JP2001275677A - 核酸断片プライマーまたはプローブ、およびこれを用いたポリヒドロキシアルカノエート合成微生物の検出方法 - Google Patents
核酸断片プライマーまたはプローブ、およびこれを用いたポリヒドロキシアルカノエート合成微生物の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速、簡易かつ特異的に、しかも感度よくポ
リヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成微生物の存
在および優先度を検出する手段の提供。 【解決手段】 ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブ
またはプライマーとして、配列表：１〜９に示す塩基配
列またはその相補的配列に基づき、少なくともその部分
配列を含む核酸断片を用いることで、目的とするＰＨＡ
合成酵素遺伝子を有するＰＨＡ合成微生物を検出する方
法、それに用いるプローブまたはプライマーを提供す
る。
リヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成微生物の存
在および優先度を検出する手段の提供。 【解決手段】 ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブ
またはプライマーとして、配列表：１〜９に示す塩基配
列またはその相補的配列に基づき、少なくともその部分
配列を含む核酸断片を用いることで、目的とするＰＨＡ
合成酵素遺伝子を有するＰＨＡ合成微生物を検出する方
法、それに用いるプローブまたはプライマーを提供す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物由来のポリ
ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子Ｄ
ＮＡとハイブリダイズ可能な核酸断片、この核酸断片を
プライマーまたはプローブとして利用して、微生物由来
のＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡを検出する方法、あるい
は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡの塩基配列を決定する
方法、ならびに、前記微生物由来のＰＨＡ合成酵素遺伝
子ＤＮＡの検出により、ＰＨＡ合成能を有する微生物の
検出またはスクリーニングを行う方法に関するものであ
る。
ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子Ｄ
ＮＡとハイブリダイズ可能な核酸断片、この核酸断片を
プライマーまたはプローブとして利用して、微生物由来
のＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡを検出する方法、あるい
は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡの塩基配列を決定する
方法、ならびに、前記微生物由来のＰＨＡ合成酵素遺伝
子ＤＮＡの検出により、ＰＨＡ合成能を有する微生物の
検出またはスクリーニングを行う方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】これまで、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸
（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に
蓄積するＰＨＡ合成能を有する微生物に関して、多くの
報告がなされている（「生分解性プラスチックハンドブ
ック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・
ティー・エス，Ｐ１７８−１９７）。これらＰＨＡなど
の微生物産生ポリマーは、従来の化学合成によるプラス
チックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利
用することができる。さらに、ＰＨＡなどの微生物産生
ポリマーは、本来、生分解性であるがゆえに、自然界で
微生物により完全分解されるという利点を有している。
従って、従来用いられてきた、多くの合成高分子化合物
のように、廃棄した際、自然環境に残留して、環境汚染
を引き起こす懸念がない。また、微生物産生ＰＨＡの多
くは、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等と
しての応用も期待されている。
（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に
蓄積するＰＨＡ合成能を有する微生物に関して、多くの
報告がなされている（「生分解性プラスチックハンドブ
ック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・
ティー・エス，Ｐ１７８−１９７）。これらＰＨＡなど
の微生物産生ポリマーは、従来の化学合成によるプラス
チックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利
用することができる。さらに、ＰＨＡなどの微生物産生
ポリマーは、本来、生分解性であるがゆえに、自然界で
微生物により完全分解されるという利点を有している。
従って、従来用いられてきた、多くの合成高分子化合物
のように、廃棄した際、自然環境に残留して、環境汚染
を引き起こす懸念がない。また、微生物産生ＰＨＡの多
くは、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等と
しての応用も期待されている。
【０００３】このような微生物産生ＰＨＡは、その生産
を行う微生物の種類、また、微生物の培養に用いる培地
組成、培養条件等により、その組成や構造が様々に変化
することも報告されている。これまで、主にＰＨＡの物
性の改良を図るという目的で、前記する手段を利用し
て、産生されるＰＨＡの組成や構造を制御する方法の研
究がなされてきた。
を行う微生物の種類、また、微生物の培養に用いる培地
組成、培養条件等により、その組成や構造が様々に変化
することも報告されている。これまで、主にＰＨＡの物
性の改良を図るという目的で、前記する手段を利用し
て、産生されるＰＨＡの組成や構造を制御する方法の研
究がなされてきた。
【０００４】例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス
・Ｈ１６株（Alcaligenes eutropusH16， ATCC No.1769
9）ならびにその変異株は、その培養時の炭素源を変化
させることによって、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と
３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）との共重合体を様々な
組成比で生産することが報告されている（特表平６−１
５６０４号公報、特表平７−１４３５２号公報、特表平
８−１９２２７号公報等）。
・Ｈ１６株（Alcaligenes eutropusH16， ATCC No.1769
9）ならびにその変異株は、その培養時の炭素源を変化
させることによって、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と
３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）との共重合体を様々な
組成比で生産することが報告されている（特表平６−１
５６０４号公報、特表平７−１４３５２号公報、特表平
８−１９２２７号公報等）。
【０００５】また、特許公報第２６４２９３７号では、
シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ２９３４７
株（Pseudomonas oleovorans ATCC29347）に、炭素源と
して非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数
が６から１２までの３−ヒドロキシアルカノエートをモ
ノマーユニットとするＰＨＡを生産することが開示され
ている。
シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ２９３４７
株（Pseudomonas oleovorans ATCC29347）に、炭素源と
して非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数
が６から１２までの３−ヒドロキシアルカノエートをモ
ノマーユニットとするＰＨＡを生産することが開示され
ている。
【０００６】特開平５−７４４９２号公報では、メチロ
バクテリウム属（Methylobacteriumsp.）、パラコッカ
ス属（Paracoccus sp.）、アルカリゲネス属（Alcalige
nessp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）の微
生物を、炭素数３から７の第一級アルコールに接触させ
ることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させ
る方法が開示されている。
バクテリウム属（Methylobacteriumsp.）、パラコッカ
ス属（Paracoccus sp.）、アルカリゲネス属（Alcalige
nessp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）の微
生物を、炭素数３から７の第一級アルコールに接触させ
ることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させ
る方法が開示されている。
【０００７】特開平５−９３０４９号公報および特開平
７−２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビエ
（Aeromonas caviae）を、オレイン酸やオリーブ油を炭
素源として培養することにより、３ＨＢと３−ヒドロキ
シヘキサン酸（３ＨＨｘ）の２成分共重合体を生産する
ことが開示されている。
７−２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビエ
（Aeromonas caviae）を、オレイン酸やオリーブ油を炭
素源として培養することにより、３ＨＢと３−ヒドロキ
シヘキサン酸（３ＨＨｘ）の２成分共重合体を生産する
ことが開示されている。
【０００８】特開平９−１９１８９３号公報では、コマ
モナス・アシドボランス・ＩＦＯ１３８５２株（Comamo
nas acidovorans IFO13852）が、炭素源としてグルコン
酸および１，４−ブタンジオールを用いた培養により、
３ＨＢと４−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持
つポリエステルを生産することが開示されている。
モナス・アシドボランス・ＩＦＯ１３８５２株（Comamo
nas acidovorans IFO13852）が、炭素源としてグルコン
酸および１，４−ブタンジオールを用いた培養により、
３ＨＢと４−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持
つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００９】さらに、ある種の微生物では、様々な置換
基、例えば、不飽和炭化水素、エステル基、アリール基
（芳香環基）、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキ
シド等が導入されたＰＨＡを生産することが報告されて
おり、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性
改良を目指す試みもなされ始めている。例えば、Ｍａｋ
ｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９１，１９５７−１９６
５，１９９０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，
５２５６−５２６０，１９９１、Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，
３，４９２−４９４，１９９１等では、シュードモナス
・オレオボランスが３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸（３ＨＰＶ）をモノマーユニットとして含むＰＨＡを
生産することが報告されており、３ＨＰＶが含まれるこ
とに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認めら
れている。
基、例えば、不飽和炭化水素、エステル基、アリール基
（芳香環基）、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキ
シド等が導入されたＰＨＡを生産することが報告されて
おり、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性
改良を目指す試みもなされ始めている。例えば、Ｍａｋ
ｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９１，１９５７−１９６
５，１９９０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，
５２５６−５２６０，１９９１、Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，
３，４９２−４９４，１９９１等では、シュードモナス
・オレオボランスが３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸（３ＨＰＶ）をモノマーユニットとして含むＰＨＡを
生産することが報告されており、３ＨＰＶが含まれるこ
とに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認めら
れている。
【００１０】上述するように、多くの微生物がポリ−３
−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを
生産し、菌体内に蓄積することが報告されいるが、微生
物が産生するＰＨＡの特性は、ＰＨＡ合成微生物の多様
性に依るところが大きい。従って、ＰＨＡ合成能の多様
性を示す、種々のＰＨＡ合成微生物を検出し、さらにこ
れらの検出されたＰＨＡ合成微生物多数から、目的とす
るＰＨＡ合成能を示す菌株を効率良くスクリーニングす
ることが必要となる。
−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを
生産し、菌体内に蓄積することが報告されいるが、微生
物が産生するＰＨＡの特性は、ＰＨＡ合成微生物の多様
性に依るところが大きい。従って、ＰＨＡ合成能の多様
性を示す、種々のＰＨＡ合成微生物を検出し、さらにこ
れらの検出されたＰＨＡ合成微生物多数から、目的とす
るＰＨＡ合成能を示す菌株を効率良くスクリーニングす
ることが必要となる。
【００１１】その際、ＰＨＡ合成微生物の検出あるいは
スクリーニングを行う手段として、従来から幾つかの方
法を利用されている。ＰＨＡ合成能を直接的に検証する
手段としては、種々の分離培養法が用いられている。一
般的には、特別な培地、例えば、特定の基質のみを添加
した培地による選択培養を行うことが多い。この選択培
養の方法は、簡便であるため広く用いられるが、目的と
するＰＨＡ合成能を有する菌株のみが必ずしも選択され
るとは限らない。すなわち、分離培養法における、ＰＨ
Ａ合成の有無を調べる方法としては、例えば、スダンブ
ラックＢにより染色する方法（Archives of Biotechnol
ogy，７１巻，２８３頁，１９７０年）、位相差顕微鏡
によりＰＨＡの蓄積を調べる方法などが用いられてい
る。しかしながら、ＰＨＡ合成能を示す菌以外にも、ス
ダンブラックＢにより染色される他の菌が存在する可能
性もあり、厳密にはこの染色のみをその指標とすること
はできない。
スクリーニングを行う手段として、従来から幾つかの方
法を利用されている。ＰＨＡ合成能を直接的に検証する
手段としては、種々の分離培養法が用いられている。一
般的には、特別な培地、例えば、特定の基質のみを添加
した培地による選択培養を行うことが多い。この選択培
養の方法は、簡便であるため広く用いられるが、目的と
するＰＨＡ合成能を有する菌株のみが必ずしも選択され
るとは限らない。すなわち、分離培養法における、ＰＨ
Ａ合成の有無を調べる方法としては、例えば、スダンブ
ラックＢにより染色する方法（Archives of Biotechnol
ogy，７１巻，２８３頁，１９７０年）、位相差顕微鏡
によりＰＨＡの蓄積を調べる方法などが用いられてい
る。しかしながら、ＰＨＡ合成能を示す菌以外にも、ス
ダンブラックＢにより染色される他の菌が存在する可能
性もあり、厳密にはこの染色のみをその指標とすること
はできない。
【００１２】そのため、スダンブラックＢ染色法で選別
した菌株個々について、さらに、詳細な形態学的、ある
いは生化学的な性状を検査する必要がある。形態学的、
あるいは生化学的な性状に基づき、目的とする菌を検
出、選抜するには、熟練と経験を要し、しかも、その手
法自体、手順が煩雑であり、また時間がかかる。このよ
うに、スダンブラックＢ染色法を基礎とする菌の選択
は、種々の実用面での問題を含むものである。また同様
に、位相差顕微鏡によりＰＨＡの蓄積を調べる方法も、
ＰＨＡ蓄積の判定には熟練と経験を要し、その確度に問
題があり、加えて、手法が煩雑であることも、実用上の
大きな課題である。
した菌株個々について、さらに、詳細な形態学的、ある
いは生化学的な性状を検査する必要がある。形態学的、
あるいは生化学的な性状に基づき、目的とする菌を検
出、選抜するには、熟練と経験を要し、しかも、その手
法自体、手順が煩雑であり、また時間がかかる。このよ
うに、スダンブラックＢ染色法を基礎とする菌の選択
は、種々の実用面での問題を含むものである。また同様
に、位相差顕微鏡によりＰＨＡの蓄積を調べる方法も、
ＰＨＡ蓄積の判定には熟練と経験を要し、その確度に問
題があり、加えて、手法が煩雑であることも、実用上の
大きな課題である。
【００１３】これらＰＨＡ合成自体を判定して、ＰＨＡ
合成能の有無を検出する方法に代わる手法として、ＰＨ
Ａ合成に係わるＰＨＡ合成酵素遺伝子の有無を検出する
方法が考えらる。すなわち、ＰＨＡ合成酵素遺伝子に特
異的な核酸の塩基配列を、それに相補的な塩基配列を持
つオリゴヌクレオチドプライマーあるいはプローブを利
用して検出し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を持つ菌株のみを
選別する方法が考えられる。
合成能の有無を検出する方法に代わる手法として、ＰＨ
Ａ合成に係わるＰＨＡ合成酵素遺伝子の有無を検出する
方法が考えらる。すなわち、ＰＨＡ合成酵素遺伝子に特
異的な核酸の塩基配列を、それに相補的な塩基配列を持
つオリゴヌクレオチドプライマーあるいはプローブを利
用して検出し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を持つ菌株のみを
選別する方法が考えられる。
【００１４】ＰＨＡ合成酵素遺伝子については、既にい
くつかの菌株でその塩基配列が解明され、報告されてい
る（Peoples, O. P. and Sinskey,A. J., J. Biol. Che
m.,264, 15293 (1989)；Huisman, G. W. et al., J. Bi
ol. Chem., 266, 2191 (1991)；Pieper,U. et al., FEM
S Microbiol. Lett., 96, 73 (1992)；Timm, A. andSte
inbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15 (1992)；Ma
tsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6459 (199
8)）。また、これら既知の塩基配列を参照して、保存度
の高い領域を選択し、オリゴヌクレオチドを設計した例
としては、Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Bi
ochem., 209, 15 (1992)により報告された配列が挙げら
れる。
くつかの菌株でその塩基配列が解明され、報告されてい
る（Peoples, O. P. and Sinskey,A. J., J. Biol. Che
m.,264, 15293 (1989)；Huisman, G. W. et al., J. Bi
ol. Chem., 266, 2191 (1991)；Pieper,U. et al., FEM
S Microbiol. Lett., 96, 73 (1992)；Timm, A. andSte
inbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15 (1992)；Ma
tsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6459 (199
8)）。また、これら既知の塩基配列を参照して、保存度
の高い領域を選択し、オリゴヌクレオチドを設計した例
としては、Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Bi
ochem., 209, 15 (1992)により報告された配列が挙げら
れる。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】上述するように、ＰＨ
Ａ合成微生物を効率よく検出し、さらに目的とするＰＨ
Ａ合成能を有する菌株をスクリーニングするためには、
その微生物の土壌中での存在および優占度や生育状況を
知る必要がある。その際、微生物を特異的に検出、計測
できる方法が必要であるが、従来の検出手段である、ス
ダンブラックＢ染色を利用する選択培地による培養や、
位相差顕微鏡を利用するＰＨＡ合成の判定は、その特異
性、感度、簡便さ、検出およびスクリーニングに要する
時間などの点で実用面で問題が多い。特に、十分な確度
で判定を下すには、熟練と経験を要するため、ＰＨＡ合
成微生物を効率よく検出およびスクリーニングする手段
としては、必ずしも適するものではなかった。
Ａ合成微生物を効率よく検出し、さらに目的とするＰＨ
Ａ合成能を有する菌株をスクリーニングするためには、
その微生物の土壌中での存在および優占度や生育状況を
知る必要がある。その際、微生物を特異的に検出、計測
できる方法が必要であるが、従来の検出手段である、ス
ダンブラックＢ染色を利用する選択培地による培養や、
位相差顕微鏡を利用するＰＨＡ合成の判定は、その特異
性、感度、簡便さ、検出およびスクリーニングに要する
時間などの点で実用面で問題が多い。特に、十分な確度
で判定を下すには、熟練と経験を要するため、ＰＨＡ合
成微生物を効率よく検出およびスクリーニングする手段
としては、必ずしも適するものではなかった。
【００１６】それに代えて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の有
無を検出する方法は、高い確度を持つ有力な手段と考え
られる。ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブまたは
プライマーの提案はなされているものの、目的とするＰ
ＨＡ合成微生物の検出およびスクリーニング手段として
用いるため、ＰＨＡ合成微生物に選択的かつＰＨＡ合成
微生物に幅広く共通なプローブまたはプライマーの選択
は、現在においても最も困難な課題として存在してい
る。
無を検出する方法は、高い確度を持つ有力な手段と考え
られる。ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブまたは
プライマーの提案はなされているものの、目的とするＰ
ＨＡ合成微生物の検出およびスクリーニング手段として
用いるため、ＰＨＡ合成微生物に選択的かつＰＨＡ合成
微生物に幅広く共通なプローブまたはプライマーの選択
は、現在においても最も困難な課題として存在してい
る。
【００１７】本発明は、前記の課題を解決するもので、
本発明の目的は、迅速、簡易かつ特異的に、しかも感度
よくＰＨＡ合成微生物の存在および優占度を検出する手
段、すなわち、ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブ
またはプライマーとして利用可能であり、ＰＨＡ合成微
生物に対して高い選択性を持ち、また、ＰＨＡ合成微生
物の間では、幅広く共通的に用いることができる核酸断
片の提供、ならびに前記の核酸断片をプローブまたはプ
ライマーとして利用するＰＨＡ合成酵素遺伝子の検出、
ならびにスクリーニングを行う方法の提供を行うことに
ある。加えて、本発明は、前記のＰＨＡ合成酵素遺伝子
の検出に続き、前記の核酸断片をプライマーとして用い
る、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の塩基配列を決定する方法の
提供をも、その目的に含むものである。
本発明の目的は、迅速、簡易かつ特異的に、しかも感度
よくＰＨＡ合成微生物の存在および優占度を検出する手
段、すなわち、ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブ
またはプライマーとして利用可能であり、ＰＨＡ合成微
生物に対して高い選択性を持ち、また、ＰＨＡ合成微生
物の間では、幅広く共通的に用いることができる核酸断
片の提供、ならびに前記の核酸断片をプローブまたはプ
ライマーとして利用するＰＨＡ合成酵素遺伝子の検出、
ならびにスクリーニングを行う方法の提供を行うことに
ある。加えて、本発明は、前記のＰＨＡ合成酵素遺伝子
の検出に続き、前記の核酸断片をプライマーとして用い
る、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の塩基配列を決定する方法の
提供をも、その目的に含むものである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく、従来提案されている塩基配列と比較し
て、ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブまたはプラ
イマーにより適する塩基配列の選択を進めた。また、本
発明者らは、このＰＨＡ合成酵素遺伝子検出は、土壌中
からＰＨＡ合成能を有する新規な微生物を分離する際、
より広い範囲のＰＨＡ合成微生物に対して、そのＰＨＡ
合成酵素遺伝子の存在を検出可能となるように、新たに
プローブまたはプライマーとして利用できる塩基配列の
選択を進めた。その結果、数種の塩基配列を選択し、こ
れらの塩基配列、あるいは、その相補的な塩基配列から
なるＤＮＡ断片は、ＰＨＡ合成能を示す新規な微生物に
対して、その染色体ＤＮＡ中に存在するＰＨＡ合成酵素
遺伝子と高い選択性でハイブリダイズでき、各種のハイ
ブリダイゼーション法に用いるプローブ、あるいは、ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR：Polymerase Chain Reactio
n）によるＰＣＲ増幅産物の採取に用いるプライマーと
なることを見出した。このいずれかの手法を用いること
より、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の存在を極めて高い確度で
検出でき、有効なＰＨＡ合成微生物の検出手段となるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
題を解決すべく、従来提案されている塩基配列と比較し
て、ＰＨＡ合成酵素遺伝子検出用のプローブまたはプラ
イマーにより適する塩基配列の選択を進めた。また、本
発明者らは、このＰＨＡ合成酵素遺伝子検出は、土壌中
からＰＨＡ合成能を有する新規な微生物を分離する際、
より広い範囲のＰＨＡ合成微生物に対して、そのＰＨＡ
合成酵素遺伝子の存在を検出可能となるように、新たに
プローブまたはプライマーとして利用できる塩基配列の
選択を進めた。その結果、数種の塩基配列を選択し、こ
れらの塩基配列、あるいは、その相補的な塩基配列から
なるＤＮＡ断片は、ＰＨＡ合成能を示す新規な微生物に
対して、その染色体ＤＮＡ中に存在するＰＨＡ合成酵素
遺伝子と高い選択性でハイブリダイズでき、各種のハイ
ブリダイゼーション法に用いるプローブ、あるいは、ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR：Polymerase Chain Reactio
n）によるＰＣＲ増幅産物の採取に用いるプライマーと
なることを見出した。このいずれかの手法を用いること
より、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の存在を極めて高い確度で
検出でき、有効なＰＨＡ合成微生物の検出手段となるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】すなわち、本発明の核酸断片は、ＰＨＡ合
成能を有する新規な微生物、その微生物が有するＰＨＡ
合成酵素遺伝子を検出するために、プローブまたはプラ
イマーとして利用できる塩基配列を有する人為的に調製
される核酸断片である。より具体的には、本発明の核酸
断片は、配列番号：１〜９に示す塩基配列、またはその
相補的な塩基配列、あるいは、これらの塩基配列に基づ
き変異が施された改変配列の何れかから選ばれる核酸断
片である。また、プローブまたはプライマーとする際に
は、本発明の核酸断片は、前記の特定の塩基配列を有す
る核酸断片、あるいはその塩基配列中の部分配列からな
る核酸断片からなるプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸断片の形態とされる。
成能を有する新規な微生物、その微生物が有するＰＨＡ
合成酵素遺伝子を検出するために、プローブまたはプラ
イマーとして利用できる塩基配列を有する人為的に調製
される核酸断片である。より具体的には、本発明の核酸
断片は、配列番号：１〜９に示す塩基配列、またはその
相補的な塩基配列、あるいは、これらの塩基配列に基づ
き変異が施された改変配列の何れかから選ばれる核酸断
片である。また、プローブまたはプライマーとする際に
は、本発明の核酸断片は、前記の特定の塩基配列を有す
る核酸断片、あるいはその塩基配列中の部分配列からな
る核酸断片からなるプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸断片の形態とされる。
【００２０】加えて、本発明の核酸断片は、そのハイブ
リダイゼーション特性を維持する範囲で、塩基配列の実
質的な相同性を保ちつつ、若干の変異を有してもよく、
例えば、その非本質的な変異として、配列番号：１〜９
に示す塩基配列、またはその相補的な塩基配列に基づき
施される変異が、塩基配列の一部欠失、余剰な塩基また
は塩基配列の付加、または塩基配列中の塩基または部分
配列を他の塩基あるいは塩基配列により置換、もしく
は、これらの変異を複合して施したものである改変配列
の核酸断片とすることができる。
リダイゼーション特性を維持する範囲で、塩基配列の実
質的な相同性を保ちつつ、若干の変異を有してもよく、
例えば、その非本質的な変異として、配列番号：１〜９
に示す塩基配列、またはその相補的な塩基配列に基づき
施される変異が、塩基配列の一部欠失、余剰な塩基また
は塩基配列の付加、または塩基配列中の塩基または部分
配列を他の塩基あるいは塩基配列により置換、もしく
は、これらの変異を複合して施したものである改変配列
の核酸断片とすることができる。
【００２１】本発明のプライマーは、上記する塩基配列
からなるプライマーとして利用可能な核酸断片を含むプ
ライマーであって、付加的な修飾として、前記核酸断片
の分子上に結合する標識物、または／および固相担体と
結合可能な部位が導入されていてもよい。同じく、本発
明のプローブは、上記する塩基配列からなるプローブと
して利用可能な核酸断片を含むプローブであって、付加
的な修飾として、前記核酸断片の分子上に結合する標識
物、または／および固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていてもよい。
からなるプライマーとして利用可能な核酸断片を含むプ
ライマーであって、付加的な修飾として、前記核酸断片
の分子上に結合する標識物、または／および固相担体と
結合可能な部位が導入されていてもよい。同じく、本発
明のプローブは、上記する塩基配列からなるプローブと
して利用可能な核酸断片を含むプローブであって、付加
的な修飾として、前記核酸断片の分子上に結合する標識
物、または／および固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていてもよい。
【００２２】本発明のプライマーは、例えば、ＰＣＲ増
幅におけるプライマー対に利用でき、その場合には、塩
基配列に実質的な差異のある二種の核酸断片の組み合わ
せからなるプライマーであって、前記二種の核酸断片の
少なくとも一つは上に記載される本発明のプライマー用
核酸断片であり、二種の核酸断片はそれぞれ、その分子
上に標識物、または／および固相担体と結合可能な部位
が導入されていてもよいプライマーとする。
幅におけるプライマー対に利用でき、その場合には、塩
基配列に実質的な差異のある二種の核酸断片の組み合わ
せからなるプライマーであって、前記二種の核酸断片の
少なくとも一つは上に記載される本発明のプライマー用
核酸断片であり、二種の核酸断片はそれぞれ、その分子
上に標識物、または／および固相担体と結合可能な部位
が導入されていてもよいプライマーとする。
【００２３】本発明のプライマーは、前記のＰＣＲ増幅
におけるプライマー対のみでなく、例えば、ｍＲＮＡに
対するｃＤＮＡ調製用のプライマーにも利用できるが、
いずれの用途においても、上記する改変塩基配列のプラ
イマー用核酸断片を利用することもできる。改変塩基配
列のプライマー用核酸断片を利用する場合、用いる上述
する本発明のプライマー用核酸断片の塩基配列は、配列
番号：１〜９に示す塩基配列またはその相補的な塩基配
列に基づき、塩基配列の一部欠失、余剰な塩基または塩
基配列の付加、または塩基配列中の塩基または部分配列
を他の塩基あるいは塩基配列により置換、もしくは、こ
れらの変異を複合して施した改変塩基配列であることを
特徴とするプライマーとすることができる。
におけるプライマー対のみでなく、例えば、ｍＲＮＡに
対するｃＤＮＡ調製用のプライマーにも利用できるが、
いずれの用途においても、上記する改変塩基配列のプラ
イマー用核酸断片を利用することもできる。改変塩基配
列のプライマー用核酸断片を利用する場合、用いる上述
する本発明のプライマー用核酸断片の塩基配列は、配列
番号：１〜９に示す塩基配列またはその相補的な塩基配
列に基づき、塩基配列の一部欠失、余剰な塩基または塩
基配列の付加、または塩基配列中の塩基または部分配列
を他の塩基あるいは塩基配列により置換、もしくは、こ
れらの変異を複合して施した改変塩基配列であることを
特徴とするプライマーとすることができる。
【００２４】本発明のプライマーまたはプローブは、上
述するように付加的な修飾を施すことができる。従っ
て、その際、付加的な修飾が施された核酸断片を少なく
とも一種含み、前記の核酸断片の一種における付加的な
修飾は、標識物または固相担体と結合可能な部位の、核
酸断片の5' 末端側への導入であることを特徴とするプ
ライマーまたはプローブとすることができる。
述するように付加的な修飾を施すことができる。従っ
て、その際、付加的な修飾が施された核酸断片を少なく
とも一種含み、前記の核酸断片の一種における付加的な
修飾は、標識物または固相担体と結合可能な部位の、核
酸断片の5' 末端側への導入であることを特徴とするプ
ライマーまたはプローブとすることができる。
【００２５】例えば、このような付加的な修飾として、
分子上に導入される標識物または固相担体と結合可能な
部位が、ビオチン残基、2,4 - ジニトロフェニル基、ジ
ゴキシゲニン残基のいずれかであることを特徴とするプ
ライマーまたはプローブとすると好ましい。
分子上に導入される標識物または固相担体と結合可能な
部位が、ビオチン残基、2,4 - ジニトロフェニル基、ジ
ゴキシゲニン残基のいずれかであることを特徴とするプ
ライマーまたはプローブとすると好ましい。
【００２６】さらに、本発明のＰＨＡ合成微生物の検出
方法は、上で述べた塩基配列の本発明の核酸断片、プラ
イマーまたはプローブとして利用可能な核酸断片の形
態、ないしは、配列の変異が、塩基配列の一部欠失、余
剰な塩基または塩基配列の付加、または塩基配列中の塩
基または部分配列を他の塩基あるいは塩基配列により置
換、もしくは、これらの変異を複合して施したものであ
る改変配列の核酸断片、これらのいずれかである本発明
による核酸断片の少なくとも一種をプローブとして用い
ることを特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方法とでき
る。あるいは、上で述べた塩基配列の本発明の核酸断
片、プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸断
片の形態、ないしは、配列の変異が、塩基配列の一部欠
失、余剰な塩基または塩基配列の付加、または塩基配列
中の塩基または部分配列を他の塩基あるいは塩基配列に
より置換、もしくは、これらの変異を複合して施したも
のである改変配列の核酸断片、これらのいずれかである
本発明による核酸断片の少なくとも一種をプライマーと
して用いることを特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方
法とすることもできる。
方法は、上で述べた塩基配列の本発明の核酸断片、プラ
イマーまたはプローブとして利用可能な核酸断片の形
態、ないしは、配列の変異が、塩基配列の一部欠失、余
剰な塩基または塩基配列の付加、または塩基配列中の塩
基または部分配列を他の塩基あるいは塩基配列により置
換、もしくは、これらの変異を複合して施したものであ
る改変配列の核酸断片、これらのいずれかである本発明
による核酸断片の少なくとも一種をプローブとして用い
ることを特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方法とでき
る。あるいは、上で述べた塩基配列の本発明の核酸断
片、プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸断
片の形態、ないしは、配列の変異が、塩基配列の一部欠
失、余剰な塩基または塩基配列の付加、または塩基配列
中の塩基または部分配列を他の塩基あるいは塩基配列に
より置換、もしくは、これらの変異を複合して施したも
のである改変配列の核酸断片、これらのいずれかである
本発明による核酸断片の少なくとも一種をプライマーと
して用いることを特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方
法とすることもできる。
【００２７】例えば、本発明のＰＨＡ合成微生物の検出
方法は、先に記載する本発明のプライマーを用い、下記
（１）〜（４）に記載する４工程： （１）ＰＨＡ合成微生物の有無を検出したい試料を準備
する工程 （２）必要に応じて、試料中の菌体の破砕処理を行う工
程 （３）試料中に前記プライマーを加え、プライマーの伸
張反応を行う工程 （４）工程（３）で得られた伸張反応物について検出操
作を行う工程 前記工程（１）、工程（３）、工程（４）と必要に応じ
て工程（２）を含むことを特徴とするＰＨＡ合成微生物
の検出方法とすると好ましい。特に、上に記載する二種
の核酸断片の組み合わせからなるプライマーを用いるこ
とを特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方法として実施
するより好ましい。すなわち、工程（３）のプライマー
の伸張反応がポリメラーゼ連鎖反応によりなされること
を特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方法として実施す
ると一層好ましい。
方法は、先に記載する本発明のプライマーを用い、下記
（１）〜（４）に記載する４工程： （１）ＰＨＡ合成微生物の有無を検出したい試料を準備
する工程 （２）必要に応じて、試料中の菌体の破砕処理を行う工
程 （３）試料中に前記プライマーを加え、プライマーの伸
張反応を行う工程 （４）工程（３）で得られた伸張反応物について検出操
作を行う工程 前記工程（１）、工程（３）、工程（４）と必要に応じ
て工程（２）を含むことを特徴とするＰＨＡ合成微生物
の検出方法とすると好ましい。特に、上に記載する二種
の核酸断片の組み合わせからなるプライマーを用いるこ
とを特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方法として実施
するより好ましい。すなわち、工程（３）のプライマー
の伸張反応がポリメラーゼ連鎖反応によりなされること
を特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方法として実施す
ると一層好ましい。
【００２８】
【発明の実施の形態】本発明の核酸断片は、配列番号：
１〜９に示す塩基配列、またはその相補的な塩基配列を
実質的に保持し、ＰＨＡ合成能を示す微生物各種に対し
て、その染色体ＤＮＡ中に存在するＰＨＡ合成酵素遺伝
子と高い選択性でハイブリダイズできる特性を有するも
のである。配列番号：１〜９に示す塩基配列はいずれ
も、その配列長は、２３〜２７塩基と、おおよそ２５塩
基からなるものである。本発明の核酸断片は、この塩基
配列またはその相補的な塩基配列を実質的に保持する一
本鎖のＤＮＡ分子として、ＰＨＡ合成酵素遺伝子二重鎖
ＤＮＡのいずれかの鎖に選択的にハイブリダイズする。
１〜９に示す塩基配列、またはその相補的な塩基配列を
実質的に保持し、ＰＨＡ合成能を示す微生物各種に対し
て、その染色体ＤＮＡ中に存在するＰＨＡ合成酵素遺伝
子と高い選択性でハイブリダイズできる特性を有するも
のである。配列番号：１〜９に示す塩基配列はいずれ
も、その配列長は、２３〜２７塩基と、おおよそ２５塩
基からなるものである。本発明の核酸断片は、この塩基
配列またはその相補的な塩基配列を実質的に保持する一
本鎖のＤＮＡ分子として、ＰＨＡ合成酵素遺伝子二重鎖
ＤＮＡのいずれかの鎖に選択的にハイブリダイズする。
【００２９】以下に、本発明の核酸断片、そのプローブ
あるいはプライマーとしての利用形態、ならびに、プロ
ーブあるいはプライマーに用いたＰＨＡ合成微生物の検
出方法について、より詳しく説明する。
あるいはプライマーとしての利用形態、ならびに、プロ
ーブあるいはプライマーに用いたＰＨＡ合成微生物の検
出方法について、より詳しく説明する。
【００３０】＜核酸断片＞本発明の核酸断片は、上述す
るとおり、配列番号：１〜９に示される核酸配列、また
はその相補的な塩基配列を有する核酸、あるいは、これ
らの塩基配列に基づき変異が施された改変配列の何れか
から選ばれる塩基配列を実質的に有する核酸断片であ
る。すなわち、本発明の核酸断片は、プライマーあるい
はプローブとして利用する際、その用途に応じて、その
配列の長さを１０〜５０塩基の長さとする一本鎖の核酸
断片である。
るとおり、配列番号：１〜９に示される核酸配列、また
はその相補的な塩基配列を有する核酸、あるいは、これ
らの塩基配列に基づき変異が施された改変配列の何れか
から選ばれる塩基配列を実質的に有する核酸断片であ
る。すなわち、本発明の核酸断片は、プライマーあるい
はプローブとして利用する際、その用途に応じて、その
配列の長さを１０〜５０塩基の長さとする一本鎖の核酸
断片である。
【００３１】従って、プライマーとして利用する際に
は、配列番号：１〜９に示す塩基配列はいずれも、その
配列長は、２３〜２７塩基と、おおよそ２５塩基からな
るものであるが、例えば、その部分塩基配列を選択し、
最小の全長１０塩基の核酸断片、または、その相補的な
塩基配列を有する最小の全長１０塩基の核酸断片とする
こともできる。一方、プローブとして利用する際には、
例えば、おおよそ２５塩基からなる塩基配列に付加的な
塩基配列を連結して、最大全長５０塩基の核酸断片、ま
たは、相補的なおおよそ２５塩基からなる塩基配列に付
加的な塩基配列を連結して、最大全長５０塩基の核酸断
片とすることができる。なお、本発明の核酸断片におい
て、配列番号：１〜９で示す塩基配列またはその相補的
な塩基配列に基づき、その部分塩基配列のみを用いる場
合には、その部分塩基配列のみでも、ＰＨＡ合成微生物
に特異的であり、他の細菌に相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。
は、配列番号：１〜９に示す塩基配列はいずれも、その
配列長は、２３〜２７塩基と、おおよそ２５塩基からな
るものであるが、例えば、その部分塩基配列を選択し、
最小の全長１０塩基の核酸断片、または、その相補的な
塩基配列を有する最小の全長１０塩基の核酸断片とする
こともできる。一方、プローブとして利用する際には、
例えば、おおよそ２５塩基からなる塩基配列に付加的な
塩基配列を連結して、最大全長５０塩基の核酸断片、ま
たは、相補的なおおよそ２５塩基からなる塩基配列に付
加的な塩基配列を連結して、最大全長５０塩基の核酸断
片とすることができる。なお、本発明の核酸断片におい
て、配列番号：１〜９で示す塩基配列またはその相補的
な塩基配列に基づき、その部分塩基配列のみを用いる場
合には、その部分塩基配列のみでも、ＰＨＡ合成微生物
に特異的であり、他の細菌に相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。
【００３２】あるいは、配列番号：１〜９で示す塩基配
列またはその相補的な塩基配列に基づき、実質的にＰＨ
Ａ合成酵素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を
残す範囲で、一部塩基配列に置き換え、付加・挿入、欠
失を有してもよい。例えば、本発明の核酸断片を、ＰＣ
Ｒ反応に用いるプライマーとする際、プライマー相互が
ハイブリダイゼーションを起こさないように、ＰＨＡ合
成酵素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を保持
する範囲内で、塩基の置き換え、末端配列の除去などの
変異操作を施したものとすることができる。また、ＰＣ
Ｒ反応などにより二重鎖ＤＮＡを形成した際、本発明の
核酸断片に由来する部分に、制限酵素による切断配列を
含むように、塩基配列に置き換え、付加・挿入などの操
作を施したものとすることができる。あるいは、一般
に、ミックスプライマーとしてに用いられる際には、塩
基配列中にコードされるアミノ酸配列が一致する範囲
で、コドン縮退の範囲に応じて塩基の置き換えを行い、
互いに類似する塩基配列を有する複数種の混合物とする
こともできる。
列またはその相補的な塩基配列に基づき、実質的にＰＨ
Ａ合成酵素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を
残す範囲で、一部塩基配列に置き換え、付加・挿入、欠
失を有してもよい。例えば、本発明の核酸断片を、ＰＣ
Ｒ反応に用いるプライマーとする際、プライマー相互が
ハイブリダイゼーションを起こさないように、ＰＨＡ合
成酵素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を保持
する範囲内で、塩基の置き換え、末端配列の除去などの
変異操作を施したものとすることができる。また、ＰＣ
Ｒ反応などにより二重鎖ＤＮＡを形成した際、本発明の
核酸断片に由来する部分に、制限酵素による切断配列を
含むように、塩基配列に置き換え、付加・挿入などの操
作を施したものとすることができる。あるいは、一般
に、ミックスプライマーとしてに用いられる際には、塩
基配列中にコードされるアミノ酸配列が一致する範囲
で、コドン縮退の範囲に応じて塩基の置き換えを行い、
互いに類似する塩基配列を有する複数種の混合物とする
こともできる。
【００３３】なお、前記する塩基配列の改変、または付
加・挿入は、その変更に伴い、目的とするＰＨＡ合成酵
素遺伝子以外の遺伝子との高いハイブリダイゼーション
能を誘起しないように選択するとよい。例えば、ＰＨＡ
合成酵素遺伝子を保持する微生物において、アルカン酸
の代謝反応に関与するその他の酵素蛋白質の遺伝子との
高いハイブリダイゼーション能を誘起する塩基配列を導
入するなど、選択性を損なう懸念のある改変とならない
ように選択するとよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子自
体は保持しないが、アルカン酸の代謝能を有する微生物
において、アルカン酸の代謝反応に関与するその他の酵
素蛋白質の遺伝子との高いハイブリダイゼーション能を
誘起する塩基配列を導入するなど、選択性を損なう懸念
のある塩基配列の変異とならないように選択するとよ
い。
加・挿入は、その変更に伴い、目的とするＰＨＡ合成酵
素遺伝子以外の遺伝子との高いハイブリダイゼーション
能を誘起しないように選択するとよい。例えば、ＰＨＡ
合成酵素遺伝子を保持する微生物において、アルカン酸
の代謝反応に関与するその他の酵素蛋白質の遺伝子との
高いハイブリダイゼーション能を誘起する塩基配列を導
入するなど、選択性を損なう懸念のある改変とならない
ように選択するとよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子自
体は保持しないが、アルカン酸の代謝能を有する微生物
において、アルカン酸の代謝反応に関与するその他の酵
素蛋白質の遺伝子との高いハイブリダイゼーション能を
誘起する塩基配列を導入するなど、選択性を損なう懸念
のある塩基配列の変異とならないように選択するとよ
い。
【００３４】本発明における核酸断片は、上述するよう
に、例えば一部の塩基もしくは塩基配列の欠失、置換、
付加などが施された塩基配列であり、プローブまたはプ
ライマーとしての使用形態・目的に応じて、１０〜５０
塩基の長さの核酸断片とすることができる。特に、核酸
断片をプライマーとして利用する場合には、ＰＨＡ合成
酵素遺伝子を鋳型としてプライマーの伸張反応を行う
が、通常、その伸張反応に大きな影響を与えると考えら
れる3'末端付近の変異とならないようにするか、あるい
は、3'末端付近の変異があっても、その変異を施す塩基
数を最小限にとどめることが好ましい。従って、より好
適には、付加的な塩基配列などの、本来のハイブリダイ
ゼーション能を補完・増進する作用を有さない変異を導
入する際には、5'末端付近でその変異があるようにす
る。
に、例えば一部の塩基もしくは塩基配列の欠失、置換、
付加などが施された塩基配列であり、プローブまたはプ
ライマーとしての使用形態・目的に応じて、１０〜５０
塩基の長さの核酸断片とすることができる。特に、核酸
断片をプライマーとして利用する場合には、ＰＨＡ合成
酵素遺伝子を鋳型としてプライマーの伸張反応を行う
が、通常、その伸張反応に大きな影響を与えると考えら
れる3'末端付近の変異とならないようにするか、あるい
は、3'末端付近の変異があっても、その変異を施す塩基
数を最小限にとどめることが好ましい。従って、より好
適には、付加的な塩基配列などの、本来のハイブリダイ
ゼーション能を補完・増進する作用を有さない変異を導
入する際には、5'末端付近でその変異があるようにす
る。
【００３５】また、本発明の核酸断片を利用したプライ
マーまたはプローブにおいては、上記する１０〜５０塩
基の長さの核酸断片からなり、そのＤＮＡ分子上に標識
物または（および）固相担体と結合可能な部位が導入さ
れ、修飾がなされた核酸断片であってもよい。下で述べ
るように、この標識物または（および）固相担体と結合
可能な部位は、本発明のプライマーまたはプローブを含
む二本鎖ＤＮＡ断片、または、ハイブリダイゼーション
したＤＮＡ複合体を、係る標識物または（および）固相
担体と結合可能な部位を利用して、検出または固定化す
る役割を有する。この付加的な修飾は、本発明の核酸断
片を利用したプライマーまたはプローブのＰＨＡ合成酵
素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を損なわな
い限り、その導入部位に特に制限はない。
マーまたはプローブにおいては、上記する１０〜５０塩
基の長さの核酸断片からなり、そのＤＮＡ分子上に標識
物または（および）固相担体と結合可能な部位が導入さ
れ、修飾がなされた核酸断片であってもよい。下で述べ
るように、この標識物または（および）固相担体と結合
可能な部位は、本発明のプライマーまたはプローブを含
む二本鎖ＤＮＡ断片、または、ハイブリダイゼーション
したＤＮＡ複合体を、係る標識物または（および）固相
担体と結合可能な部位を利用して、検出または固定化す
る役割を有する。この付加的な修飾は、本発明の核酸断
片を利用したプライマーまたはプローブのＰＨＡ合成酵
素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を損なわな
い限り、その導入部位に特に制限はない。
【００３６】このような必要に応じて標識物または固相
担体と結合可能な部位が導入されたプライマーは、例え
ば、このプライマーを利用し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を
鋳型とした３'末端の伸張反応を行って、ＰＨＡ合成微
生物の検出を行う。すなわち、標識物または固相担体と
結合可能な部位が導入可能な位置は、プライマーの伸張
反応を妨げない位置ならばどこでもよいが、可能であれ
ば、５'末端に導入することが好ましい。また、プロー
ブを利用した検出を行う場合、一般に、プローブ３'末
端への伸張反応は利用しない。従って、プローブの標識
物または固相担体と結合可能な部位が導入可能な位置
は、３'末端や５'末端の水酸基部分、さらには塩基部分
やりん酸ジエステル部分などを用いることもできる。ま
た、プローブの塩基配列自体やその長さなどを考慮し、
ハイブリダイゼーションの妨げにならない位置に導入す
ることが望ましい。例えば、プローブの塩基配列の全体
中、ハイブリダイゼーションに主に関与する配列番号：
１〜９で示す塩基配列またはその相補的な塩基配列に基
づく部分を除く、付加的な塩基配列部分をその導入位置
に利用することも望ましい。
担体と結合可能な部位が導入されたプライマーは、例え
ば、このプライマーを利用し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を
鋳型とした３'末端の伸張反応を行って、ＰＨＡ合成微
生物の検出を行う。すなわち、標識物または固相担体と
結合可能な部位が導入可能な位置は、プライマーの伸張
反応を妨げない位置ならばどこでもよいが、可能であれ
ば、５'末端に導入することが好ましい。また、プロー
ブを利用した検出を行う場合、一般に、プローブ３'末
端への伸張反応は利用しない。従って、プローブの標識
物または固相担体と結合可能な部位が導入可能な位置
は、３'末端や５'末端の水酸基部分、さらには塩基部分
やりん酸ジエステル部分などを用いることもできる。ま
た、プローブの塩基配列自体やその長さなどを考慮し、
ハイブリダイゼーションの妨げにならない位置に導入す
ることが望ましい。例えば、プローブの塩基配列の全体
中、ハイブリダイゼーションに主に関与する配列番号：
１〜９で示す塩基配列またはその相補的な塩基配列に基
づく部分を除く、付加的な塩基配列部分をその導入位置
に利用することも望ましい。
【００３７】本発明の核酸断片は、本来プライマーまた
はプローブとして利用されるので、その使用に際して
は、一本鎖ＤＮＡとするが、調製に際しては、互いに相
補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合した二本鎖
ＤＮＡの形状をとってもよい。これら本発明の核酸断
片、あるいはその部分塩基配列は、合目的的な形態に、
任意の方法により調製することができる。核酸断片の塩
基配列に従って、例えば、後述する実施例に記載する方
法に従い、塩基配列全部または一部を化学合成してもよ
い。あるいは、化学合成したプライマーを利用して、PC
R法で増幅し、増幅断片をそのまま、または、増幅断片
から切断した部分断片を、プローブとして用いることも
可能である。さらには、本発明の核酸断片により一旦検
出されたＰＨＡ合成微生物の遺伝子から、所定の領域を
制限酵素などを利用して直接切り出して、調製すことも
可能である。また、それらの遺伝子をE.coli などのプ
ラスミドにクローニングし、菌の増殖の後にプラスミド
を回収し、所定の領域を切り出して利用することも可能
である。
はプローブとして利用されるので、その使用に際して
は、一本鎖ＤＮＡとするが、調製に際しては、互いに相
補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合した二本鎖
ＤＮＡの形状をとってもよい。これら本発明の核酸断
片、あるいはその部分塩基配列は、合目的的な形態に、
任意の方法により調製することができる。核酸断片の塩
基配列に従って、例えば、後述する実施例に記載する方
法に従い、塩基配列全部または一部を化学合成してもよ
い。あるいは、化学合成したプライマーを利用して、PC
R法で増幅し、増幅断片をそのまま、または、増幅断片
から切断した部分断片を、プローブとして用いることも
可能である。さらには、本発明の核酸断片により一旦検
出されたＰＨＡ合成微生物の遺伝子から、所定の領域を
制限酵素などを利用して直接切り出して、調製すことも
可能である。また、それらの遺伝子をE.coli などのプ
ラスミドにクローニングし、菌の増殖の後にプラスミド
を回収し、所定の領域を切り出して利用することも可能
である。
【００３８】＜標識物および固相担体と結合可能な部位
＞上記核酸断片をプローブまたはプライマーとして利用
する場合、前記標識物として、放射性物質、非放射性物
質のどちらを用いてもよい。放射性物質を用いる際に
は、例えば、リン酸エステル部に、放射性の同位体を含
むものとするとよい。非放射性の標識物としては、直接
検出可能な標識として、フルオレセイン誘導体、ローダ
ミンおよびその誘導体などの蛍光物質、化学発光物質、
遅延蛍光物質などがあげられる。また、標識物と特異的
に結合する物質を利用し、間接的に標識物を検出するこ
とも可能である。こうした間接的に検出可能な標識物と
しては、ビオチン、ハプテンなどがあげられる。例え
ば、ビオチンの場合には、アビジンあるいはストレプト
アビジンを、ハプテンの場合には、これに特異的に結合
する抗体を検出に利用する。標識に利用するハプテンと
しては、2,4-ジニトロフェニル基を有する化合物やジゴ
キシゲニンなどを使うことができる。これらの標識物
は、いずれも単独あるいは必要に応じ複数種を組み合わ
せて、プローブまたはプライマーに導入することも可能
である。
＞上記核酸断片をプローブまたはプライマーとして利用
する場合、前記標識物として、放射性物質、非放射性物
質のどちらを用いてもよい。放射性物質を用いる際に
は、例えば、リン酸エステル部に、放射性の同位体を含
むものとするとよい。非放射性の標識物としては、直接
検出可能な標識として、フルオレセイン誘導体、ローダ
ミンおよびその誘導体などの蛍光物質、化学発光物質、
遅延蛍光物質などがあげられる。また、標識物と特異的
に結合する物質を利用し、間接的に標識物を検出するこ
とも可能である。こうした間接的に検出可能な標識物と
しては、ビオチン、ハプテンなどがあげられる。例え
ば、ビオチンの場合には、アビジンあるいはストレプト
アビジンを、ハプテンの場合には、これに特異的に結合
する抗体を検出に利用する。標識に利用するハプテンと
しては、2,4-ジニトロフェニル基を有する化合物やジゴ
キシゲニンなどを使うことができる。これらの標識物
は、いずれも単独あるいは必要に応じ複数種を組み合わ
せて、プローブまたはプライマーに導入することも可能
である。
【００３９】固相担体と結合可能な部位は、例えば、サ
ンドイッチハイブリダイゼーションなど核酸の特定断片
を固相担体に特異的に結合する場合に利用する。その
際、該固相担体と選択的に結合可能なものであれば何で
あってもよい。例えば、ビオチンあるいはフルオレセイ
ン、2,4-ジニトロフェニル基を有する化合物やジゴキシ
ゲニンなどのハプテンがあげられる。これらは、固相担
体の種類に応じて、いずれも単独あるいは必要に応じ複
数種を組み合わせて、プローブまたはプライマーに導入
することが可能である。なお、本発明の核酸断片、プラ
イマーまたはプローブに施される、標識物または／およ
び固相担体と結合可能な部位の導入による付加的な修飾
は、上で述べた例示に限られるものではない。
ンドイッチハイブリダイゼーションなど核酸の特定断片
を固相担体に特異的に結合する場合に利用する。その
際、該固相担体と選択的に結合可能なものであれば何で
あってもよい。例えば、ビオチンあるいはフルオレセイ
ン、2,4-ジニトロフェニル基を有する化合物やジゴキシ
ゲニンなどのハプテンがあげられる。これらは、固相担
体の種類に応じて、いずれも単独あるいは必要に応じ複
数種を組み合わせて、プローブまたはプライマーに導入
することが可能である。なお、本発明の核酸断片、プラ
イマーまたはプローブに施される、標識物または／およ
び固相担体と結合可能な部位の導入による付加的な修飾
は、上で述べた例示に限られるものではない。
【００４０】本発明のＰＨＡ合成微生物の検出方法は、
上記する本発明の核酸断片からなるプライマーまたはプ
ローブを利用する方法である。
上記する本発明の核酸断片からなるプライマーまたはプ
ローブを利用する方法である。
【００４１】＜プローブを用いた検出法＞プローブを用
いた本発明のＰＨＡ合成微生物の検出法は、上記の塩基
配列を有する核酸断片であって、標識物または（およ
び）固相担体と結合可能な部位が導入されてもよい核酸
断片からなる本発明のプローブの少なくとも一種を用い
ることを特徴とする方法である。一般的に、プローブを
用いた検出法としては、ドットハイブリダイゼーショ
ン、サザンハイブリダイゼーション、in situ ハイブリ
ダイゼーションの形態があり、上記標識を施した核酸断
片を使用し、常法どおりハイブリダイゼーションを行う
ことができる。また、in situ ハイブリダイゼーション
においても、本発明の核酸断片を検出に供することが可
能である。
いた本発明のＰＨＡ合成微生物の検出法は、上記の塩基
配列を有する核酸断片であって、標識物または（およ
び）固相担体と結合可能な部位が導入されてもよい核酸
断片からなる本発明のプローブの少なくとも一種を用い
ることを特徴とする方法である。一般的に、プローブを
用いた検出法としては、ドットハイブリダイゼーショ
ン、サザンハイブリダイゼーション、in situ ハイブリ
ダイゼーションの形態があり、上記標識を施した核酸断
片を使用し、常法どおりハイブリダイゼーションを行う
ことができる。また、in situ ハイブリダイゼーション
においても、本発明の核酸断片を検出に供することが可
能である。
【００４２】また、ハイブリダイゼーション操作の簡易
化のためにサンドイッチハイブリダイゼーションを基本
とする手法が開発されており、この手法を応用して、本
発明の核酸断片を固定プローブ等に利用してＰＨＡ合成
微生物の検出を行うことができる。
化のためにサンドイッチハイブリダイゼーションを基本
とする手法が開発されており、この手法を応用して、本
発明の核酸断片を固定プローブ等に利用してＰＨＡ合成
微生物の検出を行うことができる。
【００４３】多くの場合、ＰＨＡ合成酵素遺伝子とのハ
イブリダイゼーションにより、検出を行うが、ＰＨＡ合
成酵素遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、あるいは、その
ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより、検出を行
ってもよい。
イブリダイゼーションにより、検出を行うが、ＰＨＡ合
成酵素遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、あるいは、その
ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより、検出を行
ってもよい。
【００４４】＜プライマーを用いた検出法＞プライマー
を用いた本発明によるＰＨＡ合成微生物の検出法は、上
記の塩基配列を有する核酸断片であって、標識物または
（および）固相担体と結合可能な部位が導入されてもよ
い核酸断片からなる本発明のプローブの少なくとも一種
を用いることを特徴とする方法である。より好ましい例
としては、後述するような二種の異なるプライマーを利
用して、遺伝子増幅反応により試料中の微量核酸断片を
増幅するPCR（Polymerase Chain Reaction）法を応用す
る検出法である。ここで、二種のプライマーを用いる
際、プライマーの形態としては、例えば、二種のプライ
マーともになんらの修飾もされていないもの、二種のプ
ライマーのうち少なくとも一方に検出可能な標識または
固相担体と結合可能な部分が導入されたもの、二種のプ
ライマーのうち、一方には標識物が導入され、他方には
固相担体と結合可能な部位が導入されたもの、二種のプ
ライマーともに固相担体と結合可能な部分が導入された
もの、などがあげられる。
を用いた本発明によるＰＨＡ合成微生物の検出法は、上
記の塩基配列を有する核酸断片であって、標識物または
（および）固相担体と結合可能な部位が導入されてもよ
い核酸断片からなる本発明のプローブの少なくとも一種
を用いることを特徴とする方法である。より好ましい例
としては、後述するような二種の異なるプライマーを利
用して、遺伝子増幅反応により試料中の微量核酸断片を
増幅するPCR（Polymerase Chain Reaction）法を応用す
る検出法である。ここで、二種のプライマーを用いる
際、プライマーの形態としては、例えば、二種のプライ
マーともになんらの修飾もされていないもの、二種のプ
ライマーのうち少なくとも一方に検出可能な標識または
固相担体と結合可能な部分が導入されたもの、二種のプ
ライマーのうち、一方には標識物が導入され、他方には
固相担体と結合可能な部位が導入されたもの、二種のプ
ライマーともに固相担体と結合可能な部分が導入された
もの、などがあげられる。
【００４５】本発明によるＰＨＡ合成微生物の検出方法
は、前記したような本発明によるプライマーを少なくと
も一種、好ましくは、二種のプライマー組み合わせから
なるプライマー対を用いて、以下のように実施すること
ができる。 （１）ＰＨＡ合成微生物の有無を検出したい試料を準備
する工程、（２）必要に応じて、試料中の菌体の破砕処
理を行う工程、（３）試料中に上記プライマーを加え、
プライマーの伸張反応を行う工程、（４）工程（３）で
得られた伸張反応物について検出操作を行う工程、前記
の工程（１）、（３）、（４）、さらに、必要に応じ
て、工程（２）を含む一連の工程により実施される。
は、前記したような本発明によるプライマーを少なくと
も一種、好ましくは、二種のプライマー組み合わせから
なるプライマー対を用いて、以下のように実施すること
ができる。 （１）ＰＨＡ合成微生物の有無を検出したい試料を準備
する工程、（２）必要に応じて、試料中の菌体の破砕処
理を行う工程、（３）試料中に上記プライマーを加え、
プライマーの伸張反応を行う工程、（４）工程（３）で
得られた伸張反応物について検出操作を行う工程、前記
の工程（１）、（３）、（４）、さらに、必要に応じ
て、工程（２）を含む一連の工程により実施される。
【００４６】すなわち、試料中に含まれる多種の核酸断
片、遺伝子ＤＮＡなどから、本発明のプライマーと相補
的な塩基配列を有するものの有無を、それを鋳型とし
て、プライマーの伸張反応による反応物の生成を検出す
ることにより行う方法である。この時、プライマーの伸
張反応に、PCR法を応用すると、反応生成物の選択的な
増幅が行われるので、より高い検出感度が達成される。
加えて、増幅産物の分子量（塩基長）も所定量となり、
検出がより容易となる。
片、遺伝子ＤＮＡなどから、本発明のプライマーと相補
的な塩基配列を有するものの有無を、それを鋳型とし
て、プライマーの伸張反応による反応物の生成を検出す
ることにより行う方法である。この時、プライマーの伸
張反応に、PCR法を応用すると、反応生成物の選択的な
増幅が行われるので、より高い検出感度が達成される。
加えて、増幅産物の分子量（塩基長）も所定量となり、
検出がより容易となる。
【００４７】工程（４）における、プライマーの伸張反
応により増幅された核酸断片の検出は、電気泳動、ある
いはハイブリダイゼーションなどの通常用いられる方法
を利用してもよい。また、遺伝子の増幅反応において、
それぞれのプライマーに別々の標識を導入しておき、増
幅反応後、反応生成物を固相担体に吸着し、反応生成物
を選択的に検出する方法などを用いることも可能であ
る。
応により増幅された核酸断片の検出は、電気泳動、ある
いはハイブリダイゼーションなどの通常用いられる方法
を利用してもよい。また、遺伝子の増幅反応において、
それぞれのプライマーに別々の標識を導入しておき、増
幅反応後、反応生成物を固相担体に吸着し、反応生成物
を選択的に検出する方法などを用いることも可能であ
る。
【００４８】前記の固相担体としては、ポリスチレンボ
ール、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズ、ラテッ
クス、ミクロタイターウェルなどの固相材料に、プライ
マー中に導入された結合部位を捕捉可能であるような、
ストレプトアビジン、抗体などを導入したものがあげら
れる。例えば、ビオチンが導入されたプライマーからの
PCR産物を捕捉するには、ストレプトアビジンを固相に
結合した担体を、フルオレセインなどが導入されたプラ
イマーからの伸張反応物を捕捉するには、フルオレセイ
ンなどに対する抗体を固相に結合した担体を、それぞれ
用いればよい。さらに、固相担体を微粒子とすることに
より、目的とする反応生成物の核酸断片を凝集、あるい
は沈澱形成の有無により、簡便に判定することもでき
る。
ール、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズ、ラテッ
クス、ミクロタイターウェルなどの固相材料に、プライ
マー中に導入された結合部位を捕捉可能であるような、
ストレプトアビジン、抗体などを導入したものがあげら
れる。例えば、ビオチンが導入されたプライマーからの
PCR産物を捕捉するには、ストレプトアビジンを固相に
結合した担体を、フルオレセインなどが導入されたプラ
イマーからの伸張反応物を捕捉するには、フルオレセイ
ンなどに対する抗体を固相に結合した担体を、それぞれ
用いればよい。さらに、固相担体を微粒子とすることに
より、目的とする反応生成物の核酸断片を凝集、あるい
は沈澱形成の有無により、簡便に判定することもでき
る。
【００４９】また、二種のプライマーとして、一方のプ
ライマーに固相担体と結合可能な部位を、他方のプライ
マーに標識物を導入したものを用いて、伸張反応を行っ
た反応物を固相担体と接触させた後に、固相担体と結合
しない不純物を適当な溶媒で洗浄除去する手法が考案さ
れている。この手法を利用すると、固相担体と結合可能
な部位を保有する目的とする核酸断片は、さらに標識物
を持つ形で該固相担体に固定され、一層特異的に検出さ
れる。これら固相担体に固定された核酸断片について、
その標識物質の実際の検出は、使用する標識物質に応じ
て一般的な手法を用いればよい。例えば、標識物質がラ
ジオアイソトープであれば、そのまま放射活性を測定す
ればよい。また、例えば、ビオチンであれば、アビジン
−酵素結合体、あるいは、ハプテンであれば、抗体−酵
素結合体を用いて、前記結合体の酵素に対してAMPPDな
どの基質と反応させ、その酵素量（酵素活性）を色的、
蛍光的手段により検出すればよい。
ライマーに固相担体と結合可能な部位を、他方のプライ
マーに標識物を導入したものを用いて、伸張反応を行っ
た反応物を固相担体と接触させた後に、固相担体と結合
しない不純物を適当な溶媒で洗浄除去する手法が考案さ
れている。この手法を利用すると、固相担体と結合可能
な部位を保有する目的とする核酸断片は、さらに標識物
を持つ形で該固相担体に固定され、一層特異的に検出さ
れる。これら固相担体に固定された核酸断片について、
その標識物質の実際の検出は、使用する標識物質に応じ
て一般的な手法を用いればよい。例えば、標識物質がラ
ジオアイソトープであれば、そのまま放射活性を測定す
ればよい。また、例えば、ビオチンであれば、アビジン
−酵素結合体、あるいは、ハプテンであれば、抗体−酵
素結合体を用いて、前記結合体の酵素に対してAMPPDな
どの基質と反応させ、その酵素量（酵素活性）を色的、
蛍光的手段により検出すればよい。
【００５０】また、プライマーの伸長反応、例えば、遺
伝子のＰＣＲ増幅反応に用いる酵素、反応条件などにつ
いては様々な手法が考案されている。本発明の核酸断片
は、その基となる配列番号：１〜９に示す塩基配列に示
す塩基配列は、それら種々のPCR法のいずれに対して
も、プライマーに利用するのに十分な長さおよび塩基配
列を有している。従って、種々のPCR法のいずれを適用
する場合にも、上述するような付加的な修飾、塩基長の
調整、変異の導入などを必要に応じて施し、本発明の核
酸断片をプライマーに用いることで、ＰＨＡ合成微生物
の検出を行うことができるものである。
伝子のＰＣＲ増幅反応に用いる酵素、反応条件などにつ
いては様々な手法が考案されている。本発明の核酸断片
は、その基となる配列番号：１〜９に示す塩基配列に示
す塩基配列は、それら種々のPCR法のいずれに対して
も、プライマーに利用するのに十分な長さおよび塩基配
列を有している。従って、種々のPCR法のいずれを適用
する場合にも、上述するような付加的な修飾、塩基長の
調整、変異の導入などを必要に応じて施し、本発明の核
酸断片をプライマーに用いることで、ＰＨＡ合成微生物
の検出を行うことができるものである。
【００５１】本発明の核酸断片は、その基となる配列番
号：１〜９に示す塩基配列に示す塩基配列中に一箇所ま
たは複数位置に、複数種の塩基を選択肢とする箇所を有
している。従って、配列番号：１〜９に示す塩基配列
は、前記の選択肢の組み合わせにより、それぞれ互いに
相同性を持つ一群の塩基配列を構成する。本発明の核酸
断片は、前記の互いに相同性を持つ一群の塩基配列から
選択される塩基配列を有するものである。プライマーあ
るいはプローブに用いる際には、配列番号：１〜９に示
す塩基配列で示される、いずれかの相同性を持つ一群か
ら選択される塩基配列を有する１種類の核酸断片を用い
ることもできる。あるいは、個々の相同性を持つ一群か
ら選択される、互いに相同性を持つ複数種の核酸断片を
混合して用いてもよい。さらには、いわゆるミックス・
プライマーと称される混合物、すなわち、相同性を持つ
一群を構成する塩基配列のものを全て含むものを用いる
こともできる。すなわち、本発明においては、配列番
号：１〜９に示す塩基配列を有する核酸断片とは、前記
するように、単一種のもの、互いに相同性を持つ複数種
の混合物、さらには、選択肢の組み合わせにより構成さ
れる互いに相同性を持つ塩基配列を持つ一群全体、これ
らの形態全てを包含する。
号：１〜９に示す塩基配列に示す塩基配列中に一箇所ま
たは複数位置に、複数種の塩基を選択肢とする箇所を有
している。従って、配列番号：１〜９に示す塩基配列
は、前記の選択肢の組み合わせにより、それぞれ互いに
相同性を持つ一群の塩基配列を構成する。本発明の核酸
断片は、前記の互いに相同性を持つ一群の塩基配列から
選択される塩基配列を有するものである。プライマーあ
るいはプローブに用いる際には、配列番号：１〜９に示
す塩基配列で示される、いずれかの相同性を持つ一群か
ら選択される塩基配列を有する１種類の核酸断片を用い
ることもできる。あるいは、個々の相同性を持つ一群か
ら選択される、互いに相同性を持つ複数種の核酸断片を
混合して用いてもよい。さらには、いわゆるミックス・
プライマーと称される混合物、すなわち、相同性を持つ
一群を構成する塩基配列のものを全て含むものを用いる
こともできる。すなわち、本発明においては、配列番
号：１〜９に示す塩基配列を有する核酸断片とは、前記
するように、単一種のもの、互いに相同性を持つ複数種
の混合物、さらには、選択肢の組み合わせにより構成さ
れる互いに相同性を持つ塩基配列を持つ一群全体、これ
らの形態全てを包含する。
【００５２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、以下に述べる実施例は本発明の最良の
実施形態の一例ではあるものの、本発明の技術的範囲
は、これら実施例に限定されるものではない。
説明する。但し、以下に述べる実施例は本発明の最良の
実施形態の一例ではあるものの、本発明の技術的範囲
は、これら実施例に限定されるものではない。
【００５３】（実施例１） プライマーの特異性の評価
−１ 本発明のプライマーは、ＰＨＡ合成微生物の検出が可能
な特異性を示すことを検証した。その一例として、本発
明のプライマーを利用して、PCR法により、ＰＨＡ合成
微生物の遺伝子ＤＮＡを鋳型として、目的とするＰＨＡ
合成酵素遺伝子の部分塩基配列を検出した例を以下に示
す。
−１ 本発明のプライマーは、ＰＨＡ合成微生物の検出が可能
な特異性を示すことを検証した。その一例として、本発
明のプライマーを利用して、PCR法により、ＰＨＡ合成
微生物の遺伝子ＤＮＡを鋳型として、目的とするＰＨＡ
合成酵素遺伝子の部分塩基配列を検出した例を以下に示
す。
【００５４】ＰＨＡ合成能を持たない既知の二菌株；E.
coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）、ＰＨＡ合成能を
有する四菌株；P.cichorii YN2（FERM P-17411）、P.ci
chorii H45（FERM P-17410）、P.putida P91（FERM P-1
7409）、P.jessenii P161（FERM P-17445）の計６種の
細菌を対象として、ＰＨＡ合成微生物の検出における特
異性を検証した。すなわち、この６種の細菌それぞれに
ついて、常法により各種細菌よりDNAを調製したものを
試料とし、PCR法によりプライマーの特異性を評価し
た。
coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）、ＰＨＡ合成能を
有する四菌株；P.cichorii YN2（FERM P-17411）、P.ci
chorii H45（FERM P-17410）、P.putida P91（FERM P-1
7409）、P.jessenii P161（FERM P-17445）の計６種の
細菌を対象として、ＰＨＡ合成微生物の検出における特
異性を検証した。すなわち、この６種の細菌それぞれに
ついて、常法により各種細菌よりDNAを調製したものを
試料とし、PCR法によりプライマーの特異性を評価し
た。
【００５５】本実施例において、配列番号：１〜９に示
す塩基配列に基づき作製される、配列番号：１〜４、６
〜８に示す塩基配列を有するミックス・プライマー７種
と配列番号：５、９に相補的な塩基配列を有するミック
ス・プライマー２種を用いて、PCR増幅産物を取得し
た。具体的には、合成委託した、下記するフォワード・ プライマー７種（アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社）； （配列番号：１）： 5'- GCCTCKGAAAACACCYTGGGSCT -3' （配列番号：２）： 5'- TGACCGARGCCWTSGCSCCGACC -3' （配列番号：３）： 5'- AGCCTGGCGCGSTTCTGCCTGCGC -3' （配列番号：４）： 5'- GGCGARAASAAGGTCAAYGCCYTSACC -3' （配列番号：６）： 5'- TGCAGGCCTAYCTGRSCTGGCAGAA -3' （配列番号：７）： 5'- CCAGTACRYSCTSAARAAYGGCCTG C -3' （配列番号：８）： 5'- CTGGACTTCTTCAAGCWCAACCCG -3' ならびに、下記するリバース・プライマー２種（アマシ
ャム・ファルマシア・バイオテク社）； （配列番号：５の相補鎖）： 5'- CAGCCACCAGGARTCGGYRTGCTTG -3' （配列番号：９の相補鎖）： 5'- ATGCTCTGSAYRTGVCCGCTGTTGG - 3' （但し、K＝GまたはT、 Y＝CまたはT、 S＝Gまたは
C、 R＝AまたはG、 W＝AまたはT、 B＝T、Gまたは
C、 V＝A、GまたはC を意味する）を用いた。
す塩基配列に基づき作製される、配列番号：１〜４、６
〜８に示す塩基配列を有するミックス・プライマー７種
と配列番号：５、９に相補的な塩基配列を有するミック
ス・プライマー２種を用いて、PCR増幅産物を取得し
た。具体的には、合成委託した、下記するフォワード・ プライマー７種（アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社）； （配列番号：１）： 5'- GCCTCKGAAAACACCYTGGGSCT -3' （配列番号：２）： 5'- TGACCGARGCCWTSGCSCCGACC -3' （配列番号：３）： 5'- AGCCTGGCGCGSTTCTGCCTGCGC -3' （配列番号：４）： 5'- GGCGARAASAAGGTCAAYGCCYTSACC -3' （配列番号：６）： 5'- TGCAGGCCTAYCTGRSCTGGCAGAA -3' （配列番号：７）： 5'- CCAGTACRYSCTSAARAAYGGCCTG C -3' （配列番号：８）： 5'- CTGGACTTCTTCAAGCWCAACCCG -3' ならびに、下記するリバース・プライマー２種（アマシ
ャム・ファルマシア・バイオテク社）； （配列番号：５の相補鎖）： 5'- CAGCCACCAGGARTCGGYRTGCTTG -3' （配列番号：９の相補鎖）： 5'- ATGCTCTGSAYRTGVCCGCTGTTGG - 3' （但し、K＝GまたはT、 Y＝CまたはT、 S＝Gまたは
C、 R＝AまたはG、 W＝AまたはT、 B＝T、Gまたは
C、 V＝A、GまたはC を意味する）を用いた。
【００５６】PCR用プライマーの組み合わせとしては、
前記配列番号：１〜４の塩基配列を持つフォワード・プ
ライマー４種に配列番号：５の相補鎖塩基配列を持つリ
バース・プライマーを組み合わせる４種のプライマー組
み合わせ、ならびに、前記配列番号：６〜８の塩基配列
を持つフォワード・プライマー３種に配列番号：９の相
補鎖塩基配列を持つリバース・プライマーを組み合わせ
る３種のプライマー組み合わせ、合計７種類の組み合わ
せとした。
前記配列番号：１〜４の塩基配列を持つフォワード・プ
ライマー４種に配列番号：５の相補鎖塩基配列を持つリ
バース・プライマーを組み合わせる４種のプライマー組
み合わせ、ならびに、前記配列番号：６〜８の塩基配列
を持つフォワード・プライマー３種に配列番号：９の相
補鎖塩基配列を持つリバース・プライマーを組み合わせ
る３種のプライマー組み合わせ、合計７種類の組み合わ
せとした。
【００５７】PCRは、市販の酵素系、AmpliTaq DNA poly
merase（宝酒造）のキットを利用して、以下の反応溶液
組成ならびに条件で行った。
merase（宝酒造）のキットを利用して、以下の反応溶液
組成ならびに条件で行った。
【００５８】50pmol/μl濃度の上記二種のプライマーを
それぞれ1μlずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵
素に添付のdNTP混合溶液を5μl、試料DNAを10ng加え、
さらに水を加えて反応溶液全量を50μlとした。これ
に、AmpliTaq DNA polymerase（宝酒造）を1unit加え
た。
それぞれ1μlずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵
素に添付のdNTP混合溶液を5μl、試料DNAを10ng加え、
さらに水を加えて反応溶液全量を50μlとした。これ
に、AmpliTaq DNA polymerase（宝酒造）を1unit加え
た。
【００５９】反応条件は、反応溶液を95℃に加温して5
分間保持した後、95℃・20秒、60℃・30秒、72℃・60秒
を1サイクルとし、この条件で、15サイクルの反応を行
い、さらに、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒を1
サイクルとし、この条件で、２０サイクルの反応を行
い、その後、72℃で5分間保温した。反応終了後、反応
溶液50μlより2μlを分取し、アガロースゲル電気泳
動、エチジウムブロマイド染色を行い、増幅産物の核酸
鎖の検出を行った。
分間保持した後、95℃・20秒、60℃・30秒、72℃・60秒
を1サイクルとし、この条件で、15サイクルの反応を行
い、さらに、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒を1
サイクルとし、この条件で、２０サイクルの反応を行
い、その後、72℃で5分間保温した。反応終了後、反応
溶液50μlより2μlを分取し、アガロースゲル電気泳
動、エチジウムブロマイド染色を行い、増幅産物の核酸
鎖の検出を行った。
【００６０】その結果、ＰＨＡ合成能を持たない既知の
二菌株；E.coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）では、
いかなる増幅産物も検出されなかった。一方、ＰＨＡ合
成微生物においてのみ、上記PCR用プライマーの組み合
わせ７種類のいずれにおいても、それぞれ増幅産物とし
て、明瞭な一本のバンドが確認できた。なお、上記のＰ
ＨＡ合成微生物４種ともに、PCR用プライマーの組み合
わせ７種類それぞれに対して、得られるＰＣＲ増幅産物
の断片長は、相互に一致しており、下記表１に示す断片
長であった。すなわち、この合計７種のプライマー組み
合わせは、それぞれ４種のＰＨＡ合成微生物に由来する
ＰＨＡ合成酵素遺伝子から、互いに対応する部分塩基配
列を増幅しているため、ＰＣＲ増幅産物は、ほぼ同じ塩
基対を有するものであった。以上の結果から、本実施例
に用いた９種のプライマーはいずれも、ＰＨＡ合成微生
物の検出に適用可能な特異性を示すものであることが確
認された。
二菌株；E.coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）では、
いかなる増幅産物も検出されなかった。一方、ＰＨＡ合
成微生物においてのみ、上記PCR用プライマーの組み合
わせ７種類のいずれにおいても、それぞれ増幅産物とし
て、明瞭な一本のバンドが確認できた。なお、上記のＰ
ＨＡ合成微生物４種ともに、PCR用プライマーの組み合
わせ７種類それぞれに対して、得られるＰＣＲ増幅産物
の断片長は、相互に一致しており、下記表１に示す断片
長であった。すなわち、この合計７種のプライマー組み
合わせは、それぞれ４種のＰＨＡ合成微生物に由来する
ＰＨＡ合成酵素遺伝子から、互いに対応する部分塩基配
列を増幅しているため、ＰＣＲ増幅産物は、ほぼ同じ塩
基対を有するものであった。以上の結果から、本実施例
に用いた９種のプライマーはいずれも、ＰＨＡ合成微生
物の検出に適用可能な特異性を示すものであることが確
認された。
【００６１】
【表１】
【００６２】（実施例２） プライマーの調製 本発明の核酸断片の一例として、標識物あるいは固相担
体と結合可能な部位が導入されているプライマー、なら
びに、標識物あるいは固相担体と結合可能な部位の導入
されていないプライマーについて、それぞれ化学合成法
により調製した。
体と結合可能な部位が導入されているプライマー、なら
びに、標識物あるいは固相担体と結合可能な部位の導入
されていないプライマーについて、それぞれ化学合成法
により調製した。
【００６３】先ず、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位がいずれも導入されていない核酸断片は、一本鎖
ＤＮＡとして、DNA自動合成機モデル381A（パーキンエ
ルマー）を用いて、ホスホアミダイト法により0.2μmol
スケールで合成を行った。目的の核酸断片は、原料等の
混入物を除去するため、OPCカートリッジ（パーキンエ
ルマー）により精製した。
な部位がいずれも導入されていない核酸断片は、一本鎖
ＤＮＡとして、DNA自動合成機モデル381A（パーキンエ
ルマー）を用いて、ホスホアミダイト法により0.2μmol
スケールで合成を行った。目的の核酸断片は、原料等の
混入物を除去するため、OPCカートリッジ（パーキンエ
ルマー）により精製した。
【００６４】また、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位が導入されているプライマーの一例として、その
塩基配列の５'末端に標識物あるいは固相担体と結合可
能な部位が付加されたプライマーを調整した。予め中間
原料として、その5'末端にアミノ基を導入したオリゴヌ
クレオチドを化学合成し、その後に適当な試薬を用いて
標識物あるいは固相担体と結合可能な部位を５'末端の
アミノ基を利用して導入した。以下に、その一例とし
て、ビオチン化した例と２，４−ジニトロフェニル基を
付加した例を述べる。
な部位が導入されているプライマーの一例として、その
塩基配列の５'末端に標識物あるいは固相担体と結合可
能な部位が付加されたプライマーを調整した。予め中間
原料として、その5'末端にアミノ基を導入したオリゴヌ
クレオチドを化学合成し、その後に適当な試薬を用いて
標識物あるいは固相担体と結合可能な部位を５'末端の
アミノ基を利用して導入した。以下に、その一例とし
て、ビオチン化した例と２，４−ジニトロフェニル基を
付加した例を述べる。
【００６５】５'末端ビオチン化したプライマーの合成 ５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチド（配
列番号：１０）：
列番号：１０）：
【００６６】
【化１】
【００６７】の合成は、上述のホスホアミダイト法によ
る合成反応により、５'末端に最後の塩基（この場合は
C）を付加した後、アミノリンクII（パーキンエルマ
ー）をさらに付加することにより、５'末端にアミノ基
を持つGを付加した。合成終了後、中間原料の５'末端に
アミノ基を導入したオリゴヌクレオチドは、同様にし
て、OPCカートリッジにより精製した。
る合成反応により、５'末端に最後の塩基（この場合は
C）を付加した後、アミノリンクII（パーキンエルマ
ー）をさらに付加することにより、５'末端にアミノ基
を持つGを付加した。合成終了後、中間原料の５'末端に
アミノ基を導入したオリゴヌクレオチドは、同様にし
て、OPCカートリッジにより精製した。
【００６８】加えて、前記の手順に準じて、下記する６
種類の５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチ
ドを中間原料として作製し、合計７種類の５'末端にア
ミノ基を導入したオリゴヌクレオチド中間原料を得た。
種類の５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチ
ドを中間原料として作製し、合計７種類の５'末端にア
ミノ基を導入したオリゴヌクレオチド中間原料を得た。
【００６９】５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（配列番号：１１）：
レオチド（配列番号：１１）：
【００７０】
【化２】
【００７１】５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（配列番号：１２）：
レオチド（配列番号：１２）：
【００７２】
【化３】
【００７３】５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（配列番号：１３）：
レオチド（配列番号：１３）：
【００７４】
【化４】
【００７５】５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（配列番号：１４）：
レオチド（配列番号：１４）：
【００７６】
【化５】
【００７７】５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（配列番号：１５）：
レオチド（配列番号：１５）：
【００７８】
【化６】
【００７９】５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（配列番号：１６）：
レオチド（配列番号：１６）：
【００８０】
【化７】
【００８１】次いで、５'末端へのビオチン化は、以下
のようにして行った。1 O.D.のアミノ化オリゴヌクレオ
チド水溶液10μlに、１Ｍ ＮａＨＣＯ3水溶液 10μl、
水 30μl、および、ビオチン化試薬として、20μg/μl
のビオチニル-N-ヒドロキシサクシニミドエステル（BR
L）のDMF溶液を50μl加え、混和後室温で放置した。４
時間後、セファデックスG-50を担体としたゲルろ過にか
け、50mM TEAB（重炭酸トリエチルアンモニウム）緩衝
液（pH7.5）で溶出し、最初のピークを集めた。この溶
出物を乾固の後、TE緩衝液（pH8.0）に溶解した。下記
する６種類のを、中間原料の５'末端にアミノ基を導入
したオリゴヌクレオチドをビオチン化して調製した。
のようにして行った。1 O.D.のアミノ化オリゴヌクレオ
チド水溶液10μlに、１Ｍ ＮａＨＣＯ3水溶液 10μl、
水 30μl、および、ビオチン化試薬として、20μg/μl
のビオチニル-N-ヒドロキシサクシニミドエステル（BR
L）のDMF溶液を50μl加え、混和後室温で放置した。４
時間後、セファデックスG-50を担体としたゲルろ過にか
け、50mM TEAB（重炭酸トリエチルアンモニウム）緩衝
液（pH7.5）で溶出し、最初のピークを集めた。この溶
出物を乾固の後、TE緩衝液（pH8.0）に溶解した。下記
する６種類のを、中間原料の５'末端にアミノ基を導入
したオリゴヌクレオチドをビオチン化して調製した。
【００８２】５'末端にジニトロフェニル基（DNP）導入
したプライマーの合成 ５'末端へのジニトロフェニル基（DNP）の導入も、ビオ
チン標識と同様に、５'末端にアミノ基を導入したオリ
ゴヌクレオチドを中間原料として行った。５'末端にア
ミノ基を導入したオリゴヌクレオチド二種類、すなわち
（配列番号：１７の相補鎖）：
したプライマーの合成 ５'末端へのジニトロフェニル基（DNP）の導入も、ビオ
チン標識と同様に、５'末端にアミノ基を導入したオリ
ゴヌクレオチドを中間原料として行った。５'末端にア
ミノ基を導入したオリゴヌクレオチド二種類、すなわち
（配列番号：１７の相補鎖）：
【００８３】
【化８】
【００８４】ならびに（配列番号：１８の相補鎖）：
【００８５】
【化９】
【００８６】を、それぞれ上記のビオチン標識のときと
同様に合成し、精製を行った。精製した2 O.D.のアミノ
化オリゴヌクレオチド水溶液 180μlに、１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ3 水溶液 20μlを加え、これに試薬の５％（v/v）ジ
ニトロフルオンベンゼンのエタノール溶液 100μlを加
え、37℃で2時間加温し、反応を行った。ビオチン化オ
リゴヌクレオチドと同様に、反応後の精製は、ゲルろ過
により行い、乾固の後、TE緩衝液（pH8.0）に溶解し
た。
同様に合成し、精製を行った。精製した2 O.D.のアミノ
化オリゴヌクレオチド水溶液 180μlに、１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ3 水溶液 20μlを加え、これに試薬の５％（v/v）ジ
ニトロフルオンベンゼンのエタノール溶液 100μlを加
え、37℃で2時間加温し、反応を行った。ビオチン化オ
リゴヌクレオチドと同様に、反応後の精製は、ゲルろ過
により行い、乾固の後、TE緩衝液（pH8.0）に溶解し
た。
【００８７】（実施例３） プローブの調製 本発明の核酸断片の一例として、標識物あるいは固相担
体と結合可能な部位が導入されているプローブを化学合
成法により調製した。
体と結合可能な部位が導入されているプローブを化学合
成法により調製した。
【００８８】3'末端にビオチン標識を導入したオリゴヌ
クレオチド（配列番号：１３）：
クレオチド（配列番号：１３）：
【００８９】
【化１０】
【００９０】を次のように調製した。予め3'末端がビオ
チン標識されている、0.5μmolスケールの3'Biotin-ONC
PGカラム（CLONTECH）を用いて、ホスホアミダイト法に
より所定の塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成し、カ
ラムから分離した。この3'末端にビオチン標識を有する
オリゴヌクレオチドも、常法によりOPCカートリッジを
用いて精製、乾固の後、TE緩衝液（pH8.0）に溶解し
た。この核酸断片は、3'末端にビオチン標識を導入して
おり、プライマーではなく、プローブに適するものであ
る。
チン標識されている、0.5μmolスケールの3'Biotin-ONC
PGカラム（CLONTECH）を用いて、ホスホアミダイト法に
より所定の塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成し、カ
ラムから分離した。この3'末端にビオチン標識を有する
オリゴヌクレオチドも、常法によりOPCカートリッジを
用いて精製、乾固の後、TE緩衝液（pH8.0）に溶解し
た。この核酸断片は、3'末端にビオチン標識を導入して
おり、プライマーではなく、プローブに適するものであ
る。
【００９１】（実施例４） プライマーの特異性の評価
−２ 本発明のプライマーは、ＰＨＡ合成微生物の検出が可能
な特異性を示すことを検証した。その一例として、本発
明のプライマーを利用して、PCR法により、 ＰＨＡ合成
微生物の遺伝子ＤＮＡを鋳型として、目的とするＰＨＡ
合成酵素遺伝子の部分塩基配列を検出した例を以下に示
す。
−２ 本発明のプライマーは、ＰＨＡ合成微生物の検出が可能
な特異性を示すことを検証した。その一例として、本発
明のプライマーを利用して、PCR法により、 ＰＨＡ合成
微生物の遺伝子ＤＮＡを鋳型として、目的とするＰＨＡ
合成酵素遺伝子の部分塩基配列を検出した例を以下に示
す。
【００９２】ＰＨＡ合成能を持たない既知の二菌株；E.
coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）、ＰＨＡ合成能を
有する四菌株；P.cichorii YN2（FERM P-17411）、P.ci
chorii H45（FERM P-17410）、P.putida P91（FERM P-1
7409）、P.jessenii P161（FERM P-17445）の計６種の
細菌を対象として、ＰＨＡ合成微生物の検出における特
異性を検証した。すなわち、この６種の細菌それぞれに
ついて、常法により各種細菌よりDNAを調製したものを
試料とし、PCR法によりプライマーの特異性を評価し
た。
coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）、ＰＨＡ合成能を
有する四菌株；P.cichorii YN2（FERM P-17411）、P.ci
chorii H45（FERM P-17410）、P.putida P91（FERM P-1
7409）、P.jessenii P161（FERM P-17445）の計６種の
細菌を対象として、ＰＨＡ合成微生物の検出における特
異性を検証した。すなわち、この６種の細菌それぞれに
ついて、常法により各種細菌よりDNAを調製したものを
試料とし、PCR法によりプライマーの特異性を評価し
た。
【００９３】本実施例において、プライマーは実施例２
で調製した９種のプライマー、具体的には、下記する
５'末端をビオチン化したフォワード・プライマー７
種； ５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオチド（配列番
号：１０）：
で調製した９種のプライマー、具体的には、下記する
５'末端をビオチン化したフォワード・プライマー７
種； ５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオチド（配列番
号：１０）：
【００９４】
【化１１】
【００９５】５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオ
チド（配列番号：１１）：
チド（配列番号：１１）：
【００９６】
【化１２】
【００９７】５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオ
チド（配列番号：１２）：
チド（配列番号：１２）：
【００９８】
【化１３】
【００９９】５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオ
チド（配列番号：１３）：
チド（配列番号：１３）：
【０１００】
【化１４】
【０１０１】５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオ
チド（配列番号：１４）：
チド（配列番号：１４）：
【０１０２】
【化１５】
【０１０３】５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオ
チド（配列番号：１５）：
チド（配列番号：１５）：
【０１０４】
【化１６】
【０１０５】５'末端をビオチン化したオリゴヌクレオ
チド（配列番号：１６）：
チド（配列番号：１６）：
【０１０６】
【化１７】
【０１０７】ならびに、下記する５'末端にジニトロフ
ェニル基（DNP）を導入したリバース・プライマー２
種； ５'末端にDNPを導入したオリゴヌクレオチド（配列番
号：１７の相補鎖）：
ェニル基（DNP）を導入したリバース・プライマー２
種； ５'末端にDNPを導入したオリゴヌクレオチド（配列番
号：１７の相補鎖）：
【０１０８】
【化１８】
【０１０９】５'末端にDNPを導入したオリゴヌクレオチ
ド（配列番号：１８の相補鎖）：
ド（配列番号：１８の相補鎖）：
【０１１０】
【化１９】
【０１１１】を用いた。
【０１１２】PCR用プライマーの組み合わせとしては、
前記配列番号：１０〜１３の塩基配列を持つフォワード
・プライマー４種に配列番号：１７の相補鎖塩基配列を
持つリバース・プライマーを組み合わせる４種のプライ
マー組み合わせ、ならびに、前記配列番号：１４〜１６
の塩基配列を持つフォワード・プライマー３種に配列番
号：１８の相補鎖塩基配列を持つリバース・プライマー
を組み合わせる３種のプライマー組み合わせ、合計７種
類の組み合わせとした。
前記配列番号：１０〜１３の塩基配列を持つフォワード
・プライマー４種に配列番号：１７の相補鎖塩基配列を
持つリバース・プライマーを組み合わせる４種のプライ
マー組み合わせ、ならびに、前記配列番号：１４〜１６
の塩基配列を持つフォワード・プライマー３種に配列番
号：１８の相補鎖塩基配列を持つリバース・プライマー
を組み合わせる３種のプライマー組み合わせ、合計７種
類の組み合わせとした。
【０１１３】PCRは、市販の酵素系、AmpliTaq DNA poly
merase（宝酒造）のキットを利用して、以下の反応溶液
組成ならびに条件で行った。
merase（宝酒造）のキットを利用して、以下の反応溶液
組成ならびに条件で行った。
【０１１４】50pmol/μl濃度の上記二種のプライマーを
それぞれ1μlずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵
素に添付のdNTP混合溶液を5μl、試料DNAを10ng加え、
さらに水を加えて反応溶液全量を50μlとした。これ
に、AmpliTaq DNA polymerase（宝酒造）を1unit加え
た。
それぞれ1μlずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵
素に添付のdNTP混合溶液を5μl、試料DNAを10ng加え、
さらに水を加えて反応溶液全量を50μlとした。これ
に、AmpliTaq DNA polymerase（宝酒造）を1unit加え
た。
【０１１５】反応条件は、反応溶液を95℃に加温して5
分間保持した後、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒
を1サイクルとした。前記の条件で、30サイクルの反応
を行い、その後、さらに72℃で5分間保温した。反応終
了後、反応溶液50μlより2μlを分取し、アガロースゲ
ル電気泳動、エチジウムブロマイド染色を行い、増幅産
物の核酸鎖の検出を行った。
分間保持した後、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒
を1サイクルとした。前記の条件で、30サイクルの反応
を行い、その後、さらに72℃で5分間保温した。反応終
了後、反応溶液50μlより2μlを分取し、アガロースゲ
ル電気泳動、エチジウムブロマイド染色を行い、増幅産
物の核酸鎖の検出を行った。
【０１１６】その結果、ＰＨＡ合成能を持たない既知の
二菌株；E.coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）では、
いかなる増幅産物も検出されなかった。一方、ＰＨＡ合
成微生物においてのみ、上記PCR用プライマーの組み合
わせ７種類のいずれにおいても、それぞれ増幅産物とし
て、明瞭な一本のバンドが確認できた。なお、上記のＰ
ＨＡ合成微生物４種ともに、PCR用プライマーの組み合
わせ７種類それぞれに対して、得られるＰＣＲ増幅産物
の断片長は、相互に一致しており、下記表２に示す断片
長であった。すなわち、この合計７種のプライマー組み
合わせは、それぞれ４種のＰＨＡ合成微生物に由来する
ＰＨＡ合成酵素遺伝子から、互いに対応する部分塩基配
列を増幅しているため、ＰＣＲ増幅産物は、ほぼ同じ増
幅断片長を有するものであった。以上の結果から、本実
施例に用いた９種のプライマーはいずれも、ＰＨＡ合成
微生物の検出に適用可能な特異性を示すものであること
が確認された。
二菌株；E.coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）では、
いかなる増幅産物も検出されなかった。一方、ＰＨＡ合
成微生物においてのみ、上記PCR用プライマーの組み合
わせ７種類のいずれにおいても、それぞれ増幅産物とし
て、明瞭な一本のバンドが確認できた。なお、上記のＰ
ＨＡ合成微生物４種ともに、PCR用プライマーの組み合
わせ７種類それぞれに対して、得られるＰＣＲ増幅産物
の断片長は、相互に一致しており、下記表２に示す断片
長であった。すなわち、この合計７種のプライマー組み
合わせは、それぞれ４種のＰＨＡ合成微生物に由来する
ＰＨＡ合成酵素遺伝子から、互いに対応する部分塩基配
列を増幅しているため、ＰＣＲ増幅産物は、ほぼ同じ増
幅断片長を有するものであった。以上の結果から、本実
施例に用いた９種のプライマーはいずれも、ＰＨＡ合成
微生物の検出に適用可能な特異性を示すものであること
が確認された。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】（実施例５） ＰＨＡ合成微生物のプライ
マーを用いた検出（１） 実施例４に示す通り、本発明のプライマーを利用してPC
R法により、ＰＨＡ合成微生物の染色体遺伝子から、目
的とするＰＨＡ合成酵素遺伝子の部分塩基配列を選択的
に増幅することができ、ＰＨＡ合成微生物の検出が可能
であることが示された。本実施例では、ＰＨＡ合成微生
物の検出に際して、本発明の付加的な修飾を施したプラ
イマーを用いることで、その標識物ならびに固相担体と
結合可能な部位を利用し、目的のＰＣＲ増幅産物のみを
選択することで、高い検出感度を達成した一例を以下に
示す。
マーを用いた検出（１） 実施例４に示す通り、本発明のプライマーを利用してPC
R法により、ＰＨＡ合成微生物の染色体遺伝子から、目
的とするＰＨＡ合成酵素遺伝子の部分塩基配列を選択的
に増幅することができ、ＰＨＡ合成微生物の検出が可能
であることが示された。本実施例では、ＰＨＡ合成微生
物の検出に際して、本発明の付加的な修飾を施したプラ
イマーを用いることで、その標識物ならびに固相担体と
結合可能な部位を利用し、目的のＰＣＲ増幅産物のみを
選択することで、高い検出感度を達成した一例を以下に
示す。
【０１１９】実施例４と同様にして、６種類の各種細菌
よりDNAを調製した。この試料ＤＮＡを、市販の酵素
系、AmpliTaq DNA polymerase（宝酒造）を用いて、以
下の反応溶液組成、反応条件でPCRに供した。
よりDNAを調製した。この試料ＤＮＡを、市販の酵素
系、AmpliTaq DNA polymerase（宝酒造）を用いて、以
下の反応溶液組成、反応条件でPCRに供した。
【０１２０】実施例２で調製した二種のプライマー： （配列番号：１０）のビオチン化フォワード・プライマ
ー
ー
【０１２１】
【化２０】
【０１２２】（配列番号：１７の相補鎖）のＤＮＰ修飾
リバース・プライマー
リバース・プライマー
【０１２３】
【化２１】
【０１２４】の20pmol/μｌ濃度プライマー液をそれぞ
れ1μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵素に
添付のdNTP混合溶液を2μｌ、試料DNAとしてYN2、H45、
P91、P161株については10pgを、他の２種の細菌につい
ては10ngを加え、さらに水を加えて、それぞれ反応溶液
全量を50μｌとした。これらの反応溶液に、AmpliTaq D
NApolymerase （宝酒造）を1unit加えた。
れ1μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵素に
添付のdNTP混合溶液を2μｌ、試料DNAとしてYN2、H45、
P91、P161株については10pgを、他の２種の細菌につい
ては10ngを加え、さらに水を加えて、それぞれ反応溶液
全量を50μｌとした。これらの反応溶液に、AmpliTaq D
NApolymerase （宝酒造）を1unit加えた。
【０１２５】反応溶液を、95℃に加温して5分間保持し
た後、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒を1サイク
ルとした。前記の条件で、35サイクルの反応を行い、そ
の後さらに72℃で5分間保温した。反応終了後、この反
応混合液をスピンカラムにかけ、未反応プライマーを除
去した。
た後、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒を1サイク
ルとした。前記の条件で、35サイクルの反応を行い、そ
の後さらに72℃で5分間保温した。反応終了後、この反
応混合液をスピンカラムにかけ、未反応プライマーを除
去した。
【０１２６】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、0.15M NaCl、0.05％ Tween20を含むTris-Cl緩衝
液（pH7.5）を100μｌ加えておき、これに未反応プライ
マーを除去した上記混合液を10μｌ加えた。そのまま、
室温30分間放置の後、マイクロプレートを上記Tris-Cl
緩衝液500μｌで3回洗浄した。この操作により、マイク
ロプレート表面に固定化されているストレプトアビジン
とプライマーに由来するビオチンにより、マイクロプレ
ート上にＰＣＲ増幅産物の固定化がなされる。
トに、0.15M NaCl、0.05％ Tween20を含むTris-Cl緩衝
液（pH7.5）を100μｌ加えておき、これに未反応プライ
マーを除去した上記混合液を10μｌ加えた。そのまま、
室温30分間放置の後、マイクロプレートを上記Tris-Cl
緩衝液500μｌで3回洗浄した。この操作により、マイク
ロプレート表面に固定化されているストレプトアビジン
とプライマーに由来するビオチンにより、マイクロプレ
ート上にＰＣＲ増幅産物の固定化がなされる。
【０１２７】洗浄後のマイクロプレートに、アルカリ性
フォスフォターゼ標識抗DNP抗体を上述のTris-Cl緩衝液
で2000倍に希釈したものを100μｌ加えた。このまま、
室温30分間放置の後、上記Tris-Cl緩衝液500μｌで3回
洗浄した。この操作により、マイクロプレート上に固定
化されているＰＣＲ増幅産物のプライマーに由来するジ
ニトロフェニル基（DNP）に対して、アルカリ性フォス
フォターゼ標識抗DNP抗体が反応（結合）する。
フォスフォターゼ標識抗DNP抗体を上述のTris-Cl緩衝液
で2000倍に希釈したものを100μｌ加えた。このまま、
室温30分間放置の後、上記Tris-Cl緩衝液500μｌで3回
洗浄した。この操作により、マイクロプレート上に固定
化されているＰＣＲ増幅産物のプライマーに由来するジ
ニトロフェニル基（DNP）に対して、アルカリ性フォス
フォターゼ標識抗DNP抗体が反応（結合）する。
【０１２８】次いで、マイクロプレート上に、4mg/mlの
濃度で1M ジエタノールアミン緩衝液に溶解したp-ニト
ロフェニルリン酸溶液を100μｌ加える。標識酵素のア
ルカリ性フォスフォターゼを前記基質p-ニトロフェニル
リン酸に作用させるため、室温30分間放置の後、マイク
ロプレートリーダーを用いて、酵素反応生成物量を405n
mの吸光度を測定して、評価した。
濃度で1M ジエタノールアミン緩衝液に溶解したp-ニト
ロフェニルリン酸溶液を100μｌ加える。標識酵素のア
ルカリ性フォスフォターゼを前記基質p-ニトロフェニル
リン酸に作用させるため、室温30分間放置の後、マイク
ロプレートリーダーを用いて、酵素反応生成物量を405n
mの吸光度を測定して、評価した。
【０１２９】その結果、YN2、H45、P91、P161の４株の
試料ＤＮＡを用いた場合にのみ、バックグラウンドに比
較し有意な吸収を確認することができた。すなわち、プ
ライマーに由来するビオチンとプライマーに由来するジ
ニトロフェニル基（DNP）をともに有する目的のＰＣＲ
増幅産物が、マイクロプレート上に固着されていること
を、標識酵素のアルカリ性フォスフォターゼに起因する
酵素活性により検出できた。
試料ＤＮＡを用いた場合にのみ、バックグラウンドに比
較し有意な吸収を確認することができた。すなわち、プ
ライマーに由来するビオチンとプライマーに由来するジ
ニトロフェニル基（DNP）をともに有する目的のＰＣＲ
増幅産物が、マイクロプレート上に固着されていること
を、標識酵素のアルカリ性フォスフォターゼに起因する
酵素活性により検出できた。
【０１３０】一方、ＰＨＡ合成能を示さない、他の２種
の菌株においては、バックグラウンド程度の吸収を示す
に留まっていた。従って、実施例４においても確認され
た通り、目的のＰＣＲ増幅産物は得られていないもので
あった。
の菌株においては、バックグラウンド程度の吸収を示す
に留まっていた。従って、実施例４においても確認され
た通り、目的のＰＣＲ増幅産物は得られていないもので
あった。
【０１３１】本実施例の結果から、実施例４と比較し、
プライマー濃度を20pmol/μｌに減じ、加えて、試料Ｄ
ＮＡの量も１０ｎｇから１０ｐｇへと大幅に減らした条
件においても、反応サイクルを増すことで、十分に検出
可能なＰＣＲ増幅産物が得られていることが判る。さら
には、付加的な修飾を施したプライマーを用いて、その
標識物ならびに固相担体と結合可能な部位を利用するこ
とで、より選択性を高くした結果、十分に高い検出感度
が達成されていることが確認された。
プライマー濃度を20pmol/μｌに減じ、加えて、試料Ｄ
ＮＡの量も１０ｎｇから１０ｐｇへと大幅に減らした条
件においても、反応サイクルを増すことで、十分に検出
可能なＰＣＲ増幅産物が得られていることが判る。さら
には、付加的な修飾を施したプライマーを用いて、その
標識物ならびに固相担体と結合可能な部位を利用するこ
とで、より選択性を高くした結果、十分に高い検出感度
が達成されていることが確認された。
【０１３２】（実施例６） ＰＨＡ合成微生物のプライ
マーを用いた検出（２） 実施例５に示すとおり、ＰＨＡ合成微生物の検出に際し
て、付加的な修飾を施した本発明にかかるプライマーを
用いることで、その標識物ならびに固相担体と結合可能
な部位を利用し、目的のＰＣＲ増幅産物のみを選択し、
高い検出感度を達成できる。本実施例では、その高い検
出感度の結果、本発明のＰＨＡ合成微生物の検出方法
は、極めて微量な試料についても、高い確度で検出が可
能であることを検証した一例を示す。
マーを用いた検出（２） 実施例５に示すとおり、ＰＨＡ合成微生物の検出に際し
て、付加的な修飾を施した本発明にかかるプライマーを
用いることで、その標識物ならびに固相担体と結合可能
な部位を利用し、目的のＰＣＲ増幅産物のみを選択し、
高い検出感度を達成できる。本実施例では、その高い検
出感度の結果、本発明のＰＨＡ合成微生物の検出方法
は、極めて微量な試料についても、高い確度で検出が可
能であることを検証した一例を示す。
【０１３３】実施例４と同様にして、ＰＨＡ合成微生物
であるYN2、H45、P91、P161株よりDNAを調製した。この
試料ＤＮＡを、市販の酵素系、AmpliTaq DNA polymeras
e（宝酒造）を用いて、以下の反応溶液組成、反応条件
でPCRに供した。
であるYN2、H45、P91、P161株よりDNAを調製した。この
試料ＤＮＡを、市販の酵素系、AmpliTaq DNA polymeras
e（宝酒造）を用いて、以下の反応溶液組成、反応条件
でPCRに供した。
【０１３４】実施例２で調製した二種のプライマー： （配列番号：１０）のビオチン化フォワード・プライマ
ー
ー
【０１３５】
【化２２】
【０１３６】（配列番号：１７の相補鎖）のＤＮＰ修飾
リバース・プライマー
リバース・プライマー
【０１３７】
【化２３】
【０１３８】の20pmol/μｌ濃度プライマー液をそれぞ
れ1μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵素に
添付のdNTP混合溶液を2μｌ、YN2、H45、P91、P161につ
いて、それぞれ試料DNAを10pg、1pg、100fg、10fgを加
え、さらに水を加えて、それぞれ反応溶液全量を50μｌ
とした。この各菌株について、試料DNAの量を前記の４
水準に選択した各４種の反応溶液に、AmpliTaq DNA pol
ymerase（宝酒造）を1 unit加えた。
れ1μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を5μl、酵素に
添付のdNTP混合溶液を2μｌ、YN2、H45、P91、P161につ
いて、それぞれ試料DNAを10pg、1pg、100fg、10fgを加
え、さらに水を加えて、それぞれ反応溶液全量を50μｌ
とした。この各菌株について、試料DNAの量を前記の４
水準に選択した各４種の反応溶液に、AmpliTaq DNA pol
ymerase（宝酒造）を1 unit加えた。
【０１３９】反応条件は、95℃に加温して5分間保持し
た後、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒を1サイク
ルとした。前記の条件で、40サイクルの反応を行い、そ
の後さらに72℃で5分間保温した。反応終了後、この反
応混合液をスピンカラムにかけ、未反応プライマーを除
去した。
た後、95℃・20秒、55℃・30秒、72℃・60秒を1サイク
ルとした。前記の条件で、40サイクルの反応を行い、そ
の後さらに72℃で5分間保温した。反応終了後、この反
応混合液をスピンカラムにかけ、未反応プライマーを除
去した。
【０１４０】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、0.15M NaCl、0.05% Tween20を含むTris-Cl緩衝液
（pH7.5）を100μl加えておき、これに未反応プライマ
ーを除去した上記混合液を10μl加えた。そのまま、室
温30分間放置の後、マイクロプレートを上記Tris-Cl緩
衝液500μlで3回洗浄した。この操作により、マイクロ
プレート上にＰＣＲ増幅産物の固定化がなされる。
トに、0.15M NaCl、0.05% Tween20を含むTris-Cl緩衝液
（pH7.5）を100μl加えておき、これに未反応プライマ
ーを除去した上記混合液を10μl加えた。そのまま、室
温30分間放置の後、マイクロプレートを上記Tris-Cl緩
衝液500μlで3回洗浄した。この操作により、マイクロ
プレート上にＰＣＲ増幅産物の固定化がなされる。
【０１４１】洗浄後のマイクロプレートに、アルカリ性
フォスフォターゼ標識抗DNP抗体を上述のTris-Cl緩衝液
で2000倍に希釈したものを100μl加えた。このまま、室
温30分間放置の後、上記Tris-Cl緩衝液500μlで3回洗浄
した。この操作により、マイクロプレート上に固定化さ
れているＰＣＲ増幅産物に対して、アルカリ性フォスフ
ォターゼ標識抗DNP抗体が反応（結合）する。
フォスフォターゼ標識抗DNP抗体を上述のTris-Cl緩衝液
で2000倍に希釈したものを100μl加えた。このまま、室
温30分間放置の後、上記Tris-Cl緩衝液500μlで3回洗浄
した。この操作により、マイクロプレート上に固定化さ
れているＰＣＲ増幅産物に対して、アルカリ性フォスフ
ォターゼ標識抗DNP抗体が反応（結合）する。
【０１４２】次いで、マイクロプレート上に、4mg/mlの
濃度で1M ジエタノールアミン緩衝液に溶解したp-ニト
ロフェニルリン酸溶液を100μl加える。標識酵素のアル
カリ性フォスフォターゼを基質p-ニトロフェニルリン酸
に作用させるため、室温30分間放置の後、マイクロプレ
ートリーダーを用いて、酵素反応生成物量を405nmの吸
光度を測定した。
濃度で1M ジエタノールアミン緩衝液に溶解したp-ニト
ロフェニルリン酸溶液を100μl加える。標識酵素のアル
カリ性フォスフォターゼを基質p-ニトロフェニルリン酸
に作用させるため、室温30分間放置の後、マイクロプレ
ートリーダーを用いて、酵素反応生成物量を405nmの吸
光度を測定した。
【０１４３】その結果、試料DNA量が10pg、1pg、100fg
の３水準では、バックグラウンドに比較し有意な吸収を
確認することができた。一方、試料DNA量が10fgのもの
については、その吸収は、バックグラウンドの吸収と比
較して、有意とは判断されない程度に留まった。また、
前記の結果は、ＰＨＡ合成微生物であるYN2、H45、P9
1、P161株のいずれにおいても、同じものであった。
の３水準では、バックグラウンドに比較し有意な吸収を
確認することができた。一方、試料DNA量が10fgのもの
については、その吸収は、バックグラウンドの吸収と比
較して、有意とは判断されない程度に留まった。また、
前記の結果は、ＰＨＡ合成微生物であるYN2、H45、P9
1、P161株のいずれにおいても、同じものであった。
【０１４４】この例にも示されるように、本発明のＰＨ
Ａ合成微生物の検出方法は、極めて試料量が僅かな場合
においても、高い確度でＰＨＡ合成微生物の検出が行え
ることが検証された。
Ａ合成微生物の検出方法は、極めて試料量が僅かな場合
においても、高い確度でＰＨＡ合成微生物の検出が行え
ることが検証された。
【０１４５】（実施例７） ＰＨＡ合成微生物のプロー
ブを用いた検出（１） 本発明のプローブは、ＰＨＡ合成微生物の検出に適用可
能な特異性を示すことを検証した。その一例として、本
発明のプローブを利用して、ドットプロット法により、
ＰＨＡ合成微生物の遺伝子ＤＮＡ中に含まれる、目的と
するＰＨＡ合成酵素遺伝子の存在を検出した例を以下に
示す。
ブを用いた検出（１） 本発明のプローブは、ＰＨＡ合成微生物の検出に適用可
能な特異性を示すことを検証した。その一例として、本
発明のプローブを利用して、ドットプロット法により、
ＰＨＡ合成微生物の遺伝子ＤＮＡ中に含まれる、目的と
するＰＨＡ合成酵素遺伝子の存在を検出した例を以下に
示す。
【０１４６】実施例４と同様にして、ＰＨＡ合成能を持
たない既知の二菌株；E.coli JM109およびJ1（FERM BP-
5352）、ＰＨＡ合成能を有する四菌株；P.cichorii YN2
（FERM P-17411）、P.cichorii H45（FERM P-17410）、
P.putida P91（FERM P-17409）、P.jessenii P161（FER
M P-17445）の計６種の細菌よりDNAを調製した。それぞ
れの試料DNAをアルカリ変性の後、ドットブロット装置
（BRL）を用いて1μgずつナイロン膜（Tropilon-45、Tr
opix社）にブロットした。80℃で２時間乾燥した後、ナ
イロン膜をビニールバッグに入れ、プレハイブリダイゼ
ーション溶液（6×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％ SD
S、100μg/ml 変性サケ精子DNA）を3 ml加え、60℃でプ
レハイブリダイゼーションを1時間行った。
たない既知の二菌株；E.coli JM109およびJ1（FERM BP-
5352）、ＰＨＡ合成能を有する四菌株；P.cichorii YN2
（FERM P-17411）、P.cichorii H45（FERM P-17410）、
P.putida P91（FERM P-17409）、P.jessenii P161（FER
M P-17445）の計６種の細菌よりDNAを調製した。それぞ
れの試料DNAをアルカリ変性の後、ドットブロット装置
（BRL）を用いて1μgずつナイロン膜（Tropilon-45、Tr
opix社）にブロットした。80℃で２時間乾燥した後、ナ
イロン膜をビニールバッグに入れ、プレハイブリダイゼ
ーション溶液（6×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％ SD
S、100μg/ml 変性サケ精子DNA）を3 ml加え、60℃でプ
レハイブリダイゼーションを1時間行った。
【０１４７】このナイロン膜に対して、ハイブリダイゼ
ーション溶液として、前記プレハイブリダイゼーション
溶液3 ml当たり、実施例３で調製したビオチン標識オリ
ゴヌクレオチドプローブ：
ーション溶液として、前記プレハイブリダイゼーション
溶液3 ml当たり、実施例３で調製したビオチン標識オリ
ゴヌクレオチドプローブ：
【０１４８】
【化２４】
【０１４９】を熱変性の後に100ng加えた液3 mlを用い
て、60℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。そ
の後、ナイロン膜をビニールバッグから取り出し、6×S
SC、0.5％ SDS溶液を用いて60℃で5分間ずつ3回洗浄し
た。
て、60℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。そ
の後、ナイロン膜をビニールバッグから取り出し、6×S
SC、0.5％ SDS溶液を用いて60℃で5分間ずつ3回洗浄し
た。
【０１５０】前記ビオチン標識プローブのハイブリダイ
ゼーションしたＤＮＡの検出は、サザンライト（Tropix
社）を用いて、添付のプロトコルに従い、プローブのビ
オチンと結合させたアルカリ性フォスフォターゼ標識ス
トレプトアビジンを標識酵素アルカリ性フォスフォター
ゼとAMPPDによる化学発光法を利用して行った。
ゼーションしたＤＮＡの検出は、サザンライト（Tropix
社）を用いて、添付のプロトコルに従い、プローブのビ
オチンと結合させたアルカリ性フォスフォターゼ標識ス
トレプトアビジンを標識酵素アルカリ性フォスフォター
ゼとAMPPDによる化学発光法を利用して行った。
【０１５１】その結果、ＰＨＡ合成微生物であるYN2、H
45、P91、P161株由来のDNAをブロットしたものについて
は、きわめて強い陽性の反応を確認できた。一方、ＰＨ
Ａ合成能を持たない他の二種の菌株においては、陽性の
反応を検出することはできなかった。従って、本実施例
に用いた本発明のプローブは、ＰＨＡ合成微生物の検出
に適用可能な特異性を示すものであることが確認され
た。
45、P91、P161株由来のDNAをブロットしたものについて
は、きわめて強い陽性の反応を確認できた。一方、ＰＨ
Ａ合成能を持たない他の二種の菌株においては、陽性の
反応を検出することはできなかった。従って、本実施例
に用いた本発明のプローブは、ＰＨＡ合成微生物の検出
に適用可能な特異性を示すものであることが確認され
た。
【０１５２】（実施例８） ＰＨＡ合成微生物のプロー
ブを用いた検出（２） 実施例７に示す通り、本発明のプローブは、YN2、H45、
P91、P161株のようなＰＨＡ合成微生物の検出に適用可
能な特異性を示すものであるが、本実施例は、種々のハ
イブリダイゼーション法に適用できることを検証した一
例を示す。
ブを用いた検出（２） 実施例７に示す通り、本発明のプローブは、YN2、H45、
P91、P161株のようなＰＨＡ合成微生物の検出に適用可
能な特異性を示すものであるが、本実施例は、種々のハ
イブリダイゼーション法に適用できることを検証した一
例を示す。
【０１５３】ＰＨＡ合成能を持たない既知の二菌株；E.
coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）、ＰＨＡ合成能を
有する四菌株；P.cichorii YN2（FERM P-17411）、P.ci
chorii H45（FERM P-17410）、P.putida P91（FERM P-1
7409）、P.jessenii P161（FERM P-17445）の計６種の
細菌を、それぞれ常法により培養した。培養した菌を集
菌し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）で洗浄の
後、前記緩衝液を用いて、それぞれの菌数が２×１０7c
ells/mlになるよう菌懸濁液を調製した。
coli JM109およびJ1（FERM BP-5352）、ＰＨＡ合成能を
有する四菌株；P.cichorii YN2（FERM P-17411）、P.ci
chorii H45（FERM P-17410）、P.putida P91（FERM P-1
7409）、P.jessenii P161（FERM P-17445）の計６種の
細菌を、それぞれ常法により培養した。培養した菌を集
菌し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）で洗浄の
後、前記緩衝液を用いて、それぞれの菌数が２×１０7c
ells/mlになるよう菌懸濁液を調製した。
【０１５４】調製した菌懸濁液50μlに、６％のホルム
アルデヒド溶液を50μl加え、菌体を固定した。次い
で、0.1％ ゼラチン、0.01％ クロムミョウバンでコー
トしたスライドグラスに、固定菌体の懸濁液30μlを滴
下し、風乾した。この菌体試料を固定したスライドグラ
スを、90％ メタノール、3％ ホルムアルデヒド溶液に1
0分間浸けて菌体の再固定を行った後、純水で洗浄し
た。
アルデヒド溶液を50μl加え、菌体を固定した。次い
で、0.1％ ゼラチン、0.01％ クロムミョウバンでコー
トしたスライドグラスに、固定菌体の懸濁液30μlを滴
下し、風乾した。この菌体試料を固定したスライドグラ
スを、90％ メタノール、3％ ホルムアルデヒド溶液に1
0分間浸けて菌体の再固定を行った後、純水で洗浄し
た。
【０１５５】上記処理を行った固定菌体試料を固定した
スライドグラスを、50mM ＮａＢＨ4を含む10mM Tris-Cl
緩衝液（pH8.0）に室温で30分間、遮光状態で浸した。
その後、純水で洗浄し、風乾した。
スライドグラスを、50mM ＮａＢＨ4を含む10mM Tris-Cl
緩衝液（pH8.0）に室温で30分間、遮光状態で浸した。
その後、純水で洗浄し、風乾した。
【０１５６】プローブには、実施例３で調製したビオチ
ン標識オリゴヌクレオチドプローブ：
ン標識オリゴヌクレオチドプローブ：
【０１５７】
【化２５】
【０１５８】に対して、FITC（Fluorescein isothiocya
nate）標識されたストレプトアビジンを前記ビオチンに
対して予め結合させたものを用いた。このFITC標識プロ
ーブを、ハイブリダイゼーション溶液（0.1M Tris-Cl緩
衝液（pH8.0）、0.75M NaCl、5mM EDTA、10％硫酸デキ
ストラン、0.2％ BSA（Bovine Serum Albumin）、0.01
％ポリアデニル酸）に濃度5ng/μｌ添加した液30μl
を、スライドグラス上に滴下した。スライドグラスを気
密性の容器に入れて、45℃、1時間の反応を遮光状態で
行った。
nate）標識されたストレプトアビジンを前記ビオチンに
対して予め結合させたものを用いた。このFITC標識プロ
ーブを、ハイブリダイゼーション溶液（0.1M Tris-Cl緩
衝液（pH8.0）、0.75M NaCl、5mM EDTA、10％硫酸デキ
ストラン、0.2％ BSA（Bovine Serum Albumin）、0.01
％ポリアデニル酸）に濃度5ng/μｌ添加した液30μl
を、スライドグラス上に滴下した。スライドグラスを気
密性の容器に入れて、45℃、1時間の反応を遮光状態で
行った。
【０１５９】反応後、SET緩衝液（Tris-Cl（pH8.0）、
0.2mM EDTA、30mM NaCl）でスライドグラスを洗浄し、
遮光状態で風乾した。FITC標識プローブのハイブリダイ
ゼーションした菌を検出するため、オリンパスの落射型
蛍光顕微鏡で検鏡を行い蛍光の有無を調べた。励起光源
は水銀ランプを使用し、B励起により観察を行った。検
鏡の結果、ＰＨＡ合成微生物であるYN2、H45、P91、P16
1株については、いずれも菌体に蛍光が認められた。一
方、ＰＨＡ合成能を持たない、他の二種の細菌では蛍光
を観察することはできなかった。
0.2mM EDTA、30mM NaCl）でスライドグラスを洗浄し、
遮光状態で風乾した。FITC標識プローブのハイブリダイ
ゼーションした菌を検出するため、オリンパスの落射型
蛍光顕微鏡で検鏡を行い蛍光の有無を調べた。励起光源
は水銀ランプを使用し、B励起により観察を行った。検
鏡の結果、ＰＨＡ合成微生物であるYN2、H45、P91、P16
1株については、いずれも菌体に蛍光が認められた。一
方、ＰＨＡ合成能を持たない、他の二種の細菌では蛍光
を観察することはできなかった。
【０１６０】本実施例に示すように、本発明のプローブ
は、微生物から調製したＤＮＡ試料を用いる場合は勿論
のこと、その他、固定菌体を試料とする手法において
も、十分に目的とするＰＨＡ合成微生物の検出に適用可
能な特異性を有することが確認された。
は、微生物から調製したＤＮＡ試料を用いる場合は勿論
のこと、その他、固定菌体を試料とする手法において
も、十分に目的とするＰＨＡ合成微生物の検出に適用可
能な特異性を有することが確認された。
【０１６１】
【発明の効果】本発明の核酸断片は、配列番号：１〜９
に示す塩基配列またはその相補的な塩基配列、あるい
は、これらに基づき、その部分塩基配列を含むもので、
この特定の塩基配列を有する核酸断片をプライマーまた
はプローブとして利用すれば、ＰＨＡ合成微生物の検出
を特異的に行うことができる。従って、前記の通り、本
発明のプライマーまたはプローブを用いるＰＨＡ合成微
生物の検出方法は、その検出感度、特異性、また、手順
の簡便さ、迅速性の点で優れた検出方法となる。このよ
うに、ＰＨＡ合成微生物の検出が効率化されると、ＰＨ
Ａ合成微生物を利用して生産されるＰＨＡの開発、例え
ば、生分解性プラスチックなどの分野における研究・開
発に多大な貢献をなすものである。
に示す塩基配列またはその相補的な塩基配列、あるい
は、これらに基づき、その部分塩基配列を含むもので、
この特定の塩基配列を有する核酸断片をプライマーまた
はプローブとして利用すれば、ＰＨＡ合成微生物の検出
を特異的に行うことができる。従って、前記の通り、本
発明のプライマーまたはプローブを用いるＰＨＡ合成微
生物の検出方法は、その検出感度、特異性、また、手順
の簡便さ、迅速性の点で優れた検出方法となる。このよ
うに、ＰＨＡ合成微生物の検出が効率化されると、ＰＨ
Ａ合成微生物を利用して生産されるＰＨＡの開発、例え
ば、生分解性プラスチックなどの分野における研究・開
発に多大な貢献をなすものである。
【０１６２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> CANON INC. <120> DNA Fragments Specific to Genes of Enzymes for Preparation of Poly -hidroxyalkanoic Acid and Methods Using those for Probing and/or Screeni ng Micro-oraganisms producing the PHA <130> 4052014 <160> 9 <170> Microsoft Word <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 1 gcctc kgaaa acacc ytggg sct 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 2 tgacc gargc cwtsg csccg acc 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 3 agcct ggcgc gsttc tgcct gcgc 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 4 ggcga raasa aggtc aaygc cytsa cc 27 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 5 caagc ayrcc gaytc ctggt ggctg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 6 tgcar gccta yctgr sctgg cagaa 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 7 ccagt acrys ctsaa raayg gcctg c 26 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 8 ctgga cttct tcaag cwcaa cccg 24 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 9 ccaac agcgg bcayr tscag agcat 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 10 gcctc ggaaa acacc ttggg gct 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 11 tgacc gaagc catgg cgccg acc 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 12 agcct ggcgc ggttc tgcct gcgc 24 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 13 ggcga aaaca aggtc aacgc cctga cc 27 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 14 tgcag gccta cctga gctgg cagaa 25 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 15 ccagt acgcg ctgaa gaacg gcctg c 26 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 16 ctgga cttct tcaag cacaa cccg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 17 caagc acgcc gactc ctggt ggctg 25 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 18 ccaac agcgg gcatg tccag agcat 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 本間 務 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 須田 栄 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA03 CA09 GA30 4B063 QA01 QA13 QQ05 QQ42 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34
Claims (14)
- 【請求項１】 配列番号：１〜９に示す塩基配列、また
はその相補的な塩基配列、あるいは、これらの塩基配列
に基づき変異が施された改変配列の何れかから選ばれる
核酸断片。 - 【請求項２】 請求項１に記載される核酸断片、あるい
はその塩基配列中の部分配列からなる核酸断片からなる
プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸断片。 - 【請求項３】 配列番号：１〜９に示す塩基配列、また
はその相補的な塩基配列に基づき施される変異が、塩基
配列の一部欠失、余剰な塩基または塩基配列の付加、ま
たは塩基配列中の塩基または部分配列を他の塩基あるい
は塩基配列により置換、もしくは、これらの変異を複合
して施したものであることを特徴とする請求項１または
２のいずれかに記載の核酸断片。 - 【請求項４】 請求項２または３のいずれか１項に記載
のプライマーとして利用可能な核酸断片を含むプライマ
ーであって、付加的な修飾として、前記核酸断片の分子
上に結合する標識物、または／および固相担体と結合可
能な部位が導入されていてもよいプライマー。 - 【請求項５】 請求項２または３のいずれか１項に記載
のプローブとして利用可能な核酸断片を含むプローブで
あって、付加的な修飾として、前記核酸断片の分子上に
結合する標識物、または／および固相担体と結合可能な
部位が導入されていてもよいプローブ。 - 【請求項６】 塩基配列に実質的な差異のある二種の核
酸断片の組み合わせからなるプライマーであって、前記
二種の核酸断片の少なくとも一つは請求項４に記載され
るプライマー用核酸断片であり、二種の核酸断片はそれ
ぞれ、その分子上に標識物、または／および固相担体と
結合可能な部位が導入されていてもよいプライマー。 - 【請求項７】 請求項４に記載されるプライマー用核酸
断片の塩基配列は、配列番号：１〜９に示す塩基配列ま
たはその相補的な塩基配列に基づき、塩基配列の一部欠
失、余剰な塩基または塩基配列の付加、または塩基配列
中の塩基または部分配列を他の塩基あるいは塩基配列に
より置換、もしくは、これらの変異を複合して施した改
変塩基配列であることを特徴とする請求項４または請求
項６のいずれかに記載のプライマー。 - 【請求項８】 付加的な修飾が施された核酸断片を少な
くとも一種含み、前記の核酸断片の一種における付加的
な修飾は、標識物または固相担体と結合可能な部位の、
核酸断片の5' 末端側への導入であることを特徴とする
請求項４〜７のいずれか１項に記載のプライマーまたは
プローブ。 - 【請求項９】 付加的な修飾として、分子上に導入され
る標識物または固相担体と結合可能な部位が、ビオチン
残基、2,4 - ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン残基
のいずれかであることを特徴とする請求項４〜８のいず
れか１項に記載のプライマーまたはプローブ。 - 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれか１項に記載す
る核酸断片の少なくとも一種をプローブとして用いるこ
とを特徴とするＰＨＡ合成微生物の検出方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれか１項に記載す
る核酸断片の少なくとも一種をプライマーとして用いる
ことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成微
生物の検出方法。 - 【請求項１２】 請求項４または６に記載するプライマ
ーを用い、下記（１）〜（４）に記載する４工程： （１）ポリヒドロキシアルカノエート合成微生物の有無
を検出したい試料を準備する工程 （２）必要に応じて、試料中の菌体の破砕処理を行う工
程 （３）試料中に前記プライマーを加え、プライマーの伸
張反応を行う工程 （４）工程（３）で得られた伸張反応物について検出操
作を行う工程 前記工程（１）、工程（３）、工程（４）と必要に応じ
て工程（２）を含むことを特徴とするポリヒドロキシア
ルカノエート合成微生物の検出方法。 - 【請求項１３】 請求項６に記載する二種の核酸断片の
組み合わせからなるプライマーを用いることを特徴とす
る請求項１２に記載のポリヒドロキシアルカノエート合
成微生物の検出方法。 - 【請求項１４】 工程（３）のプライマーの伸張反応が
ポリメラーゼ連鎖反応によりなされることを特徴とする
請求項１２または１３に記載のポリヒドロキシアルカノ
エート合成微生物の検出方法。
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-
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