤每种萃取溶液并用蒸发器浓缩。在冷却甲醇中再沉淀浓缩的溶液,获得聚合物,在真空、室温下干燥聚合物并称重。所得产率示于表31中。
按与实施例26相同的方法分析制备的PHA组成。发现PHA主要是3-羟基-5-苯基戊酸的均聚物。
结果表明:本发明任一实施方式都能制得高产率的3-羟基-5-苯基戊酸单元比例高的PHA。
实施例30
(用菌株P161制备聚-3-羟基-5-苯基戊酸)
将生长在M9琼脂培养基中的菌株P161的菌落在4种类型的培养基中(每种培养基200毫升)接种,并在30℃下培养24小时,琼脂培养基含0.1%NA,所述类型的培养基包括:(1)含0.5%YE和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,和(2)含0.5%SG和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,(3)含0.5%BE和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基,和(4)含0.5%PP和0.1%5-苯基戊酸的M9液态培养基。从每种培养基中离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
称重从每种培养基中收集的冻干颗粒并将其悬浮在100毫升氯仿中,在55℃下搅拌20小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤每种萃取溶液并用蒸发器浓缩。在冷却甲醇中再沉淀浓缩的溶液,获得聚合物,在真空、室温下干燥聚合物并称重。所得产率示于表32中。
按与实施例26相同的方法分析制备的PHA组成。发现PHA含有97%3-羟基-5-苯基戊酸单元和3%3-羟基丁酸单元。
结果表明:本发明任一实施方式都能制得高产率的3-羟基-5-苯基戊酸单元比例高的PHA。
实施例31
将菊苣假单胞菌菌株YN2在10毫升含0.5%D-葡萄糖的M9培养基中摇动培养,培养温度为30℃,摇动速率为125转/分钟,培养时间为72小时,移出2毫升培养液在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%NO2PxBA的M9培养基中进一步进行摇动培养,培养温度为30℃,摇动速率为125转/分钟,培养时间为72小时。离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养基中,所述培养基含有0.5%D-葡萄糖和0.1%NO2PxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养48小时。离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR在下列条件下分析由此制备的PHA:
<分析器>
FT-NMR:Bruker DPX400
共振频率:1H=400Mhz
<分析条件>
需分析的核素:1H
溶剂:CDCl3
参比值:密封在毛细管中的TMS/CDCl3
温度:室温
图14示出了1H-NMR光谱图,表33示出了光谱图的鉴定结果,表34示出了3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元的组成。正如表33所示的,PHA是用化学式(45)代表的物质,含有3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元。
根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,除了3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元外,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。结果示于表34中。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,转化为聚苯乙烯基准)进行测定,PHA的数均分子量(Mn)为81900,重均分子量(Mw)为226200。
实施例32
将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%NO2PxBA的M9培养基中接种,并在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。45小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养基中,所述培养基含有0.5%D-葡萄糖和0.1%NO2PxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。48小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR在实施例31的条件下分析由此制备的PHA。
结果证实:PHA是含3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元的PHA,如表35所示。
根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和鉴定除3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表35中。
实施例33
将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞在200毫升含0.5%聚胨和0.1%NO2PxBA的M9培养基中接种,并在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。21小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养培养基中,所述培养基含有0.5%丙酮酸钠和0.1%NO2PxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR分析在实施例31的条件下测定获得的PHA。结果证实:PHA是含3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元的PHA,如表36所示。
根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和鉴定除3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表36中。
实施例34
首先将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞在10毫升含0.5%D-葡萄糖的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养,然后移出2毫升培养液加入到200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA的M9培养基中,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。48小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养基中,所述培养基含有0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。47小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR分析在下列条件下测定获得的PHA:
<测定仪器>
FT-NMR:Bruker DPX400
共振频率:1H=400Mhz
<测定条件>
测定核素:1H
测定溶剂:CDCl3
参比值:密封在毛细管中的TMS/CDCl3
测定温度:室温
图15示出了1H-NMR光谱图,表37示出了其相应的结果,表38示出了PHA所含的3-羟基-4-(氰基苯氧基)丁酸单体单元的组成。正如表37所示的,PHA是用化学式(46)代表的物质,含有3-羟基-4-(氰基苯氧基)丁酸单体单元。
另外,根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和鉴定除了3-羟基-4-(硝基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表38中。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:(氯仿,折合聚苯乙烯)测定PHA的分子量,获得Mn=58200,Mw=108100。
实施例35
首先将菊苣假单胞菌菌株H45细胞在10毫升含0.5%D-葡萄糖的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养,然后移出2毫升培养液加入到200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA的M9培养基中,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。48小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养基中,所述培养基含有0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。47小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR分析在实施例34的条件下测定获得的PHA。结果证实:PHA是含3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元的PHA,如表39所示。
根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和除了3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表39中。
实施例36
将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA的M9培养基中接种,并在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。48小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养基中,所述培养基含有0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。48小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR分析在实施例34的条件下测定获得的PHA。结果证实:PHA是含3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元的PHA,如表40所示。
另外,根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和鉴定除3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表40中。
实施例37
将菊苣假单胞菌菌株H45细胞在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA的M9培养基中接种,并在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。48小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养培养基中,所述培养基含有0.5%D-葡萄糖和0.1%CNPxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。48小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR分析在实施例34的条件下测定获得的PHA。结果证实:PHA是含3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元的PHA,如表41所示。
另外,根据常规方法甲醇分解获得的PHA,然后用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和鉴定除3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表41中。
实施例38
将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞在200毫升含0.5%聚胨和0.1%CNPxBA的M9培养基中接种,并在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。23小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养培养基中,所述培养基含有0.5%丙酮酸钠和0.1%CNPxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR分析在实施例34的条件下测定获得的PHA。结果证实:PHA是含3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元的PHA,如表42所示。
另外,根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和鉴定除3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表42中。
实施例39
将菊苣假单胞菌菌株H45细胞在200毫升含0.5%聚胨和0.1%CNPxBA的M9培养基中接种,并在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。23小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升M9培养培养基中,所述培养基含有0.5%丙酮酸钠和0.1%CNPxBA但不含氮源(NH4Cl),进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据NMR分析在实施例34的条件下测定获得的PHA。结果证实:PHA是含3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元的PHA,如表43所示。
另外,根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物和鉴定除3-羟基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸单体单元外的单体单元。结果示于表43中。
实施例40
(合成4-(4-氟苯氧基)丁酸)
按下列合成方法制备一种新型化合物,4-(4-氟苯氧基)丁酸。
向一个有四开口的圆底烧瓶中倒入240毫升无水丙酮,加入15.2克(0.11摩尔)碳酸钾,在氮气氛下搅拌。向该溶液中加入9.0克(0.06摩尔)碘化钠和7.9克(0.07摩尔)4-氟苯酚,在室温、氮气氛下彻底搅拌。然后加入11.7克(0.06摩尔)4-溴乙基丁酸酯,在65℃下回流加热24小时。
在上述反应完成后,用旋转蒸发器除去溶剂丙酮,将其残留物再溶解在氯仿中。加入水进行相分离,收集有机层。用无水硫酸镁脱水有机层后,用旋转蒸发器除去氯仿。然后,用真空泵干燥获得14.0克粗4-(4-氟苯氧基)乙基丁酸酯(气相色谱质谱联用计:GC-MS Shimadzu QP-5050,GC-MS峰比纯度:用EI法为65.2%)。在下列的酯水解反应中使用未经纯化的制成的粗4-(4-氟苯氧基)乙基丁酸。
将制成的粗4-(4-氟苯氧基)乙基丁酸酯溶解在300毫升乙醇-水(1∶9(v/v))的混合溶液中,在冰冷却下(0-4℃)在4小时内,向反应物中加入大约10倍摩尔当量的氢氧化钾。将混合物倒入3升眭0.1摩尔/升盐酸中,使其沉淀。过滤沉淀物,分离,用真空泵进行干燥,获得粗4-(4-氟苯氧基)丁酸。
将所得到的粗4-(4-氟苯氧基)丁酸(沉淀物)溶解在少量的热甲醇中,逐渐冷却到再结晶。用真空泵干燥过滤的再结晶产物,获得目的化合物,4-(4-氟苯氧基)丁酸。在-系列的过程中,按4-溴甲基丁酸酯原料计的产率为52.7%。
为了证实制成的化合物是目的物4-(4-氟苯氧基)丁酸,用下列测定装置在下列测定条件下进行NMR分析,鉴定化合物的结构。
<测定装置>
FT-NMR:Bruker DPX 400
<测定条件>
共振频率:1H 400Mhz
13C 100Mhz
测定核素:1H,13C
使用的溶剂:CDCl3
参比值:毛细管密封的TMS/CDCl3
测定温度:室温
图16和17分别示出了测定的1H-NMR光谱特征和13C-NMR光谱特征。表44和45示出了图16和17示出的NMR光谱每种信号的对应分析结果。对应的分析结果证实所得到的化合物是目的物4-(4-氟苯氧基)丁酸。
实施例41
首先将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞(FERM BP-7375)在10毫升含0.5%D-葡萄糖的M9培养培养基中接种,在30℃下以125转/分钟摇动培养72小时。然后移出2毫升培养液加入到200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA的M9培养基(不含无机氮源,NH4Cl)中,以125转/分钟连续摇动培养。45小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。46小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
根据常规方法甲醇分解获得的PHA,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)进行分析,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。图18示出了测定的GC-MS光谱数据,上部特征示出了GC光谱,下部特征示出了对应于GC光谱上主峰的MS光谱。该结果表明获得的PHA含主要组分3-羟基-4-(4-氟苯氧基)丁酸单体单元,另外,还含有少量的六种单体单元,可以用下列化学式(47)表示。
此外,通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:(氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定PHA的分子量。
表46示出了鉴定结果,平均分子量,以及冻干颗粒的产率和回收的聚合物。表明获得的PHA是含3-羟基-4-(4-氟苯氧基)丁酸(3HpFPxB)单体单元。此外,同样地,萃取的PHA包括主要组分3HpFPxB单元,但是,它们是含多于-种单体单元组分的混合物,所述单体单元选自由3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二碳烯酸组成的组。测定的分子量(按数均分子量计)为Mn=42400,另一方面,Mw=90600(按重均分子量计)。
按与实施例40相同的测定装置和测定条件通过NMR分析测定PHA。测定的1H-NMR光谱特征示于图19。表47示出了图19所示的NMR光谱主峰各种信号的对应分析结果。该对应的分析结果证实获得的PHA含主要组分3HpFPxB单元。
实施例42
将菊苣假单胞菌菌株H45细胞;FERM BP-7374在10毫升含0.5%D-葡萄糖的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟摇动培养72小时。然后移出2毫升培养液加入到200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA的M9培养基中,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。45小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在含有0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。46小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA,萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表48中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA是含3HpFPxB单体单元的PHA。萃取的PHA主要由主要组分3HpFPxB组成。认为是含多于一种化合物的混合物,所述化合物选自由3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二碳烯酸组成的组。
实施例43
将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。96小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在200毫升含有0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。64小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表49中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA主要含3HpFPxB单体单元的PHA。
实施例44
将菊苣假单胞菌菌株H45细胞在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。96小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在200毫升含有0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。64小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表50中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA主要含3HpFPxB单体单元的PHA。
实施例45
将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在200毫升含有0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表51中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA主要含3HpFPxB单体单元的PHA。
实施例46
将菊苣假单胞菌菌株H45细胞在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在200毫升含有0.5%D-葡萄糖和0.1%pFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表52中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA主要含3HpFPxB单体单元的PHA。
实施例47
(合成4-(3-氟苯氧基)丁酸)
按下列合成方法制备一种新型化合物,4-(3-氟苯氧基)丁酸。
向一个有四颈圆底烧瓶中倒入240毫升无水丙酮,加入15.2克(0.11摩尔)碳酸钾,在氮气氛下搅拌。向该溶液中加入9.0克(0.06摩尔)碘化钠和7.9克(0.07摩尔)3-氟苯酚,在室温、氮气氛下彻底搅拌混合物。然后加入11.7克(0.06摩尔)4-溴乙基丁酸酯,在65℃下回流加热24小时。
在上述反应完成后,用旋转蒸发器蒸馏掉溶剂丙酮,将其残留物溶解在氯仿中。加入水进行相分离,收集有机层。用无水硫酸镁脱水有机层后,用旋转蒸发器蒸馏掉氯仿。然后,用真空泵干燥获得14.0克粗4-(3-氟苯氧基)乙基丁酸酯(纯度87.9%,GC-MS峰比,采用气相色谱质谱联用计:GC-MS ShimadzuQP-5050,按EI方法测定)。接着对获得的未经纯化的粗4-(3-氟氧基)乙基丁酸酯进行酯水解。
将3.0克由此获得的粗酯溶解在100毫升乙醇-水(1∶9(v/v))的混合溶液中,向反应物中加入大约10倍过摩尔当量的氢氧化钾,使混合物在室温下反应4小时。将反应混合物倒入200毫升0.1摩尔/升盐酸水溶液中,使其沉淀。过滤沉淀物,分离,用真空泵进行干燥,获得粗4-(4-氟苯氧基)丁酸。
将由此获得的粗4-(3-氟苯氧基)丁酸(沉淀物)溶解在少量的热甲醇中,逐渐冷却到再结晶。用真空泵干燥过滤的再结晶产物,获得目的化合物,4-(3-氟苯氧基)丁酸。
用3.0克粗酯获得的4-(3-氟苯氧基)丁酸的产率为2.4克。整个过程中按4-溴甲基丁酸酯原料计的总产率为93.2%。
为了证实目的化合物4-(3-氟苯氧基)丁酸,用下列测定装置和下列测定条件进行NMR分析,鉴定获得的化合物的结构。
<测定装置>
FT-NMR:Bruker DPX 400
<测定条件>
共振频率:1H 400MHZ
13C 100MHZ
测定核素:1H和13C
使用的溶剂:CDCl3
参比值:毛细管密封的TMS/CDCl3
测定温度:室温
图20和21分别示出了测定的1H-NMR光谱特征和13C-NMR光谱特征。表53和54示出了图20和21示出的NMR光谱每种信号的对应分析结果。根据该分析结果(测量),证实获得的化合物是目的物4-(3-氟苯氧基)丁酸。
实施例48
将菊苣假单胞菌菌株YN2细胞(FERM BP-7375)在10毫升含0.5%D-葡萄糖的M9培养培养基中接种,在30℃下以125转/分钟摇动培养72小时。然后移出2毫升培养液加入到200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA的M9培养基中,以125转/分钟连续摇动培养。45小时后,离心收集细胞,并将其再悬浮在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA但不含无机氮源,NH4Cl的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。47小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
将由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定PHA单体单元的甲基酯化产物。图22示出了测定的GC-MS光谱数据,上部特征示出了GC光谱,下部特征示出了对应于GC光谱上主峰的MS光谱。该结果表明获得的PHA含主要组分3-羟基-4-(3-氟苯氧基)丁酸(3HmFPxB)单体单元,另外,还含有少量的6种单体单元,可以用下列化学式(48)表示。
此外,通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:(氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定PHA的分子量。
表55示出了鉴定结果,平均分子量,以及冻干颗粒的产率和回收的聚合物。表明获得的PHA是含3-羟基-4-(3-氟苯氧基)丁酸(3HmFPxB)单体单元。此外,同样地,萃取的PHA包括主要组分3HmFPxB单元,认为它们是含多于一种单体单元组分的混合物,所述单体单元选自由3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二碳烯酸组成的组。测定的分子量为数均分子量Mn=34500和重均分子量Mw=75200。
按与实施例47相同的测定装置和测定条件通过NMR分析测定PHA。测定的1H-NMR光谱特征示于图23。表56示出了图23所示的NMR光谱主峰各种信号的对应分析结果(测量)。根据分析结果(测量),证实获得的化合物含主要组分3HmFPxB单元。
实施例49
将菊苣假单胞菌菌株H45细胞;FERM BP-7374在10毫升含0.5%D-葡萄糖的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟摇动培养72小时。然后移出2毫升培养液加入到200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA的M9培养基中,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。45小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在含有0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。47小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimdzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表57中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA是含3HmFPxB单体单元的PHA。萃取的PHA主要由主要组分3HmFPxB组成,认为是含多于一种化合物的混合物,所述化合物选自由3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二碳烯酸组成的组。
实施例50
将菊苣假单胞菌H45在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。96小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在200毫升含有0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。64小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元,表58中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA主要含3HmFPxB单体单元的PHA。
实施例51
将菊苣假单胞菌YN2在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在200毫升含有0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱聪联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表59中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA主要含3HmFPxB单体单元的PHA。
实施例52
将菊苣假单胞菌H45在200毫升含0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,并将其再悬浮在200毫升含有0.5%D-葡萄糖和0.1%mFPxBA但不含无机氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟摇合培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。萃取后,用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物。然后仅回收沉淀物并真空干燥获得PHA。
对由此获得的PHA进行甲醇分解,用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析产物,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表60中示出了鉴定结果,获得的重量和冻干颗粒的产率。由此获得的PHA主要含3HmFPxB单体单元的PHA。
实施例53
<用菌株YN2制备含HFPxV的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%聚胨(Wzko纯化学股份有限公司)和0.1%5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。27小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,然后称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(G(-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表61中示出了细菌细胞和聚合物的产率,分子量和单体单元的分析结果。按GC-MS总离子色谱的面积比(TIC)计算单体单元的比例。由3-羟基丁酸甲酯和3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯的GC-MS获得的光谱示于图24和25中。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-(4-氟苯氧基)戊酸制备含3-羟基5-(4-氟苯氧基)戊酸的PHA共聚物。
实施例54
<用菌株YN2制备含HFPV的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%聚胨(Wzko纯化学股份有限公司)和0.1%5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。27小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,然后称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表62中示出了细菌细胞和聚合物的产率,分子量和单体单元的分析结果。按GC-MS总离子色谱的面积比(TIC)计算单体单元的比例。由3-羟基丁酸甲酯和3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯的GC-MS获得的光谱示于图26和27中。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-(4-氟苯氧基)戊酸制备含3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的PHA共聚物。
实施例55
<用菌株YN2制备含HFPxV的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,将它们再悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%FPxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,然后进一步在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。62小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并冻干。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表63中示出了细菌细胞和聚合物的产率,分子量和单体单元的分析结果。由3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯和3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯(3HFPxV)的GC-MS测定获得的质谱示于图28-30中。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-(4-氟苯氧基)戊酸制备含3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)的PHA共聚物。
实施例56
<用菌株YN2制备含HFPV的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,将它们再悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,然后进一步在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。62小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表64中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯和3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯的GC-MS获得的质谱示于图31-33中。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-(4-氟苯基)戊酸制备含3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)的PHA共聚物。
实施例57
<用菌株YN2制备含HFPV单元和HGPxV的PHA(采用葡萄糖二步培养)>
分别制备含0.5%葡萄糖和0.1%5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA),和含0.5%葡萄糖和0.1%5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的两种M9培养基。将菌株YN2在200毫升的各种M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。94小时后,离心收集培养的细胞,将这两种培养液一起再悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖,0.1%FPVA和0.1%FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,然后进一步在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表65中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由GC-MS测定获得的3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)甲酯和3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)甲酯的GC-MS获得的质谱示于图34-37中。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-(4-氟苯基)戊酸和5-(4-氟苯氧基)戊酸制备含3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)单元和3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的PHA共聚物。
实施例58
<用菌株YN2制备含HPxN,HPxHp单元和HPxV的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%聚胨(Wako纯化学股份有限公司)和0.1%11-苯氧基十一烷酸(PxUDA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。64小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在室温(23℃)下搅拌72小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA,然后称重PHA。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表66中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基-辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯,3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的GC-MS获得的质谱示于图38-43中。
结果表明可用菌株YN2和培养基11-苯氧基十一烷酸制备含3-羟基-5苯氧基戊酸(3HPxV),3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)三种单元的PHA共聚物。
实施例59
<用菌株YN2制备含HPxN单元,HPxHP单元和HPxV单元的PHA(采用葡萄糖两步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%11-苯氧基十一癸酸(PxUDA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。64小时后,离心收集培养的细胞,并将它们再悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%PxUDA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,然后称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表67中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基己酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基十二烷酸甲酯,3-羟基十二碳烯酸甲酯,3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯,3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的GC-MS获得的质谱示于图44-52中。
结果表明可用菌株YN2和培养基11-苯氧基十一烷酸制备含3-羟基-5苯氧基戊酸(3HPxV),3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)三种单元的PHA共聚物。
实施例60
<用菌株H45制备含HPxN单元,HPxHp单元和HPxV单元的PHA(采用葡萄糖两步培养)>
将菌株H45在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%11-苯氧基十一烷酸(PxUDA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。64小时后,离心收集培养的细胞,将它们再悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%PxUDA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,然后进一步在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,然后称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表68中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基己酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基-十二烷酸甲酯,3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯,3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的GC-MS获得的质谱示于图53-61中。
结果表明可用菌株YN2和培养基11-苯氧基十一烷酸制备含3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV),3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)三种单元的PHA共聚物。
实施例61
<用菌株YN2制备含HPxO单元,HPxHx单元和HPxB单元的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%聚胨(Wako纯化学股份有限公司)和0.1%8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯拐和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表69中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯,3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的GC-MS获得的质谱示于图62-65中。
结果表明可用菌株YN2和培养基8-苯氧基辛酸制备含3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB),3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)三种单元的的PHA共聚物。
实施例62
<用菌株H45制备含HPxO单元,HPxHx单元和HPxB单元的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株H45在200毫升含0.5%聚胨(Wako纯化学股份有限公司)和0.1%8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表70中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯,3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)进行和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的GC-MS获得的质谱示于图66-69中。
结果表明可用菌株H45和培养基8-苯氧基辛酸制备含3-强击机-4-苯氧基丁酸(3HPxB),3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的PHA共聚物。
实施例63
<用菌株YN2制备含HPxO单元,HPxHx单元和HPxB单元的PHA(采用葡萄糖一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。48小时后,离心收集细胞,将它们再悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%PxOA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,然后进一步在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表71中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯,3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯和3-羟基-8-苯氧基辛酸甲酯的GC-MS获得的质谱示于图70-75中。
结果表明可用菌株YN2和培养基8-苯氧基辛酸制备含3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB),3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)三种单元的PHA共聚物。
实施例64
<用菌株H45制备含HPxO单元,HPxHx单元和HPxB单元的PHA(采用葡萄糖两步培养)>
将菌株H45在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。48小时后,离心收集培养的细菌细胞,将它们再悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%PxOA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,然后进一步在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。24小时后,离心收集培养的细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表72中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基己酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基十二烷酸甲酯,3-羟基十二碳烯酸甲酯,3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯,3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯和3-羟基-8-苯氧基辛酸甲酯的GC-MS获得的质谱示于图76-84中。
结果表明可用菌株H45和培养基8-苯氧基辛酸制备含3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB),3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的PHA共聚物。
实施例65
<用菌株YN2制备含HPxHp单元和HPxV单元的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%聚胨(Wako纯化学股份有限公司)和0.1%7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。64小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表73中示出了细菌细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS获得的质谱示于图85-89中。
结果表明可用菌株H45和培养基7-苯氧基庚酸制备含3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的PHA共聚物。
实施例66
<用菌株H45制备含HPxHp单元和HPxV单元的PHA(采用聚胨一步培养)>
将菌株H45在200毫升含0.5%聚胨(Wako纯化学股份有限公司)和0.1%7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。64小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥和称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC,Toso HCL-8020,柱:聚合物实验PLGEL MICED-C(5微米),溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分。将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表74中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图90-92示出了分别由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株H45和培养基7-苯氧基庚酸制备含3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的PHA共聚物。
实施例67
<用菌株YN2制备含HPxHp单元和HPxV单元的PHA(采用葡萄糖两步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。64小时后,离心收集细胞,将它们在悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%PxHpA但不含氮源(MH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟培养,24小时后,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC,Toso/HCL-8020,柱:聚合物实验/PLGEL/MICED-C/5微米,溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分:将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表75中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图93-100分别示出了由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基己酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基十二烷酸甲酯,3-羟基十二碳烯酸甲酯,3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株YN2和培养基7-苯氧基庚酸制备含3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的PHA共聚物。
实施例68
<用菌株H45制备含HPxHp单元和HPxV单元的PHA(采用葡萄糖两步培养)>
将菌株H45在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。64小时后,离心收集细胞,将它们在悬浮在200毫升含0.5%葡萄糖和0.1%PxpA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟培养,24小时后,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,然后称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso/HCL-8020,柱:聚合物实验/PLGEL/MICED-C/5微米,溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分:将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表76中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图101-107分别示出了由3-羟基己酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基十二烷酸甲酯,3-羟基十二碳烯酸甲酯,3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株H45和培养基7-苯氧基庚酸制备含3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)两种单元的PHA共聚物。
实施例69
<用菌株YN2制备含PHPxV单元的PHA(采用苹果酸钠两步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%苹果酸钠和0.1%5-苯氧基戊酸(PxVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。60小时后,离心收集细胞,将它们在悬浮在200毫升含0.5%苹果酸钠和0.1%PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟培养,24小时后,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC,Toso/HCL-8020,柱:聚合物实验/PLGEL/MICED-C/5微米,溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分:将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表77中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图103-114分别示出了由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基己酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基十二烷酸甲酯,3-羟基十二碳烯酸甲酯和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-苯氧基戊酸制备含3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)单元的PHA共聚物。
实施例70
<用菌株H45制备含HPxV单元的PHA(采用苹果酸钠两步培养)>
将菌株H45在200毫升含0.5%苹果酸钠和0.1%5-苯氧基戊酸(PxVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。60小时后,离心收集细胞,将它们在悬浮在200毫升含0.5%苹果酸钠和0.1%PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟培养,24小时后,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso/HCL-8020,柱:聚合物实验/PLGEL/MICED-C/5微米,溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分折获得的聚合物的单元组分:将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表78中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图115-120分别示出了由3-羟基己酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯,3-羟基十二烷酸甲酯,3-羟基十二碳烯酸甲酯和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株H45和培养基5-苯氧基戊酸制备含3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)单元的PHA共聚物。
实施例71
<用菌株YN2制备含HPV单元的PHA(采用果糖两步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%果糖和0.1%5-苯基戊酸(PVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。120小时后,离心收集细胞,将它们在悬浮在200毫升含0.5%果糖和0.1%PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟培养,50小时后,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso/HCL-8020,柱:聚合物实验/PLGEL/MICED-C/5微米,溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分:将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元,表79中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图121-123分别示出了由3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯和3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-苯基戊酸制备含3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)单元的PHA共聚物。
实施例72
<用菌株YN2制备含HPV单元的PHA(采用甘露糖两步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%甘露糖和0.1%5-苯基戊酸(PVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。43小时后,离心收集细胞,将它们在悬浮在200毫升含0.5%甘露糖和0.1%PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟培养,91小时后,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC,Toso/HCL-8020,柱:聚合物实验/PLGEL/MICED-C/5微米,溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分:将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表80中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图124-125分别示出了由3-羟基辛酸甲酯和3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-苯基戊酸制备含3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)单元的PHA共聚物。
实施例73
<用菌株YN2制备含HPV单元的PHA(采用乳酸两步培养)>
将菌株YN2在200毫升含0.5%乳酸钠和0.1%5-苯基戊酸(PVA)的M9培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。46小时后,离心收集细胞,将它们在悬浮在200毫升含0.5%乳酸钠和0.1%PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培养基中,进一步在30℃下以125转/分钟培养,28小时后,用冷却甲醇洗涤一次,冻干并称重。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升氯仿中,在60℃下搅拌24小时萃取聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得聚合物,称重聚合物。
通过凝胶渗透色谱(GPC;Toso/HCL-8020,柱:聚合物实验/PLGEL/MICED-C/5微米,溶剂:氯仿,折合成聚苯乙烯分子量)测定获得的聚合物的分子量。
按下列方法分析获得的聚合物的单元组分:将5毫克聚合物试样倒入25毫升圆底烧瓶中,加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3%,v/v)的甲醉。在100℃下回流混合物3.5小时,进一步加水进行分离。借助于气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050,柱:DB-WAXETR(J&W Inc.),EI方法)分析有机层,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。表81中示出了细胞和聚合物的产率,单体单元的分析结果。此外,图126-129分别示出了由3-羟基丁酸甲酯,3-羟基辛酸甲酯,3-羟基癸酸甲酯和3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的GC-MS获得的质谱。
结果表明可用菌株YN2和培养基5-苯基戊酸制备含3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)单元的PHA共聚物。
实施例74
<用菌株YN2制备含HPxB单元的PHA(采用苹果酸二钠两步培养)>
将菊苣假单胞菌菌株YN2在200毫升的5种类型的M9培养培养基中接种,每种培养培养基分别含0.1%4-苯氧基-正丁酸(PxBA)和任一种0.5%苹果酸二钠半水合物,L-谷氨酸钠一水合物,D(+)-葡萄糖和正壬酸和聚胨(NihonSeiyaku),在30℃下以125转/分钟进行摇动培养。48小时后,离心收集细胞,用冷却甲醇洗涤一次并真空干燥。
将这5种颗粒分别悬浮在20毫升氯仿中,在60℃下搅拌20小时萃取PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤萃取溶液,用旋转蒸发器浓缩滤液,在冷却甲醇中再沉淀浓缩物,回收沉淀物,真空干燥获得PHA。在按常规方法进行甲醇水解后,采用气相色谱质谱联用计(GC-MS,Shimadzu QP-5050;EI方法)分析获得的PHAs,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。结果在用苹果酸二钠作为生长碳源的情况下,如表82所示,获得高产率的含高比例3-羟基-4-苯氧基-正丁酸(3HPxB)单元,由4-苯氧基-正丁酸产生的所需单元,此外,表83示出了在用苹果酸二钠情况下细胞和聚合物的产率,聚合物的组成。
实施例75
<用菌株YN2制备含HPxB单元的PHA(采用苹果酸二钠两步培养:大量培养)>
将菊苣假单胞菌菌株YN2在200毫升含0.5%酵母提取物(OrientalYeast Industries)的M9培养培养基中接种,在30℃下以125转/分钟进行摇动培养作为种子培养物。在盛有5升M9培养基和50毫升种子细胞的10升振动发酵罐中接种并在2.5升/分钟通风、30℃下以80转/分钟进行摇动培养,所述M9培养基含有0.5%苹果酸二钠半水合物和0.1%4-苯氧基-正丁酸。39小时后,离心收集细胞。将该颗粒悬浮在120毫升大约1.7%次氯酸钠溶液中,在4℃下摇动2小时萃取PHA。离心收集PHA,干燥获得56毫克PHA/升培养培养基。
在按常规方法进行甲醇水解后,采用气相色谱质谱联用计(GC-MS,ShimadzuQP-5050;EI方法)分析获得的PHA,鉴定甲基酯化的PHA单体单元。结果用4-苯氧基-正丁酸产生的所要求的单体单元,即3-羟基-4-苯氧基-正丁酸单元的组分比例(GC-MS,峰面积比)为99.7%。