KR102407237B1 - 캠필로박터를 선택적으로 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 pcr 키트 - Google Patents

캠필로박터를 선택적으로 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 pcr 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캠필로박터를 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 PCR 키트에 관한 것으로, 본 발명은 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹, 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)을 구분 검출할 수 있다. 또한, 본 발명은 스트레스 환경에 노출되어 소위 '살아있으나 집락을 이루지 못하는 세포의 상태 (Viable but non-culturable)'의 세포로 전환되는 캠필로박터(Campylobacter)도 구분 검출 가능하다.

Description

캠필로박터를 선택적으로 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 PCR 키트 {Real-time PCR kit for specific detection of Campylobacter}
본 발명은 캠필로박터를 선택적으로 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 PCR 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스트레스 환경에 노출되어 소위 '살아있으나 집락을 이루지 못하는 세포의 상태 (Viable but non-culturable)'의 세포로 전환되는 캠필로박터(Campylobacter)의 특성을 고려한 것으로서, 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)을 선택적으로 구분 검출할 수 있는 Real-time PCR kit에 관한 것이다.
캠필로박터(Campylobacter)는 그람 음성의 만곡형 또는 나선형의 간균으로, 공기노출, 건조, 낮은 pH (<pH 5.0), 열처리, 냉동 등의 환경적 스트레스에 의해 균들이 점차 구형으로 변하는 특성을 갖는다. 이런 특성을 보인 균은 세포막이 온전하고 호흡 등의 대사활성은 유지하나 일반적인 실험실 배양조건에서는 성장하지 못해, 소위 '살아있으나 집락을 이루지 못하는 세포의 상태 (Viable but non-culturable, VBNC)' 가 된다.
캠필로박터(Campylobacter)는 미국에서 가장 많이 발생되고 있는 식중독 원인균으로, 주로 식품매개 질병을 일으키는 종은 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)와 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli)이다. 이외에 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis), 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae)는 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹에 속하며, 최근 들어 이들로 인한 식중독이 발생하고 있다. 또한, 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)는 소와 양의 불임 및 유산 등의 번식장애를 일으키는 균으로 사람에게도 병원성을 갖는 것으로 보고되어 있다.
캠필로박터(Campylobacter) 균을 관리하고 통제하기 위해서는, 캠필로박터(Campylobacter) 속에 속하는 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)를 상호 간에 선택적으로 구분 검출할 필요가 있다.
대한민국 특허공개번호 제1020150143348호 (공개일자 2015.12.23)에는, 캠필로박터 제주니를 검출하기 위한 고감도 실시간 등온증폭반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물, 키트 및 검출방법이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제1020200059766호 (공개일자 2020.05.29)에는, 캠필로박터 콜라이 특이적인 유전자에 대한 프라이머 세트가 기재되어 있다.
본 발명은 스트레스 환경에 노출되어 소위 '살아있으나 집락을 이루지 못하는 세포의 상태 (Viable but non-culturable)'의 세포로 전환되는 캠필로박터(Campylobacter)의 특성을 고려하고, 오랜 시간이 소요되는 배지 검출법을 보완한 신속검출법으로서, 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)을 구분 검출할 수 있는 Real-time PCR kit를 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli) 검출용 프라이머 세트 (a); 서열번호 4의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 세트 (b); 서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹 검출용 프라이머 세트 (c); 서열번호 10의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 11의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹 검출용 프라이머 세트 (d) 및; 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus) 검출용 프라이머 세트 (e);를 포함하되, 상기, 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹은 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis), 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고,상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하며, 상기 프라이머 세트 (c)는, 바람직하게 서열번호 9에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고, 상기 프라이머 세트 (d)는, 바람직하게 서열번호 12에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고, 상기 프라이머 세트 (e)는, 바람직하게 서열번호 15에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(taggin)되어 있는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 키트를 제공한다. 이때, 상기 중합효소연쇄반응은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)일 수 있다.
본 발명은 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)를 구분 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 스트레스 환경에 노출되어 소위 '살아있으나 집락을 이루지 못하는 세포의 상태 (Viable but non-culturable)'의 세포로 전환되는 캠필로박터(Campylobacter)를 종별로 구분 검출 가능하다.
아울러, 본 발명의 Real-time PCR kit는 오랜 시간이 소요되는 배지 검출법을 대체할 수 있는 것으로 신속히 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)를 구분 검출할 수 있다.
도 1은 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹, 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)에 특이적인 바이오마커를 발굴하기 위해 사용한 유전체 정보이다.
도 2는 본 발명의 프라이머를 사용하여 101~6 CFU/ml 농도의 4종 미생물에 대해 Real-time PCR을 수행한 결과이다.
종래에 미생물의 검출에 많이 사용된 배지 검출법은 세균 검출에서 있어 표준화된 검출기법이나 시간과 노동력의 소모가 많다.
캠필로박터는 증균배지와 선택배지의 배양시간이 48시간 이상이고, 첨가되는 항생제인 쎄포페라존(cefoperazone)에 내성을 갖는 대장균 등으로 인해 선택성이 낮아 효과적인 배지 검출법이 부재한 실정이다. 또한, 캠필로박터는 미호기성이며, 스트레스 환경에 노출되었을 때 '살아있으나 집락을 이루지 못하는 세포의 상태 (Viable but non-culturable)'로 전환되는 특성으로 인해 배양이 까다로워 이를 보완해 줄 신속 검출기법의 개발이 필요하다.
그러나, 캠필로박터의 신속 검출기법은 대부분 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)와 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli)를 대상으로 제한되어 있는 실정이다. 따라서, 캠필로박터의 주요 병원성균인 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹, 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)를 구분 검출할 필요가 있는데, 본 발명에서는 이들 균을 구분 검출할 수 있는 Real-time PCR kit를 개발한 것이다.
한편, 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹은 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis), 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae)가 속하는데, 변이로 인해 전체 커버할 수 있는 바이오마커가 확인되지 않았다.
따라서, 본 발명에서는 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis)의 바이오마커로 MFS transporter를, 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae) 의 바이오마커로 putative mobility protein을 선정하여, 2개의 프라이머 세트를 개발한 것이다.
이로부터 본 발명은 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli) 검출용 프라이머 세트 (a); 서열번호 4의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 세트 (b); 서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹 검출용 프라이머 세트 (c); 서열번호 10의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 11의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹 검출용 프라이머 세트 (d) 및; 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus) 검출용 프라이머 세트 (e);를 포함하되, 상기, 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹은 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis), 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고,상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하며, 상기 프라이머 세트 (c)는, 바람직하게 서열번호 9에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고, 상기 프라이머 세트 (d)는, 바람직하게 서열번호 12에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고, 상기 프라이머 세트 (e)는, 바람직하게 서열번호 15에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(taggin)되어 있는 것일 수 있다. 형광염료의 태깅에 의해 타겟균들의 감염여부를 형광 분석기를 통해 바로 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 키트를 제공한다. 상기 본 발명에서 개발한 멀티플렉스 프라이머 세트를 중합효소연쇄반응(PCR)에 사용하게 되며 이를 통해 캠필로박터(Campylobacter) 균을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. 또한, 상기 중합효소연쇄반응 키트에는 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트 외 버퍼, dNTP 등이 첨가될 수 있는데 이는 당업계에 널리 알려져 있으므로, 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응 키트에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것일 수 있으며, 실시간으로 결과 산물을 확인할 수 있어 현장에서 캠필로박터(Campylobacter)의 감염을 즉시 확인할 수 있다는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 캠필로박터 속 균주 4종의 선택적 검출을 위한 프라이머 선정]
본 실시예에서는 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)을 구분 검출할 수 있는 프라이머 세트를 표 1과 같이 개발하였다.
프라이머 세트 개발을 위해, 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) NCCP 11192, 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli) NCCP 11191, 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) ATCC BAA-1060, 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus) ATCC 27374 균주를 사용하였다.
도 1에 기재된 것과 같은 유전체 정보를 이용하여 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹, 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)에 특이적인 바이오마커를 발굴하였다. 해당 유전체 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information, 미국 국립생물공학 정보센터)의 데이터베이스를 활용하였다. 또한, 유전체 정보들의 비교분석을 위해 panX genome analysis program (Ding, Baumdicker et al. 2017)을 이용하였다. 그 결과, 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)의 바이오마커로 amidohydrolase, toxin, glycosyltransferase를 선정하여 프라이머를 개발하였다.
한편, 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹은 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis), 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae)가 속하며, 변이로 인해 전체 커버할 수 있는 바이오마커가 확인되지 않았다.
따라서, 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis)의 바이오마커로 MFS transporter를 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae) 의 바이오마커로 putative mobility protein을 선정하여, 2개의 프라이머 세트를 개발하였다.
하기 표 1은 이상과 같은 과정을 통해 발굴한 프라이머 및 probe 정보이다.
캠필로박터 Real-time PCR kit의 primer 및 probe 정보 (하기 시퀀스에서 굵은색은 형광 염료를 의미함)
Target 서열번호 Sequence (5'-3') Conc.(pmol)

C. coli
(Toxin)		 Forward primer 1 ATG CCT AGC TGT TTT AAG TG 20
Reverse primer 2 GGC GAT ACT AGA GTC AGG 20
Probe
(5' 말단에 HEX, 3' 말단에 BHQ1이 태깅됨)		 3 HEX TGC TCA TGC ATT GAT TGC CAC CAT T BHQ1 10

C. jejuni
(Amido
hydrolase)		 Forwa)rd primer 4 CGG ATA GTT ATA GYA TTG AAG TTA 10
Reverse primer 5 GCR RCA TAA ATA GGA TCT TTT G 10
Probe (5' 말단에 TEXAS RED, 3' 말단에 BHQ2가 태깅됨) 6 TEXAS RED AGC ACT TCC ATG ACC ACC YCT TCC BHQ2 4

C. lari(MFS transporter)		 Forward primer 1 7 TCT TCY ATY ATY GCT CTT GGA TCA 20
Reverse primer 1 8 AAA CTA GCA TCA TCC ATR CTT GTA AC 15
Probe 1
(5' 말단에 FAM, 3' 말단에 BHQ1이 태깅됨)		 9 FAM YAG YGG AAC CTT RCT TGC AGC T BHQ1 10

C. lari(Putative mobility protein)		 Forward primer 2 10 MTC ARG CAR GYT TAA TGC TTA A 20
Reverse primer 2 11 AGG AGT AGT AGT TGG AGC A 20
Probe 2
(5' 말단에 FAM, 3' 말단에 BHQ1이 태깅됨)		 12 FAM ACG CCT TCD ART ACY TGC ATT ACM GC BHQ1 20

C. fetus(Glycosyl
transferase)		 Forward primer 13 GCA YAT AAC ACT TAG TAT GAT ACA 20
Reverse primer 14 GRT AYG TYG GTA TAT TTA CAT G 20
Probe
(5' 말단에 CY5, 3' 말단에 BHQ2가 태깅됨)		 15 CY5 AAT ACC AAY CAA GGC GGC GGA A BHQ2 7.5
주) R: G 또는 A, Y: T 또는 C, M: A 또는 C, D: A 또는 G 또는 T를 의미함.
[실험예 1: 상기 실시예 1에서 발굴한 프라이머 세트를 이용한 위양성 검증 실험]
상기 실시예 1에서 개발한 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)의 프라이머가 Real-time PCR 진행 시, 대상 균주만 특이적으로 증폭하는지 여부를 확인하기 위한 검증실험 진행하였다. 실시간 중합효소연쇄반응을 위한 조성은 아래 표 2와 같으며, 그 다음 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 후, 95℃ 11초 및 60℃ 1분으로 구성된 사이클을 40회 반복하였다.
실시간 중합효소연쇄반응을 위한 조성
Target (gene) Sample Volue (uL) 기타
C. coli
(Toxin) 		F primer 0.1 20 pM
R primer 0.1 20 pM
Probe 0.05 10 pM
C. jejuni
(Amido
hydrolase) 		F primer 0.05 10 pM
R primer 0.05 10 pM
Probe 0.02 4 pM
C. lari
(MFS transporter) 		F primer 0.1 20 pM
R primer 0.075 15 pM
Probe 0.05 10 pM
C. lari
(Putative mobility protein) 		F primer 0.1 20 pM
R primer 0.1 20 pM
Probe 0.1 20 pM
C. fetus
(Glycosyl
transferase) 		F primer 0.1 20 pM
R primer 0.1 20 pM
Probe 0.375 7.5 pM
qPCR mix 10 Biofact 사 qPCR mix
Molecular water 5.53
Total 17
실험 결과는 하기 표 3에 나타냈다.
위양성 검증 결과
Strain Ct value Strain Ct value
C. jejuni
marker 		C. coli
marker 		C. lari Group
marker 		C. fetus
marker 		C. jejuni
marker 		C. coli
marker 		C. lari Group
marker 		C. fetus
marker
Campylobacter jejuni NCCP 11192 16.03 N/A N/A N/A Clostridium perfringens NCCP 15911 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter jejuni NCTC 11168 15.64 N/A N/A N/A Vibrio vulnificus CMCP6 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter jejuni KCTC 15212 16.32 N/A N/A N/A Vibrio parahaemolyticus KCTC 2471 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter coli NCCP 11191 N/A 18.79 N/A N/A Vibrio cholera NCCP 14552 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter coli NCTC 11168 N/A 19.06 N/A N/A Listeria monocytogenes NCCP 14552 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter lari ATCC BAA 1060 N/A N/A 17.75 N/A Salmonella Typhimurium LT2 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter lari Isolate N/A N/A 17.57 N/A Bacillus cereus KCTC 3624 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter lari Isolate N/A N/A 17.55 N/A Yersinia enterocolitica ATCC 55076 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter lari Isolate N/A N/A 18.16 N/A Staphylococcus aureus KCTC 1621 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter volucris KCTC15208 N/A N/A 18.35 N/A EHEC ATCC 43895 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter fetus ATCC 27374 N/A N/A N/A 16.56 EAEC NCCP 14039 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter fetus BAA-2539 N/A N/A N/A 18.27 ETEC NCCP 15732 N/A N/A N/A N/A
Campylobacter fetus Isolate N/A N/A N/A 19.31 EPEC NCCP 15661 N/A N/A N/A N/A
　 　 　 　 　 　 EIEC NCCP 15663 N/A N/A N/A N/A
상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이 타깃하는 균주만 특이적으로 증폭하는 것을 확인할 수 있었다. 타깃 균주를 제외한 균주에서는 40 cycle 이내 위양성 결과가 검출되지 않았다.
[실험예 2: 상기 실시예 1에서 개발한 프라이머 세트를 이용한 최소검출한계 검증 실험]
상기 실시예 1에서 개발한 프라이머 및 프로브(probe)로 Real-time PCR 수행 시, 최소 검출 가능한 균수를 측정하는 검증실험을 진행하였다.
실험을 위해, Biorad사의 CFX96 IVD Real-time PCR detection system 장비를 사용하였다. C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus를 TSB (5% Blood 첨가) 에 접종하여 37~42℃에서 48~72시간 미호기 배양 후, Genelix™ Bacterial DNA Extraction kit (세니젠®)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 이후 TE buffer (바이오니아®)에 십진 희석하여 Real-time PCR을 수행하였다. 실시간 중합효소연쇄반응을 위한 조성과 온도 및 시간 조건은 상기 실험예 1과 동일하게 진행하였다.
실험 결과는 도 2와 같이 나타났다. 도 2는 본 발명의 프라이머를 사용하여 101~6 CFU/ml 농도의 4종 미생물에 대해 Real-time PCR을 수행한 결과이다. 모든 프라이머가 101~2 CFU/ml 수준의 검출한계를 나타냈다. 102 CFU/ml 균농도에 해당하는 DNA 혼합액에서 C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus 프라이머는 각각 Ct value 33.29, 35.01, 34.01, 33.65 으로 검출되었다. 101 CFU/ml 균농도에 해당하는 DNA 혼합액에서 각각 Ct value 36.82, 38.99, 37.18, 37.99 으로 검출되었다.
따라서, 모든 프라이머가 101~2 CFU/ml 수준의 검출한계를 나타내는 것으로 확인되었다.
<110> Sanigen Co.,Ltd. <120> Real-time PCR kit for specific detection of Campylobacter <130> YP-20-154 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Campylobacter coli <400> 1 atgcctagct gttttaagtg 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Campylobacter coli <400> 2 ggcgatacta gagtcagg 18 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Campylobacter coli <400> 3 tgctcatgca ttgattgcca ccatt 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Campylobacter jejuni <400> 4 cggatagtta tagyattgaa gtta 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Campylobacter jejuni <400> 5 gcrrcataaa taggatcttt tg 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Campylobacter jejuni <400> 6 agcacttcca tgaccaccyc ttcc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Campylobacter lari group <400> 7 tcttcyatya tygctcttgg atca 24 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Campylobacter lari group <400> 8 aaactagcat catccatrct tgtaac 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Campylobacter lari group <400> 9 yagyggaacc ttrcttgcag ct 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Campylobacter lari group <400> 10 mtcargcarg yttaatgctt aa 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Campylobacter lari group <400> 11 aggagtagta gttggagca 19 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Campylobacter lari group <400> 12 acgccttcda rtacytgcat tacmgc 26 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Campylobacter fetus <400> 13 gcayataaca cttagtatga taca 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Campylobacter fetus <400> 14 grtaygtygg tatatttaca tg 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Campylobacter fetus <400> 15 aataccaayc aaggcggcgg aa 22

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 콜라이 (Campylobacter coli) 검출용 프라이머 세트 (a);
    서열번호 4의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 세트 (b);
    서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹 검출용 프라이머 세트 (c);
    서열번호 10의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 11의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹 검출용 프라이머 세트 (d) 및;
    서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 캠필로박터 페투스 (Campylobacter fetus) 검출용 프라이머 세트 (e);를 포함하되,
    상기, 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari) 그룹은 캠필로박터 라리 (Campylobacter lari), 캠필로박터 오르니쏘콜 (Campylobacter ornithocol), 캠필로박터 아르모리쿠스 (Campylobacter armoricus), 캠필로박터 페로리디스 (Campylobacter peloridis), 캠필로박터 볼루크리스 (Campylobacter volucris), 캠필로박터 수반타륵티쿠스 (Campylobacter subantarcticus), 캠필로박터 인술라에니그라에 (Campylobacter insulaenigrae) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트 (a)는,
    서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고,
    상기 프라이머 세트 (b)는,
    서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하며,
    상기 프라이머 세트 (c)는,
    서열번호 9에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고,
    상기 프라이머 세트 (d)는,
    서열번호 12에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하고,
    상기 프라이머 세트 (e)는,
    서열번호 15에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 탐침(probe)은,
    5'말단 및 3'말단에 형광염료가 태깅(taggin)되어 있는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 프라이머 세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 선택되는 어느 하나 항의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 중합효소연쇄반응은,
    실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응 키트.
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