KR101531289B1 - 동시 다중 유전자 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi)를 포함한 비브리오균 검출 방법 - Google Patents

동시 다중 유전자 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi)를 포함한 비브리오균 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오균을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 4종의 PCR 프라이머 세트를 개발하고 이들 프라이머 세트를 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)에 동시에 적용하여 신속, 정확하게 비브리오균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)에 의해 세균을 분리하는 과정 없이 더욱 간단하고 빠르게 어병 비브리오균의 오염을 진단할 수 있어 국민 식생활 안전 확보 등 공중보건에 크게 기여할 수 있으며, 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 이용한 어패류의 지속적인 감시를 통하여 질병 발생을 예방하고 치료대책을 마련하여 국가 방역 사업에 기여할 수 있을 것이다.

Description

동시 다중 유전자 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi)를 포함한 비브리오균 검출 방법{Method for Detecting Vibrio Bacteria Including Vibrio scophthalmi Using Multiplex PCR}
본 발명은 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 4종의 PCR 프라이머 세트를 개발하고 이들 프라이머 세트를 이용하여 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 신속, 정확하게 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법에 관한 것이다.
한국의 해산 어류에서 발생하는 대표적인 세균성 질병은 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)에 의한 에드와드증(edwardsiellosis)와 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)에 의한 연쇄구균증(streptococosis), 그리고 비브리오속 세균에 의한 비브리오증(vibriosis) 등이 있다(Kim JW et al., Kor J Fish Pathol, 19:207-214, 2006). 이들 중 비브리오증(vibriosis)의 원인세균인 비브리오균은 그람음성간균으로, 한 개의 편모가 있어 운동성이 활발하며 아포나 협막은 없는 것이 특징이며, 비브리오속 세균에서 새로운 속으로 분류된 리스토넬라 앙귤라륨(Listonella anguillarum)과 포토박테리움 담셀라(Photobacterium damselae)를 포함한다(Edward JN, Fish diseases, Iowa state University Press, USA, 1996). 최근 한국의 양식 어류에서 발생하는 비브리오증(vibriosis)의 원인균은 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 비브리오 익치오엔테리 (Vibrio ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae) 등으로 보고되고 있다(Kim DH et al., Kor J Fish Pathol, 27:497-505, 2004; Won KM et al., Kor J Fish Pathol, 19:119-126, 2006; Sunaryanto A and Nariam A, Bull Brackishwater Aqua Dev Cent, 8:105-112, 1986). 비브리오 하베이(V. harveyi)는 넙치 등의 어류와 새우 등의 갑각류에 질병을 일으키며(Lavilla-Pitogo CR et al., Aquaculture, 91:1-13, 1990; Won KM and Park SI, Aquaculture, 285:8-13, 2008), 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)는 넙치 장어에 발생하는 장관백탁증의 원인체로 보고되고 있으며(Fukuda Y et al., Fish Pathol, 31:33-38, 1996), 포토박테리움 담셀라(P. damselae)는 넙치에 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다(Kwon MG et al., Kor J Fish Pathol, 22:115-124, 2009)비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)는 터봇에서 처음 분리가 되었고(Cerda-Cuellar et al, Int J Syst Bacteriol, 47:58-61, 1997) 우리나라 넙치에서 분리되며(강, 제주대학교, 2003, 박사학위논문) 넙치에 병원성이 보고되어 인위감염에 의한 폐사가 보고되었다(Kim et al., Kor J Fish Pathol, 26:207-217, 2013). 또한 체표 출혈, 장염의 증상이 있으며 폐사를 동반한 뱀장어에서 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)가 분리되기도 하였다(Lee et al., Kor J Fish Pathol, 25:173-180, 2012).
비브리오속 세균은 생화학적 성상, 혈청학적 특성 등으로 동정이 이루어지지만 비브리오속 세균은 그 특성이 유사하여 신속하고 정확한 동정에 어려움이 있다. 최근에 DNA-DNA 혼성화(hybridization)법, 임의증폭다형DNA(RAPD, random amplified polymorphic DNA), 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction) 등의 방법을 이용한 비브리오 하베이(V. harveyi)의 동정(Gomez-gil B et al., Microbiology, 150:1769-1777, 2004), 16S-23S 유전자간 스페이스 영역(ISR, intergenic spacer region)을 표적으로 한 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)의 동정(Moon YG and Heo MS, Kor J Microbiol, 41:117-124, 2005) 및 동시 다중 유전자 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 이용한 포토박테리움 담셀라(P. damselae)의 동정(Osorio CR et al., Dis Aquat Organ 40:177-183, 2000)이 보고되고 있으며, DNA-DNA 혼성화(hybridization)법에 의한 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)의 동정(Cerda-Cuellar et al, Int J Syst Bacteriol, 47:58-61, 1997)이 보고되고 있으나, 국내 양식어류에서 발생하는 비브리오증의 원인균은 생화학적 방법으로 정확히 동정하기 어렵고 그 종류가 다양하여 여러 종류의 세균을 동시에 구분할 수 있는 노동 집약적이며 신속하고 정확한 비브리오속 동정방법의 제공이 필요하다.
일반적으로 RNA 중합효소(polymerase)의 subunit을 암호화하는 rpoB 유전자는 housekeeping 유전자로서 계통분류를 위한 마커로 이용되고 있으며(Martems M et al., Int J Syst Evol Microbiol, 58:200-214, 2008; Klenk HP and Zillig W, J Mol Evol, 38:420-432, 1994), 비브리오과(vibrionaceae)의 rpoB 유전자 경우, 균주 사이의 차이가 뚜렷하여 일부 비브리오과의 동정에 이용되고 있다(Tarr CL et al., J Clin Microbiol, 45:134-140, 2007). 또한, dnaJ 유전자는 heat shock protein 40을 암호화하는 housekeeping 유전자로서 이를 이용한 비브리오과 균주의성공적인 분류가 보고되었다(Nhung et al., Syst Appl Microbiol, 30:309-315, 2007).
이에, 본 발명자들은 어류에서 비브리오증을 일으키는 비브리오속 세균을 동정하는 정확하면서 신속한 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 비브리오속 세균들의 균주 사이에서 뚜렷한 차이를 나타내는 rpoB 유전자 및 dnaJ 유전자 특이적인 프라이머를 이용한 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하여 국내 양식어류에서 발생하는 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)를 포함한 비브리오증의 원인균을 신속, 정확하게 동정할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)를 포함한 어병 비브리오균을 동정하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비브리오증(vibriosis)의 원인균인 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 익치오엔테리 (V. ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라 (P. damselae) 및 비브리오 하베이(V. harveyi) 각각에 특이적 PCR용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트 군에서 선택되어진 둘 이상의 프라이머 세트로 구성된 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)를 포함한 비브리오균 진단 및 분류 키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미 (Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 PCR용 프라이머 세트를 포함하고, 추가적으로 상기 (a)~(c)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 비브리오균 진단 및 분류 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 4종의 프라이머 세트들은 공통의 PCR 조건을 가지고 1회의 PCR 반응으로 동시에 적용하는 것이 가능하며, 이들 4종의 프라이머 세트들을 모두 동시에 이용하는 본 발명에 의한 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 기법은 1회 PCR을 수행함으로써 신속, 정확하게 검체 내에 존재하는 4종의 비브리오균의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)에 의해 세균을 분리하는 과정 없이 더욱 간단하고 빠르게 어병 비브리오균의 오염을 진단할 수 있어 국민 식생활 안전 확보 등 공중보건에 크게 기여할 수 있으며, 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 이용한 어패류의 지속적인 감시를 통하여 질병 발생을 예방하고 치료대책을 마련하여 국가 방역 사업에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 4종의 비브리오균을 진단하기 위해 제작된 본 발명의 프라이머의 온도 특이도를 조사한 결과를 나타낸 도면이다. (M: 100bp DNA ladder, Lanes 1-12, 1:58.0℃, 2:58.3℃, 3:58.9℃, 4:59.7℃, 5:60.8℃, 6:62.3℃, 7:64.0℃, 8:65.4℃, 9:66.5℃, 10:67.3℃, 11:67.8℃, 12:68.0℃)
도 2는 4종의 비브리오균을 진단하기 위해 제작된 본 발명의 프라이머의 균 특이도를 조사한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 (하나의 표적균에 대한) 동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR)에서 4종의 비브리오균을 진단하기 위해 제작된 본 발명의 프라이머의 민감도를 조사한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에서는 한국의 양식 넙치에서 발생하는 비브리오증의 주요 원인균을 신속, 정확, 간편하게 동정하고자 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)를 포함한 어병 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법을 제공하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 housekeeping 유전자인 rpoB 유전자의 variation 부위가 비브리오과(vibrionaceae) 균주 사이에서 뚜렷한 차이가 나타난다는 점을 이용하여 비브리오 하베이(V. harveyi), 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae) 각각의 rpoB 유전자에 특이적인 3종의 프라이머 세트를 제작하였다. 또한, rpoB 유전자가 동일한 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)와 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)를 구별하기 위하여 dnaJ 유전자 양쪽 바깥부분의 염기서열에 상보적인 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) 특이적인 1종의 프라이머 세트를 추가로 제작하였다. dnaJ 유전자를 바탕으로 제작한 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) 특이적인 프라이머를 이용한 실시예에서 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi)를 포함한 다른 세균들에서는 PCR 산물이 형성되지 않고, 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)에서만 PCR 산물이 형성되는 것을 확인하였다.
제작된 4종의 프라이머 세트들은 공통의 PCR 조건을 가지고 1회의 PCR 반응에 동시 적용하는 것이 가능하며, 이들 4종의 프라이머 세트들을 모두 동시에 이용하여 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시하면 1회 PCR을 수행함으로써 검체 내에 존재하는 4종의 비브리오균을 신속, 정확하게 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법에 관한 것이다.
또한, 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하고, 추가적으로 (a) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 및 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 특이적 PCR용 프라이머 세트, (b) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 포토박테리움 담셀라(Photobacterium damselae) 특이적 PCR용 프라이머 세트, 및 (c) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) 특이적 PCR용 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하는 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 상기 4종의 비브리오균을 동시에 검출하는 것이 가능하다.
비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)에 특이적인 서열번호 1(VI-dnaJF)와 서열번호 2(VI-dnaJR) 프라이머는 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) dnaJ 유전자의 base position 33222bp to 33246bp와 34418bp to 34395bp 부위, 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) 및 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)에 특이적인 서열번호 3(VI-3F)과 서열번호 4(VI-1R) 프라이머는 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) rpoB 유전자의 base position 318bp to 340bp와 751bp to 728bp 부위, 포토박테리움 담셀라(P. damselae)에 특이적인 서열번호 5(PD-2F)와 서열번호 6(PD-2R) 프라이머는 포토박테리움 담셀라(P. damselae) rpoB 유전자의 base position 121bp to 144bp와 653bp to 631bp 부위 및 비브리오 하베이(V. harveyi)에 특이적인 서열번호 7(VH-4F)과 서열번호 8(VH-7R) 프라이머는 비브리오 하베이(V. harveyi) rpoB 유전자의 base position 136bp to 159bp와 736bp to 714bp 부위와 각각 상보적으로 설계하였다(표1).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적 프라이머 세트에 추가적으로 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 및 비브리오 익치오엔테리 (Vibrio ichthyoenteri) 특이적 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 포토박테리움 담셀라 (Photobacterium damselae) 특이적 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) 특이적 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오균의 검출용 프라이머는 결합하는 세균의 특이적 염기서열과 어닐링 온도가 다르기 때문에, 2개 이상의 프라이머를 하나의 튜브에 포함시켜서 사용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오균의 검출 및 동정 방법은 비브리오균에 감염된 넙치로부터 세균을 분리, 배양하고, 배양된 병원균으로부터 DNA를 추출하여 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 세균을 분리하고 배양하는 과정 없이 감염된 조직에서 DNA를 직접 분리하여 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시하여도 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 하베이(V. harveyi), 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae)를 검출하는 것이 가능하다.
상기의 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)은 94℃에서 5분간 가열하는 단계, 94℃에서 30초간 변성, 55℃와 70℃ 범위에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 30초간 중합반응을 한 주기로 30회 반복하는 단계, 72℃에서 7분간 중합 반응하는 단계를 포함한다.
비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)의 경우는 58℃와 66.5℃ 범위의 온도에서 434bp의 PCR 산물이 형성되었고, 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)의 경우는 58℃와 66.5℃ 범위와 58℃와 64℃ 범위에서에서 각각 434bp와 1,068bp의 PCR 산물이 형성되었으며, 포토박테리움 담셀라(P. damselae)의 경우는 58℃와 66.5℃ 범위에서 535bp의 PCR 산물이 형성되었으며, 비브리오 하베이(V. harveyi)의 경우는 58℃와 68℃ 범위의 모든 온도에서 601bp의 PCR 산물이 형성됨을 확인하였다(도 1).
서열번호 3 및 4의 프라이머 세트에 의해 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)와 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) 모두에서 434bp의 PCR 산물이 형성되었으나, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트에 의해 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)에서만 1,068bp의 PCR 산물이 형성되어 두 비브리오균이 확실하게 구별됨을 확인하였다.
본 발명에 따른 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오균의 검출 및 동정방법에 사용되는 주형의 형태는 순수하게 분리된 세균의 DNA와 DNA 분리 과정을 거치지 않고 100℃에서 10분간 열처리한 세균 전체(colony multiplex PCR) 모두가 가능하다.
상기의 동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR)은 PCR-PreMix(바이오니아, 대전, 한국)에 8개의 프라이머를 각각 0.25pmole씩, 주형 DNA를 1㎕ 넣은 후 멸균된 3차 증류수로 최종 반응액을 20㎕로 조절하여 실시하였다.
본 발명에 따른 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통한 비브리오균의 검출 방법은 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)는 1pg 이상의 농도부터, 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)는 100pg 이상의 농도부터, 포토박테리움 담셀라(P. damselae)는 1ng 이상의 농도부터, 비브리오 하베이(V. harveyi)는 10pg 이상의 농도부터 증폭이 가능하였다(도 3).
본 발명은 상기 비브리오균에 특이적인 프라이머를 사용하여 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 수행 후에 추가적으로 PCR 산물의 크기를 분석함으로써 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 신속, 간편하게 비브리오균을 검출 및 동정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 PCR용 프라이머 세트를 포함하고, 추가적으로 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 및 비브리오 익치오엔테리 (Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 PCR용 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 포토박테리움 담셀라 (Photobacterium damselae) 특이적인 PCR용 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) 특이적인 PCR용 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 비브리오균 진단 및 분류 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 하나 이상의 비브리오균을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 비브리오균 진단 및 분류용 키트이다.
상기 키트의 프라이머는 2개 이상의 프라이머를 하나의 튜브에 포함하는 것을 특징으로 하는 비브리오균 진단 및 분류용 키트이다.
상기 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있으며, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함하는 것도 가능하다.
이러한 키트를 이용하면, 공통의 PCR 조건을 가지고 본 발명에서 제작한 2종이상의 프라이머 세트들을 모두 동시에 이용한 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시하여 1회 PCR을 수행함으로써 검체 내에 존재하는 2종 이상의 비브리오균을 신속, 정확하게 검출 및 동정하는 것이 가능하다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 대상 세균 균주
비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 하베이(V. harveyi), 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae)를 쉽고 빠르게 동정하기 위한 동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR)은 26종의 세균들(비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi) CAIM(Collection of Aquatic Important Microorganisms) 1797, 비브리오 하베이(V. harveyi) KCCM(한국미생물보존센터) 40866, 포토박테리움 담셀라(P. damselae) ATCC(American Type Culture Collection) 12279, 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) KCTC 12725 , 리스토넬라 앙귤라륨(Listonella anguillarum) ATCC 33539, 비브리오 에스투아리아누(V. aestuarianus) KCCM 40863, 비브리오 알지노라이티쿠스(V. alginolyticus) KCCM 40513, 비브리오 캄프벨리(V. campbellii) KCCM 41986, 비브리오 콜레라(V. cholerae) KCCM 41626, 비브리오 디아조트로피쿠스(V. diazotrophicus) KCCM 41666, 비브리오 피셔리(V. ficsheri) KCCM 41685, 비브리오 플루비아리스(V. fluvialis) KCCM 40827, 비브리오 퍼니시(V. furnissii) KCCM 41679, 비브리오 미미쿠스(V. mimius) KCCM 42257, 비브리오 오다리(V. ordalii) KCCM 41669, 비브리오 파라헤모라이티쿠스(V. parahaemolyticus) KCCM 41664, 비브리오 페내시다(V. penaecida) KCCM 40869, 비브리오 프로테오라이티쿠스(V. proteolyticus) KCCM 11992, 비브리오 살모니시다(V. salmonicida) KCCM 41663, 비브리오 벌리피쿠스(V. vulnificus) ATCC 27562, 에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) ATCC 14175, 에드워드시엘라 타르다(E. tarda) ATCC 15949, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) KCCM 11328, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) KCCM 12214, 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae) KCTC(한국생명공학 연구원 생물자원센터) 3657, 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberis) KCTC 3651을 대상으로 실시하였다. 비브리오속 세균들은 1%(w/v) 염화나트륨이 첨가된 BHIA(Brain heart infusion agar, BD, Detroit, MI, USA) 배지에 접종하여 25℃에서 하룻밤 배양하였고, 이 외의 세균들은 BHIA 배지에 접종하여 25℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양한 세균들은 멸균된 PBS로 3회 세척한 후, high pure PCR template preparation kit(Roche, Mannheim, Germany를 사용하여 total DNA를 분리하고 이를 NanoVue System(GE healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 정량하였다.
2004년부터 2010년 사이에 한국의 양식 넙치에서 632개의 비브리오속 세균을 분리하였다. 분리 과정은 우리나라 양식장에서 사육된 넙치의 신장과 비장을 TCBS(Thiosulfate-citrate-bile-Sucrose agar, BD, Detroit, MI, USA) 배지에 접종하고 25℃에서 24시간 내에 배양된 세균을 수집하였다. 분리된 세균들은 BHIB(Brain heart infusion broth, BD, Detroit, MI, USA) 배지에서 하룻밤 배양하고 20%(w/v) 글라이세롤을 첨가하여 -80℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
실시예 2 : 동시 다중 중합효소 반응(multiplex PCR)용 프라이머의 제작
동정 대상이 되는 표적 유전자는 housekeeping 유전자로서 비브리오 균주 사이에서 서열다양성 부위의 차이가 뚜렷한 RNA 중합효소 subunit을 암호화하는 rpoB 유전자와 housekeeping 유전자이며 heat shock protein 40을 암호화하는 dnaJ 유전자이다. 이 유전자들을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머는 GenBank에 등록된 유전자를 바탕으로 제작하였다(표1).
비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)와 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)의 구분을 위해 dnaJ 유전자의 양쪽 바깥 부분의 염기서열을 비교하여 33222bp to 33246bp 와 34418bp to 34395bp 부위에 상보적으로 설계하였다. 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri) 및 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)에 특이적인 VI-3F와 VI-1R 프라이머는 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri, Accession Number: NE AFWF01000121)의 base position 318bp to 340bp와 751bp to 728bp 부위와 상보적으로 설계하였다. 포토박테리움 담셀라(P. damselae)에 특이적인 PD-2F와 PD-2R 프라이머는 포토박테리움 담셀라(P. damselae, Accession Number: EF064429)의 base position 121bp to 144bp와 653bp to 631bp 부위와 상보적으로 설계하였다. 비브리오 하베이(V. harveyi)에 특이적인 VH-4F와 VH-7R 프라이머는 비브리오 하베이(V. harveyi, Accession Number: EF064407)의 base position 136bp to 159bp와 736bp to 714bp 부위와 상보적으로 설계하였다(표 1). 모든 프라이머들은 automated DNA synthesizer (Bioneer, Daejeon, Korea)로 합성하였다.
비브리오 균주 서열번호 프라이머이름 서열(5`3`) PCR 산물 크기
비브리오 익치오엔테리
(Vibrio ichthyoenteri)		 1 VI-dnaJF GGCTTTTAGATCAAATTAACCGTAA 1,068 bp
2 VI-dnaJR GCAATGAATTGGTGACGAAAAGC
비브리오 익치오엔테리
(Vibrio ichthyoenteri)
비브리오 스코프탈미
(Vibrio scophthalmi)		 3 VI-3F ATGCAATCATGCCTCAAGATCTA 434 bp
4 VI-1R AAATGTACCTTCTTCAGTCAACTT
포토박테리움 담셀라
(Photobacterium damselae)		 5 PD-2F CAAGACATCATCGATGTGATGCGT 533 bp
6 PD-2R GAAACTTTACCATCTACCACTTTG
비브리오 하베이
(Vibrio harveyi)		 7 VH-4F GTGATGAAGAAGCTTATCGCGATT 601 bp
8 VH-7R CGCCTTCTTCAGTTAACGCAGGA
실시예 3 : 하나의 표적균에 대한 동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR)에서 비브리오 스코프탈미( V. scophthalmi ), 비브리오 하베이( V. harveyi ), 비브리오 익치오엔테리( V. ichthyoenteri ), 포토박테리움 담셀라( P. damselae ) 특이적 프라이머의 특이도 검사
제작된 프라이머들의 온도 특이성을 향상시키기 위하여 58℃와 68℃ 범위로 annealing 온도를 조절하여 PCR을 실시하였다. PCR 결과를 확인하기 위하여 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 PCR 산물을 100V에서 30분 동안 전기영동하였다. 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)의 경우는 58℃와 66.5℃ 범위에서 PCR 산물이 형성되었으며, 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)의 경우는 58℃와 66.5℃ 범위에서 434bp, 58℃와 64℃ 범위에서 1,068bp의 PCR 산물이 형성되었으며, 포토박테리움 담셀라(P. damselae)의 경우는 58℃와 68.7℃ 범위에서 PCR 산물이 형성되었으며, 비브리오 하베이(V. harveyi)의 경우는 58℃와 68℃ 범위의 모든 온도에서 PCR 산물이 형성됨을 확인하였다(도 1). 상기 4종의 비브리오균에 대한 PCR 산물은 annealing 온도가 64℃일 때 모두 형성되었다.
제작된 프라이머들의 균 특이성을 확인하기 위하여 26종의 균 각각에 상기 4종의 프라이머 세트들을 모두 동시에 적용하여 94℃에서 5분간 가열하는 단계, 94℃에서 30초간 변성, 64℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 30초간 중합반응을 한 주기로 30회 반복하는 단계, 72℃에서 7분간 중합반응하는 단계를 수행하는 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시하였다. PCR 결과를 확인하기 위하여 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 PCR 산물을 100V에서 30분 동안 전기영동하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae), 비브리오 하베이(V. harveyi) 각각은 434bp, 434bp 및 1,068bp, 533bp, 601bp에서 PCR 산물을 형성하였으나, 이들을 제외한 22개의 비표적 세균에서는 PCR 산물을 형성하지 않았다(도 2). 이것은 제작된 4종의 프라이머가 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시하였을 때 다른 균종 대해서 비특이적 반응을 하지 않고, 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 하베이(V. harveyi), 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae)에 특이적으로 반응함을 의미한다.
실시예 4 : 하나의 표적균에 대한 동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR)에서 비브리오 스코프탈미( V. scophthalmi ), 비브리오 하베이( V. harveyi ), 비브리오 익치오엔테리( V. ichthyoenteri ), 포토박테리움 담셀라( P. damselae ) 특이적 프라이머의 민감도 검사
각각의 비브리오균마다 동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR)의 민감도를 조사하기 위하여 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi), 비브리오 하베이(V. harveyi), 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri), 포토박테리움 담셀라(P. damselae)의 분리된 DNA를 희석하고 100ng, 10ng, 5ng, 1ng, 100pg, 10pg, 1pg의 DNA를 주형으로 사용하였다. 동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR)은 PCR-PreMix(바이오니아, 대전, 한국)에 8개의 프라이머를 각각 0.25pmole씩, 주형 DNA를 1㎕ 넣은 후 멸균된 3차 증류수로 최종 반응액을 20㎕로 조절하여 실시하였으며 음성 대조군으로 주형 DNA 대신 멸균된 3차 증류수를 첨가한 반응액을 제조하여 함께 실시하였다(PTC-220 DNA Engine Dyad Peltier thermal cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)은 94℃에서 5분간 가열하는 단계, 94℃에서 30초간 변성, 64℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 30초간 중합반응을 한 주기로 30회 반복하는 단계, 72℃에서 7분간 중합 반응하는 단계를 수행하며 실시하였고, 결과는 PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 100V에서 30분 동안 전기영동하여 확인하였다.
동시 다중 중합효소반응(multiplex PCR) 결과, 비브리오 스코프탈미(V. scophthalmi)는 1pg의 농도부터, 비브리오 익치오엔테리(V. ichthyoenteri)는 100pg 이상의 농도부터, 포토박테리움 담셀라(P. damselae)는 1ng 이상의 농도부터, 비브리오 하베이(V. harveyi)는 10pg 이상의 농도부터 증폭되었다(도 3).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> National Fisheries Research and Development Institute <120> Method for Detecting Vibrio Bacteria Including Vibrio scophthalmi Using Multiplex PCR <130> P14-B393 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VI-dnaJF <400> 1 ggcttttaga tcaaattaac cgtaa 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VI-dnaJR <400> 2 gcaatgaatt ggtgacgaaa agc 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VI-3F <400> 3 atgcaatcat gcctcaagat cta 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VI-1R <400> 4 aaatgtacct tcttcagtca actt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-2F <400> 5 caagacatca tcgatgtgat gcgt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-2R <400> 6 gaaactttac catctaccac tttg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-4F <400> 7 gtgatgaaga agcttatcgc gatt 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-7R <400> 8 cgccttcttc agttaacgca gga 23

Claims (7)

  1. 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi)와 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 포함하고, 추가적으로 (a)~(c)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하는 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법:
    (a) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 및 비브리오 익치오엔테리 (Vibrio ichthyoenteri) 특이적 프라이머 세트;
    (b) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 포토박테리움 담셀라 (Photobacterium damselae) 특이적 프라이머 세트; 및
    (c) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) 특이적 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)은 94℃에서 5분간 가열하는 단계, 94℃에서 30초간 변성, 55℃~70℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 30초간 중합반응을 한 주기로 30회 반복하는 단계, 72℃에서 7분간 중합 반응하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 수행 후에 추가적으로 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 산물의 크기를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통해 비브리오균을 검출 및 동정하는 방법.
  5. 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 추가적으로 (a)~(c)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 조성물.
    (a) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 및 비브리오 익치오엔테리 (Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 프라이머 세트;
    (b) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 포토박테리움 담셀라 (Photobacterium damselae) 특이적인 프라이머 세트; 및
    (c) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) 특이적인 프라이머 세트.
  7. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미 (Vibrio scophthalmi) 구별이 가능한 비브리오 익치오엔테리(Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 PCR용 프라이머 세트를 포함하고, 추가적으로 (a)~(c)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 비브리오균 진단 및 분류 키트:
    (a) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 비브리오 스코프탈미(Vibrio scophthalmi) 및 비브리오 익치오엔테리 (Vibrio ichthyoenteri) 특이적인 PCR용 프라이머 세트;
    (b) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 포토박테리움 담셀라 (Photobacterium damselae) 특이적인 PCR용 프라이머 세트; 및
    (c) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) 특이적인 PCR용 프라이머 세트.
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