CN108913794A - 弯曲菌细胞膨胀致死毒素a型，b型和c型三重pcr检测引物及试剂盒 - Google Patents

弯曲菌细胞膨胀致死毒素a型，b型和c型三重pcr检测引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物及试剂盒，所述弯曲菌分为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌，对应引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.18所示。本发明的三重PCR检测方法能快速、准确的检测出弯曲菌细胞膨胀致死毒素，可对弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的单个毒素进行检测，也可对A型，B型和C型毒素同时检测，省时省力，使原来需要做三次PCR和三次电泳的检测，现在一次就可以完成，传统的单一PCR方法检测时间一般2‑3天，该三重PCR方法将检测时间缩短至4 h，大大提高了工作效率，可用于弯曲菌毒素型普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和检测。

Description

弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物及 试剂盒
技术领域
本发明涉及一种弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物及试剂盒，属于PCR检测技术领域。
背景技术
弯曲菌病原名孤菌病，是由弯曲菌引起的人和动物多种疾病的总称。各种动物（特别是猪、鸡、牛、羊）都能患病，除可引起腹泻外，还可造成牛、羊和犬的流产、不孕、乳房炎及禽类的传染性肝炎等疾病。对人除可引起腹泻和食物中毒外，也可造成流产、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎和脑膜炎等全身性感染。近年来，国内外从动物和人类分离到弯曲菌的报道日益增多。该病在世界各地的分布较广。目前该病已作为重要的人兽共患病而引起广泛重视。
引起动物和人类疾病的主要是空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌。弯曲菌的菌体纤细，呈螺旋形、撇行、S形和鸥形等多种形态。在老龄培养物中呈螺旋状长丝或圆球形，运动力活泼。革兰氏染色阴性，微需氧，对营养要求较高。在含10%二氧化碳的环境中生长良好，于培养基内添加血液、血清有利于初代的培养。
研究表明弯曲菌能产生细胞膨胀致死毒素，其有三个亚型，即A型，B型和C型。细胞膨胀致死毒素与弯曲菌致病性、出血性腹泻、食物中毒、食品安全密切相关。动物感染弯曲菌后，可随粪便排菌，也可通过牛乳和其他分泌物排出，造成污染。猪、禽在宰杀和加工过程中肉品被污染，容易引起暴发。鸡和猪肠道中带菌率相当高，特别是鸡，可达50%~90%，已成为本病流行病学的一个重要问题。禽类感染本菌主要引起肝炎变化。
雏鸡感染后常表现精神沉郁和腹泻。病的严重程度取决于鸡的日龄和菌株的毒力，环境应激因素可加重病情。剖检变化主要是肠管鼓胀，肠腔积有黏液和水样内容物，如病菌毒力腔，可能见到出血变化。开产前后的母鸡感染后表现精神沉郁，体重减轻，鸡冠发白、干燥、萎缩，常有腹泻，产蛋率下降25%~35%，病死率一般为2%~15%。死后剖检最明显的病理变化是肝肿大、褪色，有星状黄色小坏死灶散播于整个肝实质内，肝被膜下有大小不等的出血灶，严重者肝变脆，并满布菜花样大坏死灶区；慢性病例肝变硬并萎缩，常伴有腹水或心包积液。由于鸡肝脏发生炎症和坏死，又称为鸡弯曲菌性肝炎或鸡传染性肝炎。
人感染后，潜伏期一般为3~5 d，病情轻重不一。典型病人先有发热，全省无力，头痛，肌肉酸痛，婴儿还可发生抽搐临诊症状。继而腹痛，常局限于脐周，呈间歇性，有的呈隐痛，排便后可缓解。发热12~24 h后开始腹泻，呈水样，每天排便5~10次，1~2 d后部分病例出现黏液便或脓血便，经过1周可自行缓解，少数病例腹痛可持续数周，反复发生腹泻。近年来，弯曲菌常引起儿童肠道外感染，如败血症、脑膜炎、胆囊炎、腹膜炎、心内膜炎、血栓性静脉炎和反应性关节炎等。
根据流行病史和临诊表现可怀疑为本病，确诊需进行细菌的分离鉴定。但细菌分离需要耗时2~7 d才能确诊，不仅费时费力，结果也不准确，而且敏感性差，容易产生假阳性的结果，不利于养殖户和规模化企业采取相应的措施和药物来进行及时的预防和治疗。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物及试剂盒，可以一次检测三种目的基因，操作简便、省工省时，为弯曲菌的鉴别诊断及检测提供技术支持和理论基础。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物，所述弯曲菌分为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌，对应引物的核苷酸序列分别为：
①结肠弯曲菌三对特异性引物：
CCCDTAF：ATTGCCAAGGCTAAAATCTC
CCCDTAR：TCGTACCTCTCCTTGGCG
CCCDTBF：GATAAAGTCTCCAAAACTGC
CCCDTBR：ATGAAAAAAATTATATGTTTATTTTTATC
CCCDTCF：GCTTAATACAGTTACGATAG
CCCDTCR：TTCTAAAGGGGTAGCAGCTG
②空肠弯曲菌三对特异性引物：
CJCDTAF：GCTACTTGGAATATGCAAGG
CJCDTAR：AGGACTTGAACCTACTTTTC
CJCDTBF：TGGTTCTCTATTRAAATCWCC
CJCDTBR：AGGTGGAGTAGTTAAAAACC
CJCDTCF：ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC
CJCDTCR：AAGGGGTAGCAGCTGTTAA
③胎儿弯曲菌三对特异性引物：
CFCDTAF：GTTTGGATTTTCAAATGTTCC
CFCDTAR：AAGACAAATGTAAGCACTC
CFCDTBF：TATTTATGCAAGTCGTGCGA
CFCDTBR：AAGCATAAGTTTTGCAAACG
CFCDTCF：CAAGAGTTCCTCTTAAACTC
CFCDTCR：GGCTTTGCAAAACCAGAAG
其中，w=a或t，r=g或a。
以上引物核苷酸序列从左到右是5’-末端至3’-末端的方向。
一种三重PCR检测引物在制备弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测试剂盒中的应用。
一种弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测试剂盒，包括弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物。
所述的试剂盒，还包括2×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
PCR检测试剂所构建的PCR反应体系为：2×PCR Buffer 12.5 μl、25 mM MgCl2 4.25 μl、dNTPs（10 mM each）1 μl、10 mM CDTAF 1 μl、10 mM CDTAR 1 μl、10 mM CDTBF 1μl、10 mM CDTBR 1 μl、10 mM CDTCF 1 μl、10 mM CDTCR 1 μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.25 μl、DNA 1 μl。
所述的试剂盒，还包括阳性对照和阴性对照。
阳性对照为弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的DNA，阴性对照为副猪嗜血杆菌的DNA。
PCR扩增结果为：结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的扩增长度分别为950 bp、750 bp和600 bp；空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的扩增长度分别为850 bp、700 bp和500 bp；胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的扩增长度分别为760 bp、570 bp和250 bp。
本发明有益效果：
1、本发明提供了一种能同时检测弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测方法，该方法能快速、准确的检测出弯曲菌细胞膨胀致死毒素，可对弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的单个毒素进行检测，也可对A型，B型和C型毒素同时检测，可用于弯曲菌毒素型普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和检测。
2、本发明的方法是建立在分子生物学基础上的，检测中提供了阴性和阳性对照，大大提高了毒素定型的准确度，降低假阳性的出现几率，特异性较强。
3、本发明的三重PCR检测不仅具有单个PCR的特异性、敏感性、准确性，而且可以在一个反应体系里同时扩增三种毒素的不同目的基因片段，省时省力，使原来需要做三次PCR和三次电泳的检测，现在一次就可以完成，传统的单一PCR方法检测时间一般2-3天，该三重PCR方法将检测时间缩短至4 h，大大提高了工作效率。
4、本发明特别适合于弯曲菌及混合感染的大量临床样本的快速检测和诊断，可以为临床和科研上这三种毒素分型提供科学依据，而且对提高弯曲菌的检测、监控、毒素定型、疫苗筛选和耐药性检测及动物源性食品的安全具有重要意义。
附图说明
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR扩增产物与单一PCR扩增产物的对比图。图中M泳道为DL2000 DNA Marker，2号和3号泳道为三重PCR，可同时把A型，B型和C型毒素区分开；5、6、8、9、11、12号泳道为单重PCR，每次只能检测一种毒素，其中5、6号泳道为C型毒素，8、9号泳道为B型毒素，11、12号泳道为A型毒素；1、4、7、10号泳道为阴性对照（副猪嗜血杆菌的DNA）。
图2为空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR扩增产物与单一PCR扩增产物的对比图。图中M泳道为DL2000 DNA Marker，2号和3号泳道为三重PCR，可同时把A型，B型和C型毒素区分开；5、6、8、9、11、12号泳道为单重PCR，每次只能检测一种毒素，其中5、6号泳道为B型毒素，8、9号泳道为A型毒素，11、12号泳道为C型毒素；1、4、7、10号泳道为阴性对照（副猪嗜血杆菌的DNA）。
图3为胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR扩增产物与单一PCR扩增产物的对比图。图中M泳道为DL2000 DNA Marker，2号和3号泳道为三重PCR，可同时把A型，B型和C型毒素区分开；5、6、8、9、11、12号泳道为单重PCR，每次只能检测一种毒素，其中5、6号泳道为C型毒素，8、9号泳道为A型毒素，11、12号泳道为B型毒素；1、4、7、10号泳道为阴性对照（副猪嗜血杆菌的DNA）。
图4 为结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR扩增敏感性图。图中M泳道为DL2000 DNA Marker，1-6号泳道分别为各型模板量10 ng，1000 pg，100 pg，10 pg，1pg，0.1 pg。
图5 为空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR扩增敏感性图。图中M泳道为DL2000 DNA Marker，1-6号泳道分别为各型模板量10 ng，1000 pg，100 pg，10 pg，1pg，0.1 pg。
图6 为胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR扩增敏感性图。图中M泳道为DL2000 DNA Marker，1-6号泳道分别为各型模板量10 ng，1000 pg，100 pg，10 pg，1pg，0.1 pg。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。文中的百分含量，如没有特别说明均指重量百分比。
实施例1、结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的三重PCR检测方法
（1）结肠弯曲菌菌株的DNA提取
DNA提取方法可以为常规方法，本发明DNA的提取方法如下：
将待检测样本涂布在固体培养基上，培养，刮取固体培养基表面生长的菌落，收集到干净的离心管中；
加入1.5ml裂解液，裂解液的组成为：0.15mol/L的NaCl，15-35 mmol/l的盐酸胍，0.1mol/l的Na2EDTA，15mg/ml的溶菌酶，10-30 mmol/l的十二烷基氨基酸，pH=8.0；
100℃水浴5 min；
加入100 μl无水乙醇，温和翻转离心管混合均匀，离心；
将步骤④中的溶液和絮状物一起倒入DNA置于收集管的吸附柱中，室温放置2min；
12000 rpm离心1min，弃去收集管，将DNA吸附柱放入另一干净的收集管中；
在DNA吸附柱中加入200 μl Buffer，Buffer中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1， 室温放置2 min，12000 rpm离心1min，弃去收集管，将DNA吸附柱放入另一干净的收集管中；
在DNA吸附柱中加入200 μl 醋酸钠-醋酸缓冲液，12000 rpm离心1 min，弃废液，将DNA吸附柱放回收集管中；
重复步骤⑧；
12000rpm离心2 min；将DNA吸附柱转入1.5 ml离心管中，向硅胶模的中央加50 μlpH≥7.0的去离子水，将1.5ml离心管的盖子扣在DNA吸附柱上，做好标记，去除DNA吸附柱的盖子；室温放置2 min，12000 rpm离心1 min，离心结束后再加入50 μl pH≥7.0的去离子水；重复此步骤。
（2）设计引物
根据结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的基因，设计特异性引物，核苷酸序列如下：
CCCDTAF：ATTGCCAAGGCTAAAATCTC（SEQ ID NO.1）
CCCDTAR：TCGTACCTCTCCTTGGCG（SEQ ID NO.2）
CCCDTBF：GATAAAGTCTCCAAAACTGC（SEQ ID NO.3）
CCCDTBR：ATGAAAAAAATTATATGTTTATTTTTATC（SEQ ID NO.4）
CCCDTCF：GCTTAATACAGTTACGATAG（SEQ ID NO.5）
CCCDTCR：TTCTAAAGGGGTAGCAGCTG（SEQ ID NO.6）
以上核苷酸序列从左到右是5’-末端至3’-末端的方向。
结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型预期扩增长度分别为950 bp、750 bp和600 bp。
（3） PCR产物扩增体系
扩增体系的建立，在PCR试剂管中加入反应液，反应液包括2×PCR Buffer、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及A型，B型和C型三对特异性异物，以步骤（1）提取的DNA为模板，反应液总体积为25 μl，扩增体系的具体组成如下：2×PCR Buffer 12.5 μl、25 mM MgCl2 4.25 μl、dNTPs（10 mM each）1 μl、10 mM CCCDTAF 1 μl、10 mM CCCDTAR 1 μl、10 mM CCCDTBF 1μl、10 mM CCCDTBR 1 μl、10 mM CCCDTCF 1 μl、10 mM CCCDTCR 1 μl、5U/μl Taq DNA聚合酶 0.25 μl、DNA 1 μl。
（4）PCR扩增程序
95 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，32个循环；72℃延伸2 min。
（5）PCR扩增产物的检测
三重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳时的凝胶浓度为1%，其中含有1%的凝胶燃料，100 V 电泳30 min，在凝胶成像系统下观察结果。
结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的三重PCR检测试剂盒的组成包括：2×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、CCCDTAF、CCCDTAR、CCCDTBF、CCCDTBR、CCCDTCF、CCCDTCR、TaqDNA聚合酶，以及阳性对照（结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的DNA）和阴性对照（副猪嗜血杆菌的DNA）。
实施例2、空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的三重PCR检测方法
（1）空肠弯曲菌菌株的DNA提取：
方法同实施例1。
（2）设计引物
根据空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的基因，设计特异性引物，核苷酸序列如下：
CJCDTAF：GCTACTTGGAATATGCAAGG（SEQ ID NO.7）
CJCDTAR：AGGACTTGAACCTACTTTTC（SEQ ID NO.8）
CJCDTBF：TGGTTCTCTATTRAAATCWCC（SEQ ID NO.9）
CJCDTBR：AGGTGGAGTAGTTAAAAACC（SEQ ID NO.10）
CJCDTCF：ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC（SEQ ID NO.11）
CJCDTCR：AAGGGGTAGCAGCTGTTAA（SEQ ID NO.12）
其中，w=a或t，r=g或a。
以上核苷酸序列从左到右是5’-末端至3’-末端的方向。
空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型预期扩增长度分别为850 bp、700 bp和500 bp。
（3） PCR产物扩增体系
扩增体系的建立，在PCR试剂管中加入反应液，反应液包括2×PCR Buffer、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及A型，B型和C型三对特异性异物，以步骤（1）提取的DNA为模板，反应液总体积为25 μl，扩增体系的具体组成如下：2×PCR Buffer 12.5 μl、25 mM MgCl2 4.25 μl、dNTPs（10 mM each）1 μl、10 mM CJCDTAF 1 μl、10 mM CJCDTAR 1 μl、10 mM CJCDTBF 1μl、10 mM CJCDTBR 1 μl、10 mM CJCDTCF 1 μl、10 mM CJCDTCR 1 μl、5U/μl Taq DNA聚合酶 0.25 μl、DNA 1 μl。
（4）PCR扩增程序
95℃预变性2 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min。
（5）PCR扩增产物的检测
三重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳时的凝胶浓度为1%，其中含有1%的凝胶燃料，100 V 电泳30 min，在凝胶成像系统下观察结果。
空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的三重PCR检测试剂盒的组成包括：2×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、CJCDTAF、CJCDTAR、CJCDTBF、CJCDTBR、CJCDTCF、CJCDTCR、TaqDNA聚合酶，以及阳性对照（空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的DNA）和阴性对照（副猪嗜血杆菌的DNA）。
实施例3、胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的三重PCR检测方法
（1）胎儿弯曲菌菌株的DNA提取：
方法同实施例1。
（2）设计引物
根据胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的基因，设计特异性引物，核苷酸序列如下：
CFCDTAF：GTTTGGATTTTCAAATGTTCC（SEQ ID NO.13）
CFCDTAR：AAGACAAATGTAAGCACTC（SEQ ID NO.14）
CFCDTBF：TATTTATGCAAGTCGTGCGA（SEQ ID NO.15）
CFCDTBR：AAGCATAAGTTTTGCAAACG（SEQ ID NO.16）
CFCDTCF：CAAGAGTTCCTCTTAAACTC（SEQ ID NO.17）
CFCDTCR：GGCTTTGCAAAACCAGAAG（SEQ ID NO.18）
以上核苷酸序列从左到右是5’-末端至3’-末端的方向。
胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型预期扩增长度分别为760 bp、570 bp和250 bp。
（3） PCR产物扩增体系
扩增体系的建立，在PCR试剂管中加入反应液，反应液包括2×PCR Buffer、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及A型，B型和C型三对特异性异物，以步骤（1）提取的DNA为模板，反应液总体积为25 μl，扩增体系的具体组成如下：2×PCR Buffer 12.5 μl、25 mM MgCl2 4.25 μl、dNTPs（10 mM each）1 μl、10 mM CFCDTAF 1 μl、10 mM CFCDTAR 1 μl、10 mM CFCDTBF 1μl、10 mM CFCDTBR 1 μl、10 mM CFCDTCF 1 μl、10 mM CFCDTCR 1 μl、5U/μl Taq DNA聚合酶 0.25 μl、DNA 1 μl。
（4）PCR扩增程序
94℃预变性5 min；94℃变性 45s，56℃退火1 min，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸2min。
（5）PCR扩增产物的检测
三重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳时的凝胶浓度为1%，其中含有1%的凝胶燃料，100 V 电泳30 min，在凝胶成像系统下观察结果。
胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的三重PCR检测试剂盒的组成包括：2×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、CFCDTAF、CFCDTAR、CFCDTBF、CFCDTBR、CFCDTCF、CFCDTCR、TaqDNA聚合酶，以及阳性对照（胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的DNA）和阴性对照（副猪嗜血杆菌的DNA）。
实施例4、效果检测
1、结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型
以结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为样品，分别采用实施例1的三重PCR检测方法和普通的单一PCR检测方法进行检测，结果见图1。图1结果表明，本发明的方法可以同时检测结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型，单一PCR方法每次只能检测一种毒素。
2、空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型
以空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为样品，分别采用实施例2的三重PCR检测方法和普通的单一PCR检测方法进行检测，结果见图2。图2结果表明，本发明的方法可以同时检测空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型，单一PCR方法每次只能检测一种毒素。
3、胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型
以胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为样品，分别采用实施例3的三重PCR检测方法和普通的单一PCR检测方法进行检测，结果见图3。图3结果表明，本发明的方法可以同时检测胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型，单一PCR方法每次只能检测一种毒素。
实施例5、特异性检测
以结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为实验模板，以大肠杆菌，传染性胸膜肺炎放线杆菌，支原体的DNA为对照模板，按照实施例1的三重PCR检测方法进行检测。结果显示，只有结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型能够得到目的条带，其它对照模板无扩增条带产生，说明本发明具有很高的特异性。
以空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为实验模板，以大肠杆菌，传染性胸膜肺炎放线杆菌，支原体的DNA为对照模板，按照实施例2的三重PCR检测方法进行检测。结果显示，只有空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型能够得到目的条带，其它对照模板无扩增条带产生，说明本发明具有很高的特异性。
以胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为实验模板，以大肠杆菌，传染性胸膜肺炎放线杆菌，支原体的DNA为对照模板，按照实施例3的三重PCR检测方法进行检测。结果显示，只有胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型能够得到目的条带，其它对照模板无扩增条带产生，说明本发明具有很高的特异性。
实施例6、敏感性检测
以结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为模板，各型模板量均设定为10 ng，1000 pg，100 pg，10 pg，1 pg，0.1 pg，按照实施例1的三重PCR检测方法进行检测，结果见图4。图4结果表明，本发明的PCR方法可检出10 pg的DNA模板，具有较高的敏感性。
以空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为模板，各型模板量均设定为10 ng，1000 pg，100 pg，10 pg，1 pg，0.1 pg，按照实施例2的三重PCR检测方法进行检测，结果见图5。图5结果表明，本发明的PCR方法可检出10 pg的DNA模板，具有较高的敏感性。
以胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的混合感染DNA为模板，各型模板量均设定为10 ng，1000 pg，100 pg，10 pg，1 pg，0.1 pg，按照实施例3的三重PCR检测方法进行检测，结果见图6。图6结果表明，本发明的PCR方法可检出10 pg的DNA模板，具有较高的敏感性。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物及试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 1
attgccaagg ctaaaatctc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 2
tcgtacctct ccttggcg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 3
gataaagtct ccaaaactgc 20
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 4
atgaaaaaaa ttatatgttt atttttatc 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 5
gcttaataca gttacgatag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 6
ttctaaaggg gtagcagctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 7
gctacttgga atatgcaagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 8
aggacttgaa cctacttttc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物()
<220>
<221> misc_feature
<223> w=a或t
<400> 9
tggttctcta ttraaatcwc c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 10
aggtggagta gttaaaaacc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 11
atcttttaac cttgcttttg c 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 12
aaggggtagc agctgttaa 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 13
gtttggattt tcaaatgttc c 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 14
aagacaaatg taagcactc 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 15
tatttatgca agtcgtgcga 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 16
aagcataagt tttgcaaacg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 17
caagagttcc tcttaaactc 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物()
<400> 18
ggctttgcaa aaccagaag 19

Claims (8)

1.弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物，其特征在于，所述弯曲菌分为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌，对应引物的核苷酸序列分别为：
①结肠弯曲菌三对特异性引物：
CCCDTAF：ATTGCCAAGGCTAAAATCTC
CCCDTAR：TCGTACCTCTCCTTGGCG
CCCDTBF：GATAAAGTCTCCAAAACTGC
CCCDTBR：ATGAAAAAAATTATATGTTTATTTTTATC
CCCDTCF：GCTTAATACAGTTACGATAG
CCCDTCR：TTCTAAAGGGGTAGCAGCTG
②空肠弯曲菌三对特异性引物：
CJCDTAF：GCTACTTGGAATATGCAAGG
CJCDTAR：AGGACTTGAACCTACTTTTC
CJCDTBF：TGGTTCTCTATTRAAATCWCC
CJCDTBR：AGGTGGAGTAGTTAAAAACC
CJCDTCF：ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC
CJCDTCR：AAGGGGTAGCAGCTGTTAA
③胎儿弯曲菌三对特异性引物：
CFCDTAF：GTTTGGATTTTCAAATGTTCC
CFCDTAR：AAGACAAATGTAAGCACTC
CFCDTBF：TATTTATGCAAGTCGTGCGA
CFCDTBR：AAGCATAAGTTTTGCAAACG
CFCDTCF：CAAGAGTTCCTCTTAAACTC
CFCDTCR：GGCTTTGCAAAACCAGAAG
其中，w=a或t，r=g或a；
以上引物核苷酸序列从左到右是5’-末端至3’-末端的方向。
2.一种权利要求1所述的引物在制备弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测试剂盒中的应用。
3.一种弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PCR检测试剂所构建的PCR反应体系为：2×PCR Buffer 12.5 μl、25 mM MgCl2 4.25 μl、dNTPs（10 mM each）1 μl、10 mM CDTAF 1 μl、10 mM CDTAR 1 μl、10 mM CDTBF 1 μl、10 mM CDTBR 1 μl、10 mM CDTCF 1 μl、10 mMCDTCR 1 μl、5U/μl Taq DNA聚合酶 0.25 μl、DNA 1 μl。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照为弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的DNA，阴性对照为副猪嗜血杆菌的DNA。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增结果为：结肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的扩增长度分别为950 bp、750 bp和600 bp；空肠弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的扩增长度分别为850 bp、700 bp和500 bp；胎儿弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的扩增长度分别为760 bp、570 bp和250 bp。
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