KR20190076944A - 어류 비브리오병의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비브리오 감염증의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 어류 비브리오 감염증 원인세균의 특정 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열을 선정하여 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)을 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 비브리오 감염증을 판별하거나 어류의 비브리오 감염증의 감염 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 수 시간내 정확한 진단이 가능하여 양식 넙치에 빈번하게 발생하는 비브리오 감염증의 정확하고 신속한 진단을 통하여 경제적인 손실을 줄일 수 있으며, 정확한 동정과 조기 진단을 통한 적절한 항생제의 사용으로 항생제의 오남용 및 불필요한 생산단가의 상승을 막을 수 있다.
Description
본 발명은 비브리오 감염증의 판별 및 검출용 유전자 마커 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 어류 비브리오 감염증 원인세균의 특정 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열을 선정하여 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)을 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 비브리오 감염증을 판별하거나 어류의 비브리오 감염증의 감염 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.
어류 비브리오 감염증, 어류 연쇄구균 감염증, 어류 에드와드 감염증은 세계적으로 많이 양식되는 넙치, 틸라피아, 방어, 무지개송어에 감염되어 높은 폐사를 일으키고 있다. 특히 국내 양식어종 중 가장 많이 생산되는 넙치는 전체 양식어류 생산량의 약 50%를 차지하고 있으나, 기생충, 세균, 바이러스 등 병원체에 의한 감염성 질병의 발생으로 폐사처리되어 그 피해가 증가하고 있다. 특히 양식넙치에서 실시한 질병조사에서는 양식넙치에서 기생충, 세균, 바이러스 검출율이 각각 43.2%, 38.8%, 24.4%로 나타났으며, 검출된 어병세균 중 비브리오속 세균이 9.7%로 가장 많다고 보고되었다. 따라서 감염성 및 병원성의 판별이 중요시되고 있는 시점이다.
세균의 유전자를 분석하기 위한 다양한 방법이 개발되어 있으며, 유전자 염기서열 분석법(sanger sequencing), RAPD(random amplified polymorphic DNA), RFLP(restriction fragment length polymorphism)법 등이 사용되고 있으나, 여전히 분석 시간이 길고 절차가 까다롭다는 문제점을 가지고 있다. 양식 현장에서 사용되고 있는 세균성 질병의 검출은 많은 시간을 필요로 하는 세균 배양법에 의존하고 있으며 이러한 세균 배양법은 객관성이 떨어져 검출 오류의 가능성이 있고, 선택배지를 사용한 세균 배양법은 단일 세균에 대한 검사만 가능하며, 세부적인 분류가 불가능한 단점을 가지고 있다. 검출의 정확도를 높이기 위하여 생화학 분석(API test)가 사용되고 있으나, 절차가 복잡하고 반응시간이 길어 신속한 검출이 불가능하며, 특히 수산 질병관련 세균의 경우, 데이터베이스가 많지 않아 정확도가 낮으므로 실제 수산 현장에 사용되지 않고 있다. 이러한 문제점을 극복하고 수 시간 내 정확한 검출이 가능한 분자검출 제품의 개발로 세균성 질병의 피해를 조기에 막을 수 있다.
이와 같이 감염된 어류에서 검출되는 병원성 세균의 유전형(genotype) 및 유전체 마커를 선정하고, 상기 마커를 이용하여 유전형에 따른 세균의 병원성을 손쉽게 분석할 수 있는 방법이 필요한 실정이다. 상기와 같은 마커의 개발로 양식 넙치 등 어류에 빈번하게 발생하는 비브리오 감염증의 원인세균을 정확하게 검출 및 판별하고, 원인세균에 감염된 개체의 조기 검출을 통하여 원인세균의 정확한 동정과 어류의 항생제 오남용 및 불필요한 어류의 생산단가 상승을 막을 수 있다.
이에, 본 발명자들은 비브리오 감염증 원인세균의 종을 판별하고, 상기 원인세균에 감염된 개체를 검출하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 비브리오 감염증 원인세균인 비브리오 하베이(Vibrio harvey), 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(Vibrio ichtyoenteri), 비브리오 피스체리(Vibrio fischeri), 비브리오 알기노리티커스(Vibio alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(Vibrio anguillarium), 비브리오 스플렌디더스(Vibrio splendidus) 및 포토박테리움 담셀라(Photobacterium damselae)의 판별 및/또는 검출용 유전자 마커를 발굴하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머 쌍을 이용하여 세균 종마다 서로 다른 형광의 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 어류 질병 원인세균을 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비브리오 감염증의 정확하고 신속한 진단을 위해 8종의 비브리오 감염증 원인세균의 특정 염기서열(서열번호 18 내지 서열번호 26)을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 비브리오균의 판별 또는 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 비브리오균의 16S rDNA 또는 dnaJ 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열 중 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 서열번호 18 내지 26의 염기서열로 표시되는 유전자 중 하나 이상의 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 비브리오균의 판별 또는 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 비브리오균의 판별 또는 검출용 프라이머 쌍을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 9 내지 서열번호 17 중 하나 이상의 염기서열로 표시되는 비브리오균의 판별 또는 검출용 PNA 프로브를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; ((b) 서열번호 18 내지 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 유전자 중 하나 이상의 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 이용하여 상기 표적 핵산에 포함된 비브리오균의 유전자를 증폭 및 혼성화시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 비브리오균을 검출하거나 또는 어류에 상기 세균 종의 감염 여부를 판별하는 단계를 포함하는 비브리오균의 판별 또는 검출 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 수 시간내 정확한 진단이 가능하여 양식 넙치에 빈번하게 발생하는 비브리오 감염증의 정확하고 신속한 진단을 통하여 경제적인 손실을 줄일 수 있으며, 정확한 동정과 조기 진단을 통한 적절한 항생제의 사용으로 항생제의 오남용 및 불필요한 생산단가의 상승을 막을 수 있다.
도 1은 Vibrio , Photobacterium 을 포함한 Vibrionaceae의 속 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2은 V. anguilarium , V. alginolyticus 및 P. damselae의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 V. splendidus의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 V. fischeri의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자 유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 V. ichtyoenteri , V. scophthalmi의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자 유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 6은 dnaJ 유전자를 사용하여 V. ichtyoenteri의 판별 및 검출용 유전자 특이적 펩티드핵산의 염기서열도이다.
도 7은 V. alginolyticus , P. anguillarium , V. splendidus , V. fischeri 및 P. damselae 판별용 PNA 프로브 및 Vibrionaceae 속 판별용 프로브의 Tm 파라미터를 분석한 것이다.
도 8은 V. harvey, V. ichtyoenteri , V. scophthalmi 판별용 PNA 프로브의 Tm 파라미터를 분석한 것이다.
도 9~10은 각각 A SET, B SET, C SET에 해당하는 PNA 프로브의 결합온도를 분석한 것이다.
도 11은 A SET에 해당하는 정방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 12는 B SET에 해당하는 정방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 13은 C SET에 해당하는 정방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 14는 C SET에 해당하는 역방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 15는 PNA 형광 probe의 다중분석 real-time PCR의 원리를 나타낸 개략도이다.
도 16은 비브리오 감염증 진단용 PCR의 구성을 나타낸 것이다.
도 17은 비브리오 감염증 원인세균 종의 판별 및 개체의 세균 감염 검출을 위한 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 반응조건을 나타낸 것이다.
도 18은 Vibrio, Photobacterium의 8종의 세균을 사용한 A SET의 Vibrionaceae 속의 진단/판별용 Singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 B SET의 Singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다. (A)는 V. harvey, (B)는 V. ichtyoenteri . V. scophthalmi , (C)는 dnaJ 사용 V. ichtyoenteri , (D)는 P. damselae의 결과를 나타낸다.
도 20은 C SET의 Singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다. (A)는 V. fischeri , (B)는 V. alginolyticus , (C)는 V. anguillarium, (D)는 V. splendidus의 결과를 나타낸다.
도 21은 B SET와 C SET의 다중분석 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 22~23은 다중 분석 키트를 이용하여 비브리오 세균의 DNA에 대한 키트 민감도 분석을 나타낸 것이다. 도 22는 B SET에서의 결과를, 도 23은 C CET에서의 결과를 나타낸다. 도 22 (A) V. harvey, (B) V. scophthalmi , (C) V. ichtyoenteri , (D) P. damselae을 나타내며, 도 23 (A) V. alginolyticus, (B) V. fischeri , (C) V. anguillarium , (D) V. splendidus 를 나타낸다.
도 24은 넙치 DNA와의 혼재 상황에서의 검출능 검사 모식도를 나타낸 것이다.
도 25는 PNA 프로브 기반 리얼타임 PCR의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
도 2은 V. anguilarium , V. alginolyticus 및 P. damselae의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 V. splendidus의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 V. fischeri의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자 유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 V. ichtyoenteri , V. scophthalmi의 판별 및 검출용 16S rDNA 유전자 유전자 특이적 염기서열을 나타낸 것이다.
도 6은 dnaJ 유전자를 사용하여 V. ichtyoenteri의 판별 및 검출용 유전자 특이적 펩티드핵산의 염기서열도이다.
도 7은 V. alginolyticus , P. anguillarium , V. splendidus , V. fischeri 및 P. damselae 판별용 PNA 프로브 및 Vibrionaceae 속 판별용 프로브의 Tm 파라미터를 분석한 것이다.
도 8은 V. harvey, V. ichtyoenteri , V. scophthalmi 판별용 PNA 프로브의 Tm 파라미터를 분석한 것이다.
도 9~10은 각각 A SET, B SET, C SET에 해당하는 PNA 프로브의 결합온도를 분석한 것이다.
도 11은 A SET에 해당하는 정방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 12는 B SET에 해당하는 정방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 13은 C SET에 해당하는 정방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 14는 C SET에 해당하는 역방향 프라이머를 제작한 것이다. 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
도 15는 PNA 형광 probe의 다중분석 real-time PCR의 원리를 나타낸 개략도이다.
도 16은 비브리오 감염증 진단용 PCR의 구성을 나타낸 것이다.
도 17은 비브리오 감염증 원인세균 종의 판별 및 개체의 세균 감염 검출을 위한 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 반응조건을 나타낸 것이다.
도 18은 Vibrio, Photobacterium의 8종의 세균을 사용한 A SET의 Vibrionaceae 속의 진단/판별용 Singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 B SET의 Singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다. (A)는 V. harvey, (B)는 V. ichtyoenteri . V. scophthalmi , (C)는 dnaJ 사용 V. ichtyoenteri , (D)는 P. damselae의 결과를 나타낸다.
도 20은 C SET의 Singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다. (A)는 V. fischeri , (B)는 V. alginolyticus , (C)는 V. anguillarium, (D)는 V. splendidus의 결과를 나타낸다.
도 21은 B SET와 C SET의 다중분석 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 22~23은 다중 분석 키트를 이용하여 비브리오 세균의 DNA에 대한 키트 민감도 분석을 나타낸 것이다. 도 22는 B SET에서의 결과를, 도 23은 C CET에서의 결과를 나타낸다. 도 22 (A) V. harvey, (B) V. scophthalmi , (C) V. ichtyoenteri , (D) P. damselae을 나타내며, 도 23 (A) V. alginolyticus, (B) V. fischeri , (C) V. anguillarium , (D) V. splendidus 를 나타낸다.
도 24은 넙치 DNA와의 혼재 상황에서의 검출능 검사 모식도를 나타낸 것이다.
도 25는 PNA 프로브 기반 리얼타임 PCR의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 비브리오 감염증 원인세균의 종을 판별하고, 상기 원인세균에 감염된 개체를 검출하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 비브리오비리데 비브리오 하베이(V. harvey), 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(V. ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오 피스체리(V. fischeri), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(V. anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(V. splendidus)의 판별 및/또는 검출용 유전자 마커를 발굴하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머 쌍을 이용하여 세균 종마다 서로 다른 형광의 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 어류 질병 원인세균을 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하고자 하였다.
비브리오(Vibrionaceae)과에 속하는 세균에는 Vibrio sp . Aeromonas sp . Plesiomonas sp . Photobacterium sp . Lucibacterium sp. 가 있으며, 본원발명에서는 어류에서 감염증을 일으키는 비브리오과 세균인 비브리오 하베이(V. harvey), 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(V. ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오 피스체리(V. fischeri), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(V. anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(V. splendidus)의 검출방법을 개발하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 비브리오 감염증 원인세균의 판별 및 검출용 유전자 마커로 세균 종을 판별하고, 어류의 상기 세균 종의 감염 여부를 검출하는 방법을 개발하고자, 상기 세균의 16S rDNA 또는 dna J의 염기서열을 확보하였으며, CLC Genomic workbench 8.0.1로 세균 종마다 대표(consesus) 서열을 제작한 다음, clustal W alignment로 유전자를 비교분석하였다. 유전자 분석을 통해 선정된 비브리오 하베이(V. harvey), 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(V. ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오 피스체리(V. fischeri), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(V. anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(V. splendidus)의 16S rDNA 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열 중 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 유전자 마커(부위)를 표적으로 선정하고, 상기 유전자 마커에 대응되는 세균 종 판별용 프라이머 쌍 및 PNA 프로브를 이용하여 비브리오 감염증 원인세균의 종을 검출하고 판별할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 비브리오균의 16S rDNA 또는 dnaJ 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열 중 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 서열번호 18 내지 26의 염기서열로 표시되는 유전자 중 하나 이상의 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 비브리오균의 판별 또는 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍에서 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 프로브는 서열번호 9 내지 서열번호 17 중 하나 이상의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 비브리오균의 판별 또는 검출용 프라이머 쌍의 판별 또는 검출용 프라이머 쌍에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 비브리오균의 16S rDNA 또는 dnaJ 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열 중 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)과 상응하는 서열번호 9 내지 서열번호 17 중 하나 이상의 염기서열로 표시되는 비브리오균의 판별 또는 검출용 프로브의 판별 또는 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 비브리오균은 비브리오 하베이(V. harvey), 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(V. ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오 피스체리(V. fischeri), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(V. anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(V. splendidus)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다.
상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Quasar, JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.
펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 포리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다
또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 세균 종의 SNP가 포함되도록 12~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 PNA 프로브의 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.
본 발명의 조성물은 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 조성물은 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 조성물은는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
상기 조성물을 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 세균 종 판별이 가능하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (b) 서열번호 18 내지 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 유전자 중 하나 이상의 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 이용하여 상기 표적 핵산에 포함된 비브리오균의 유전자를 증폭 및 혼성화시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 비브리오균을 검출하거나 또는 어류에 상기 세균 종의 감염 여부를 판별하는 단계를 포함하는 비브리오균의 판별 또는 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 비브리오균은 비브리오 하베이(V. harvey), 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(V. ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오 피스체리(V. fischeri), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(V. anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(V. splendidus)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2 이상의 표적 핵산을 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적 핵산 검출을 통해 하나 이상의 비브리오균의 세균 종을 판별 또는 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 비브리오균의 세균 종과 혼합된 시료이거나 상기 세균에 감염된 개체(예컨대, 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "표적 핵산", "합성 DNA" 또는 "인공합성 올리고"는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 "표적 유전자"의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.
본 발명의 "염기변이"는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다.
상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Quasar, JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.
PNA 프로브를 이용한 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 분석을 위해서는 우선 SNP를 포함하는 부분의 염기를 이용한 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 변이(SNP 포함)를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이(SNP 포함)의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 돌연변이(SNP 포함)가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 타겟 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이(SNP 포함) 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[
실시예
1]
비브리오균의
판별 및 검출용 유전자
마커
, 및 상기 세균에 특이적인 프라이머 및 PNA 프로브 제작
어류 감염증 원인세균들 중에서 한국의 양식 넙치 등 어류에서 분리된 세균 38종, 461개의 분리 균주를 대상으로 세균 16S rDNA 또는 dnaJ 유전자의 유전형을 구분하기 위하여 16S rDNA 또는 dnaJ 유전자의 염기서열을 Sanger sequencing을 통하여 확보하였으며, CLC Genomic workbench 8.0.1을 사용하여 세균 종마다 해당되는 대표(consesus) 서열을 제작하여 clustal W alignment를 사용하여 비교분석하였다. 유전자 분석을 통해 8종의 비브리오균으로 비브리오 하베이(V. harvey), 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(V. ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오 피스체리(V. fischeri), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(V. anguillarium), 및 비브리오 스플렌디더스(V. splendidus)에 특이적인 염기 부위를 비브리오 세균 종의 판별 및 검출용 유전자 마커로 선정하였다.
A 세트는 brio , Photobacterium 을 포함한 Vibrionaceae의 속의 검출용 프라이머 세트이다.
B 세트에는 비브리오 하베이(V. harvey), 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(V. ichtyoenteri) 및 포토박테리움 담셀라(P. damselae)가 포함되어 있고, C 세트에는 비브리오 피스체리(V. fischeri), 비브리오 알기노리티커스(V. alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(V. anguillarium), 및 비브리오 스플렌디더스(V. splendidus)검출용 프라이머 세트가 포함되어 있다.
상기 비브리오균의 존재 여부를 확인하고 검출용으로 사용하기 위하여 표 1의 프라이머 서열을 사용하였다. 구체적으로 A SET 프라이머는 Vibrionaceae 속판별을 위한 16S rDNA의 특이적인 프라이머로, Forward primer로 세균 16s rDNA의 공통적인 primer 27F를 제작하였고, Vibrionaceae 속에 공통적인 Viph R1 프라이머를 제작하였다. B SET 프라이머는 16s rDNA의 특이적인 프라이머로 Vibrio, Photobacteium의 모든 종의 공통적인 VibF1A 프라이머 및 VibR1A 프라이머를 제작하였으며, C SET 프라이머는 16s rDNA의 특이적인 프라이머로 Vibrio 및 Photobacterium의 모든 종의 공통적인 프라이머 VibF2B 및 VibR2, dnaJ 유전자의 증폭용 프라이머로 dnaJF2, dnaJR1를 제작하였다.
본 발명에서 사용한 PNA 프로브는 PNA 프로브 디자이너(Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 설계하였고, 상기 PNA 프로브에 세균 특이적 염기서열과 리포터 및 소광자를 포함시켜 제작하였다. 이때, 상기 PNA 프로브는 같은 형광이 포함되지 않도록 각각 FAM, HEX, TexasRed, Cy5를 결합하여 제작하였다(표 1).
본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법으로 확인하였다(표적 핵산과의 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다).
도 1~6은 본 발명에 따른 상기 8종의 세균(V. harvey, V. scophthalmi , V. ichtyoenteri, P. damselae , V. fischeri , V. alginolyticus , V. anguillarium , V. splendidus)의 16S rDNA 또는 dnaJ 유전자 일부와 SNP 및 이로부터 도출된 펩티드핵산(peptide nucleic acid, PNA)의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이며, 선정된 마커 부위의 염기서열은 빨간색으로 표기하였다.
도 7~8은 A~C SET에 포함된 비브리오균의 PNA 프로브의 Tm 파라미터를 분석한 것이며, 각 각 PNA 프로브에 따른 염기서열은 노란색으로 표기하였다. 또한 도 9~10는 각각 B SET, C SET에 해당하는 PNA 프로브의 결합온도를 분석한 것이다. 도 11~14는 B SET, C SET에 해당하는 프라이머를 제작한 것이며, 선정된 프라이머 부위의 염기서열은 노란색으로 표기하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 유전자 마커, 프라이머 염기서열 및 PNA 프로브 염기서열(표 1)을 결정하였다.
| 구분 | 명칭 | 서열(5' -> 3') | 서열번호 | 타겟 |
| 프라이머 | Vib F1A | TACTGGGCGTAAAGCGCAT | 1 |
V. harvey,
V. scophthalmi, V. ichtyoenteri P.damselae |
| Vib R1A | GCGTTAGCTCCGAAAGCC | 2 | ||
| Vib F2B | GGACGGGTGAGTAATGCC | 3 |
V. fischeri,
V. alginolyticus , V. anguillarium, V. splendidus |
|
| Vib R2 | CCCGGGCTTTCACATCT | 4 | ||
| dnaJ F2 | CCGCAAAGAAGCCTTGG | 5 | V. ichtyoenteri | |
| dnaJ R1 | CGATATCTTCGGCGATGTG | 6 | ||
| 27F | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | 7 | Vibrio, Photobacterium | |
| Viph R1 | CCCGGGCTTTCACATCT | 8 | ||
| PNA 프로브 | ViPh | Dabcyl-AGCGCATGCAGG-O-K (Quasar) | 9 | Vibrio, Photobacterium |
| Har_4 |
Dabcyl-CGGGTCAAAGA-O-K (FAM) | 10 | V. harvey | |
| ich, sco_3 | Dabcyl-ATAGCGTAATTATTTGAC-O-K (Texas red) | 11 |
V. ichtyoenteri,
V. scophtahalmi |
|
| dam_1 | Dabcyl-GGCGGCCTGTTA-O-K (HEX) | 12 | P. damselae | |
| dnaJ_1 | Dabcyl-CGAACCACGTTGT-O-K (Cy5) | 13 | V. ichtyoenteri | |
| Alg_2 | Dabcyl-CTCGGAATAGCATTTG-O-K (HEX) | 14 | V. alginolyticus | |
| Ang_1 | Dabcyl-TGGTGGATTAAGT-O-K (Texas-Red) | 15 | V. anguillarium | |
| Spl_2 | Dabcyl-ACAGACACTGACA-O-K (Cy5) | 16 | V. splendidus | |
| Fish_1 | Dabcyl-GGTTGTTCCCTTGAG-O-K (FAM) | 17 | V. fischeri | |
| 16S rDNA 마커 | V. harvey_16S rDNA marker | CGGGTCAAAGA | 18 | V. harvey |
| V. scophthalmi & V. ichtyoenteri _16S rDNA marker | ATAGCGTAATTATTTGAC | 19 |
V. scophthalmi,
V. ichtyoenteri |
|
| P. damselae_16S rDNA marker | GGCGGCCTGTTA | 20 | P. damselae | |
| V. fischeri_16S rDNA marker | GGTTGTTCCCTTGAG | 21 | V. fischeri | |
| V. alginolyticus_16S rDNA marker | CTCGGAATAGCATTTG | 22 | V. alginolyticus | |
| V. anguillarium_16S rDNA marker | TGGTGGATTAAGT | 23 | V. anguillarium | |
| V. splendidus_16S rDNA marker | ATAGCGTAATTATTTGAC | 24 | V. splendidus | |
| 16S rDNA 마커 | Vibrionaceae의 속 _16S rDNA marker | AGCGCATGCAGG | 25 |
Vibrio sp
Photobacterium sp . |
| dnaJ 마커 | V. ichtyoenteri_dnaJ marker | CGAACCACGTTGT | 26 | V. ichtyoenteri |
(상기 표 1에서 Dabcyl은 소광자, Quasar, FAM, Texas red, HEX, Cy5는 리포터를 의미한다.)
[
실시예
2]
리얼타임
PCR
(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 및 융해곡선의 분석을 통한 세균 유전자 판별방법
실시예 1의 세균 특이적 유전자 마커, PNA 프로브 및 프라이머를 이용하여, 8종의 세균(V. harvey, V. scophthalmi , V. ichtyoenteri , P. damselae , V. fischeri, V. alginolyticus , V. anguillarium , V. splendidus)의 DNA 샘플에 대하여 증폭곡선 및 용해곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 세균 종을 판별하고자 하였다. 도 16은 비브리오 감염증 진단용 PCR의 구성을 나타낸 것이다.
PCR은 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 모든 실험 조건은 단일가닥 표적 핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X PNA qPCR PCR MasterMix(시선바이오머티리얼스, 한국), 0.1μM 순방향 프라이머(forward primer) 및 1μM 역방향 프라이머(reverse primer)에 4종의 PNA 프로브 혼합물 1μM, 10ng 세균 유래 DNA를 첨가한 다음 실시간 PCR을 수행하였다.
도 17은 세균 종의 판별 및 검출을 위한 리얼타임 PCR의 반응조건을 도시한 것으로, 세균 유래 DNA의 유전자 마커 부위를 증폭 및 혼성화시키고, 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이는 과정을 그래프로 나타내었다. 여기서, 리얼타임 PCR 과정은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 58℃에서 45초, 74℃에서 45초 동안 반응시켰으며, 이를 40 사이클 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음, 80℃에서 30초, 60℃에서 30초, 45℃에서 80℃까지 1℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 18~21에 나타난 바와 같이, 서열번호 18 내지 서열번호 26 중에서 선택되는 각각의 펩티드핵산을 세균 DNA 샘플(V. harvey, V. scophthalmi , V. ichtyoenteri, P. damselae , V. fischeri , V. alginolyticus , V. anguillarium , V. splendidus)에 대하여 적용하게 되면 세균 별 증폭곡선 및 형광별 융해곡선 그래프를 얻을 수 있었다.
또한, 도 18 및 도 21에 나타난 바와 같이, 1개 튜브에서 리얼타임 PCR을 동시에 수행함으로써 각 세트별 융해곡선의 분석으로 A SET 8종세균, B SET 3종의 세균(V. harvey, V. scophthalmi , V. ichtyoenteri), C SET 4종의 세균(V. fischeri , V. alginolyticus , V. anguillarium , V. splendidus)에 대한 다중 검출(multi-detection)이 가능하였다.
상기 결과를 종합하면, 세균의 개별적인 검출 또는 서로 다른 세균 종이 혼합되어 있는 시료로부터 세균 종의 판별이 가능하였다.
[
실시예
3］세균
DNA 사용
진단키트의
민감도와 Real-time
PCR의
특이도 및 민감도 분석
본 발명에 따른 PNA 프로브, 프라이머를 포함하는 다중 분석 키트를 이용하여 비브리오 세균의 DNA에 대한 키트 민감도 분석을 진행하였다. 민감도 분석 시 10-fold dilution을 진행한 표준균주 DNA(100ng~0.01ng)를 사용하여 분석하였으며, 각 형광의 Ct value를 사용하여 정량분석의 효율을 비교하였다.
그 결과, Melting peak 및 Amplification curve 분석결과 진단 PCR 세트 모두 0.01ng DNA 검출의 높은 민감도를 나타내었다(도 22~23). 도 22는 B SET에서의 결과를, 도 23은 C CET에서의 결과를 나타낸다. 도 12 (A) V. harvey, (B) V. scophthalmi, (C) V. ichtyoenteri 을 나타내며, 도 23 (A) V. alginolyticus, (B) V. fischeri, (C) V. anguillarium, (D) V. splendidus 를 나타낸다.
또한, 실제 넙치의 조직에 존재하는 어병세균을 검사하는 진단절차에 적용하기 위하여, 본 발명에 따른 PNA 프로브, 프라이머, PCR 반응물 및 온도조건으로 작동되는 진단키트의 시제품과 넙치 DNA와 세균의 DNA가 혼합된 시료를 사용하여, 넙치 DNA의 유무에 따른 검사의 효율을 확인하였다. 구체적으로 10-fold dilution을 진행한 표준균주 (100,000 ~ 10 colony)를 사용하여 분석하였으며, 각 형광의 Ct value를 사용하여 정량분석의 효율을 비교하였다.
그 결과, PCR 세트 모두 10 colony 까지 검출이 가능하며, 넙치 DNA의 유무에 따른 "교차반응(cross-reaction)"이 없는 것으로 확인되어, 특이도와 민감도가 높다는 것이 입증되었다(도 25).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> National Institute of Fisheries Science
<120> Genetic Marker for Discrimination and Detection of Vibriosis in
fish and Method for Discrimination and Detection of Vibriosis in
fish Using the Same
<130> P17-B196
<160> 26
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
tactgggcgt aaagcgcat 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
gcgttagctc cgaaagcc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
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<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cccgggcttt cacatct 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ccgcaaagaa gccttgg 17
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
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<210> 8
<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
cccgggcttt cacatct 17
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA porbe
<400> 9
agcgcatgca gg 12
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<211> 11
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA porbe
<400> 10
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<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA porbe
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<211> 12
<212> DNA
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<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA porbe
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> PNA porbe
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ggttgttccc ttgag 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for V. harvey
<400> 18
cgggtcaaag a 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for V. scophthalmi and V. ichtyoenteri
<400> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for P. damselae
<400> 20
ggcggcctgt ta 12
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for V. fischeri
<400> 21
ggttgttccc ttgag 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for V. alginolyticus
<400> 22
ctcggaatag catttg 16
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<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for V. anguillarium
<400> 23
tggtggatta agt 13
<210> 24
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for V. splendidus
<400> 24
acagacactg aca 13
<210> 25
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA marker for Vibrio sp. and Photobacterium sp.
<400> 25
agcgcatgca gg 12
<210> 26
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dnaJ marker for V. ichtyoenteri
<400> 26
cgaaccacgt tgt 13
Claims (21)
- 서열번호 18 내지 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 서열번호 10 내지 서열번호 12로 표시되는 프로브를 포함하는 비브리오 하베이(Vibrio harvey), 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(Vibrio ichtyoenteri) 및 포토박테리움 담셀라(P. damselae)로 구성된 군에서 선택되는 2종이상 되는 비브리오균의 다중 판별 또는 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher) 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Quasar, JOE, Cy3 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 소광자quencher)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 비브리오 하베이(Vibrio harvey), 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(Vibrio ichtyoenteri) 및 포토박테리움 담셀라(P. damselae)로 구성되는 비브리오균의 다중 판별 또는 검출 방법:
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 서열번호 18 내지 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 서열번호 10 내지 서열번호 12로 표시되는 프로브를 이용하여 상기 표적 핵산에 포함된 비브리오균의 유전자를 증폭 및 혼성화시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 비브리오균을 검출하거나 또는 어류에 상기 세균 종의 감염 여부를 판별하는 단계.
- 제6항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열번호 18 내지 서열번호 20, 서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 서열번호 9 내지 서열번호 13로 표시되는 프로브를 포함하는 비브리오 하베이(Vibrio harvey), 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(Vibrio ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오피스체리(Vibrio fischeri), 비브리오 알기노리티커스(Vibio alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(Vibrio anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(Vibrio splendidus)로 구성되는 비브리오균의 다중 판별 또는 검출용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2, 서열번호 5 및 6과 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher) 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Quasar, JOE, Cy3 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 비브리오 하베이(Vibrio harvey), 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(Vibrio ichtyoenteri) 및 포토박테리움 담셀라(P. damselae)로 구성된 군에서 선택되는 비브리오균의 판별 또는 검출 방법:
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 서열번호 18 내지 서열번호 20, 서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 이용하여 상기 표적 핵산에 포함된 비브리오균의 유전자를 증폭 및 혼성화시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 비브리오균을 검출하거나 또는 어류에 상기 세균 종의 감염 여부를 판별하는 단계.
- 제13항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6과 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열번호 18 내지 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 서열번호 9 내지 서열번호 17로 표시되는 프로브를 포함하는 비브리오 하베이(Vibrio harvey), 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(Vibrio ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오피스체리(Vibrio fischeri), 비브리오 알기노리티커스(Vibio alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(Vibrio anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(Vibrio splendidus)로 구성되는 비브리오균의 다중 판별 또는 검출용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6과 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher) 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Quasar, JOE, Cy3 및 Cy5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 비브리오 하베이(Vibrio harvey), 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi), 비브리오 이쵸엔터리(Vibrio ichtyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오피스체리(Vibrio fischeri), 비브리오 알기노리티커스(Vibio alginolyticus), 비브리오 안구일라리움(Vibrio anguillarium) 및 비브리오 스플렌디더스(Vibrio splendidus)로 구성되는 비브리오균의 다중 판별 또는 검출 방법:
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 서열번호 18 내지 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 서열번호 9 내지 서열번호 17로 표시되는 프로브를 이용하여 상기 표적 핵산에 포함된 비브리오균의 유전자를 증폭 및 혼성화시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 비브리오균을 검출하거나 또는 어류에 상기 세균 종의 감염 여부를 판별하는 단계.
- 제20항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6과 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR1020190075672A KR102091283B1 (ko) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 어류 비브리오병의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법 |
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| JP2000135086A (ja) * | 1998-10-29 | 2000-05-16 | Canon Inc | １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び該遺伝子中のＤＮＡ配列を用いたＫＢ１株の検出法 |
| KR20150028063A (ko) * | 2013-09-05 | 2015-03-13 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | 리포터 및 소광자가 결합된 프로브를 이용한 액상형 어레이 및 이를 이용한 표적핵산 또는 돌연변이 검출방법 |
| KR101531289B1 (ko) * | 2015-02-12 | 2015-06-24 | 대한민국 | 동시 다중 유전자 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi)를 포함한 비브리오균 검출 방법 |
-
2019
- 2019-06-25 KR KR1020190075672A patent/KR102091283B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000135086A (ja) * | 1998-10-29 | 2000-05-16 | Canon Inc | １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び該遺伝子中のＤＮＡ配列を用いたＫＢ１株の検出法 |
| KR20150028063A (ko) * | 2013-09-05 | 2015-03-13 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | 리포터 및 소광자가 결합된 프로브를 이용한 액상형 어레이 및 이를 이용한 표적핵산 또는 돌연변이 검출방법 |
| KR101531289B1 (ko) * | 2015-02-12 | 2015-06-24 | 대한민국 | 동시 다중 유전자 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi)를 포함한 비브리오균 검출 방법 |
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|---|
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| Vibrio harveyi, Genebank accession no. AY332564.1(2003.7.29.)* * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102091283B1 (ko) | 2020-05-15 |
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