KR101749977B1 - 캠필로박터 제주니를 검출하기 위한 고감도 실시간 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 캠필로박터 제주니의 검출 방법 - Google Patents

캠필로박터 제주니를 검출하기 위한 고감도 실시간 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 캠필로박터 제주니의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캠필로박터 제주니를 검출하기 위한 고감도 실시간 등온증폭반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물, 키트 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행할 경우, 기존의 검출방법에 비하여 균 분리가 완료되기 전 다양한 생물이 혼재된 시료에서 캠필로박터 제주니를 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있고, 그 결과를 정량화할 수 있으며, 반응 시간이 크게 개선되어 캠필로박터 제주니의 오염 및 발생 수준을 빠르고 정확하게 확인할 수 있어, 식중독 사고가 발생했을 때 원인체 검출을 위한 조기 스크리닝 시스템으로서 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

캠필로박터 제주니를 검출하기 위한 고감도 실시간 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 캠필로박터 제주니의 검출 방법{Primer set for high sensitive real-time loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Campylobacter jejuni, and method for detecting Campylobacter jejuni using the same}
본 발명은 캠필로박터 제주니를 검출하기 위한 고감도 실시간 등온증폭반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물, 키트 및 검출방법에 관한 것이다.
식중독 발생건수와 환자수는 해마다 계속 증가하고 있고 대형화되고 있다. 국내에서 식중독으로 인한 사회적 손실 비용은 의료비용, 생산성 손실비용 등을 포함하여 약 1조 6천억원으로 추정되는데. 그 중 생산성 손실비용은 74.6%로 1조 2천억원, 의료비용은 24.8%로 4천 2백억원인 것으로 조사된 바 있다. 우리나라에서 식중독 발생건수는 2005년 109건에 환자수 5,711명이었으나, 이후 매년 증가하여 2006년에는 259건, 10,833명의 환자수와 2007년 510건, 9,686명의 환자수, 그리고 2010년에는 271건에 7,218명의 환자 수가 보고되었다.
식중독의 중요한 원인균의 하나인 캠필로박터 균에는 C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus 등 다양한 종류가 존재하며, 이 중 식중독 원인균으로 중요한 균은 캠필로박터 제주니(C. jejuni)이다. 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 설사, 복통 등의 증상을 일으키는 식품 매개 장염의 중요한 원인균으로 이미 외국에서는 살모넬라, 병원성 대장균에 의한 식중독보다 C. jejuni에 의한 식중독이 더 많이 발생하는 것으로 보고되었다(Altekruse et al., 1999). C. jejuni는 양쪽 끝에 하나씩 극성 편모를 가지고 있는 그람음성의 나선형 간균이며, 5~10% 산소에서 주로 증식하는 미호기성균으로 대부분 42℃에서 잘 증식하기 때문에 호열성 캠필로박터균(thermophilic Campylobacter)으로 분류된다. 또한 공기 중 노출이나, 건조, 가열, pH 등에 감수성이 있고 500~800개의 소량의 균으로도 식중독을 일으킬 수 있으며, 성인보다는 유아, 어린이 및 면역력이 낮은 사람에게 감염률이 높다(Altekruse et al., 1999). C. jejuni는 주로 가금류, 소, 돼지 등에 많이 분포하고, 특히 닭 등의 가금류의 경우 보균률은 50~100% 정도로 매우 높다(Zhao et al., 2001; Kim et al., 2010). C. jejuni에 의한 식중독은 여름철에 가장 빈번하게 발생하며 원인으로는 조리가 덜 되거나, 오염된 닭고기 섭취와 관련된 경우가 많다.
C. jejuni에 감염되면 보통 2~5일 후 증상이 발생하고 증상은 전형적으로 5~8일간 지속된다. 임상증상으로는 설사, 구토, 발열, 메스꺼움 등 다양한 증상을 보이며, 일부 면역체계가 무너진 경우에는 길랑-바레(Guillan-Barre) 증후군 및 라이터(Reiter) 증후군 등의 더욱 심각한 질병으로 이어질 수 있다. 1978년 벨기에에서 C. jejuni이 6.3%의 퀴놀론(quinolone) 내성율을 보이는 것을 보고(Vanhoof et al., 1978; Endtz et al., 1991; Piddock, 1995)한 이후 현재까지 캠필로박터균 치료제로 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone)계 항생제가 많이 사용되고 있다. 그러나 플루오로퀴놀론계 항생제 사용이 증가함에 따라 이 항생제에 내성을 가진 캠필로박터 균주가 증가하고 있으며(Zaman et al., 1992), 분리된 캠필로박터 균주 가운데 플루오로퀴놀론계 항생제인 시프로플록사신(ciprofloxacin)에 대한 내성균주는 4.1%에 달한다(Gaunt and Piddock, 1996). 몇몇 나라에서는 캠필로박터균의 플루오로퀴놀론계 내성이 빠르게 증가하여 이 세균에 의한 위중한 감염의 치료에 문제점을 제기하고 있다(Snchez et al., 1994; Gaunt and Piddock, 1996).
최근 기존의 표준배양법과 병용하여 유전자 기반의 검출법인 PCR(Polymerase Chain Reaction)법 및 실시간(real-time) PCR법 등이 여러 분야에 응용되고 있다. 이는 균 특이 유전자를 증폭함으로써 원인균을 검출할 수 있는 기법으로 표준배양법과 비교하였을 때 간단하고 신속하게 결과를 판정할 수 있는 장점이 있으나, PCR의 경우 증폭산물을 확인하기 위하여 한천 겔 상에서 전기영동 과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있을 뿐만 아니라, 우유 및 식육 등 식품 시료 성분에 의한 유전자 증폭반응의 저해가 우려되기도 한다(Bickley et al., 1996; Kim et al., 2000; Rossen et al., 1992).
한편, 등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)은 기존의 유전자증폭법인 PCR 및 실시간(real-time) PCR과 유사하나 신속하고 민감도 및 정확도가 뛰어난 방법으로 최근 여러 분야에 걸쳐 다양하게 응용되고 있다(Jiang et al., 2013; Jiang et al., 2012; Techathuvanan et al., 2010; Thekisoe et al., 2010; Wang et al., 2012). 기존의 유전자 증폭 방법들이 온도 구배 조건 하에서 반응이 진행되는 것과 다르게, 등온증폭반응은 등온조건에서 Bst DNA 중합효소 등을 활용하여 주형 DNA 이중나선 구조의 열 변성 없이 증폭반응이 진행된다. 또한, 등온증폭법에 사용되는 6개의 프라이머는 표적 유전자 서열의 각기 다른 8개의 부위를 인식하여 유전자 증폭을 진행하므로 다른 방법에 비해 민감도 및 특이도를 향상시킬 수 있다(Nagamine et al., 2002; Notomi et al., 2000; Tomita et al., 2008).
본 발명자들은 캠필로박터 제주니를 검출할 수 있는 새로운 방법을 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 캠필로박터 제주니의 hipO 유전자를 실시간으로 검출할 수 있는 고감도 실시간 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제작하고, 상기 프라이머 세트를 이용할 경우 다양한 생물이 혼재된 시료에서 캠필로박터 제주니를 특이적으로 조기에 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 균을 정량화할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프라이머 세트를 이용한 캠필로박터 제주니 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트;를 포함하는, 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 캠필로박터 제주니 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행할 경우, 기존의 검출방법에 비하여 균 분리가 완료되기 전 다양한 생물이 혼재된 시료에서 캠필로박터 제주니를 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있고, 그 결과를 정량화할 수 있으며, 반응 시간이 크게 개선되어 캠필로박터 제주니의 오염 및 발생 수준을 빠르고 정확하게 확인할 수 있어, 식중독 사고가 발생했을 때 원인체 검출을 위한 조기 스크리닝 시스템으로서 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트의 표적서열 위치 정보를 나타낸 도이다.
도 2는 등온증폭반응의 온도 조건을 달리했을 때 반응 시간에 따른 증폭산물의 발생 정도를 나타낸 도이다.
도 3은 캠필로박터 제주니 균주(ATCC 33560)에서 hipO 유전자를 표적으로 하여 등온증폭반응을 수행하였을 때, 시간에 따라 검출되는 형광물질의 양을 측정한 Tp값을 나타낸 도이다.
도 4는 캠필로박터 제주니 균주(ATCC 33560)에서 hipO 유전자를 표적으로 하여 등온증폭반응을 수행하였을 때, 표준 곡선을 나타낸 도이다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트;를 포함하는, 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)”은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요없는 Bst, Gsp 등의 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법으로, 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 고리(loop) 구조로 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭유무를 확인하는 방법으로서, 바람직하게는 형광 검출용 시약을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 있어서, “실시간 등온증폭반응”은 증폭유무를 실시간으로 확인하는 방법으로서, 바람직하게는 실시간으로 캠필로박터 제주니를 검출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 세트는 캠필로박터 제주니의 시가독소 유전자인 hipO 유전자를 표적으로 한다.
본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)에 사용되는 것이 바람직하며, 내부 프라이머 세트, 외부 프라이머 세트 및 고리 프라이머 세트로 구성되어 있다. 각 프라이머의 구체적인 정보는 하기와 같다.
제 1 프라이머 세트를 구성하는 서열번호 1의 FIP는 hipO 유전자의 정방향 내부 프라이머(forward inner primer);
서열번호 2의 BIP는 hipO 유전자의 역방향 내부 프라이머(backward inner primer)이다.
제 2 프라이머 세트를 구성하는 서열번호 3의 LF는 hipO 유전자의 고리 정방향 프라이머(loop forward primer);
서열번호 4의 LB는 hipO 유전자의 고리 역방향 프라이머(loop backward primer)이다.
제 3 프라이머 세트를 구성하는 서열번호 5의 F3는 hipO 유전자의 정방향 외부 프라이머(forward outer primer);
서열번호 6의 B3는 hipO 유전자의 역방향 외부 프라이머(backward outer primer)이다.
본 발명에서 "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에 있어서, “내부 프라이머(inner primer)”는 주형 DNA에 결합하여 새로운 DNA 사슬 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 서열번호 1과 2의 프라이머는 증폭하고자 하는 hipO 유전자의 내부에 위치하는 내부 프라이머로, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 내부 프라이머(FIP)이고, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 내부 프라이머(BIP)이다.
본 발명에 있어서, “외부 프라이머(outer primer)”는 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합한 위치보다 더 바깥쪽에서 주형 DNA에 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 DNA 사슬이 신장된 이후, 외부 프라이머와 주형 DNA의 결합으로 사슬 변위(strand displacement)가 발생하여 먼저 형성된 사슬이 떨어져 나오게 된다. 본 발명의 서열번호 5와 6의 프라이머는 증폭하고자 하는 hipO 유전자의 내부에 위치하는 외부 프라이머로, 서열번호 5의 프라이머는 정방향 외부 프라이머(F3)이고, 서열번호 6의 프라이머는 역방향 외부 프라이머(B3)이다.
본 발명에 있어서, “고리 프라이머(loop primer)”는 상기 내부 프라이머 및 외부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 형성된 초기 줄기 고리(stem loop) 구조 사슬이 고리(loop) 구조 생성 횟수를 증가시켜 결과적으로 전체 반응을 가속화시킬 수 있도록 하는, 뉴클레오티드 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 서열번호 3과 4의 프라이머는 증폭하고자 하는 hipO 유전자의 고리 프라이머로, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 고리 프라이머(LF)이고, 서열번호 4의 프라이머는 역방향 고리 프라이머(LB)이다.
본 발명에 따른 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행할 경우, 기존의 검출방법에 비하여 균 분리가 완료되기 전 다양한 생물이 혼재된 시료에서 캠필로박터 제주니를 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있고, 그 결과를 정량화할 수 있으며, 반응 시간이 크게 개선되어 캠필로박터 제주니의 오염 및 발생 수준을 빠르고 정확하게 확인할 수 있어, 식중독 사고가 발생했을 때 원인체 검출을 위한 조기 스크리닝 시스템으로서 효과적으로 활용될 수 있다.
이에, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 검출용 조성물 또는 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트과 함께 미생물 검출 키트에 포함되는 통상적인 구성 성분을 포함할 수 있다. 상기 캠필로박터 제주니 검출용 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 캠필로박터 제주니 검출방법을 제공한다.
본 발명의 캠필로박터 제주니 검출방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 검출방법은 캠필로박터 제주니의 hipO를 표적으로 시료 내 캠필로박터 제주니를 균 분리가 완료되기 전에 검출하는 방법일 수 있다.
상기 검출방법에 있어서, 단계 (a)의 시료는 캠필로박터 제주니 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 DNA를 추출하는 미지의 물질을 의미하며, 예를 들어 캠필로박터 제주니에 오염된 식품, 천연물(예를 들어, 물), 생물학적 시료, 혼합시료 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 동물은 캠필로박터 제주니에 감염될 수 있는 종을 모두 포함하며, 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래, 닭, 오리 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, “혼합시료”는 균 분리가 완료된 순수 배양액이 아닌, 분변, 환경 시료와 같은 혼합물이 섞여있는 시료를 의미하고, 바람직하게는 시료의 증균액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 캠필로박터 제주니의 hipO 유전자를 표적으로 캠필로박터 제주니를 검출할 수 있는 시료의 증균액일 수 있다.
상기 검출방법에 있어서, 단계 (b)의 등온증폭반응은 60~67℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 65℃이다.
상기 검출방법에 있어서, 단계 (c)의 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 검출방법은 (d) 상기 (c) 단계의 검출 시간을 측정하여 캠필로박터 제주니를 정량화하는 단계;를 포함하는 방법일 수 있다.
상기 “정량화”는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 증폭반응 수행 시의 표준곡선과 비교하여 DNA 농도에 따른 형광물질 검출 시간을 정량화하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 단계 (c)의 증폭 산물을 형광지표를 이용하여 검출함으로써 형광물질 검출 시간을 측정하여 DNA 농도를 정량화하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 균주의 준비
총 125종의 균주를 이용하였으며, 이 중 캠필로박터 제주니인 수탁번호 ATCC 33560 균주는 등온증폭반응의 검출한계를 측정하기 위한 균주로 사용되었다. 125종의 균주의 구체적인 정보를 표 1에 나타내었다.
Figure 112015056513516-pat00001
실시예 2 : DNA 추출
그람음성균 및 캠필로박터 제주니 균주로부터 가열방법(boiling method)을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 보다 구체적으로, 1mL의 균 세포 서스펜션(suspension)을 10분간 가열한 뒤, 3분간 얼음에 냉각시키고, 3분간 원심 분리하였다. 그 후 상층액을 등온증폭반응과 PCR 수행에 사용하기 위한 주형으로 사용하였다. 게놈 DNA는 인스타진 매트릭스(InstaGene Matrix)(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 공지의 방법으로 그람양성균으로부터 추출하였다. 등온증폭반응 수행 시의 최적 조건 및 검출한계를 측정하기 위해 DNeasy Blood와 Tissue Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 캠필로박터 제주니인 수탁번호 ATCC 33560 균주의 주형 DNA를 이용하였다.
실시예 3 : 고감도 실시간 등온증폭반응용(LAMP) 프라이머 디자인
캠필로박터 제주니의 hipO 유전자를 증폭하기 위한 6개의 프라이머는 Genbank에 등록되어 있는 캠필로박터 제주니의 hipO 유전자 서열(NC017279, NC017281, CP000814, CP001900, CP000025 및 CP000538)을 얼라인먼트(alignment)하여 생성된 하나의 공통 서열(consensus sequence)을 대상으로 디자인하였다. 각 6개의 LAMP 프라이머는 내부 프라이머(FIP, BIP), 외부 프라이머(F3, B3), 고리 프라이머(LF, LB) 세트로 구성되어 있다. 내부 프라이머 및 외부 프라이머는 반응에 필수적으로, 반응 산물의 초기 줄기 루프(stem loop) 구조를 생성한다. 고리 프라이머는 반응산물의 루프 구조 생성 횟수를 증가시켜 결과적으로 전체 반응을 가속화시킨다.
상기 프라이머의 구체적인 표적서열 위치 및 염기서열을 도 1 및 표 2에 각각 나타내었다.
Figure 112015056513516-pat00002
실시예 4 : 고감도 실시간 등온증폭반응(LAMP) 조건 설정
캠필로박터 제주니를 검출하기 위한 등온증폭반응용 반응액은 프라이머를 포함하여 GspSSD 중합효소(GspSSD polymerase)(OptiGene Ltd., UK), 에바그린(Evagreen)(Solgent, Korea) 및 dNTPs를 이용하여 조성하고 조건의 최적화를 거쳐 최종 제조하였다. 10mM 농도의 dNTPs, 8U/ul 농도의 GspSSD 중합효소, 50mM 농도의 MgSO2·H2O, 5M 농도의 베타인(Betaine), 20X 농도의 에바그린(Evagreen)을 여러 농도로 조합하여 Genie II platform (Optigene Ltd., UK)을 통해 증폭산물 관찰 시간이 가장 빨랐던 조합을 확인하였다. 확인한 최종 농도는 1X 버퍼, 1 M 베타인, 4 mM MgSO4, 각각 0.5 mM의 dNTP, 각각 0.8 μM의 FIP 및 BIP, 각각 0.4 μM의 LF 및 LB, 각각 0.2 μM의 F3 및 B3, 1X 에바그린(Solgent, Seoul, Korea), 8 U의 GspSSD 중합효소로, 상기 조합이 가장 빠른 시간에 증폭 산물을 만드는 것을 확인하였다.
또한, 최적 온도 조건을 설정하기 위해 60~67℃ 범위에서 온도 조건을 변화시켰으며, 각 온도별로 검출된 증폭 산물의 양을 확인하고, 시간당 생성되는 증폭산물의 양을 비율로 나타내어 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 등온증폭반응은 65℃에서 가장 빠른 시간에 증폭 산물을 만드는 것을 확인하였다.
실험예 1 : 포괄도(inclusivity) 및 배척도(exclusivity) 측정
상기 실시예 3 및 4에서 제조한 등온증폭반응용 프라이머와 반응액을 이용한 캠필로박터 제주니 검출방법의 포괄도(inclusivity) 및 배척도(exclusivity)를 측정하기 위해 상기 실시예 1의 총 125종의 균주를 이용하였다. 그 결과 표 1의 포괄도 실험을 위한 84종의 균주 전부에서 양성 반응이, 배척도 실험을 위한 41종의 균주 전부에서 음성 반응이 나타났으며, 이를 통해 본 발명의 프라이머 및 반응액을 사용하여 등온증폭반응 수행 시 각각 100%의 포괄도 및 배척도가 관찰됨을 알 수 있다.
실험예 2 : 어닐링 온도 측정
상기 실시예 3에서 제조한 프라이머를 이용한 등온증폭반응(LAMP)의 어닐링 온도를 측정하기 위해 캠필로박터 제주니인 수탁번호 ATCC 33560 균주로부터 상기 실시예 2와 같은 방법으로 각각 100 ng/㎕의 DNA 3세트를 추출하였다. 그 후, 등온증폭반응은 지니 Ⅱ 장치(Genie Ⅱ)(Optigene, UK)를 사용하여 수행하였으며, 1X 버퍼, 1M 베타인, 4mM MgSO4, 각 0.5mM의 dNTP, 각 0.8μM의 FIP와 BIP, 각 0.4μM의 LF와 LB, 각 0.2μM의 F3와 B3, 1X 에바그린(SolGent, Korea), 8U Gsp 중합효소(Optigene, UK) 및 4μL의 주형 DNA를 포함하는 총 부피가 25 μL인 반응액을 이용하였고, 음성 대조군으로(NC; negative control)는 증류수(Invitrogen, USA)를 이용하였다. 60~67℃의 온도에서 30분동안 등온중폭반응을 수행하였고, 98℃에서 78℃까지 어닐링 곡선을 분석하였다. 어닐링 곡선을 분석한 결과 캠필로박터 제주니에 포함된 hipO 유전자는 84.29 ± 0.68℃의 Tm값을 가지는 것을 확인하였다.
실험예 3 : 검출한계 및 민감도 측정
상기 실시예 3에서 제조한 프라이머를 이용한 등온증폭반응의 검출한계를 측정하기 위해 상기 실험예 1의 캠필로박터 제주니인 수탁번호 ATCC 33560 균주로부터 실험예 2의 방법으로 DNA를 추출하였고, 추출한 DNA를 1 fg/㎕ 내지 100 ng/㎕의 농도로 10배 단계로 희석하였으며, 상기 실험예 4에서와 동일한 조건으로 수행한 등온증폭반응을 통해 검출한계를 측정하고, 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 캠필로박터 제주니인 수탁번호 ATCC 33560 균주의 DNA를 100 fg/㎕ 내지 100 ng/㎕의 농도로 희석하고 유전자가 증폭됨에 따라 발현되는 형광물질의 검출 시간을 실시간으로 측정한 결과, 형광물질이 검출되는 시간의 평균을 나타내는 Tp 값은 9.67분으로 측정되었다. 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 수행 시, 높은 농도의 DNA부터 순차적으로 형광물질이 검출되며, 이를 실시간으로 확인할 수 있다는 것을 알 수 있다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 100 fg/㎕ 내지 100 ng/㎕의 농도의 주형 DNA의 표준 곡선 분석 결과, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응의 정량화 방정식은 y = -1.3988x + 19.355이고, 상관계수는 R2=0.9133으로 측정되었다. 이를 통해 DNA 농도에 따른 형광물질의 검출 시간을 측정하여 캠필로박터 제주니를 정량화할 수 있음을 확인하였다.
또한, 종래 보고된 캠필로박터 제주니 검출을 위한 등온증폭반응(cj0414 유전자를 표적으로 함)의 검출 한계가 5.6 X 103 CFU/g 인 반면, 본 발명의 프라이머를 이용한 등온증폭반응(hipO 유전자를 표적으로 함)의 검출 한계는 약 2.5 X 102 CFU/ml이므로, 본 발명의 프라이머를 이용한 등온증폭반응이 더 높은 민감도를 가짐을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 등온증폭반응용 프라이머를 이용한 등온증폭반응 수행 시, 적은 양의 시료로 캠필로박터 제주니의 hipO 유전자를 실시간으로 신속하게 판별하고 정량화할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 4 : 소 농장에서 직접 수득한 샘플의 등온증폭반응 수행
본 발명에 따른 캠필로박터 제주니 검출방법의 현장 적용성을 확인하기 위하여, 소의 분변 및 소 농장의 환경샘플(바닥 샘플)에서 분리한 다양한 야외분리주를 이용하여 PCR과 등온증폭반응(LAMP)을 수행하였다.
실험예 4-1 : 캠필로박터 제주니 야외분리주의 배양
캠필로박터 제주니 야외분리주는 246개의 소 농장 샘플(232개의 소의 대변, 11개의 농장 토양 샘플, 1개의 가공되지 않은 우유 샘플, 1개의 물 샘플, 1개의 사료 샘플)의 배양을 통해 수득하였으며, 상기 샘플은 2012년 8월부터 2013년 5월까지 경기도에 위치한 15곳의 소 농장에서 얻었다.
캠필로박터 제주니 야외분리주를 일반적인 배양법으로 배양하였다. 보다 구체적으로, 각 샘플 1g을 5%의 레이키드 홀스 블러드(laked horse blood)와 항생 물질(Oxoid)를 포함하는 9 mL 볼튼 증균액(Bolton broth)(Oxoid, Hampshire, UK)에 42℃의 온도에서 하룻밤 동안 미호기성 조건에서 농축시켰다. 농축 배양액의 한 루프(loop)를 항생물질(mCCDA; Oxoid)을 포함하는 변형된 목탄 세포페라존 디옥시콜산 한천(modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar)에 스트리킹한 후 미호기성 조건 및 42℃의 온도에서 48시간동안 배양하였다. 캠필로박터 제주니의 hipO 유전자를 포함하는 군락이 형성되었는지를 하기 실험예 4-2와 같은 PCR을 수행하여 확인하고, 최대 4개 군락을 분리하였다.
실험예 4-2 : 캠필로박터 제주니 야외분리주의 PCR 및 등온증폭반응 수행
상기 실험예 4-1에서 배양된 야외분리주에서 51개의 균주에서 캠필로박터 제주니가 동정되었으며, 상기 51개의 균주로부터 상기 실시예 2의 방법으로 추출한 DNA를 90℃에서 5분간 예비-변성 후, 90℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 45초간 연장하는 과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 최종 연장하는 과정을 통해 PCR를 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 표 3과 같다.
Figure 112015056513516-pat00003
또한, 상기 야외분리주에서 공지의 방법으로 추출한 DNA를 상기 실시예 3 및 4와 같은 방법으로 등온증폭반응을 수행하여 Tm 값 및 검출한계를 측정하였다. 그 결과, 5.52 내지 19.28분(평균 Tp 값은 10.8분) 내에 hipO 유전자가 검출되었으며, 84.30 ± 0.74℃의 Tm 값이 측정되었다.
실험예 4-3 : 캠필로박터 제주니 야외분리주의 PCR 및 등온증폭반응 결과 비교
상기 실시예 3에서 제조한 6개의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 이용한 캠필로박터 제주니 검출방법의 민감도를 상기 PCR 수행한 결과와 비교하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
Figure 112015056513516-pat00004
표 4에 나타낸 바와 같이, 검출 키트로 추출된 DNA를 이용하여 PCR 및 등온증폭반응(LAMP) 수행 시, 배양-양성 샘플에서 각각 100%의 민감도를 관찰하였다. 또한, PCR은 3시간 정도가 소요된 반면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응은 30분 가량이 소요되었다. 이를 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 수행 시, 훨씬 신속하게 캠필로박터 제주니를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 가열방법으로 추출된 DNA를 이용하여 PCR 및 등온증폭반응(LAMP) 수행 시, 배양-양성 샘플에서 PCR은 35.5%, 등온증폭반응은 84.4%의 민감도를 관찰하였는데, 이를 통해 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응이 PCR과 비교할 때 분변, 토양과 같은 잠재적인 방해물질에 영향을 받지 않고 시료에서 효과적으로 캠필로박터 제주니를 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한 이를 이용하여 순수 배양액이 아닌 기타 물질이 섞여있는 증균액과 같은 혼합시료에서도 캠필로박터 제주니를 조기 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.
또한, 가열방법으로 추출된 DNA 및 검출 키트로 추출된 DNA를 이용하여 배양-음성 샘플에서 PCR 및 등온증폭반응(LAMP) 수행 시, PCR은 양성 샘플이 각각 0%로 관찰된 반면, 등온증폭반응은 각각 8.5%, 17.7%의 양성 샘플이 관찰되었다. 상기 배양-음성 샘플에는 사멸하였거나 손상된 캠필로박터 제주니 외에도 살아있으나 표준 배양 방법을 이용하여 배양할 수 없는 캠필로박터 제주니를 포함할 수 있다. 또한, 배양-음성 샘플의 등온증폭반응 수행 시 캠필로박터 제주니의 검출 한계가 배양-양성 샘플의 1/10 정도인 점에 비추어, 일반적인 배양 방법을 사용하여 캠필로박터 제주니를 분리하지 않은 배양 전 단계의 배양-음성 샘플에서 캠필로박터 제주니를 조기 스크리닝 하기 위한 도구로서 활용할 수 있음을 알 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 수행 시, 일반적인 배양법으로 캠필로박터 제주니를 분리하지 않은 샘플에서 캠필로박터 제주니를 검출할 수 있는 스크리닝 시스템으로서 활용할 수 있으며, 음식물 생산 과정 중 감염을 막는 데에 중요한 초기 단계에서 고감도로 캠필로박터 제주니를 정성-정량 검출할 수 있음을 알 수 있다.
종합적으로, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 수행 시, 형광물질 검출을 통해 고감도로 신속하게 실시간으로 캠필로박터 제주니를 검출할 수 있으며, 상기 유전자를 정량화할 수 있을 뿐만 아니라, 균 분리가 완료된 순수배양액이 아닌 분변, 환경 시료 등과 같은 혼합물이 섞여있는 시료의 증균액(Bolton broth)에서 캠필로박터 제주니의 조기 스크리닝이 가능한바, PCR에 비해 등온증폭반응의 현장 적용성이 현저히 우수함을 알 수 있다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Primer set for high sensitive real-time loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Campylobacter jejuni, and method for detecting Campylobacter jejuni using the same <130> SNU-2015-0403 <150> KR 10-2014-0072322 <151> 2014-06-13 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP_hipO <400> 1 ctgctgaaga gggtttgggt gcatattgtg ccatccaa 38 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP_hipO <400> 2 gctaaatact ttgcagcaag cagctttgcc tttacaagaa tgc 43 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF_hipO <400> 3 ggtgctaagg caatgataga ag 22 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB_hipO <400> 4 catcatgacc gcaagcatg 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_hipO <400> 5 gaagaagcca tcatcgca 18 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3_hipO <400> 6 aataggactt cgtgcagata tg 22

Claims (10)

  1. 다음을 포함하는 캠필로박터 제주니 검출을 위한 실시간 등온증폭반응용(real-time loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트:
    서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물.
  4. 제3항의 조성물을 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 키트.
  5. 다음 단계를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출방법:
    (a) 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, (d) 상기 검출 시간을 측정하여 캠필로박터 제주니를 정량화하는 단계;를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 혼합시료인 것을 특징으로 하는, 캠필로박터 제주니 검출방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 식품, 천연물 및 생물학적 시료로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 캠필로박터 제주니 검출방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리한 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 캠필로박터 제주니 검출방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 등온증폭반응은 60 내지 67℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 캠필로박터 제주니 검출방법.
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