JPH07255486A - 新規核酸断片およびこれらを用いたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出法 - Google Patents
新規核酸断片およびこれらを用いたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出法Info
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- JPH07255486A JPH07255486A JP6051739A JP5173994A JPH07255486A JP H07255486 A JPH07255486 A JP H07255486A JP 6051739 A JP6051739 A JP 6051739A JP 5173994 A JP5173994 A JP 5173994A JP H07255486 A JPH07255486 A JP H07255486A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の正確な検出。 【構成】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から抽出した特異
配列をプライマーまたはプローブとして用いて検出す
る。
ＫＫ０１株の正確な検出。 【構成】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から抽出した特異
配列をプライマーまたはプローブとして用いて検出す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規核酸断片およびその
用途に関する。詳しくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃ
ｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株を検出するためのプライマー
またはプローブとして利用可能な核酸断片、およびそれ
を構成している塩基配列の部分配列、およびこれらを用
いたＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出法に関する
ものである。
用途に関する。詳しくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃ
ｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株を検出するためのプライマー
またはプローブとして利用可能な核酸断片、およびそれ
を構成している塩基配列の部分配列、およびこれらを用
いたＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌は、グラ
ム陰性の偏性好気性桿菌で、きわめて多彩な有機化合物
を代謝する能力を持ち、特に各種芳香族化合物の分解能
に優れていることが知られている。
ム陰性の偏性好気性桿菌で、きわめて多彩な有機化合物
を代謝する能力を持ち、特に各種芳香族化合物の分解能
に優れていることが知られている。
【０００３】近年、芳香族化合物、パラフィン、ナフテ
ンなどの脂肪族炭化水素、あるいはトリクロロエチレン
などの有機塩素系化合物などによる環境汚染が問題とな
っており、すでに汚染されてしまった環境を浄化し、も
との状態に修復していく技術の確立が強く求められてい
る。この環境修復技術としては種々の物理化学的な手法
が行われているが、コスト、操作性、投下エネルギー
量、処理範囲などに係る難点、汚染物質の単なる抽出、
回収に留まり無害な化学物に変換するものではないなど
の観点より、必ずしも実用的に満足できる技術であると
はいえない。
ンなどの脂肪族炭化水素、あるいはトリクロロエチレン
などの有機塩素系化合物などによる環境汚染が問題とな
っており、すでに汚染されてしまった環境を浄化し、も
との状態に修復していく技術の確立が強く求められてい
る。この環境修復技術としては種々の物理化学的な手法
が行われているが、コスト、操作性、投下エネルギー
量、処理範囲などに係る難点、汚染物質の単なる抽出、
回収に留まり無害な化学物に変換するものではないなど
の観点より、必ずしも実用的に満足できる技術であると
はいえない。
【０００４】そこで、上記の物理化学的手法に対して、
微生物を利用した処理が実用的な汚染環境の修復方法を
提供できるものとして期待されている。ここで、汚染物
質の多くは化学工業などで使用される合成物質であり、
自然界に生息する微生物によっては普遍的には分解され
ないためその処理が容易でないものが多い。しかし、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌は先に述べたようにきわめ
て多彩な有機化合物を代謝する能力を持っており、土壌
汚染問題を引き起こしている芳香族炭化水素や有機塩素
系化合物などの難分解性化合物と言われるものでも分解
することができる菌株が数多く分離されてきている。と
りわけトリクロロエチレン分解菌の開発は盛んに進めら
れており、その分解活性を向上させたり、あるいはトリ
クロロエチレン分解酵素の誘導物質を不要化したりした
遺伝子組み換え菌の土壌への散布なども検討されはじめ
てきている。
微生物を利用した処理が実用的な汚染環境の修復方法を
提供できるものとして期待されている。ここで、汚染物
質の多くは化学工業などで使用される合成物質であり、
自然界に生息する微生物によっては普遍的には分解され
ないためその処理が容易でないものが多い。しかし、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌は先に述べたようにきわめ
て多彩な有機化合物を代謝する能力を持っており、土壌
汚染問題を引き起こしている芳香族炭化水素や有機塩素
系化合物などの難分解性化合物と言われるものでも分解
することができる菌株が数多く分離されてきている。と
りわけトリクロロエチレン分解菌の開発は盛んに進めら
れており、その分解活性を向上させたり、あるいはトリ
クロロエチレン分解酵素の誘導物質を不要化したりした
遺伝子組み換え菌の土壌への散布なども検討されはじめ
てきている。
【０００５】ここで、発明者らはＰ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株（寄託番号：Ｐ−１２８６９号）がトリクロ
ロエチレンを分解することを明らかにしており、このよ
うなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を利用した環境浄化
技術を普及させ、さらにこの技術を実用的かつ社会的に
有効な技術として定着させていくために、分解能力など
にすぐれた菌の開発とともに、それらを導入した土壌に
おける菌の活動、増殖、伝搬、生残、つまりは土壌中で
の菌の優占度、生育状況などを十分に把握していくこと
を研究している。これらの課題を解決していくために
は、目的とする菌を選択的に検出することができる手法
の確立がまず必要不可欠である。
ＫＫ０１株（寄託番号：Ｐ−１２８６９号）がトリクロ
ロエチレンを分解することを明らかにしており、このよ
うなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を利用した環境浄化
技術を普及させ、さらにこの技術を実用的かつ社会的に
有効な技術として定着させていくために、分解能力など
にすぐれた菌の開発とともに、それらを導入した土壌に
おける菌の活動、増殖、伝搬、生残、つまりは土壌中で
の菌の優占度、生育状況などを十分に把握していくこと
を研究している。これらの課題を解決していくために
は、目的とする菌を選択的に検出することができる手法
の確立がまず必要不可欠である。
【０００６】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の検出方法
としては種々の分離培養法が知られており、一般的には
特別な培地による選択培養を行うことが多い。この方法
は簡便であるため広く用いられるが、目的とする菌のみ
が必ずしも選択的に培養されるとは限らない。たとえ
ば、フェノールを分解する菌であるＰ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の場合には、カテコールのカテコール２，３
オキシゲナーゼによる分解産物である２−ヒドロキシム
コン酸セミアルデヒドの黄色の着色を簡便な指標とする
ことができる。しかしながら、カテコールをメタ開裂に
より代謝できる他の菌が存在する可能性もあり、厳密に
は黄色の着色のみをその指標とすることはできず、更に
詳細な形態学的、あるいは生化学的な性状をも検査する
必要がある。
としては種々の分離培養法が知られており、一般的には
特別な培地による選択培養を行うことが多い。この方法
は簡便であるため広く用いられるが、目的とする菌のみ
が必ずしも選択的に培養されるとは限らない。たとえ
ば、フェノールを分解する菌であるＰ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の場合には、カテコールのカテコール２，３
オキシゲナーゼによる分解産物である２−ヒドロキシム
コン酸セミアルデヒドの黄色の着色を簡便な指標とする
ことができる。しかしながら、カテコールをメタ開裂に
より代謝できる他の菌が存在する可能性もあり、厳密に
は黄色の着色のみをその指標とすることはできず、更に
詳細な形態学的、あるいは生化学的な性状をも検査する
必要がある。
【０００７】しかしここで必要となる形態学的、あるい
は生化学的な性状から目的とする菌を検出するには数多
の熟練と経験を要し、しかもその手法は煩雑であり時間
がかかるなど、実用面では種々の問題があった。
は生化学的な性状から目的とする菌を検出するには数多
の熟練と経験を要し、しかもその手法は煩雑であり時間
がかかるなど、実用面では種々の問題があった。
【０００８】また、目的とする菌に特異的な抗体を用意
し放射性同位元素または蛍光色素でラベルし検出に用い
る方法も知られているが、この方法はまず抗体を得るの
に非常に手間がかかる点と、更に抗体の特異性がロット
により大きくばらつく点が大きな難点であった。
し放射性同位元素または蛍光色素でラベルし検出に用い
る方法も知られているが、この方法はまず抗体を得るの
に非常に手間がかかる点と、更に抗体の特異性がロット
により大きくばらつく点が大きな難点であった。
【０００９】これらの方法に代るものとして、生物種に
特異的な核酸の塩基配列に着目し、それに相補的な配列
を持つオリゴヌクレオチドプライマーあるいはプローブ
を利用することによりその生物種を検出する方法が発表
されている。特に、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は
生物において必須の細胞構成成分であり、その構造は生
物の進化の過程において比較的よく保存されている。ｒ
ＲＮＡの中でも１６ＳｒＲＮＡについては比較的よく研
究が行われており、多くの生物種についてその塩基配列
が同定されている。
特異的な核酸の塩基配列に着目し、それに相補的な配列
を持つオリゴヌクレオチドプライマーあるいはプローブ
を利用することによりその生物種を検出する方法が発表
されている。特に、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は
生物において必須の細胞構成成分であり、その構造は生
物の進化の過程において比較的よく保存されている。ｒ
ＲＮＡの中でも１６ＳｒＲＮＡについては比較的よく研
究が行われており、多くの生物種についてその塩基配列
が同定されている。
【００１０】１６Ｓ ｒＲＮＡには種々の生物で共通に
保存されている領域と、生物種により配列の異なる可変
領域のあることが知られており、この可変領域に対応す
るＤＮＡプライマーあるいはプローブを利用した菌の検
出、同定法が近年開発されてきた。たとえば、ｒＲＮＡ
は細胞中に１０4 個以上存在し、ハイブリダイゼーシ
ョン法のターゲットとしては感度の面からも非常に有利
に利用できるものであるが、ここでは、目的とする菌を
検出するためのプローブまたはプライマーをいかに選択
するかの点こそが最も重要かつ困難な課題となってお
り、この方法を利用するためには目的とする細菌の１６
Ｓ ｒＲＮＡ、あるいはその遺伝子の塩基配列を正しく
知る必要がある。
保存されている領域と、生物種により配列の異なる可変
領域のあることが知られており、この可変領域に対応す
るＤＮＡプライマーあるいはプローブを利用した菌の検
出、同定法が近年開発されてきた。たとえば、ｒＲＮＡ
は細胞中に１０4 個以上存在し、ハイブリダイゼーシ
ョン法のターゲットとしては感度の面からも非常に有利
に利用できるものであるが、ここでは、目的とする菌を
検出するためのプローブまたはプライマーをいかに選択
するかの点こそが最も重要かつ困難な課題となってお
り、この方法を利用するためには目的とする細菌の１６
Ｓ ｒＲＮＡ、あるいはその遺伝子の塩基配列を正しく
知る必要がある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】前述のように、特定の
微生物を利用して土壌中の汚染物質の浄化処理を行う場
合、処理の条件や微生物の生育条件を最適にするために
は、まづその微生物の土壌中での優占度や生育状況を知
る必要がある。そのためには微生物を特異的に検出、計
測できる方法が必要であるが、いままでのＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ属細菌の検出はフェノールを唯一の炭素源と
する選択培地による培養や、抗体法などによるもので、
その特異性、感度、簡便さ、検出に要する時間などの点
で問題が多く、土壌中での菌の挙動をリアルタイムでモ
ニタリングすることは不可能であった。
微生物を利用して土壌中の汚染物質の浄化処理を行う場
合、処理の条件や微生物の生育条件を最適にするために
は、まづその微生物の土壌中での優占度や生育状況を知
る必要がある。そのためには微生物を特異的に検出、計
測できる方法が必要であるが、いままでのＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ属細菌の検出はフェノールを唯一の炭素源と
する選択培地による培養や、抗体法などによるもので、
その特異性、感度、簡便さ、検出に要する時間などの点
で問題が多く、土壌中での菌の挙動をリアルタイムでモ
ニタリングすることは不可能であった。
【００１２】本発明は、上記従来技術の課題に鑑みなさ
れたものであり、その目的は迅速、簡易かつ特異的に、
しかも感度よくＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株を検
出、計数する方法を提供することにある。
れたものであり、その目的は迅速、簡易かつ特異的に、
しかも感度よくＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株を検
出、計数する方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、後記の配列番
号１で表されるＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の１６
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を提供するものである。本発明はま
た、上記遺伝子配列で示される核酸、ならびに、その相
補的な塩基配列を有する核酸、および、これらの変異配
列で示される核酸から選ばれる核酸断片に関するもので
ある。
号１で表されるＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の１６
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を提供するものである。本発明はま
た、上記遺伝子配列で示される核酸、ならびに、その相
補的な塩基配列を有する核酸、および、これらの変異配
列で示される核酸から選ばれる核酸断片に関するもので
ある。
【００１４】本発明は、また、上記のいずれかの核酸中
の部分配列であってプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸からなる核酸断片に関する。具体的には、
プライマーとして利用可能な核酸が１０〜５０塩基の長
さであり、プローブとして利用可能な核酸が１０塩基か
ら上限は各核酸の全塩基数以下の長さの核酸断片であ
る。
の部分配列であってプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸からなる核酸断片に関する。具体的には、
プライマーとして利用可能な核酸が１０〜５０塩基の長
さであり、プローブとして利用可能な核酸が１０塩基か
ら上限は各核酸の全塩基数以下の長さの核酸断片であ
る。
【００１５】また、本発明は上記核酸断片を利用したプ
ライマーまたはプローブに関する。すなわち本発明によ
るプライマーまたはプローブは、上記したような核酸断
片であって、標識物または（および）固相担体と結合可
能な部位が導入されている場合もある核酸断片からなる
プライマーまたはプローブである。
ライマーまたはプローブに関する。すなわち本発明によ
るプライマーまたはプローブは、上記したような核酸断
片であって、標識物または（および）固相担体と結合可
能な部位が導入されている場合もある核酸断片からなる
プライマーまたはプローブである。
【００１６】本発明は、また、上記のプライマー、ある
いはプローブを利用したＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１
株の検出方法に関する。すなわち、プライマーを利用し
た本発明によるＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出
方法は、上記したような本発明によるプライマー、好ま
しくは２種の組み合わせからなるプライマーを用いて、
下記（１）〜（４）の工程を実施することを特徴とする
ものである。 （１）Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の有無を検出し
たい試料を準備し、（２）必要に応じて、試料中の菌体
の破砕処理を行い、（３）試料に上記プライマーを加え
プライマーの伸張反応を行い、（４）工程（３）で得ら
れた伸張反応物について検出操作を行う。
いはプローブを利用したＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１
株の検出方法に関する。すなわち、プライマーを利用し
た本発明によるＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出
方法は、上記したような本発明によるプライマー、好ま
しくは２種の組み合わせからなるプライマーを用いて、
下記（１）〜（４）の工程を実施することを特徴とする
ものである。 （１）Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の有無を検出し
たい試料を準備し、（２）必要に応じて、試料中の菌体
の破砕処理を行い、（３）試料に上記プライマーを加え
プライマーの伸張反応を行い、（４）工程（３）で得ら
れた伸張反応物について検出操作を行う。
【００１７】また、プローブを利用した本発明による
Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出方法は、前記し
たようなプローブの少なくとも１種を用いることを特徴
とするものである。
Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出方法は、前記し
たようなプローブの少なくとも１種を用いることを特徴
とするものである。
【００１８】以下、本発明を詳細に説明するが、ここで
いうＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株は、この発明の目
的に適う限りにおいて遺伝子工学の常識に従って同等の
作用を奏するその突然変異株も包含するものである。
いうＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株は、この発明の目
的に適う限りにおいて遺伝子工学の常識に従って同等の
作用を奏するその突然変異株も包含するものである。
【００１９】Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング、全塩基配列の決定 既知の種々のグラム陰性細菌のｒＲＮＡ塩基配列を比較
し、共通配列領域の推定を行った。次に、この領域より
プライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法によりＰ．ｃｅｐ
ａｃｉａ ＫＫ０１株ＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝
子領域内の約１１００塩基の断片を増幅し、プラスミド
ｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位にクローニングし
た。得られた遺伝子の塩基配列を決定し、既知の１６Ｓ
ｒＲＮＡ塩基配列との比較により、この断片が１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子であることを確認した。
ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング、全塩基配列の決定 既知の種々のグラム陰性細菌のｒＲＮＡ塩基配列を比較
し、共通配列領域の推定を行った。次に、この領域より
プライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法によりＰ．ｃｅｐ
ａｃｉａ ＫＫ０１株ＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝
子領域内の約１１００塩基の断片を増幅し、プラスミド
ｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位にクローニングし
た。得られた遺伝子の塩基配列を決定し、既知の１６Ｓ
ｒＲＮＡ塩基配列との比較により、この断片が１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子であることを確認した。
【００２０】この遺伝子断片を用いて、完全長の、ＰＣ
Ｒを経由しない１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング
を行った。まず、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株ＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩで切断し、λファージベクターＤＡＳ
ＨＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入し、ライブラリーを調製
した。これを上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子部分断片をプ
ローブとしたプラークハイブリダイゼーション法により
スクリーニングし、完全長の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を
含むクローンを選択した。
Ｒを経由しない１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング
を行った。まず、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株ＤＮ
ＡをＳａｕ３ＡＩで切断し、λファージベクターＤＡＳ
ＨＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入し、ライブラリーを調製
した。これを上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子部分断片をプ
ローブとしたプラークハイブリダイゼーション法により
スクリーニングし、完全長の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を
含むクローンを選択した。
【００２１】塩基配列の決定は欠失法と適当な制限酵素
切断部位を利用したサブクローニングにより行った。欠
失は、プラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位
に完全長の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をリクローニングの
後、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ とＭｕｎｇ Ｂｅ
ａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅにより段階的に導入した。これ
らの段階欠失クローンおよび制限酵素を利用したサブク
ローンを用いて、ダイデオキシ法により塩基配列の決定
を行った。
切断部位を利用したサブクローニングにより行った。欠
失は、プラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位
に完全長の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をリクローニングの
後、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ とＭｕｎｇ Ｂｅ
ａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅにより段階的に導入した。これ
らの段階欠失クローンおよび制限酵素を利用したサブク
ローンを用いて、ダイデオキシ法により塩基配列の決定
を行った。
【００２２】Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＶＫＫ０１株１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の特異領域の決定 上記のようにして決定した塩基配列を、既知の他種細菌
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列と比較し、特異領域を
決定した。この場合ＥＭＢＬ核酸配列データライブラリ
などを利用しパーソナル・コンピュータを利用して解析
を行った。
ｒＲＮＡ遺伝子の特異領域の決定 上記のようにして決定した塩基配列を、既知の他種細菌
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列と比較し、特異領域を
決定した。この場合ＥＭＢＬ核酸配列データライブラリ
などを利用しパーソナル・コンピュータを利用して解析
を行った。
【００２３】決定した特異領域は、新規な塩基配列であ
り本発明の目的に利用可能性を備えているから特許請求
の範囲請求項３に列記して特許請求するものである。
り本発明の目的に利用可能性を備えているから特許請求
の範囲請求項３に列記して特許請求するものである。
【００２４】核酸断片 本発明による核酸断片は、配列番号１で示す核酸、なら
びに、その相補的な塩基配列を有する核酸、および、こ
れらの変異配列で示される核酸から選ばれる核酸断片、
また、上記のいずれかの核酸中の部分配列であってプラ
イマーまたはプローブとして利用可能な核酸からなるも
のであることは前記したとおりである。
びに、その相補的な塩基配列を有する核酸、および、こ
れらの変異配列で示される核酸から選ばれる核酸断片、
また、上記のいずれかの核酸中の部分配列であってプラ
イマーまたはプローブとして利用可能な核酸からなるも
のであることは前記したとおりである。
【００２５】これらの核酸断片は、特にプローブとし
て、また、部分塩基配列はプライマーまたはプローブと
して使用することができる。プライマーまたはプローブ
として利用可能な核酸は、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０
１株を検出するためのプライマー、あるいはプローブと
して機能するものであればよい。ここで、部分塩基配列
を用いる場合には、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株に
特異的で、他の細菌、たとえばＰ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどの他種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ属細菌、土壌よりよく分離される、Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ属細菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅ属細菌などに相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。部分塩基配列は具体的には、プラ
イマーの場合、１０〜５０塩基の長さであり、プローブ
の場合は１０塩基の長さから各核酸の全塩基数以下の長
さのものである。
て、また、部分塩基配列はプライマーまたはプローブと
して使用することができる。プライマーまたはプローブ
として利用可能な核酸は、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０
１株を検出するためのプライマー、あるいはプローブと
して機能するものであればよい。ここで、部分塩基配列
を用いる場合には、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株に
特異的で、他の細菌、たとえばＰ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどの他種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ属細菌、土壌よりよく分離される、Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ属細菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅ属細菌などに相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。部分塩基配列は具体的には、プラ
イマーの場合、１０〜５０塩基の長さであり、プローブ
の場合は１０塩基の長さから各核酸の全塩基数以下の長
さのものである。
【００２６】これらの核酸断片あるいはその部分塩基配
列は、合目的的な任意の方法により調製することがで
き、たとえば後述実施例に記載の方法に従い、配列全部
または一部を化学合成してもよい。あるいは、Ｐ．ｃｅ
ｐａｃｉａ ＫＫ０１株の遺伝子から制限酵素などを利
用して直接切り出すことも可能であり、また、それらの
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉなどのプラスミドにクローニング
し、菌の増殖の後にプラスミドを回収し、切り出して利
用することも可能である。
列は、合目的的な任意の方法により調製することがで
き、たとえば後述実施例に記載の方法に従い、配列全部
または一部を化学合成してもよい。あるいは、Ｐ．ｃｅ
ｐａｃｉａ ＫＫ０１株の遺伝子から制限酵素などを利
用して直接切り出すことも可能であり、また、それらの
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉなどのプラスミドにクローニング
し、菌の増殖の後にプラスミドを回収し、切り出して利
用することも可能である。
【００２７】本発明における上記核酸断片における変異
としては、たとえば一部の塩基もしくは塩基配列の欠
失、置換、付加などがあげられる。ここで核酸断片をプ
ライマーとして利用する場合は、プライマーの伸張反応
に大きな影響を与えると考えられる３′末端付近は変異
のないようにするか、あるいはあっても最小限にとどめ
ることが好ましく、より好適には５′末端付近で変異が
あるようにすることが本発明の目的に適う。
としては、たとえば一部の塩基もしくは塩基配列の欠
失、置換、付加などがあげられる。ここで核酸断片をプ
ライマーとして利用する場合は、プライマーの伸張反応
に大きな影響を与えると考えられる３′末端付近は変異
のないようにするか、あるいはあっても最小限にとどめ
ることが好ましく、より好適には５′末端付近で変異が
あるようにすることが本発明の目的に適う。
【００２８】ここで好適に利用できる核酸断片の塩基配
列としては、勿論前記の特異領域にそのすべてないしは
大部分が由来し僅かの隣接部分を有するもので目的遂行
に便利な程度の塩基長のものとして発明者は特許請求の
範囲の請求項６で示しているものを提出する。なお理解
の便宜の為に次にこれらの塩基配列を配列表１に示した
塩基番号を併記し再掲しておく。
列としては、勿論前記の特異領域にそのすべてないしは
大部分が由来し僅かの隣接部分を有するもので目的遂行
に便利な程度の塩基長のものとして発明者は特許請求の
範囲の請求項６で示しているものを提出する。なお理解
の便宜の為に次にこれらの塩基配列を配列表１に示した
塩基番号を併記し再掲しておく。
【００２９】
【表１３】
【００３０】
【表１４】
【００３１】
【表１５】
【００３２】
【表１６】
【００３３】
【表１７】
【００３４】
【表１８】
【００３５】
【表１９】
【００３６】
【表２０】
【００３７】
【表２１】
【００３８】
【表２２】
【００３９】
【表２３】 標識物および固相担体と結合可能な部位 このような、プライマーまたはプローブとして利用可能
な核酸断片または部分塩基配列は、必要なら標識物また
は固相担体と結合可能な部位が導入されていてもよい。
ここで、プライマーを利用した検出を行う場合、標識物
または固相担体と結合可能な部位を導入してよい位置は
プライマーの伸張反応を妨げない位置ならばどこでもよ
いが、可能であれば５′末端は最も好ましい。またプロ
ーブを利用した検出を行う場合なら、標識物または固相
担体と結合可能な部位を導入してよい位置は３′末端や
５′末端の水酸基部分さらには塩基部分やりん酸ジエス
テル部分などが考えられるが、プローブの塩基配列や長
さなどを考慮し、ハイブリダイゼーションの妨げになら
ないようにすることが望ましい。
な核酸断片または部分塩基配列は、必要なら標識物また
は固相担体と結合可能な部位が導入されていてもよい。
ここで、プライマーを利用した検出を行う場合、標識物
または固相担体と結合可能な部位を導入してよい位置は
プライマーの伸張反応を妨げない位置ならばどこでもよ
いが、可能であれば５′末端は最も好ましい。またプロ
ーブを利用した検出を行う場合なら、標識物または固相
担体と結合可能な部位を導入してよい位置は３′末端や
５′末端の水酸基部分さらには塩基部分やりん酸ジエス
テル部分などが考えられるが、プローブの塩基配列や長
さなどを考慮し、ハイブリダイゼーションの妨げになら
ないようにすることが望ましい。
【００４０】上記核酸をプローブまたはプライマーとし
て利用する場合、標識物として、放射性物質、非放射性
物質のどちらを用いてもよい。非放射性の標識物として
は、直接標識可能なものとしてフルオレセイン誘導体、
ローダミンおよびその誘導体などの蛍光物質、化学発光
物質、遅延蛍光物質などがあげられる。
て利用する場合、標識物として、放射性物質、非放射性
物質のどちらを用いてもよい。非放射性の標識物として
は、直接標識可能なものとしてフルオレセイン誘導体、
ローダミンおよびその誘導体などの蛍光物質、化学発光
物質、遅延蛍光物質などがあげられる。
【００４１】また、標識物と特異的に結合する物質を利
用し間接的に標識物を検出することも可能である。こう
した標識物としてはビオチン、ハプテンなどがあげら
れ、ビオチンの場合アビジンあるいはストレプトアビジ
ンを、ハプテンの場合はこれに特異的に結合する抗体を
利用する。ハプテンとしては２，４−ジニトロフェニル
基を有する化合物やジゴキシゲニンなどを使うことがで
きる。これらの標識物はいずれも単独あるいは必要に応
じ複数種を組み合わせて、プローブまたはプライマーに
導入可能である。
用し間接的に標識物を検出することも可能である。こう
した標識物としてはビオチン、ハプテンなどがあげら
れ、ビオチンの場合アビジンあるいはストレプトアビジ
ンを、ハプテンの場合はこれに特異的に結合する抗体を
利用する。ハプテンとしては２，４−ジニトロフェニル
基を有する化合物やジゴキシゲニンなどを使うことがで
きる。これらの標識物はいずれも単独あるいは必要に応
じ複数種を組み合わせて、プローブまたはプライマーに
導入可能である。
【００４２】サンドイッチハイブリダイゼーションなど
核酸の特定断片を固相担体に特異的に結合する必要があ
る場合は、固相担体と結合可能な部位は、該担体と選択
的に結合可能なものであれば何であってもよい。たとえ
ば、ビオチンあるいはフルオレセイン、２，４−ジニト
ロフェニル基を有する化合物やジゴキシゲニンなどのハ
プテンがあげられ、これらはいずれも単独あるいは必要
に応じ複数種を組み合わせて、プローブまたはプライマ
ーに導入可能である。
核酸の特定断片を固相担体に特異的に結合する必要があ
る場合は、固相担体と結合可能な部位は、該担体と選択
的に結合可能なものであれば何であってもよい。たとえ
ば、ビオチンあるいはフルオレセイン、２，４−ジニト
ロフェニル基を有する化合物やジゴキシゲニンなどのハ
プテンがあげられ、これらはいずれも単独あるいは必要
に応じ複数種を組み合わせて、プローブまたはプライマ
ーに導入可能である。
【００４３】プローブを用いた検出法 プローブを用いた本発明によるＰ．ｃｅｐａｃｉａ Ｋ
Ｋ０１株の検出法は、前記核酸断片の塩基配列を有する
核酸断片であって、標識物または（および）固相担体と
結合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片よ
りなるプローブの少なくとも１種を用いることを特徴と
するものである。
Ｋ０１株の検出法は、前記核酸断片の塩基配列を有する
核酸断片であって、標識物または（および）固相担体と
結合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片よ
りなるプローブの少なくとも１種を用いることを特徴と
するものである。
【００４４】一般的にプローブを用いた検出法として
は、ドットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダ
イゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーショ
ンがあり、これらのいずれでも上記標識核酸断片を使用
し、常法どおりハイブリダイゼーションを行うことがで
きる。
は、ドットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダ
イゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーショ
ンがあり、これらのいずれでも上記標識核酸断片を使用
し、常法どおりハイブリダイゼーションを行うことがで
きる。
【００４５】近年、ハイブリダイゼーションの感度をあ
げるために１細胞あたり多数のコピーが存在するｒＲＮ
Ａを検出ターゲットとする方法が開発されているが、本
発明における核酸断片は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする
領域を含む核酸断片であり、同様の手法でｒＲＮＡの検
出に供することができる。
げるために１細胞あたり多数のコピーが存在するｒＲＮ
Ａを検出ターゲットとする方法が開発されているが、本
発明における核酸断片は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする
領域を含む核酸断片であり、同様の手法でｒＲＮＡの検
出に供することができる。
【００４６】また、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョンにおいても、一般にｒＲＮＡを検出ターゲットとす
ることでＳ／Ｎ比のよい検出が可能であるが、上記同様
に本発明における核酸断片を検出に供することが可能で
ある。
ョンにおいても、一般にｒＲＮＡを検出ターゲットとす
ることでＳ／Ｎ比のよい検出が可能であるが、上記同様
に本発明における核酸断片を検出に供することが可能で
ある。
【００４７】また、操作の簡易化のためにサンドイッチ
ハイブリダイゼーションを基本とする方法が開発されて
おり、これらの方法によっても本発明における核酸断片
を利用してＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出を行
うことができる。
ハイブリダイゼーションを基本とする方法が開発されて
おり、これらの方法によっても本発明における核酸断片
を利用してＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出を行
うことができる。
【００４８】プライマーを用いた検出法 プライマーを用いた本発明によるＰ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の検出法は、前記核酸断片の塩基配列を有す
る核酸断片であって、標識物または（および）固相担体
と結合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片
よりなるプライマーの少なくとも１種を用いることを特
徴とするものであり、より好ましい例としては、後述す
るような２種の異なるプライマーによる遺伝子増幅反応
により試料中の微量核酸断片を増幅するＰＣＲ（Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を
用いた検出法である。
ＫＫ０１株の検出法は、前記核酸断片の塩基配列を有す
る核酸断片であって、標識物または（および）固相担体
と結合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片
よりなるプライマーの少なくとも１種を用いることを特
徴とするものであり、より好ましい例としては、後述す
るような２種の異なるプライマーによる遺伝子増幅反応
により試料中の微量核酸断片を増幅するＰＣＲ（Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を
用いた検出法である。
【００４９】ここで２種のプライマーの基本的な形態と
しては、たとえば、２種のプライマーともに何の修飾も
されていないもの、２種のプライマーのうち少なくとも
一方に検出可能な標識または固相担体と結合可能な部分
が導入されたもの、２種のプライマーのうち一方に標識
物が導入され、他方に固相担体と結合可能な部位が導入
されたもの、２種のプライマーともに固相担体と結合可
能な部分が導入されたもの、などがあげられる。
しては、たとえば、２種のプライマーともに何の修飾も
されていないもの、２種のプライマーのうち少なくとも
一方に検出可能な標識または固相担体と結合可能な部分
が導入されたもの、２種のプライマーのうち一方に標識
物が導入され、他方に固相担体と結合可能な部位が導入
されたもの、２種のプライマーともに固相担体と結合可
能な部分が導入されたもの、などがあげられる。
【００５０】本発明によるＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０
１株の検出方法は前記したような本発明によるプライマ
ー、好ましくは２種の組み合わせからなるプライマーを
用いて以下のように実施することができる。 （１）Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の有無を検出し
たい試料を準備し、（２）必要に応じて、試料中の菌体
の破砕処理を行い、（３）試料に上記プライマーを加え
プライマーの伸張反応を行い、（４）工程（３）で得ら
れた伸張反応物について検出操作を行う。
１株の検出方法は前記したような本発明によるプライマ
ー、好ましくは２種の組み合わせからなるプライマーを
用いて以下のように実施することができる。 （１）Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の有無を検出し
たい試料を準備し、（２）必要に応じて、試料中の菌体
の破砕処理を行い、（３）試料に上記プライマーを加え
プライマーの伸張反応を行い、（４）工程（３）で得ら
れた伸張反応物について検出操作を行う。
【００５１】ここで、プライマー伸張反応により増幅さ
れた核酸断片の検出は、電気泳動、あるいはハイブリダ
イゼーションなどの通常用いられる方法を利用してもよ
いし、遺伝子の増幅反応においてそれぞれのプライマー
に別々の標識を導入しておき、増幅反応後生成物を固相
担体に吸着し、生成物を選択的に検出する方法などを用
いることも可能である。
れた核酸断片の検出は、電気泳動、あるいはハイブリダ
イゼーションなどの通常用いられる方法を利用してもよ
いし、遺伝子の増幅反応においてそれぞれのプライマー
に別々の標識を導入しておき、増幅反応後生成物を固相
担体に吸着し、生成物を選択的に検出する方法などを用
いることも可能である。
【００５２】ここで固相担体としてはポリスチレンボー
ル、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズ、ラテック
ス、ミクロタイターウェルなどの固相材料に、プライマ
ー中に導入された結合部位を捕捉できるようなもの例え
ば、ストレプトアビジン、抗体などを導入したものがあ
げられる。たとえば、ビオチンが導入されたプライマー
からのＰＣＲ産物を捕捉するには、ストレプトアビジン
を固相に結合した担体が、フルオレセインなどが導入さ
れたプライマーからの伸張反応物を捕捉するには、それ
ぞれに対する抗体を固相に結合した担体が用いられる。
ル、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズ、ラテック
ス、ミクロタイターウェルなどの固相材料に、プライマ
ー中に導入された結合部位を捕捉できるようなもの例え
ば、ストレプトアビジン、抗体などを導入したものがあ
げられる。たとえば、ビオチンが導入されたプライマー
からのＰＣＲ産物を捕捉するには、ストレプトアビジン
を固相に結合した担体が、フルオレセインなどが導入さ
れたプライマーからの伸張反応物を捕捉するには、それ
ぞれに対する抗体を固相に結合した担体が用いられる。
【００５３】さらに、固相担体を微粒子とすることによ
り、目的とする核酸を凝集、あるいは沈殿の有無により
簡便に判定することもできる。また、一方のプライマー
には固相担体と結合可能な部位を、他方のプライマーに
は標識物を導入したものをそれぞれ用いて、伸張反応を
行った反応物を固相担体と接触させた後に不純物を適当
な溶媒で洗浄除去する方法もあり、目的核酸は標識物を
持つ形で該固相担体に固定され特異的に検出される。
り、目的とする核酸を凝集、あるいは沈殿の有無により
簡便に判定することもできる。また、一方のプライマー
には固相担体と結合可能な部位を、他方のプライマーに
は標識物を導入したものをそれぞれ用いて、伸張反応を
行った反応物を固相担体と接触させた後に不純物を適当
な溶媒で洗浄除去する方法もあり、目的核酸は標識物を
持つ形で該固相担体に固定され特異的に検出される。
【００５４】これら標識物質の実際の検出には、使用す
る標識物質に応じて一般的な手法を用いればよい。たと
えば、標識物質がラジオアイソトープであれば、そのま
ま活性を測定すればよいし、たとえばビオチンであれば
アビジン−酵素結合体、また、ハプテンであれば抗体−
酵素結合体などを用いてＡＭＰＰＤなどの基質と反応さ
せ、光学的、蛍光的手段により検出を行えばよい。
る標識物質に応じて一般的な手法を用いればよい。たと
えば、標識物質がラジオアイソトープであれば、そのま
ま活性を測定すればよいし、たとえばビオチンであれば
アビジン−酵素結合体、また、ハプテンであれば抗体−
酵素結合体などを用いてＡＭＰＰＤなどの基質と反応さ
せ、光学的、蛍光的手段により検出を行えばよい。
【００５５】また、遺伝子の増幅反応に用いる酵素、反
応条件などについてはさまざまな方法が考案されている
が、本発明における核酸断片は、種々のＰＣＲ法に利用
するのに十分な長さおよび塩基配列を持ち、これを用い
ることでＰ．ｃｅｐａｃｉａＫＫ０１株の検出を確実簡
便に行うことができるものである。
応条件などについてはさまざまな方法が考案されている
が、本発明における核酸断片は、種々のＰＣＲ法に利用
するのに十分な長さおよび塩基配列を持ち、これを用い
ることでＰ．ｃｅｐａｃｉａＫＫ０１株の検出を確実簡
便に行うことができるものである。
【００５６】
［実施例１］ Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の１６
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニングと塩基配列の決定 既知のグラム陰性好気性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓおよびＡｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）からの１６Ｓ ｒＲＮＡ
を得て、以下の２つの共通塩基配列を選び出した。
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニングと塩基配列の決定 既知のグラム陰性好気性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓおよびＡｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）からの１６Ｓ ｒＲＮＡ
を得て、以下の２つの共通塩基配列を選び出した。
【００５７】配列１：５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴ
ＧＧＣＴＣＡＧ３′ 配列２：５′ＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴ
Ｔ３′ 上記配列について、配列１については主鎖を、配列２に
ついてはその相補鎖を合成した。これらの合成したＤＮ
Ａをプライマーとして、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａＫＫ０１株
のＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。生成した約１１００
塩基対のＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ１１９のＨｉ
ｎｃＩＩ切断部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換した。
ＧＧＣＴＣＡＧ３′ 配列２：５′ＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴ
Ｔ３′ 上記配列について、配列１については主鎖を、配列２に
ついてはその相補鎖を合成した。これらの合成したＤＮ
Ａをプライマーとして、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａＫＫ０１株
のＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。生成した約１１００
塩基対のＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ１１９のＨｉ
ｎｃＩＩ切断部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換した。
【００５８】形質転換株を、アンピシリン、ＩＰＴＧ、
Ｘ−ｇａｌを含む寒天培地上で選択し、生じた白色コロ
ニーよりプラスミドを調製し、挿入断片の有無を調べ
た。約１１００塩基対のＤＮＡ断片が挿入されている組
み換えプラスミドを選択し、上記ＰＣＲ断片の末端の塩
基配列をダイデオキシ法により決定した。これを既知の
各種細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列と比較したとこ
ろ、非常に相同性が高く、この挿入断片はＰ．ｃｅｐａ
ｃｉａ ＫＫ０１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ部分配列である
と推定した。
Ｘ−ｇａｌを含む寒天培地上で選択し、生じた白色コロ
ニーよりプラスミドを調製し、挿入断片の有無を調べ
た。約１１００塩基対のＤＮＡ断片が挿入されている組
み換えプラスミドを選択し、上記ＰＣＲ断片の末端の塩
基配列をダイデオキシ法により決定した。これを既知の
各種細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列と比較したとこ
ろ、非常に相同性が高く、この挿入断片はＰ．ｃｅｐａ
ｃｉａ ＫＫ０１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ部分配列である
と推定した。
【００５９】ＰＣＲを経由しない、完全長の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子のクローニングを以下のように行った。
Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株のＤＮＡを制限酵素Ｓ
ａｕ３ＡＩで部分分解し、アガロースゲル電気泳動によ
り９〜２３キロ塩基対断片を分離、精製し、これらのＤ
ＮＡ断片をλＤＡＳＨＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）の
ＢａｍＨＩ消化物に挿入した。ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ
Ｇｏｌｄ ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を
用いて、インビトロパッケージング法によりファージ粒
子の調製を行い、ＤＮＡライブラリーを作製した。ここ
で、上記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子部分断片をプローブとし
て、該ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼ
ーション法により陽性ファージのスクリーニングを行っ
た。陽性ファージは５００個に１個程度の割合で取得で
きた。常法により陽性ファージを培養の後、塩化セシウ
ム密度勾配法によりファージＤＮＡを精製した。
ＲＮＡ遺伝子のクローニングを以下のように行った。
Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株のＤＮＡを制限酵素Ｓ
ａｕ３ＡＩで部分分解し、アガロースゲル電気泳動によ
り９〜２３キロ塩基対断片を分離、精製し、これらのＤ
ＮＡ断片をλＤＡＳＨＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）の
ＢａｍＨＩ消化物に挿入した。ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ
Ｇｏｌｄ ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を
用いて、インビトロパッケージング法によりファージ粒
子の調製を行い、ＤＮＡライブラリーを作製した。ここ
で、上記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子部分断片をプローブとし
て、該ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼ
ーション法により陽性ファージのスクリーニングを行っ
た。陽性ファージは５００個に１個程度の割合で取得で
きた。常法により陽性ファージを培養の後、塩化セシウ
ム密度勾配法によりファージＤＮＡを精製した。
【００６０】塩基配列の決定は段階欠失クローンと、１
６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内の制限酵素切断部位を利用して
得たサブクローンを用いて行った。欠失は、プラスミド
ｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位に完全長の１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子をリクローニングの後、Ｅｘｏｎｕｃｌ
ｅａｓｅＩＩＩ とＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａ
ｓｅにより段階的に導入した。これらの段階欠失クロー
ンおよび制限酵素を利用したサブクローンを用いて、ダ
イデオキシ法により塩基配列の決定を行った。こうして
決定されたＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の１６Ｓ
ｒＲＮＡの塩基配列は、配列番号１の塩基配列である。
６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内の制限酵素切断部位を利用して
得たサブクローンを用いて行った。欠失は、プラスミド
ｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位に完全長の１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子をリクローニングの後、Ｅｘｏｎｕｃｌ
ｅａｓｅＩＩＩ とＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａ
ｓｅにより段階的に導入した。これらの段階欠失クロー
ンおよび制限酵素を利用したサブクローンを用いて、ダ
イデオキシ法により塩基配列の決定を行った。こうして
決定されたＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の１６Ｓ
ｒＲＮＡの塩基配列は、配列番号１の塩基配列である。
【００６１】［実施例２］ プライマーの調製 本発明において、標識物あるいは固相担体と結合可能な
部位が導入されているプライマー、あるいは導入されて
いないプライマーは、以下に示す化学合成法により調製
した。
部位が導入されているプライマー、あるいは導入されて
いないプライマーは、以下に示す化学合成法により調製
した。
【００６２】まず、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位がいずれも導入されていないものは、ＤＮＡ自動
合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎ
ｃ．モデル３８１Ａ）を用いて、ホスホアミダイト法に
より０．２μｍｏｌスケールで合成を行い、ＯＰＣカー
トリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎ
ｃ．）により精製した。
な部位がいずれも導入されていないものは、ＤＮＡ自動
合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎ
ｃ．モデル３８１Ａ）を用いて、ホスホアミダイト法に
より０．２μｍｏｌスケールで合成を行い、ＯＰＣカー
トリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎ
ｃ．）により精製した。
【００６３】また、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位が導入されているプライマーは、まずその５′末
端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドとして合成
し、その後に適当な試薬を用いて標識物あるいは固相担
体と結合可能な部位を導入した。以下にその例を示す。
な部位が導入されているプライマーは、まずその５′末
端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドとして合成
し、その後に適当な試薬を用いて標識物あるいは固相担
体と結合可能な部位を導入した。以下にその例を示す。
【００６４】５′末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（５′−ＡＡＡＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴ
ＡＣＡＧＴＣＧ−３′）の合成は、上述したような合成
反応により５′末端に最後の塩基（この場合はＡ）を付
加した後、アミノリンクＩＩ ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）をさらに付加すること
により行い、合成終了後、ＯＰＣカートリッジにより精
製した。
レオチド（５′−ＡＡＡＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴ
ＡＣＡＧＴＣＧ−３′）の合成は、上述したような合成
反応により５′末端に最後の塩基（この場合はＡ）を付
加した後、アミノリンクＩＩ ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）をさらに付加すること
により行い、合成終了後、ＯＰＣカートリッジにより精
製した。
【００６５】ビオチン化は、以下のようにして行った。
１Ｏ．Ｄ．のアミノ化オリゴヌクレオチド水溶液１０μ
ｌに、１ＭＮａＨＣＯ３ 水溶液１０μｌ、水３０μ
ｌ、および２０μｇ／μｌのビオチニル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニミドエステル（ＢＲＬ）のＤＭＦ溶液を５０
μｌ加え、混和後室温で放置した。４時間後、セファデ
ックスＧ−５０を担体としたゲルろ過にかけ、５０ｍＭ
ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出し、最初のピークを集め乾固の
後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
１Ｏ．Ｄ．のアミノ化オリゴヌクレオチド水溶液１０μ
ｌに、１ＭＮａＨＣＯ３ 水溶液１０μｌ、水３０μ
ｌ、および２０μｇ／μｌのビオチニル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニミドエステル（ＢＲＬ）のＤＭＦ溶液を５０
μｌ加え、混和後室温で放置した。４時間後、セファデ
ックスＧ−５０を担体としたゲルろ過にかけ、５０ｍＭ
ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出し、最初のピークを集め乾固の
後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
【００６６】５′末端にジニトロフェニル基（ＤＮＰ）
を導入したオリゴヌクレオチド（５′−ＡＧＣＡＣＴＣ
ＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ−３′）は、ビオチン標
識のときと同様に、まずその５′末端にアミノ基を導入
したオリゴヌクレオチドとして合成および精製を行っ
た。このようにして得た２Ｏ．Ｄ．のアミノ化オリゴヌ
クレオチド水溶液１８０μｌに、１ＭＮａＨＣＯ３ 水
溶液２０μｌを加え、これに５％（ｖ／ｖ）ジニトロフ
ルオロベンゼンのエタノール溶液１００μｌを加え３７
℃で２時間加温し、反応を行った。精製は、ビオチン化
オリゴヌクレオチドと同様にゲルろ過により行い、乾固
の後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
を導入したオリゴヌクレオチド（５′−ＡＧＣＡＣＴＣ
ＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ−３′）は、ビオチン標
識のときと同様に、まずその５′末端にアミノ基を導入
したオリゴヌクレオチドとして合成および精製を行っ
た。このようにして得た２Ｏ．Ｄ．のアミノ化オリゴヌ
クレオチド水溶液１８０μｌに、１ＭＮａＨＣＯ３ 水
溶液２０μｌを加え、これに５％（ｖ／ｖ）ジニトロフ
ルオロベンゼンのエタノール溶液１００μｌを加え３７
℃で２時間加温し、反応を行った。精製は、ビオチン化
オリゴヌクレオチドと同様にゲルろ過により行い、乾固
の後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
【００６７】［実施例３］ プローブの調製 ３′末端にビオチン標識を導入したオリゴヌクレオチド
（５′−ＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴ
ＴＣＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＡ−３′）を調製した。あら
かじめ３′末端がビオチン標識されている、０．５μｍ
ｏｌスケールの３′Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＮ ＣＰＧカラム
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、ホスホアミダイト法に
よりオリゴヌクレオチドを合成し、常法によりＯＰＣカ
ートリッジを用いて精製、乾固の後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解した。
（５′−ＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴ
ＴＣＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＡ−３′）を調製した。あら
かじめ３′末端がビオチン標識されている、０．５μｍ
ｏｌスケールの３′Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＮ ＣＰＧカラム
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、ホスホアミダイト法に
よりオリゴヌクレオチドを合成し、常法によりＯＰＣカ
ートリッジを用いて精製、乾固の後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解した。
【００６８】［実施例４］ プライマーの特異性の評価 Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ
ＢＨ株、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＩＦＯ ３０８
０）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＩＦＯ １４１６
０）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｉ
ＦＯ １４４７９）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌ
ｔｏｐｈｉｌｉａ（ＩＦＯ １４１６１）、Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（ＩＦＯ １３５３
５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株の８種の細菌を用い
て、常法により各種細菌よりＤＮＡを調製したものを試
料とし、ＰＣＲ法によりプライマーの特異性を評価し
た。
ＢＨ株、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＩＦＯ ３０８
０）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＩＦＯ １４１６
０）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｉ
ＦＯ １４４７９）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌ
ｔｏｐｈｉｌｉａ（ＩＦＯ １４１６１）、Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（ＩＦＯ １３５３
５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株の８種の細菌を用い
て、常法により各種細菌よりＤＮＡを調製したものを試
料とし、ＰＣＲ法によりプライマーの特異性を評価し
た。
【００６９】プライマーは実施例２で調製した２種のプ
ライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＴＣＣＴＴＧＧ
ＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＣＧ−３′、５′−ＤＮＰ−
ＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ−３′）
を用いた。ＰＣＲは、以下の反応溶液組成ならびに条件
で行った。
ライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＴＣＣＴＴＧＧ
ＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＣＧ−３′、５′−ＤＮＰ−
ＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ−３′）
を用いた。ＰＣＲは、以下の反応溶液組成ならびに条件
で行った。
【００７０】５０ｐｍｏｌ／μｌ濃度の上記プライマー
をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を５μ
ｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を５μｌ、試料ＤＮ
Ａを１０ｎｇ加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５
０μｌとした。これに、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を１ｕｎｉｔ加え、９０
℃に加温して５分間保持した後、９０℃・６０秒、５５
℃・４５秒、７２℃・９０秒を１サイクルとした３０サ
イクルの反応を行い、反応後さらに７２℃で５分間保温
した。反応後、５０μｌより１０μｌを分取し、アガロ
ースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色を行い、
増幅核酸鎖の検出を行った。その結果、Ｐ．ｃｅｐａｃ
ｉａ ＫＫ０１株においてのみ、期待される約５８０塩
基対の長さに、明瞭な一本のバンドが確認できた。ここ
で、他の７種の菌株においては、いかなる増幅核酸鎖も
まったく検出することはできなかった。
をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を５μ
ｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を５μｌ、試料ＤＮ
Ａを１０ｎｇ加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５
０μｌとした。これに、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を１ｕｎｉｔ加え、９０
℃に加温して５分間保持した後、９０℃・６０秒、５５
℃・４５秒、７２℃・９０秒を１サイクルとした３０サ
イクルの反応を行い、反応後さらに７２℃で５分間保温
した。反応後、５０μｌより１０μｌを分取し、アガロ
ースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色を行い、
増幅核酸鎖の検出を行った。その結果、Ｐ．ｃｅｐａｃ
ｉａ ＫＫ０１株においてのみ、期待される約５８０塩
基対の長さに、明瞭な一本のバンドが確認できた。ここ
で、他の７種の菌株においては、いかなる増幅核酸鎖も
まったく検出することはできなかった。
【００７１】［実施例５］ Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ
０１株のプライマーを用いた検出（１） 実施例４と同様にして、８種類の各種細菌よりＤＮＡを
調製した。これを以下の反応溶液組成、反応条件でＰＣ
Ｒに供した。
０１株のプライマーを用いた検出（１） 実施例４と同様にして、８種類の各種細菌よりＤＮＡを
調製した。これを以下の反応溶液組成、反応条件でＰＣ
Ｒに供した。
【００７２】実施例２で調製した、２０ｐｍｏｌ／μｌ
濃度のプライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＴＣＣ
ＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＣＧ−３′、５′−
ＤＮＰ−ＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ
−３′）をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝
液を５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μｌ、
試料ＤＮＡをＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株は１０ｐ
ｇを、他の細菌については１０ｎｇを加え、さらに水を
加えて反応溶液全量を５０μｌとした。これに、Ａｍｐ
ｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）
を１ｕｎｉｔ加え、９０℃に加温して５分間保持した
後、９０℃・６０秒、５５℃・４５秒、７２℃・９０秒
を１サイクルとした３５サイクルの反応を行い、反応後
さらに７２℃で５分間保温した。
濃度のプライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＴＣＣ
ＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＣＧ−３′、５′−
ＤＮＰ−ＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ
−３′）をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝
液を５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μｌ、
試料ＤＮＡをＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株は１０ｐ
ｇを、他の細菌については１０ｎｇを加え、さらに水を
加えて反応溶液全量を５０μｌとした。これに、Ａｍｐ
ｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）
を１ｕｎｉｔ加え、９０℃に加温して５分間保持した
後、９０℃・６０秒、５５℃・４５秒、７２℃・９０秒
を１サイクルとした３５サイクルの反応を行い、反応後
さらに７２℃で５分間保温した。
【００７３】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μｌ加えておき、これに反応後の上記混合液を１０μｌ
加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで
３回洗浄した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識
抗ＤＮＰ抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したも
のを１００μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝
液５００μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの
濃度で１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−
ニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０
分間放置の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０
５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１に示す。
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μｌ加えておき、これに反応後の上記混合液を１０μｌ
加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで
３回洗浄した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識
抗ＤＮＰ抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したも
のを１００μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝
液５００μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの
濃度で１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−
ニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０
分間放置の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０
５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１に示す。
【００７４】
【表２４】 ［実施例６］ Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株のプラ
イマーを用いた検出（２） 実施例４と同様にして、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１
株よりＤＮＡを調製した。これを以下の反応溶液組成、
反応条件でＰＣＲに供した。
イマーを用いた検出（２） 実施例４と同様にして、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１
株よりＤＮＡを調製した。これを以下の反応溶液組成、
反応条件でＰＣＲに供した。
【００７５】実施例２で調製した、２０ｐｍｏｌ／μｌ
濃度のプライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＴＣＣ
ＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＣＧ−３′、５′−
ＤＮＰ−ＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ
−３′）をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝
液を５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μｌ、
試料としてＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株より調製し
たＤＮＡを、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ
加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５０μｌとし
た。これに、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（宝酒造）を１ｕｎｉｔ加え、９０℃に加温し
て５分間保持した後、９０℃・６０秒、５５℃・４５
秒、７２℃・９０秒を１サイクルとした４０サイクルの
反応を行い、反応後さらに７２℃で５分間保温した。
濃度のプライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＴＣＣ
ＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＣＧ−３′、５′−
ＤＮＰ−ＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ
−３′）をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝
液を５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μｌ、
試料としてＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株より調製し
たＤＮＡを、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ
加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５０μｌとし
た。これに、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（宝酒造）を１ｕｎｉｔ加え、９０℃に加温し
て５分間保持した後、９０℃・６０秒、５５℃・４５
秒、７２℃・９０秒を１サイクルとした４０サイクルの
反応を行い、反応後さらに７２℃で５分間保温した。
【００７６】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μｌ加えておき、これに反応後の上記混合液を１０μｌ
加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで
３回洗浄した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識
抗ＤＮＰ抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したも
のを１００μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝
液５００μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの
濃度で１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−
ニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０
分間放置の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０
５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２に示す。
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μｌ加えておき、これに反応後の上記混合液を１０μｌ
加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで
３回洗浄した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識
抗ＤＮＰ抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したも
のを１００μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝
液５００μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの
濃度で１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−
ニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０
分間放置の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０
５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２に示す。
【００７７】
【表２５】 ［実施例７］ Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株のプロ
ーブを用いた検出（１） 実施例４と同様にして、８種類の各種細菌よりＤＮＡを
調製した。それぞれのＤＮＡをアルカリ変性の後、ドッ
トブロット装置（ＢＲＬ）を用いて１μｇずつナイロン
膜（Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−４５、Ｔｒｏｐｉｘ社）にドッ
トした。８０℃で２時間乾燥の後、ナイロン膜をビニー
ルバッグに入れ、プレハイブリダイゼーション溶液（６
×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１０
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）を３ｍｌ加え、６０
℃でプレハイブリダイゼーションを１時間行った。これ
に、ハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼ
ーション溶液に実施例３で調製したビオチン標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ（５′−ＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡ
ＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＡ−Ｂ
ｉｏｔｉｎ−３′）を熱変性の後に１００ｎｇ加えたも
の）を３ｍｌ加え、６０℃で２時間ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ナイロン膜をビニールバッグより取り出
し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液を用いて６０℃で
５分間ずつ３回洗浄した。検出はサザンライト（Ｔｒｏ
ｐｉｘ社）を用いて、アルカリ性フォスファターゼ標識
ストレプトアビジンとＡＭＰＰＤTMによる化学発光法を
利用して、添付のプロトコルに従い行った。
ーブを用いた検出（１） 実施例４と同様にして、８種類の各種細菌よりＤＮＡを
調製した。それぞれのＤＮＡをアルカリ変性の後、ドッ
トブロット装置（ＢＲＬ）を用いて１μｇずつナイロン
膜（Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−４５、Ｔｒｏｐｉｘ社）にドッ
トした。８０℃で２時間乾燥の後、ナイロン膜をビニー
ルバッグに入れ、プレハイブリダイゼーション溶液（６
×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１０
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）を３ｍｌ加え、６０
℃でプレハイブリダイゼーションを１時間行った。これ
に、ハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼ
ーション溶液に実施例３で調製したビオチン標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ（５′−ＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡ
ＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＡ−Ｂ
ｉｏｔｉｎ−３′）を熱変性の後に１００ｎｇ加えたも
の）を３ｍｌ加え、６０℃で２時間ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ナイロン膜をビニールバッグより取り出
し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液を用いて６０℃で
５分間ずつ３回洗浄した。検出はサザンライト（Ｔｒｏ
ｐｉｘ社）を用いて、アルカリ性フォスファターゼ標識
ストレプトアビジンとＡＭＰＰＤTMによる化学発光法を
利用して、添付のプロトコルに従い行った。
【００７８】その結果、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１
株ＤＮＡをドットしたものについてのみ、きわめて強い
陽性の反応を確認できた。ここで、他の７種の菌株にお
いては、陽性の反応を検出することはできなかった。
株ＤＮＡをドットしたものについてのみ、きわめて強い
陽性の反応を確認できた。ここで、他の７種の菌株にお
いては、陽性の反応を検出することはできなかった。
【００７９】［実施例８］ Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ
０１株のプローブを用いた検出（２） 実施例４に記載の８種類の各種細菌を常法により培養し
た。０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で
洗浄の後、前記緩衝液を用いてそれぞれの菌数が２×１
０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調製した。このように
して調製した菌懸濁液５０μｌに６％のホルムアルデヒ
ド溶液を５０μｌ加え菌体を固定し、０．１％ゼラチ
ン、０．０１％クロムミョウバンでコートしたスライド
グラスに３０μｌを滴下し、風乾した。試料を固定した
スライドグラスを、９０％メタノール、３％ホルムアル
デヒド溶液に１０分間浸けて菌体を再固定した後、純水
で洗浄した。
０１株のプローブを用いた検出（２） 実施例４に記載の８種類の各種細菌を常法により培養し
た。０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で
洗浄の後、前記緩衝液を用いてそれぞれの菌数が２×１
０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調製した。このように
して調製した菌懸濁液５０μｌに６％のホルムアルデヒ
ド溶液を５０μｌ加え菌体を固定し、０．１％ゼラチ
ン、０．０１％クロムミョウバンでコートしたスライド
グラスに３０μｌを滴下し、風乾した。試料を固定した
スライドグラスを、９０％メタノール、３％ホルムアル
デヒド溶液に１０分間浸けて菌体を再固定した後、純水
で洗浄した。
【００８０】上記処理を行ったスライドグラスを、５０
ｍＭ ＮａＢＨ4 を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）に室温で３０分間、遮光状態で浸した
後、純水で洗浄、風乾した。プローブは実施例３で調製
したビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブ（５−Ａ
ＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴ
ＣＣＧＧＡＣＡＡ−Ｂｉｏｔｉｎ−３′）に、ＦＩＴＣ
（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａ
ｔｅ）標識されたストレプトアビジンをあらかじめ結合
させたものを用いた。この標識プローブを、ハイブリダ
イゼーション溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１０％硫酸デキストラン、０．２％ＢＳＡ（Ｂｏ
ｖｉｎｅＳｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、０．０１％ポ
リアデニル酸）で５ｎｇ／μｌ濃度とし、３０μｌを滴
下した。スライドグラスを気密性の容器に入れて、４５
℃、１時間の反応を遮光状態で行った。
ｍＭ ＮａＢＨ4 を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）に室温で３０分間、遮光状態で浸した
後、純水で洗浄、風乾した。プローブは実施例３で調製
したビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブ（５−Ａ
ＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴ
ＣＣＧＧＡＣＡＡ−Ｂｉｏｔｉｎ−３′）に、ＦＩＴＣ
（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａ
ｔｅ）標識されたストレプトアビジンをあらかじめ結合
させたものを用いた。この標識プローブを、ハイブリダ
イゼーション溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１０％硫酸デキストラン、０．２％ＢＳＡ（Ｂｏ
ｖｉｎｅＳｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、０．０１％ポ
リアデニル酸）で５ｎｇ／μｌ濃度とし、３０μｌを滴
下した。スライドグラスを気密性の容器に入れて、４５
℃、１時間の反応を遮光状態で行った。
【００８１】反応後、ＳＥＴ緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ
（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ Ｎ
ＡＣｌ）でスライドグラスを洗浄し、遮光状態で風乾の
後、オリンパスの落射型蛍光顕微鏡で検鏡を行い蛍光の
有無を調べた。励起光源は水銀ランプを使用し、Ｂ励起
により観察を行った。検鏡の結果、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株については菌体に蛍光が認められたが、他の
細菌では蛍光を観察することはできなかった。
（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ Ｎ
ＡＣｌ）でスライドグラスを洗浄し、遮光状態で風乾の
後、オリンパスの落射型蛍光顕微鏡で検鏡を行い蛍光の
有無を調べた。励起光源は水銀ランプを使用し、Ｂ励起
により観察を行った。検鏡の結果、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株については菌体に蛍光が認められたが、他の
細菌では蛍光を観察することはできなかった。
【００８２】
【発明の効果】本発明の核酸断片は、Ｐ．ｃｅｐａｃｉ
ａ ＫＫ０１株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子
であり、これらの構成塩基またはその一部分の塩基配列
をプライマーまたはプローブとして利用すれば、Ｐ．ｃ
ｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出を特異的に行うことが
できる。
ａ ＫＫ０１株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子
であり、これらの構成塩基またはその一部分の塩基配列
をプライマーまたはプローブとして利用すれば、Ｐ．ｃ
ｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出を特異的に行うことが
できる。
【００８３】また、本発明によるＰ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の検出方法は、上記の核酸断片あるいはこれ
らの一部をプライマーまたはプローブとして用いるもの
であり、感度、特異性、簡便さ、迅速性の点で優れたも
のであり、環境浄化などの分野で多大な貢献をなすもの
である。
ＫＫ０１株の検出方法は、上記の核酸断片あるいはこれ
らの一部をプライマーまたはプローブとして用いるもの
であり、感度、特異性、簡便さ、迅速性の点で優れたも
のであり、環境浄化などの分野で多大な貢献をなすもの
である。
【００８４】
配列番号：１ 配列の長さ：１５２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ遺伝子ＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ 株名：ＫＫ０１ 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (18)
- 【請求項１】 配列番号１の塩基配列で示されるＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１の配列で示される核酸、ならび
に、その相補的な塩基配列を有する核酸、および、これ
らの変異配列で示される核酸から選ばれる新規な核酸断
片。 - 【請求項３】 次に列記する特異配列番号１から８まで
のいずれかの配列またはそれら配列のいずれかを一部と
して含むことを特徴とする請求項２に記載の新規な核酸
断片。 【表１】 - 【請求項４】 請求項３に記載のいずれかの核酸中の部
分配列であってプライマー、またはプローブとして利用
可能な核酸よりなる新規な核酸断片。 - 【請求項５】 プライマーとして利用可能な核酸が１０
〜５０塩基の長さであり、プローブとして利用可能な核
酸が１０塩基から請求項２に記載の核酸の全塩基数以下
の長さである請求項４に記載の新規な核酸断片。 - 【請求項６】 部分配列が次に配列する部分配列番号１
から４３７までのいずれかである請求項４に記載の新規
な核酸断片。 【表２】 【表３】 【表４】 【表５】 【表６】 【表７】 【表８】 【表９】 【表１０】 【表１１】 【表１２】 - 【請求項７】 変異配列が、核酸の塩基配列の一部を欠
失するか、または他の塩基もしくは塩基配列で置換もし
くは付加されたものである請求項２〜６のいずれか１項
に記載の新規な核酸断片。 - 【請求項８】 請求項２〜７のいずれか１項に記載の核
酸断片であって、標識物または（および）固相担体と結
合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片より
なるプライマー。 - 【請求項９】 請求項２〜７のいずれか１項に記載の核
酸断片であって、標識物または（および）固相担体と結
合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片より
なるプローブ。 - 【請求項１０】 ２種の核酸断片の組み合わせからなる
プライマーであって、少なくとも一方の核酸断片が請求
項８に記載の核酸断片より選ばれたものであり、それぞ
れの核酸断片に標識物または（および）固相担体と結合
可能な部位が導入されている場合もあるプライマー。 - 【請求項１１】 変異配列が核酸断片の塩基配列の一部
を欠失するか、または他の塩基もしくは塩基配列で置換
もしくは付加されたものである請求項８および１０のい
ずれか１項に記載のプライマー。 - 【請求項１２】 標識物または固相担体と結合可能な部
位が、核酸断片の５′末端側に導入されている請求項８
〜１１のいずれか１項に記載のプライマーまたはプロー
ブ。 - 【請求項１３】 標識物または固相担体と結合可能な部
位が、ビオチン残基、２，４−ジニトロフェニル基、ジ
ゴキシゲニン残基のいずれかである請求項８〜１２のい
ずれか１項に記載のプライマーまたはプローブ。 - 【請求項１４】 請求項２〜７，９，１２または１３の
いずれかに記載の核酸の塩基配列を有する核酸断片の少
なくとも１種をプローブとして用いることを特徴とする
Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出方法。 - 【請求項１５】 請求項２〜８，１０〜１３のいずれか
に記載の核酸の塩基配列を有する核酸断片の少なくとも
１種をプライマーとして用いることを特徴とするＰ．ｃ
ｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出方法。 - 【請求項１６】 請求項８，１０〜１３または１５のい
ずれかに記載のプライマーを用い、下記（１）〜（４）
の工程を実施することを特徴とするＰ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の検出方法。（１）Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ
ＫＫ０１株の有無を検出したい試料を準備し、（２）必
要に応じて、試料中の菌体の破砕処理を行い、（３）試
料に上記プライマーを加えプライマーの伸張反応を行
い、（４）工程（３）で得られた伸張反応物について検
出操作を行う。 - 【請求項１７】 請求項１０に記載のプライマーを用い
る請求項１６記載のＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の
検出方法。 - 【請求項１８】 該プライマーの伸張反応がＰＣＲ（Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で
ある請求項１６、あるいは１７のいずれか１項に記載の
Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6051739A JPH07255486A (ja) | 1994-03-23 | 1994-03-23 | 新規核酸断片およびこれらを用いたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6051739A JPH07255486A (ja) | 1994-03-23 | 1994-03-23 | 新規核酸断片およびこれらを用いたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07255486A true JPH07255486A (ja) | 1995-10-09 |
Family
ID=12895283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6051739A Pending JPH07255486A (ja) | 1994-03-23 | 1994-03-23 | 新規核酸断片およびこれらを用いたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07255486A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998048276A1 (en) * | 1997-04-23 | 1998-10-29 | The Penn State Research Foundation | Non-obligate predator bacterium burkholderia casidae and uses thereof |
| WO2000066788A2 (en) * | 1999-05-03 | 2000-11-09 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide probes for detection and quantitation of staphylococcus |
| US6821770B1 (en) | 1999-05-03 | 2004-11-23 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms |
-
1994
- 1994-03-23 JP JP6051739A patent/JPH07255486A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998048276A1 (en) * | 1997-04-23 | 1998-10-29 | The Penn State Research Foundation | Non-obligate predator bacterium burkholderia casidae and uses thereof |
| US6319497B1 (en) | 1997-04-23 | 2001-11-20 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Non-obligate predatory bacterium burkholderia casidaeand uses thereof |
| US6689357B2 (en) | 1997-04-23 | 2004-02-10 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Non-obligate predatory bacterium Burkholderia casidae and uses thereof |
| WO2000066788A2 (en) * | 1999-05-03 | 2000-11-09 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide probes for detection and quantitation of staphylococcus |
| WO2000066788A3 (en) * | 1999-05-03 | 2001-04-05 | Gen Probe Inc | Polynucleotide probes for detection and quantitation of staphylococcus |
| US6376186B1 (en) | 1999-05-03 | 2002-04-23 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide probes for detection and quantitation of staphylococcus |
| US6821770B1 (en) | 1999-05-03 | 2004-11-23 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms |
| US7449328B2 (en) | 1999-05-03 | 2008-11-11 | Gen-Probe Incorporated | Probe matrix-based device for identifying microorganisms |
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