JP2000135086A - １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び該遺伝子中のＤＮＡ配列を用いたＫＢ１株の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 迅速、簡易かつ特異的に、しかも感度よくビ
ブリオ スピーシズ ＫＢ１株を検出、計数する方法を
提供すること。 【解決手段】 ビブリオ スピーシズ ＫＢ１株から単
離した１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列から選択した
塩基配列を有するプローブまたはプライマーを用いてＫ
Ｂ２株の遺伝子工学的手法による検出を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はビブリオ属に属する
ＫＢ１株の単離された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、並びに
該遺伝子の塩基配列に基づいて得られ、該ＫＢ１株の検
出に有用な新規核酸断片およびその用途に関する。詳し
くは、該ＫＢ１株を検出するためのプライマーまたはプ
ローブとして利用可能な核酸断片、およびその構成塩基
配列の部分配列、およびこれらを用いた該ＫＢ１株の検
出法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、芳香族化合物、パラフィン、ナフ
テンなどの脂肪族炭化水素、あるいはトリクロロエチレ
ンなどの有機塩素系化合物などによる環境汚染が問題と
なっており、すでに汚染されてしまった環境を浄化し、
もとの状態に修復していく技術の確立が強く求められて
いる。この環境修復技術としては種々の物理化学的な方
法が知られているが、これらの方法は、汚染物質の単な
る抽出、回収であり、無害な化合物に変換するものでは
ないことに加えて、処理にかかるコスト、操作性、投下
エネルギー量、処理範囲等の点に関しても効率的とはい
えず、実用的な技術であるとは必ずしもいえない。

【０００３】そこで、上記の物理化学的手法に対して、
微生物を利用した処理が実用的な汚染環境の修復方法を
提供できるものとして期待されている。ここで、汚染物
質の多くは化学工業などで使用された合成物質であり、
自然界に生息する微生物によってあまり分解されないた
めその処理が容易でないものが多いが、近年、土壌汚染
を引き起こしている芳香族炭化水素や有機塩素系化合物
などの難分解性化合物を分解することができる菌株が数
多く分離されてきており、これらの微生物の利用による
環境修復に対する期待が高まっている。

【０００４】とりわけ、トリクロロエチレン分解菌の開
発が盛んに進められており、その分解活性を向上させた
り、あるいはトリクロロエチレン分解酵素の誘導物質を
不要化したりした遺伝子組み換え菌の土壌への散布など
も検討されはじめてきている。ここで、発明者らはＫＢ
１株がトリクロロエチレンを分解可能であることを明ら
かにしており、このような微生物を利用した環境浄化技
術を普及させ、さらには、この技術を実用的かつ社会的
に有効な技術として定着させていくためには、分解能力
などにすぐれた菌の開発とともに、それらを導入した土
壌における菌の活動、増殖、伝搬、生残、つまりは土壌
中での菌の優占度、生育状況などを十分に把握していく
ことが重要な課題となる。これらの課題を解決していく
ためには、目的とする菌を選択的に検出することができ
る手法の確立が必要不可欠である。

【０００５】各種細菌の検出方法として、種々の分離培
養法が用いられている。一般的には特別な培地による選
択培養を行うことが多い。この方法は簡便であるため広
く用いられるが、目的とする菌のみが必ずしも選択的に
培養されるとは限らない。たとえば、フェノールを分解
可能な菌である上記のＫＢ１株の場合、カテコールのカ
テコール−２，３−ジオキシゲナーゼによる分解産物で
ある２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの黄色の着
色を簡便な指標とすることができる。しかしながら、カ
テコールをメタ開裂により代謝可能な他の菌が存在する
可能性もあり、厳密には黄色の着色のみをその指標とす
ることはできず、詳細な形態学的、あるいは生化学的な
性状を検査する必要がある。ここで、形態学的、あるい
は生化学的な性状から目的とする菌を検出するには数多
の熟練と経験を要し、しかもその手法は煩雑であり時間
がかかるなど、種々の実用面での問題があった。

【０００６】また、目的とする菌に特異的な抗体を放射
性同位元素または蛍光色素でラベルし検出に用いる方法
が知られているが、この方法は抗体を得るのに非常に手
間がかかる点と、抗体の特異性がロットにより大きくば
らつく点が難点であった。

【０００７】これらの方法にかわるものとして、生物種
に特異的な核酸の塩基配列を、それに相補的な配列を持
つオリゴヌクレオチドプライマーあるいはプローブを利
用することにより検出する方法が発表されている。特
に、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は生物において必
須の細胞構成成分であり、その構造は生物の進化の過程
において比較的よく保存されている。ｒＲＮＡの中でも
１６Ｓ ｒＲＮＡについては研究が進んでおり、多くの
生物種についてその塩基配列が同定されてきている。１
６Ｓ ｒＲＮＡには種々の生物で共通に保存されている
領域と、生物種により配列の異なる可変領域のあること
が知られており、この可変領域に対応するＤＮＡプライ
マーあるいはプローブを利用した菌の検出、同定法が近
年開発されてきた。たとえば、ｒＲＮＡは細胞中に１０
４個以上存在し、ハイブリダイゼーション法のターゲッ
トとしては感度の面からも非常に有効なものであるが、
ここで、目的とする菌を検出するためのプローブまたは
プライマーをいかに選択するかこそが最も困難な課題と
なっており、この方法を利用するためには目的とする細
菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ、あるいはその遺伝子の塩基配列
を同定する必要がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】先述したように、特定
の微生物を利用して土壌中の汚染物質の浄化処理を行う
場合、処理条件や生育条件を最適にするためには、その
微生物の土壌中での優占度や生育状況を知る必要があ
る。そのためには微生物を特異的に検出、計測できる方
法が必要であるが、いままでの各種細菌の検出はフェノ
ールを唯一の炭素源とする選択培地による培養や、抗体
法などによるもので、その特異性、感度、簡便さ、検出
に要する時間などの点で問題が多く、土壌中での菌の挙
動をリアルタイムでモニタリングするための簡便な方法
は見当たらないのが現状である。

【０００９】本発明は上記従来技術の課題に鑑みなされ
たものであり、その目的は迅速、簡易かつ特異的に、し
かも感度よくＫＢ１株を検出、計数する方法を提供する
ことにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によって、配列表
の配列番号：１で表されるビブリオ スピーシズ ＫＢ
１株（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＫＢ１株：以下単にＫＢ１
株という）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が提供される。この
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、ＫＢ１
株の遺伝子工学的な手法を用いた検出におけるプローブ
やプライマーとして有用な核酸断片を得ることができ
る。この核酸断片は、上記の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の
塩基配列に基づいて得られるプライマーとして利用可能
な１０〜５０塩基の長さのもの、更にはプローブとして
利用可能な核酸が１０塩基から各核酸の全塩基数以下の
長さのものとして提供される。このプライマーまたはプ
ローブとして利用される核酸断片には、標識物を結合し
得る部位や、固相担体と結合可能な部位が導入すること
がで、これらの部位を利用して更に効率的なＫＢ１株の
検出が可能となる。

【００１１】本発明は、また、これらのプライマーある
いはプローブを利用したＫＢ１株の検出方法に関する。
すなわち、プライマーを利用した本発明によるＫＢ１株
の検出方法は、上記のプライマー、好ましくは２種の組
み合わせからなるプライマーを用いて、例えば、下記
（１）〜（４）の工程を実施することを特徴とするもの
である。 （１）ＫＢ１株の有無を検出したい試料を準備し、
（２）必要に応じて、試料中の菌体の破砕処理を行い、
（３）試料中に所定のプライマーを加え、プライマーを
起点とした核酸鎖の伸張反応を行い、（４）工程（３）
で得られた伸張反応物について検出操作を行う。

【００１２】また、プローブを利用した本発明によるＫ
Ｂ１株の検出方法は、前記したようなプローブの少なく
とも１種を用いることを特徴とするものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、項目ごとに本発明を詳細に
説明する。

【００１４】（ＫＢ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）本
発明における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はＫＢ１株から単
離されたものであり、本発明におけるＫＢ１株にはその
突然変異株も包含される。野生型のＫＢ１株は、平成６
年１１月１５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４
６４３である。また、自然界からの取得は、例えば特開
平０８−１５４６６７号公報に記載された方法で行うこ
とができる。

【００１５】本発明に係るＫＢ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ
遺伝子は、配列表の配列番号：１の塩基配列を有するも
のであり、ＫＢ１株から単離されたもので、例えば後述
する実施例に示す方法によりその塩基配列の決定がなさ
れたものである。この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の有する塩
基配列は、ＫＢ１株の遺伝子工学的手法を用いた検出方
法におけるプローブやプライマーとして有用な核酸断片
の塩基配列の選択の材料として有用である。また、この
この１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の有する塩基配列と相補的
な配列もまた同様の目的に有用なものである。

【００１６】（核酸断片）ＫＢ１株の遺伝子工学的手法
を用いた検出方法に使用し得るプローブやプライマーと
して有用な核酸断片としては、配列表の配列番号：１の
塩基配列またはその相補的配列から選択した部分配列ま
たは全配列を挙げることができる。更に、この核酸断片
は、プローブやプライマーとしての機能が損なわれな
い、すなわち、検出対象とする１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
の塩基配列またはその部分配列との所定位置での結合や
ハイブリダイズが可能な範囲内での変異を有するもので
も良い。

【００１７】なお、配列番号：１の塩基配列またはその
相補配列を有する核酸断片は、特にプローブとして好ま
しく、また、これらの部分塩基配列はプライマーまたは
プローブとして使用することができる。ここで、部分塩
基配列を用いる場合には、ＫＢ１株に、特異的で、他の
細菌、たとえばＰｓ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓ．ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、土壌
よりよく分離されるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌、
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属細菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ属細菌、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属細菌、Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ属細菌などに相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。部分塩基配列は具体的には、プラ
イマーの場合、１０〜５０塩基の長さのものが好まし
く、プローブの場合は１０塩基の長さから検出対象とし
ての各塩基配列（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全
塩基配列またはその相補配列）の全塩基数（最大塩基
数）までの長さのものが好ましい。

【００１８】これらの核酸断片あるいはその部分塩基配
列は、合目的な任意の方法により調製することができ、
たとえば後述実施例に記載の方法に従い、配列全部また
は一部を化学合成してもよい。あるいは、化学合成した
プライマーを利用してＰＣＲ法で増幅し、増幅断片をそ
のままプローブとして用いることも可能である。さらに
はＫＢ１株の遺伝子から制限酵素などを利用して直接切
り出すことも可能であり、また、それらの遺伝子をＥ．
ｃｏｌｉなどのプラスミドにクローニングし、菌の増殖
の後にプラスミドを回収し、切り出して利用することも
可能である。

【００１９】本発明における上記核酸断片における変異
としては、たとえば一部の塩基もしくは塩基配列の欠
失、置換または付加などがあげられる。ここで核酸断片
をプライマーとして利用する場合は、プライマーの伸張
反応に大きな影響を与えると考えられる３’末端付近は
変異のないようにするか、あるいはあっても最小限にと
どめることが好ましく、より好適には５’末端付近で変
異があるようにする。

【００２０】このような、プライマーまたはプローブと
して利用可能な核酸断片または部分塩基配列は必要に応
じて標識物を結合可能な部位及び固相担体と結合可能な
部位の少なくとも１つが導入されていてもよい。ここ
で、プライマーを利用した検出を行う場合、標識物また
は固相担体と結合可能な部位が導入可能な位置はプライ
マーの伸張反応を妨げない位置ならばどこでもよいが、
可能であれば５’末端が好ましい。また、プローブを利
用した検出を行う場合、標識物または固相担体と結合可
能な部位が導入可能な位置は３’末端や５’末端の水酸
基部分さらには塩基部分やりん酸ジエステル部分などが
考えられるが、プローブの塩基配列の長さなどを考慮
し、ハイブリダイゼーションの妨げにならないようにす
ることが望ましい。

【００２１】（標識物または固相担体と結合可能な部
位）上記核酸をプローブまたはプライマーとして利用す
る場合の標識物としては、放射性物質、非放射性物質の
どちらを用いてもよい。非放射性の標識物で直接標識可
能なものとしては、フルオレセイン誘導体、ローダミン
およびその誘導体などの蛍光物質、化学発光物質、遅延
蛍光物質などがあげられる。また、標識物と特異的に結
合する物質を利用し間接的に標識物を検出することも可
能である。こうした標識物としてはビオチン、ハプテン
などがあげられ、ビオチンの場合アビジンあるいはスト
レプトアビジンを、ハプテンの場合はこれに特異的に結
合する抗体を利用する。ハプテンとしては２，４−ジニ
トロフェニル基を有する化合物やジゴキシゲニンなどを
使うことができる。これらの標識物はいずれも単独ある
いは必要に応じ複数種を組み合わせて、プローブまたは
プライマーに導入可能である。

【００２２】サンドイッチハイブリダイゼーションなど
核酸の特定断片を固相担体に特異的に結合する必要があ
る場合は、固相担体と結合可能な部位は、該担体と選択
的に結合可能なものであれば何であってもよい。たとえ
ば、ビオチンあるいはフルオレセイン、２，４−ジニト
ロフェニル基を有する化合物やジゴキシゲニンなどのハ
プテンがあげられ、これらはいずれも単独あるいは必要
に応じ複数種を組み合わせて、プローブまたはプライマ
ーに導入可能である。

【００２３】（プローブを用いた検出法）プローブを用
いた本発明によるＫＢ１株の検出法の一態様は、先に説
明した核酸断片をプローブとして用いる方法である。こ
のプローブを用いる検出方法には、ドットハイブリダイ
ゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等を適用することが
でき、必要に応じて上記の標識物を利用して１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子あるいはその予め特定された部分配列との
ハイブリッド体の検出を行うことで、ＫＢ１株の検出を
行うことができる。なお、通常のハイブリダイゼーショ
ン法を適用する場合には、常法に従ってハイブリダイゼ
ーション反応及び検出を行うことができる。また、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいても、本発明
における核酸断片を検出に供することが可能である。更
に、ハイブリダイゼーション操作の簡易化のためにサン
ドイッチハイブリダイゼーションを基本とする方法が開
発されており、これらの方法も本発明における核酸断片
を利用したＫＢ１株の検出に適用することができる。

【００２４】（プライマーを用いた検出法）プローブを
用いた本発明によるＫＢ１株の検出法の他の態様は、プ
ライマーを用いた方法である。この検出法は、先に述べ
た核酸断片をプライマーとして用い、標的とする１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列に対応する配列を有す
る核酸断片をプライマーを起点とした伸張反応により形
成してこれを検出する方法である。用いるプライマーの
数は所望とする検出精度が得られるように選択される。

【００２５】より好ましい例としては、後述するような
２種の異なるプライマーによる遺伝子増幅反応により試
料中の微量核酸断片を増幅するＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いた検
出法を挙げることができる。ここで２種のプライマーの
基本的な形態としては、たとえば、２種のプライマーと
もに何の修飾もされていないもの、２種のプライマーの
うち少なくとも一方に検出可能な標識または固相担体と
結合可能な部分が導入されたもの、２種のプライマーの
うち一方に標識物が導入され、他方に固相担体と結合可
能な部位が導入されたもの、２種のプライマーともに固
相担体と結合可能な部分が導入されたもの、などがあげ
られる。

【００２６】本発明によるＫＢ１株の検出方法は前記し
たような本発明によるプライマー、好ましくは２種の組
み合わせからなるプライマーを用いて以下のように実施
することができる。 （１）ＫＢ１株の有無を検出したい試料を準備し、
（２）必要に応じて、試料中の菌体の破砕処理を行い、
（３）試料中に上記プライマーを加えプライマーを起点
とした核酸鎖の伸張反応を行い、（４）工程（３）で得
られた伸張反応物について検出操作を行う。

【００２７】ここで、プライマー伸張反応により増幅さ
れた核酸断片の検出は、電気泳動、あるいはハイブリダ
イゼーションなどの通常用いられる方法を利用してもよ
いし、遺伝子の増幅反応においてそれぞれのプライマー
に別々の標識を導入しておき、増幅反応後生成物を固相
担体に吸着し、生成物を選択的に検出する方法などを用
いることも可能である。ここで固相担体としてはポリス
チレンボール、アガロースビーズ、ポリアクリルビー
ズ、ラテックス、ミクロタイターウェルなどの固相材料
に、プライマー中に導入された結合部位を捕捉可能であ
るような、ストレプトアビジン、抗体などを導入したも
のがあげられる。たとえば、ビオチンが導入されたプラ
イマーからのＰＣＲ産物を捕捉するには、ストレプトア
ビジンを固相に結合した担体を、フルオレセインなどが
導入されたプライマーからの伸張反応物を捕捉するに
は、それぞれに対する抗体を固相に結合した担体を用い
ればよい。さらに、固相担体を微粒子とすることによ
り、目的とする核酸を凝集、あるいは沈澱の有無により
簡便に判定することもできる。また、一方のプライマー
に固相担体と結合可能な部位を、他方のプライマーに標
識物を導入したものを用いて、伸張反応を行った反応物
を固相担体と接触させた後に不純物を適当な溶媒で洗浄
除去する方法が考案されており、目的核酸は標識物を持
つ形で該固相担体に固定され特異的に検出される。これ
ら標識物質の実際の検出は、使用する標識物質に応じて
一般的な手法を用いればよい。たとえば、標識物質がラ
ジオアイソトープであれば、そのまま活性を測定すれば
よいし、たとえばビオチンであればアビジン−酵素結合
体、また、ハプテンであれば抗体−酵素結合体などを用
いてＡＭＰＰＤなどの基質と反応させ、色的、蛍光的手
段により検出を行えばよい。

【００２８】また、遺伝子の増幅反応に用いる酵素、反
応条件などについてはさまざまな方法が考案されている
が、本発明における核酸断片は、種々のＰＣＲ法に利用
するのに十分な長さおよび塩基配列を有しており、これ
を用いることでＫＢ１株の検出を行うことができるもの
である。

【００２９】

【実施例】実施例１ （ＫＢ１株の16S rRNA遺伝子のクローニングと塩基配列
の決定）既知のグラム陰性好気性菌の16S rRNAより、以
下の２つの共通塩基配列を選び出した。 配列１：5'-GGCGAACGGGTGAGTAATAC-3'（配列番号：２） 配列２：5'-CTTCACCCCAGTCACGAACC-3'（配列番号：３） 配列１からなる合成ＤＮＡと配列２からなる合成ＤＮＡ
を常法により合成し、これを用いて、ＫＢ１株から常法
により得られたＤＮＡに対してＰＣＲを行った。生成し
た約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、プラスミドpUC119のHi
nc II 切断部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
した。

【００３０】形質転換株を、アンピシリン、IPTG、X-ga
lを含む寒天培地上で選択し、生じた白色コロニーより
プラスミドを調製し、挿入断片の有無を調べた。約１．
４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されている組み換えプラスミ
ドを選択し、上記ＰＣＲ断片の末端の塩基配列をダイデ
オキシ法により決定した。これを既知の各種細菌の16S
rRNAの塩基配列と比較したところ、保存領域においては
非常に相同性が高く、この挿入断片はＫＢ１株の16S rR
NA部分配列であると推定した。

【００３１】ＰＣＲを経由しない、完全長の16S rRNA遺
伝子のクローニングを以下のように行った。ＫＢ１株の
ＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分分解し、アガロースゲル
電気泳動により９〜２３キロ塩基対断片を分離、精製
し、これらのＤＮＡ断片をλDASHII (STRATAGENE) のBa
mHI 消化物に挿入した。Gigapack II Gold extract (ST
RATAGENE) を用いて、インビトロパッケージ法によりフ
ァージ粒子の調製を行い、ＤＮＡライブラリーを作製し
た。ここで、上記16S rRNA遺伝子部分断片をプローブと
して、該ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイ
ゼーション法により陽性ファージのスクリーニングを行
った。陽性ファージは５００個に１個程度の割合で取得
できた。常法により陽性ファージを培養の後、塩化セシ
ウム密度勾配法によりファージＤＮＡを精製した。

【００３２】塩基配列の決定は段階欠失クローンと、16
S rRNA遺伝子内の制限酵素切断部位を利用して得た２サ
ブクローンを用いて行った。欠失は、プラスミドpUL119
のHinc II 切断部位に完全長の16S rRNA遺伝子をリクロ
ーニングの後、ExonucleaseIII とMung Bean Nuclease
により段階的に導入した。これらの段階欠失クローンお
よび制限酵素を利用したサブクローンを用いて、ダイデ
オキシ法により塩基配列の決定を行った。こうして決定
されたＫＢ１株の16S rRNAの塩基配列は、配列番号１の
塩基配列である。

【００３３】実施例２ （プライマーの調製）本発明において、標識物あるいは
固相担体と結合可能な部位が導入されているプライマー
あるいは導入されていないプライマーは、以下に示す化
学合成法により調製した。

【００３４】まず、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位がいずれも導入されていないものは、ＤＮＡ自動
合成機モデル３８１Ａ（パーキンエルアー）を用いて、
ホスホアミダイト法により０．２μｍｏｌスケールで合
成を行い、ＯＰＣカートリッジ（パーキンエルマー）に
より精製した。

【００３５】また、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位が導入されているプライマーは、まずその５’末
端にアミノ機を導入したオリゴヌクレオチドとして合成
し、その後に適当な試薬を用いて標識物あるいは固相担
体と結合可能な部位を導入した。以下にその例を示す。

【００３６】５’末端にアミオノ基を導入したオリゴヌ
クレオチド5'-CCTGGATAATACCTCGGGTC-3'（配列番号：
４）の合成は、上述したような合成反応により５’末端
に最後の塩基（この場合はＣ）を付加した後、アミノリ
ンクII（パーキンエルマー）をさらに付加することによ
り行い、合成終了後、ＯＰＣカートリッジにより精製し
た。ビオチン化は、以下のようにして行った。１Ｏ．
Ｄ．のアミノ化オリゴヌクレオチド水溶液１０μ１に、
１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 水溶液１０μｌ、水３０μｌ、およ
び２０μｇ／μｌのビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル（ＢＲＬ）のＤＭＦ溶液を５０μｌ加
え、混和後室温で放置した。４時間後、セファデックス
Ｇ−５０を担体としてゲル濾過にかけ、５０ｍＭ ＴＥ
ＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）緩衝液（ｐＨ
７．５）で溶出し、最初のピークを集め乾固の後、ＴＥ
緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。

【００３７】５’末端ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）を
導入したオリゴヌクレオチド5'-GACGTCCCAGGGGGCTG-3'
（配列番号：５）は、ビオチン標識のときと同様に、ま
ずその５’末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチ
ドとして合成および精製を行った。このようにして得た
２Ｏ．Ｄ．のアミノ化オリゴヌクレオチド水溶液１８０
μｌに、１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 水溶液２０μｌを加え、こ
れに５％（ｖ／ｖ）ジニトロフルオロベンゼンのエタノ
ール溶液１００μｌを加え３７℃で２時間加温し、反応
を行った。精製は、ビオチン化オリゴヌクレオチドと同
様にゲル濾過により行い、乾固の後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解した。

【００３８】実施例３ （プローブの調製）３’末端にビオチン標識を導入した
オリゴヌクレオチド5'-AGCTCAACTTGGGAATGGCGCTT-3'
（配列番号：６）を調製した。あらかじめ３’末端がビ
オチン標識されている、０．５μｍｏｌスケールの３’
Biotin-ONCPGカラム（CLONTECH）を用いて、ホスホアミ
ダイト法によりオリゴヌクレオチドを合成し、常法によ
りＯＰＣカートリッジを用いて精製、乾固の後、ＴＥ緩
衝液（ｐＨ０．８）に溶解した。

【００３９】実施例４ （プライマーの特異性の評価）ＫＢ１株、ＪＭ１株、B.
cepacia ＫＫＯ１株、P. putida ＢＨ株、P. aeruginos
a (IFO 3080)、 P. fluorescens (IFO 14160) 、 Alcal
igenes faecalis (IFO14479) 、 Xanthomonas maltophi
lia (IFO 14161)、 Enterobacter cloacae (IFO 13535)
、E. coli ＪＩＭ１０９株の１０種の細菌を用いて、
常法により各種細菌よりＤＮＡを調製したものを試料と
し、ＰＣＲ法によりプライマーの特異性を評価した。

【００４０】なお、ＪＭ１株及びＫＫ０１株はともに通
産省工業技術院生命工学工業技術研究所にブタペスト条
約に基づいて寄託されており、受託日及び受託番号は以
下のとおりである。 ＪＭ１株： 受託日：平成７年１月１０日、受託番号：ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５３５２ ＫＫ０１株： 受託日：平成４年３月１１日、受託番号：ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４２３５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉ
ａ−ＫＫ０１として寄託） また、プライマーは実施例２で調製した２のプライマ
ー：５’Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＣＴＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＴ
ＣＧＧＧＴＣ−３’及び５’−ＤＮＰ−ＧＡＣＧＴＣＣ
ＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧ−３’を用いた。ＰＣＲは、以下
の反応溶液組成ならびに条件で行った。

【００４１】５０ｐｍｏｌ／μｌ濃度の上記プライマー
をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を５μ
ｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を５μ１、試料ＤＮ
Ａを１０ｎｇ加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５
０μｌとした。これに、AmpliTaq DNA polymerase （宝
酒造）を１unit加え、９５℃に加温し５分間保持した
後、９５℃・２０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒
を１サイクルとした３０サイクルの反応を行い、反応後
さらに７２℃で５分間保温した。反応後、５０μｌより
２μｌを分取し、アガロースゲル電気泳動、エチジウム
ブロマイド染色を行い、増幅核酸鎖の検出を行った。そ
の結果、ＫＢ１株においてのみ、期待される約２９０塩
基対の長さに、明瞭な一本のバンドが確認できた。ここ
で、他の９種の菌株においては、いかなる増幅核酸鎖も
全く検出することはできなかった。

【００４２】実施例５ （ＫＢ１株のプライマーを用いた検出（１））実施例４
と同様にして、１０種類の各種細菌よりＤＮＡを調製し
た。これを以下の反応溶液組成、反応条件でＰＣＲに供
した。

【００４３】実施例２で調製した、２０ｐｍｏｌ／μｌ
濃度のプライマー：５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＣＴＧＧＡ
ＴＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＧＴＣ−３’及び５’−ＤＮＰ
−ＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧ−３’をそれぞ
れ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を５μｌ、酵素
に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μｌ、試料ＤＮＡをＫＢ
１株は１０ｐｇを、他の細菌については１０ｎｇ加え、
さらに水を加えて反応溶液全量を５０μｌとした。これ
に、AmpliTaq DNA polymerase （宝酒造）を１unit加
え、９５℃に加温し５分間保持した後、９５℃・２０
秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒を１サイクルとし
た３５サイクルの反応を行い、反応後さらに７２℃で５
分間保温した。この反応混合液をスピンカラムにかけ、
未反応プライマーを除去した。

【００４４】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Tween 20を
含むTris−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００μｌ加え
ており、これに反応後の上記混合液を１０μｌに加え、
室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで３回洗
浄した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識抗ＤＮ
Ｐ抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したものを１
００μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５０
０μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの濃度で
１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−ニトロ
フェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０分間放
置の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍ
の吸光度を測定した。その結果、ＫＢ１株においての
み、バックグラウンドに比較し有意な吸収を確認するこ
とができた。ここで、他の９種の菌株においては、バッ
クグラウンド程度の吸収を示すにとどまった。

【００４５】実施例６ （ＫＢ１株のプライマーを用いた検出（２））実施例４
と同様にして、ＫＢ１株よりＤＮＡを調製した。これを
以下の反応溶液組成、反応条件でＰＣＲに供した。

【００４６】実施例２で調製した、２０ｐｍｏｌ／μｌ
濃度のプライマー：５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＣＴＧＧＡ
ＴＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＧＴＣ−３’及び５’−ＤＮＰ
−ＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧ−３’をそれぞ
れ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を５μｌ、酵素
に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μｌ、試料としてＫＢ１
株より調製したＤＮＡを、１０ｐｇ，１ｐｇ，１００ｆ
ｇ，１０ｆｇ加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５
０μｌとした。これに、AmpliTaq DNA polymerase （宝
酒造）を１unit加え、９５℃に加温し５分間保持した
後、９５℃・２０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒
を１サイクルとした４０サイクルの反応を行い、反応後
さらに７２℃で５分間保温した。この反応混合液をスピ
ンカラムにかけ、未反応プライマーを除去した。

【００４７】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Tween 20を含
むTris−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００μｌ加えて
おき、これに反応後の上記混合液を１０μｌに加え、室
温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで３回洗浄
した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識抗ＤＮＰ
抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したものを１０
０μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００
μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの濃度で１
Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０分間放置
の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍの
吸光度を測定した。その結果、ＤＮＡ量が１０ｐｇ，１
ｐｇ，１００ｆｇのものについてバックグラウンドに比
較し有意な吸収を確認することができた。ここで、ＤＮ
Ａ量が１０ｆｇのものにおいては、バックグラウンド程
度の吸収を示すにとどまった。

【００４８】実施例７ （ＫＢ１株のプローブを用いた検出（１））実施例４と
同様にして、１０種類の各種細菌よりＤＮＡを調製し
た。それぞれのＤＮＡをアルカリ変性の後、ドットブロ
ット装置（ＢＲＬ）を用いて１μｇずつナイロン膜（Tr
opilon-45, Tropix 社）にブロットした。８０℃で２時
間乾燥の後、ナイロン膜をビニールバッグに入れ、プレ
ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ，５×デンハ
ルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡ）を３ｍｌ加え、６０℃でプレハブリダイゼ
ーションを１時間行った。これに、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（プレハブリダイゼーション溶液に実施例３で
調製したビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブ５’
−ＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴ−
Ｂｉｏｔｉｎ−３’を熱変性の後に１００ｎｇを加えた
もの）を３ｍｌ加え、６０℃で２時間ハイブリダイゼー
ションを行った。ナイロン膜をビニールバッグから取り
出し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液を用いて６０℃
で５分間ずつ３回洗浄した。検出はサザンライト（Trop
ix社）を用いて、アルカリ性フォスフォターゼ標識スト
レプトアビジンとAMPPD による化学発光法を利用して、
添付のプロトコルにしたがい行った。

【００４９】その結果、ＫＢ１株ＤＮＡをブロットした
ものについてのみ、極めて強い陽性の反応を確認でき
た。ここで、他の９種の菌株においては、陽性の反応を
検出することはできなかった。

【００５０】実施例８ （ＫＢ１株のプローブを用いた検出（２））実施例４に
記載の１０種類の各種細菌を常法により培養した。０．
１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄の
後、前記緩衝液を用いてそれぞれの菌数が２×１０⁷cel
ls/mlになるよう調製した。このようにして調製した菌
懸濁液５０μｌに６％のホルムアルデヒド溶液を５０μ
ｌ加え菌体を固定し、０．１％ゼラチン、０．０１％ク
ロムミョウバンでコートしたスライドグラスに３０μｌ
を滴下し、風乾した。試料を固定したスライドグラス
を、９０％メタノール、３％ホルムアルデヒド溶液に１
０分間浸けて菌体を再固定した後、純水で洗浄した。

【００５１】上記処理を行ったスライドグラスを、５０
ｍＭ ＮａＢＨ₄ を含む１０ｍＭTris−Ｃｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に室温で３０分間、遮光状態で浸した後、純
水で洗浄、風乾した。プローブは実施例３で調製したビ
オチン標識オリゴヌクレオチドプローブ５’−ＡＧＣＴ
ＣＡＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴ−Ｂｉｏｔｉ
ｎ−３’にＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate) 標
識されたストレプトアビジンをあらかじめ結合させたも
のを用いた。この標識プローブを、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（０．１Ｍ Tris −Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．
０）、０．７５ＭＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％
硫酸デキストラン、０．２％ＢＳＡ（Bovine Serum Alb
umin) 、０．０１％ポリアデニル酸）で５ｎｇ／μｌ濃
度とし、３０μｌを滴下した。スライドグラスを気密性
の容器に入れて、４５℃、１時間の反応を遮光状態で行
った。

【００５２】反応後、ＳＥＴ緩衝液（Tris−Ｃｌ（ｐＨ
８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）でスライドグラスを洗浄し、遮光状態で風乾の後、
オリンパスの落射型蛍光顕微鏡で検鏡を行い蛍光の有無
を調べた。励起光源は水銀ランプを使用し、Ｂ励起によ
り観察を行った。検鏡の結果、ＫＢ１株については菌体
に蛍光が認められたが、他の細菌では蛍光を観察するこ
とはできなかった。

【００５３】

【発明の効果】本発明の核酸断片は、ＫＢ１株の16S rR
NAをコードする遺伝子であり、これらの構成塩基または
その一部分の塩基配列をプライマーまたはプローブとし
て利用すれば、ＫＢ１株の検出を特異的に行うことがで
きる。

【００５４】また、本発明によるＫＢ１株の検出方法
は、上記の核酸断片あるいはこれらの一部をプライマー
またはプローブとして用いるものであり、感度、特異
性、簡便さ、迅速性の点で優れたものであり、環境浄化
などの分野で多大な貢献をなすものである。

【００５５】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１３８７ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体DNA 起源 生物名：ビブリオ スピーシズ ＫＢ１株 配列の特徴：１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子 配列： GGCGAACGGG TGAGTAATAC ATCGGAACGT GCCCTGTAGT GGGGGATAAC TAGTCGAAAG 60 ATTAGCTAAT ACCGCATACG ACCTGAGGGT GAAAGCGGGG GACCGCAAGG CCTCGCGCTA 120 CAGGAGCGGC CGATGTCTGA TTAGCTAGTT GGTGGGGTAA AAGCCTACCA AGGCGACGAT 180 CAGTAGCTGG TCTGAGAGGA CGATCAGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT 240 ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATTTTGGACA ATGGGGGCAA CCCTGATCCA GCAATGCCGC 300 GTGTGTGAAG AAGGCCTTCG GGTTGTAAAG CACTTTTGTC CGGAAAGAAA TGGCCCTGGA 360 TAATACCTCG GGTCGATGAC GGTACCGGAA GAATAAGCAC CGGCTAACTA CGTGCCAGCA 420 GCCGCGGTAA TACGTAGGGT GCGAGCGTTA ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGTGCGCA 480 GGCGGTTTTG TAAGACAGGC GTGAAATCCC CGAGCTCAAC TTGGGAATGG CGCTTGTGAC 540 TGCAAGGCTA GAGTATGTCA GAGGGGGGTA GAATTCCACG TGTAGCAGTG AAATGCGTAG 600 AGATGTGGAG GAATACCGAT GGCGAAGGCA GCCCCCTGGG ACGTCACTGA CGCTCATGCA 660 CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCCT AAACGATGTC 720 AACTAGTTGT TGGGGATTCA TTTCTTCAGT AACGTAGCTA ACGCGTGAAG TTGACCGCCT 780 GGGGAGTACG GTCGCAAGAT TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGACCCGC ACAAGCGGTG 840 GATGATGTGG ATTAATTCGA TGCAACGCGA AAAACCTTAC CTACCCTTGA CATGCCACTA 900 ACGAAGCAGA GATGCATTAG GTGCCCGAAA GGGAAAGTGG ACACAGGTGC TGCATGGCTG 960 TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTTGTCTC 1020 TAGTTGCTAC GAAAGGGCAC TCTAGAGAGA CTGCCGGTGA CAAACCGGGG GAAGGTGGGG 1080 ATGACGTCAA GTCCTCATGG CCCTTATGGG TAGGGCTTCA CACGTCATAC AATGGTGCGT 1140 ACAGAGGGTT GCCAACCCGC GAGGGGGAGC TAATCCCAGA AAACGCATCG TAGTCCGGAT 1200 CGTAGTCTGC AACTCGACTA CGTGAAGCTG GAATCGCTAG TAATCGCGGA TCAGCATGCC 1260 GCGGTGAATA CGTTCCCGGG TCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCATGGG AGTGGGTTTT 1320 GCCAGAAGTA GTTAGCCTAA CCGCAAGGAG GGCGATTACC ACGGCAGGGT TCATGACTGG 1380 GGTGAAG 1387 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：１６Ｓ ｒＲＮＡ共通配列増幅用プライマー配列 配列： GGCGAACGGG TGAGTAATAC 20 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：１６Ｓ ｒＲＮＡ共通配列増幅用プライマー配列 配列： CTTCACCCCA GTCACGAACC 20 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ビブリオ スピーシズ ＫＢ１株検出用プライマー配列 配列： CCTGGATAAT ACCTCGGGTC 20 配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ビブリオ スピーシズ ＫＢ１株検出用プライマー配列 配列： GACGTCCCAG GGGGCTG 17 配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ビブリオ スピーシズ ＫＢ１株検出用プローブ配列 配列： AGCTCAACTT GGGAATGGCG CTT 23

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:63） (72)発明者 野本 毅 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA17 AA20 BA80 CA01 CA09 CA11 DA05 DA06 EA04 GA11 HA09 HA11 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ06 QQ19 QQ42 QR31 QR33 QR41 QR56 QR62 QR75 QS02 QS16 QS25 QX01

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号：１の塩基配列を有す
   ることを特徴とする１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子。
2. 【請求項２】 以下の塩基配列： （ａ）配列表の配列番号：１の塩基配列、または（ｂ）
   配列表の配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列、
   を有することを特徴とする核酸断片。
3. 【請求項３】 ビブリオ属に属するＫＢ１株（Ｖｉｂｒ
   ｉｏ ｓｐ．ＫＢ１）の有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
   検出用のプライマーまたはプローブとして有用な核酸断
   片であって、 請求項２に記載の核酸断中の全配列またはその部分配
   列、あるいはこれらの配列に対して、前記１６Ｓ ｒＲ
   ＮＡ遺伝子にハイブリダイズする機能を消失しない範囲
   で塩基の欠失、置換または付加による変異を施した変異
   配列を有することを特徴とするプライマーまたはプロー
   ブ用の核酸断片。
4. 【請求項４】 前記プライマーとして利用可能な核酸が
   １０〜５０塩基の長さであり、前記プローブとして利用
   可能な核酸が１０塩基から最大塩基数までの長さを有す
   る請求項３に記載の核酸断片。
5. 【請求項５】 標識物を結合可能な部位及び固相担体と
   結合可能な部位の少なくとも１つが導入されている請求
   項３または４に記載の核酸断片。
6. 【請求項６】 標識物を結合可能な部位及び固相担体と
   結合可能な部位の少なくとも１つが、前記核酸断片の
   ５’末端側に導入されている請求項３〜５のいずれかに
   記載の核酸断片。
7. 【請求項７】 標識物を結合可能な部位または固相担体
   と結合可能な部位が、ビオチン残基、２，４−ジニトロ
   フェニル基またはジゴキシゲニン残基である請求項３〜
   ６のいずれかに記載の核酸断片。
8. 【請求項８】 ２種の核酸断片の組み合わせからなるビ
   ブリオ属に属するＫＢ１株の有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺
   伝子検出用のプライマーセットであって、これらの核酸
   断片の少なくとも一方が、請求項３〜７のいずれかに記
   載の核酸断片であることを特徴とするプライマーセッ
   ト。
9. 【請求項９】 ビブリオ属に属するＫＢ１株の存在の有
   無を、該株の有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のプローブ
   により検出することで判定するＫＢ１株の検出方法であ
   って、 前記プローブとして、請求項３〜７のいずれかに記載の
   核酸断片を用いることを特徴とする検出方法。
10. 【請求項１０】 ビブリオ属に属するＫＢ１株の存在の
    有無を、該株の有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のプライ
    マーを用いて検出することで判定するＫＢ１株の検出方
    法であって、 前記プライマーとして、請求項３〜７のいずれかに記載
    の核酸断片または請求項８に記載のプライマーセットを
    用いることを特徴とする検出方法。
11. 【請求項１１】 請求項３〜７に記載のプライマーまた
    は請求項８に記載のプライマーセットを用い、下記
    （１）〜（４）の工程： （１）ビブリオ属に属するＫＢ１株の存在の有無を検出
    したい試料を準備する工程、（２）必要に応じて、試料
    中の菌体の破砕処理を行う工程、（３）試料中に上記プ
    ライマーを加えプライマーを起点とした核酸鎖の伸張反
    応を行う工程、（４）工程（３）で得られた伸張反応物
    について検出操作を行う工程を有することを特徴とする
    ＫＢ１株の検出方法。
12. 【請求項１２】 プライマーの伸張反応がＰＣＲ（Ｐｏ
    ｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法に
    よる請求項１１に記載の検出方法。