CN116064929A - 检测BVDV、BRV、BCoV、ETEC、沙门氏菌和CpA的液相芯片检测试剂盒 - Google Patents

检测BVDV、BRV、BCoV、ETEC、沙门氏菌和CpA的液相芯片检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、牛源沙门氏菌(Salmonella)和牛A型产气荚膜梭菌(CpA)的液相芯片检测试剂盒及其专用引物、偶联探针。利用本发明的试剂盒能够同时对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行鉴别检测，实现高通量检测的目的，且检测操作简便、特异性强、重复性好，可用于牛源原材料质检等领域。

Description

检测BVDV、BRV、BCoV、ETEC、沙门氏菌和CpA的液相芯片检测试 剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测技术领域，具体涉及一种能够同时特异性检测牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、牛源沙门氏菌、牛A型产气荚膜梭菌(CpA)的液相芯片检测试剂盒及其专用引物和偶联探针。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)的病原。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，是一种有囊膜包被的单股正链RNA病毒，其由一个5'-UTR、一个3'-UTR和一个可转录翻译成约4000个氨基酸残基的开放阅读框(Open reading frame，ORF)组成。根据5'-UTR基因序列的不同，可将BVDV分为1型和2型两个基因型。牛感染BVDV后，多发生腹泻、肺炎、繁殖障碍和黏膜病等，给养牛业造成极大的损失。
牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)是引起新生犊牛病毒性腹泻病的病原，该病原属于轮状病毒(Rotavirus，RV)。RV属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是一种无囊膜包被的双链RNA病毒。BRV由三层衣壳构成，分为11个基因片段，分别编码6种结构蛋白(VP1～VP4、VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1～NSP6)。根据构成病毒衣壳中间层的VP6蛋白的抗原和遗传特征，轮状病毒可分为9个不同的血清群。BRV感染引起的牛腹泻病在世界范围内均有分布，极大影响了畜牧业的经济效益。
牛冠状病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)是引起牛等反刍动物的呼吸道或消化道疾病(出现腹泻的症状)的病原。BCoV属于冠状病毒科冠状病毒属，是一种有囊膜包被的单股正链RNA病毒。BCoV的基因组从5'端到3'端编码5种结构蛋白，依次为核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、小衣壳蛋白(E)、纤突蛋白(S)和血凝素酯酶蛋白(HE)。牛感染BCoV后，会影响其生长和生产机能，给养牛业造成严重的经济损失。
致泻性大肠杆菌(Diarrheagenic E.coli，DEC)通常是引起腹泻症状的特殊血清型的大肠埃希氏菌，根据其发病机制及临床特征等，可分为肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli，EPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli，EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(Enteroaggregative E.coli，EAEC)和弥散黏附性大肠杆菌(Diffuse adherent E.coli，DAEC)。其中，产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是最常见的，往往感染犊牛和仔猪较多，它能导致幼畜严重腹泻和迅速脱水并导致死亡，极大影响了畜牧业的经济效益。
沙门氏菌(Salmonella)是一种无芽胞、无荚膜的革兰阴性杆菌，主要包括邦戈尔沙门氏菌和肠道沙门氏菌两个种。沙门氏菌是引起犊牛腹泻的主要病原之一，其感染可能表现为肠道疾病、败血病和生殖疾病，严重影响犊牛健康，给养殖业生产带来负面影响。
产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens，Cp)是人和动物胃肠道中的常在菌，也普遍存在于土壤和污水中。该菌可引起各种家畜以及人类多种疾病的发生，主要有创伤性感染、恶性水肿，还会引起猪、马还有反刍动物等的肠毒血症，羔羊痢疾，绵羊猝狙，对于犬、猫和人还会引起腹泻等症状。产气荚膜梭菌根据其产生四种主要致死性毒素(α、β、ε和ι)的能力不同而被分为A、B、C、D、E五种类型，各型的产气荚膜梭菌均能引起牛发病，其中尤以A、C、D型菌感染居多，且以A型产气荚膜梭菌(CpA)引起的成年牛“猝死症”发生居多。
为了鉴别检测以上可引起养殖业牲畜发生腹泻的病原体，专利文献CN112094953A(以下称文献1)公开一种用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒及引物和探针，其基于三重荧光定量RT-PCR的检测方法能最低检出浓度均为1×101copies/μL的三种病原菌质粒，实现高灵敏度和高特异性检测目的，但该文献1仅能同时鉴别检测以上三种病原体(牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒)。专利文献CN114350829A(以下称文献2)公开一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合、试剂盒及应用，其基于三重荧光定量PCR的检测方法可同时实现产肠毒素大肠杆菌(ST和LT)和沙门氏菌毒力基因的高灵敏度检测，最低检出浓度均为1×101copies/μL，然而该文献2仅能同时鉴别检测以上两种病原体(产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌)。目前，还没有能够同时检测牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCov)、牛源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、牛源沙门氏菌、牛A型产气荚膜梭菌(CpA)的方法报道。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种用于对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行液相芯片检测的引物和偶联探针组合，其包含：
用于检测BVDV的上游引物(BVDV-F)、下游引物(BVDV-R)和偶联探针(BVDV-P)，其中所述上游引物(BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(BVDV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，偶联探针(BVDV-P)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；
用于检测BRV的上游引物(BRV-F1)、下游引物(BRV-R1)和偶联探针(BRV-P1)，其中所述上游引物(BRV-F1)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：4所示，下游引物(BRV-R1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，偶联探针(BRV-P1)的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：6所示；
用于检测BCoV的上游引物(BCoV-F)、下游引物(BCoV-R)和偶联探针(BCoV-P)，其中所述上游引物(BCoV-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：10所示，下游引物(BCoV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：11所示，偶联探针(BCoV-P)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：12所示；
用于检测ETEC的上游引物(ETEC-F1)、下游引物(ETEC-R1)和偶联探针(ETEC-P1)，其中所述上游引物(ETEC-F1)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：13所示，下游引物(ETEC-R1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：14所示，偶联探针(ETEC-P1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：15所示；
用于检测Salmonella的上游引物(Sa-F2)、下游引物(Sa-R2)和偶联探针(Sa-P2)，其中所述上游引物(Sa-F2)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：21所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：22所示，偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：20所示；
用于检测CpA的上游引物(CpA-F1)、下游引物(CpA-R1)和偶联探针(CpA-P1)，其中所述上游引物(CpA-F1)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：23所示，下游引物(CpA-R1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：24所示，偶联探针(CpA-P1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：25所示。
在一些实施方式中，所述下游引物(BVDV-R)、下游引物(BRV-R1)、下游引物(BCoV-R)、下游引物(ETEC-R1)、下游引物(Sa-R2)和下游引物(CpA-R1)的核苷酸序列的5’端均标记有生物素；所述偶联探针(BVDV-P)、偶联探针(BRV-P1)、偶联探针(BCoV-P)、偶联探针(ETEC-P1)、偶联探针(Sa-P2)和偶联探针(CpA-P1)的核苷酸序列的5’端均标记有胺基。
本发明另一方面提供一种用于对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行液相芯片检测的试剂盒，其包含上述的引物和偶联探针组合。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含分别与偶联探针(BVDV-P)、偶联探针(BRV-P1)、偶联探针(BCoV-P)、偶联探针(ETEC-P1)、偶联探针(Sa-P2)和偶联探针(CpA-P1)偶联的六种不同的luminex磁球，其中将偶联探针(BVDV-P)与luminex磁球偶联后的磁球称为BVDV偶联磁球，将偶联探针(BRV-P1)与luminex磁球偶联后的磁球称为BRV偶联磁球，将偶联探针(BCoV-P)与luminex磁球偶联后的磁球称为BCoV偶联磁球，将偶联探针(ETEC-P1)与luminex磁球偶联后的磁球称为ETEC偶联磁球，将偶联探针(Sa-P2)与luminex磁球偶联后的磁球称为Sa偶联磁球，将偶联探针(CpA-P1)与luminex磁球偶联后的磁球称为CpA偶联磁球。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含三种PCR反应体系，包括用于扩增BVDV、BRV和BCoV的三重PCR反应体系，用于扩增ETEC和CpA的双重PCR反应体系和用于扩增Salmonella的单重PCR反应体系。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA目的基因片段的质粒，所述阴性对照为不含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA核酸的反应体系。
本发明另一方面还提供一种用上述的引物和偶联探针组合或试剂盒对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行非疾病诊断目的定性检测的方法，其包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组RNA/DNA，以提取的基因组RNA/DNA为模板，在上述的引物的引导下进行普通PCR扩增；
2)将步骤1)扩增得到的PCR产物与上述的BVDV偶联磁球、BRV偶联磁球、BCoV-P偶联磁球、ETEC偶联磁球、Sa偶联磁球和CpA偶联磁球混合进行液相芯片杂交，并进行上机分析，获得待测样品中各病原体对应偶联磁球的MFI值以及阳性对照品和阴性对照品中各病毒对应偶联磁球的MFI值；
3)基于步骤2)获得的MFI值对待测样品中的BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA分别进行定性判定。
在一些实施方式中，步骤1)中进行三次普通PCR扩增：
(1)对BVDV、BRV和BCoV进行三重PCR扩增，其PCR反应体系包括：一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL，PrimeScript RTEnzyme Mix II 1-2μL，上游引物(BVDV-F)和(BCoV-F)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(BVDV-R)和BCoV-R(10μM)：1-2μL，上游引物(BRV-F1)(10μM)：1-2μL，下游引物(BRV-R1)(10μM)：1-3μL，模板1-3μL，ddH2O补充至50μL；
(2)对ETEC和CpA进行双重PCR扩增，其PCR反应体系包括：一步法PCR反应液2×OneStep RT-PCR Buffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL，PrimeScript RT EnzymeMix II 1-2μL，上游引物(CpA-F1)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(CpA-R1)(10μM)：1-2μL，上游引物(ETEC-F1)(10μM)：1-2μL，下游引物(ETEC-R1)(10μM)：1-3μL，模板1-3μL，ddH2O补充至50μL；
(3)对Salmonella进行单重PCR扩增，其PCR反应体系包括：一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL，PrimeScript RTEnzyme Mix II 1-2μL，上游引物(Sa-F2)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(Sa-R2)(10μM)：1-2μL，模板1-3μL，ddH2O补充至50μL。
在一些实施方式中，步骤1)中所述普通PCR扩增的反应条件为：先52℃15min，95℃2min；然后94℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环；最后终延伸72℃7min。
在一些实施方式中，步骤3)的具体定性判定过程为：
A、若阳性对照和阴性对照中各病原体对应磁球的MFI值的比值≥3，且阳性对照中各病原体对应磁球的MFI值≥300时，则试验成立；
B、计算待测样品中各病原体对应磁球的MFI值与阴性对照的MFI值的比值QC；
C、A判定为试验成立时，当待测样品中各病原体对应磁球的MFI值≥300，且QC≥3，判为待测样品中对应病原体阳性；否则，判为阴性。
在一些实施方式中，步骤1)中的待测样品包括采自牛源用于疫苗生产的原材料血清、疫苗半成品、疫苗成品、牛源睾丸分离的原代细胞或其组合。
基于以上技术方案提供的检测BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的液相芯片检测试剂盒及其专用引物和偶联探针能够针对同一样本同时特异性地对上述六种病原体进行快速的非疾病诊断目的定性检测，具有高通量检测的特点，可为牛源原材料外源病毒与细菌的筛选提供一种快速有效的技术手段，确保疫苗生产用原料的纯净性，保证疫苗接种的安全性，还可以对牛源原材料的质量进行监控，并为后续处置提供客观数据，以保证牛源原材料血清、细胞及其制品(疫苗成品或疫苗半成品)等牛源产品的纯净性和安全性。
附图说明
图1为56号磁球与牛病毒性腹泻病毒的偶联探针偶联效率的检测结果。
图2为37号磁球与牛轮状病毒的偶联探针偶联效率的检测结果。
图3为62号磁球与牛冠状病毒的偶联探针偶联效率的检测结果。
图4为30号磁球与牛源产肠毒素大肠杆菌的偶联探针偶联效率的检测结果。
图5为19号磁球与牛源沙门氏菌的偶联探针偶联效率的检测结果。
图6为75号磁球与牛A型产气荚膜梭菌的偶联探针偶联效率的检测结果。
具体实施方式
液相芯片检测技术最初由美国(Luminex)公司发展起来，又称液态悬浮芯片技术，它是将流式细胞技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术集为一体的一种新型生物分子检测技术。具有高通量等特点。Luminex 200选用2种荧光染料，采取不同比例的配制，使微球带有100种不同的荧光染色，即可以编码100种微球，1种微球可检测一种目标分子，因此理论上可同时检测100种目标分子，该目标分子可以是抗原、核酸、酶底物或受体。检测时先将不同核酸探针、抗原或抗体以共价交联的方式结合到荧光编码的微球上，再在检测体系中加入待检样品模板，样品中的目标分子能够与特定荧光编码微球及藻红蛋白分子特异性结合，随后进行Luminex检测和结果分析。Luminex检测通道具有红色和绿色两种激光，红光检测微球编码的荧光色来区分小球种类，从而确定检测的目标分子；绿光检测与配体结合的目标分子上的荧光信号来进行定量。因此液相芯片检测技术可以从一个待检测样本中同时检测到多种目标分子，不仅减少试剂耗材的用量，还节约时间，在提高工作效率的同时降低了检测成本。
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用标记引物和偶联探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
实施例1：设计用液相芯片技术同时检测牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、牛源沙门氏菌(Salmonella)、牛A型产气荚膜梭菌(CpA)的标记引物和偶联探针
1.1、BVDV的标记引物和偶联探针的确定：使用专利文献CN112094953A(上述文献1)公开的用于对BVDV进行实时荧光定量PCR检测的引物(包括上游引物BVDV-F和下游引物BVDV-R)和探针(BVDV-P)序列，其可以同时扩增BVDV I型和II型病毒，本发明为适应针对六种病原体的鉴别体系，根据液相标记引物和偶联探针的设计原则，进一步对下游引物BVDV-R和探针BVDV-P进行改造，得到适用于液相芯片技术对BVDV进行检测的标记引物和偶联探针，其序列信息如下所示：
上游引物BVDV-F：5'-GAGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3'(SED ID NO：1)；
下游引物BVDV-R：5'-biotin-CTCGTCCACRTGGCATCTCGA-3'(SED ID NO：2)；
偶联探针BVDV-P：5'-amino(胺基)-liner C12(12个C)-CCTGAGTACAGGGKAGTCGTCRGTGGTTCGAC-3'(SED ID NO：3)
1.2、BRV的标记引物和偶联探针的确定：选择BRV保守的VP7基因片段(SED ID NO：28)作为检测靶基因，根据液相标记引物和偶联探针的设计原则，共设计了多组标记引物和偶联探针，在此列出其中的两组(序列信息如下所示)，基于能适应针对六种病原体的鉴别体系的特异性实验结果，从中确定适用于液相芯片技术检测BRV的最佳标记引物和偶联探针组合：
组1：
上游引物BRV-F1：5'-GGCTTTAAAAGMGAGAAT-3'(SED ID NO：4)；
下游引物BRV-R1：5'-biotin-RTTAGAAYTGTGGTATATTC-3'(SED ID NO：5)；
偶联探针BRV-P1：5'-amino-liner C12-CGTTTGGCTAGCGGTTAGCTCCTT-3'(SED IDNO：6)；
组2：
上游引物BRV-F2：5’-TCGATTACATTGTTGAAT-3’(SED ID NO：7)；
下游引物BRV-R2：5’-biotin-GCTATTTCGTTTGATGCCT-3’(SED ID NO：8)；
偶联探针BRV-P2：5'-amino-liner C12-AGTGATCTTGGCCACCATAATAAATGC-3’(SEDID NO：9)。
1.3、BCoV的标记引物和偶联探针的确定：使用专利文献CN112094953A(上述文献1)公开的用于对BCoV进行实时荧光定量PCR检测的引物(包括上游引物BCoV-F和下游引物BCoV-R)和探针(BCoV-P)序列，本发明为适应针对六种病原体的鉴别体系，根据液相标记引物和偶联探针的设计原则，对下游引物BCoV-R和探针BCoV-P进行改造，得到适用于液相芯片技术对BCOV进行检测的标记引物和偶联探针，其序列信息如下所示：
上游引物BCoV-F：5’-GCTAGTAACCAGGCTGATGTC-3'(SED ID NO：10)；
下游引物BCoV-R：5’-biotin-GATGCGCGTGAAGTAGATCTG-3'(SED ID NO：11)；
偶联探针BCoV-P：5'-amino-liner C12-CGATCGGGACCCAAGTAGCGATGAGGC-3'(SEDID NO：12)。
1.4、ETEC的标记引物和偶联探针的确定：选择牛源产肠毒素大肠杆菌保守的LT基因序列(SED ID NO：29)作为检测靶基因，根据液相标记引物和偶联探针的设计原则，共设计了多组标记引物和偶联探针，在此列出其中的两组(序列信息如下所示)，基于能适应针对六种病原体的鉴别体系的特异性实验结果，从中确定适用于液相芯片技术检测ETEC的最佳标记引物和偶联探针组合：
组1：
上游引物ETEC-F1：5’-AAGTGCTCACTTAGCAGGAC-3'(SED ID NO：13)；
下游引物ETEC-R1：5’-biotin-CTGCGTTAGGTGGAATACCA-3'(SED ID NO：14)；
偶联探针ETEC-P1：5'-amino-liner C12-AGGCGTATACAGCCCTCACCCATATG-3'(SEDID NO：15)；
组2：
上游引物ETEC-F2：5’-ACTTAGCAGGACAGTCTAT-3'(SED ID NO：16)；
下游引物ETEC-R2：5’-biotin-CTGAGAATATGGTATTCCA-3'(SED ID NO：17)；
偶联探针ETEC-P2：同偶联探针ETEC-P1。
1.5、牛源沙门氏菌(Salmonella)的标记引物和偶联探针的确定：选择牛源沙门氏菌保守的invA基因序列(SED ID NO：30)作为检测靶基因，根据液相标记引物和偶联探针的设计原则，共设计了多组标记引物和偶联探针，在此列出其中的两组(序列信息如下所示)，基于能适应针对六种病原体的鉴别体系的特异性实验结果，从中确定适用于液相芯片技术检测牛源沙门氏菌的最佳标记引物和偶联探针组合：
组1：
上游引物Sa-F1：5’-ACGTAGCGCAATCAAGCCT-3'(SED ID NO：18)；
下游引物Sa-R1：5’-biotin-GCCAATCAGTCCTAACGACG-3'(SED ID NO：19)；
偶联探针Sa-P1：5'-amino-liner C12-AGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGG-3'(SED IDNO：20)；
组2：
上游引物Sa-F2：5’-CGTGAAGCAAAACGTAGCGC-3'(SED ID NO：21)；
下游引物Sa-R2：5’-biotin-ATCGAGATCGCCAATCAGTCCT-3'(SED ID NO：22)；
偶联探针Sa-P2：同牛源沙门氏菌偶联探针Sa-P1。
1.6、CpA的标记引物和偶联探针的确定：选择牛A型产气荚膜梭菌保守的α基因序列(SED ID NO：31)作为检测靶基因，根据液相标记引物和偶联探针的设计原则，共设计了多组标记引物和偶联探针，在此列出其中的两组(序列信息如下所示)，基于能适应针对六种病原体的鉴别体系的特异性实验结果，从中确定适用于液相芯片技术检测牛源沙门氏菌的最佳标记引物和偶联探针组合：
组1：
上游引物CpA-F1：5’-TACATTCTATCTTGGAGAGGCT-3'(SED ID NO：23)；
下游引物CpA-R1：5’-biotin-CTCATTAGTTTTGCAACCTGCT-3'(SED ID NO：24)；
偶联探针CpA-P1：5'-amino-liner C12-CCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGC-3'(SED ID NO：25)；
组2：
上游引物CpA-F2：5’-ACAAGCTACATTCTATCTTGGA-3'(SED ID NO：26)；
下游引物CpA-R2：5’-biotin-CATTAGTTTTGCAACCTGCTGT-3'(SED ID NO：27)；
偶联探针CpA-P2：同偶联探针CpA-P1。
1.7、以牛病毒性腹泻-粘膜病病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛源产肠毒素大肠杆菌、牛源沙门氏菌、牛A型产气荚膜梭菌的核酸(按照以下实施例3中描述的方法提取获得)为模板(如无特殊说明，模板为以上六种病原体核酸的混合物)，以表1所示的各种引物组合按照普通PCR扩增体系及程序进行扩增，以不同引物组合的PCR扩增产物的混合物为模板，进行液相芯片检测(按照以下实施例3中描述的方法)：
(1.7.1)使用分别针对BVDV和BCoV的标记引物，以及针对BRV的组1的标记引物进行三重PCR扩增实验，并进行液相芯片检测，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合没有发生交叉反应，且扩增特异性良好；
(1.7.2)使用分别针对BVDV和BCoV的标记引物，以及针对BRV的组2的标记引物进行三重PCR扩增实验(扩增体系中的模板为BVDV、BRV和BCoV三种核酸的混合物)，并进行液相芯片检测，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合没有发生交叉反应，且扩增特异性良好；
(1.7.3)使用分别针对BVDV和BCoV的标记引物，以及针对BRV的组2的标记引物进行三重PCR扩增实验(扩增体系中的模板为六种核酸的混合物)，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应(表现出非特异性结果：假阴性/假阳性)；由以上(1.7.2)和(1.7.3)的检测结果表明，针对BVDV和BCoV的标记引物，以及针对BRV的组2的标记引物在仅包含BVDV、BRV和BCoV核酸的扩增体系中扩增时不会发生交叉反应，但是这三对标记引物在包含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA六种核酸的扩增体系中扩增时会发生交叉反应，因此分别针对BVDV和BCoV的标记引物，以及针对BRV的组2的标记引物的组合不适用于本发明针对以上六种病原体的鉴别体系；另外，在本实施例中发明人还利用上述文献1(CN112094953A)中公开的用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的引物和探针(文献1中表1所示，进行了适应液相芯片检测方法的改造)对包含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA六种核酸的扩增体系进行液相芯片检测，结果表明也会发生交叉反应；
(1.7.4)使用分别针对ETEC、Salmonella和CpA的组1的标记引物进行三重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应；
(1.7.5)使用分别针对ETEC和Salmonella的组1的标记引物与针对CpA的组2的标记引物进行三重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.6)使用针对ETEC的组1的标记引物与分别针对Salmonella和CpA的组2的标记引物进行三重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.7)使用针对ETEC的组2的标记引物与分别针对Salmonella和CpA的组1的标记引物进行三重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.8)使用分别针对ETEC和CpA的组2的标记引物与针对Salmonella的组1的标记引物进行三重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.9)使用分别针对ETEC和Salmonella的组2的标记引物与针对CpA的组1的标记引物进行三重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.10)使用分别针对ETEC、Salmonella和CpA的组2的标记引物进行三重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这三对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.11)使用分别针对ETEC和Salmonella的组1的标记引物进行双重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这两对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.12)使用针对ETEC的组1的标记引物与针对Salmonella的组2的标记引物进行双重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这两对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.13)使用分别针对ETEC和CpA的组1的标记引物进行双重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这两对标记引物的组合不发生交叉反应，且特异性良好；
(1.7.14)使用针对ETEC的组1的标记引物与针对CpA的组2的标记引物进行双重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这两对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.15)单独使用针对Salmonella的组1的标记引物进行单重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这对标记引物会与模板中的其他种类核酸发生交叉反应；
(1.7.16)单独使用针对Salmonella的组2的标记引物进行单重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这对标记引物不会与模板中的其他种类核酸发生交叉反应，特异性良好；
(1.7.17)使用分别针对BVDV、BRV和BCoV的标记引物以及分别针对ETEC和CpA的组1的标记引物进行五重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这五对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性；
(1.7.18)使用分别针对BVDV、BRV和BCoV的标记引物以及针对Salmonella的组2的标记引物进行四重PCR扩增实验，如表1所示的结果，这四对标记引物的组合发生交叉反应，而无特异性。
表1：分别针对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella、CpA的标记引物特异性筛选结果
Figure BDA0003742110030000101
Figure BDA0003742110030000111
注：+代表有交叉反应，—代表无交叉反应；针对BRV、ETEC、Salmonella、CpA四者，1表示组1的标记引物，2表示组2的标记引物。
综上(1.7.1)至(1.7.18)的液相芯片检测结果，最终确定以牛病毒性腹泻-粘膜病病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒为一组进行三重PCR扩增(其中使用组1的标记引物和探针检测牛轮状病毒)，以牛源产肠毒素大肠杆菌与牛A型产气荚膜梭菌的组1的标记引物为一组进行双重PCR扩增，以牛源沙门氏菌的组2的标记引物为一组进行单重PCR扩增。
实施例2、偶联探针与luminex磁球的偶联及偶联效率验证
2.1、偶联探针与luminex磁球的偶联
选取56/37/62/30/19/75号luminex磁球与实施例1确定的分别针对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的偶联探针(BVDV-P、BRV-P1、BCoV-P、ETEC-P1、Sa-P2和CpA-P1)分别进行偶联，偶联流程如下：
(2.1.1)稀释偶联探针，将合成的5’端标记胺基的偶联探针稀释至100μmoL；
(2.1.2)将恢复至室温的luminex磁球上下颠倒混匀，吸100μL(1.25×106)至1.5mL无菌无酶离心管中，12000rpm离心2min，吸弃上清；
(2.1.3)加入50μL 4℃保存的0.1M MES缓冲液(pH 4.5)并吹打混匀；
(2.1.4)加入5μL步骤(2.1.1)中稀释的100μmoL的偶联探针，并吸打混匀；
(2.1.5)现制备EDC溶液，取约10mg的EDC干粉(Sigma)，并用1mL的纯化水溶解于1.5mL的无菌无酶离心管中，取5μL加入到步骤(2.1.4)的溶液中，吹打混匀，室温避光孵育30min；
(2.1.6)重复步骤5；
(2.1.7)向步骤(2.1.6)的1.5mL无菌无酶离心管中加入1ml 0.02％Tween-20溶液，并吹打混匀，12000rpm离心2min，吸弃上清；
(2.1.8)向步骤(2.1.7)的1.5mL无菌无酶离心管中加入1ml 0.1％SDS溶液，并吹打混匀，12000rpm离心2min，吸弃上清；
(2.1.9)向步骤(2.1.8)的1.5mL无菌无酶离心管中加入100μL TE pH 8.0溶液，并吹打混匀，细胞计数仪计数(偶联磁球计数)后2-8℃避光保存。
2.2、偶联效率验证
(2.2.1)根据偶联磁球计数结果，用1.5×TMAC将偶联磁球稀释至100个/μL；
(2.2.2)稀释偶联验证生物素标记引物(即5’端生物素标记的偶联探针的反向互补序列)至10fmol/μL；
(2.2.3)配置验证体系：60μL体系中加入33μL磁球和偶联验证生物素标记引物浓度依次为0fmol、25fmol、50fmol、100fmol、125fmol、150fmol、175fmol、200fmol、225fmol，并用水补充至60μL；
(2.2.4)96℃变性5min，50℃杂交15min，得到杂交体系；
(2.2.5)用1×TMAC将SAPE显色液稀释至10mg/ml；
(2.2.6)在步骤(2.2.4)得到的杂交体系中加入25μL SAPE显色液，并吹打混匀，50℃孵育5min，使用luminex 200仪器分析检测。
偶联效率结果如图1-6所示，其中图1至图6分别表示针对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的偶联探针与luminex磁球的偶联效率曲线，可见随着偶联验证生物素标记引物浓度的依次递增，液相芯片检测的MFI值依次递增，均能达到10000MFI以上，证明各偶联探针与luminex磁球偶联成功，且偶联效率高。
实施例3、使用液相芯片技术对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行定性检测
3.1、提取待测样品的基因组核酸
提取待测样品(可为BVDV、BRV、BCOV、ETEC、Salmonella、CpA各自的细菌培养物)的基因组RNA/DNA，具体方法(使用AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit，AXYGEN公司)包括以下步骤：
(1)AXYGEN试剂盒准备：按试剂盒说明书，预先配制含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂Buffer W1A和Buffer W2中添加指定浓度的无水乙醇；
(2)在1.5mL离心管中加入200μL的待测样品，并加入200μL Buffer V-L，漩涡振荡混匀后，静置5min；
(3)在步骤(2)的1.5mL样品及试剂混合离心管中加75μL Buffer V-N，漩涡振荡混匀，12000g离心5min；
(4)将步骤(3)离心后的上清转移至2mL离心管(试剂盒内提供)中，加300μL异丙醇(含1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀；
(5)将制备管(试剂盒内提供)置于2mL离心管中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min；
(6)弃滤液，将制备管置回至2mL离心管中，加500μL Buffer W1A，室温静置1min，12000g离心1min；
(7)弃滤液，将制备管置回至2mL离心管中，加800μL Buffer W2，12000g离心1min；
(8)将制备管置回到2mL离心管中，12000g离心1min；
(9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40μL无酶水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱RNA/DNA。
3.2、待测样品中BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA目的基因片段的普通PCR扩增和液相芯片检测
3.2.1、待测样品、阴性对照和阳性对照PCR扩增
对步骤3.1提取的待测样品RNA/DNA(作为模板，为提取获得的六种病原体RNA/DNA的混合物)、阴性对照(无核酸的反应体系，例如H2O(双蒸水、无菌去离子水等))、阳性对照(预先人工合成的含有BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA目的基因片段的质粒)分别进行PCR扩增，50μL反应体系与扩增条件如表2-5所示。
表2：BVDV、BRV和BCoV的三重普通PCR反应体系
试剂名称 体积(μL)
2×One Step RT-PCR Buffer III(购自TaKaRa公司) 25
TaKaRa Ex Taq HS(购自TakaRa公司) 1
PrimeScript RT Enzyme Mix II(购自TakaRa公司) 1
BRV-F1(10μM): 1
BRV-R1(10μM): 2
BVDV-F/BCoV-F(10μM)各: 0.5
BVDV-R/BCoV-R(10μM)各: 1
模板 5.0
RNA-free H2O 12
表3：ETEC和CpA的双重普通PCR反应体系
试剂名称 体积(μL)
2×One Step RT-PCR Buffer III(购自TaKaRa公司) 25
TaKaRa Ex Taq HS(购自TakaRa公司) 1
PrimeScript RT Enzyme Mix II(购自TakaRa公司) 1
ETEC-F1(10μM): 1
ETEC-R1(10μM): 2
CpA-F1(10μM): 0.5
CpA-R1(10μM): 1
模板 5.0
RNA-free H2O 13.5
表4：Salmonella的单重普通PCR反应体系
试剂名称 体积(μL)
2×One Step RT-PCR Buffer III(购自TaKaRa公司) 25
TaKaRa Ex Taq HS(购自TakaRa公司) 1
PrimeScript RT Enzyme Mix II(购自TakaRa公司) 1
Sa-F2(10μM): 0.5
Sa-R2(10μM): 1
模板 5.0
RNA-free H2O 16.5
表5：普通PCR的扩增条件
Figure BDA0003742110030000141
3.2.2、待测样品、阴性对照和阳性对照液相芯片检测
分别100倍稀释56/37/62/30/19/75号偶联磁球(其上已经偶联有偶联探针的luminex磁球，稀释至偶联磁球的浓度为100个/μL)和SAPE显色液(浓度为0.01μg/μL)，偶联磁球稀释利用1.5×TMAC缓冲液，SAPE显色液稀释用1×TMAC缓冲液，配置液相芯片检测体系：50μL偶联磁球(上述56/37/62/30/19/75号偶联磁球的混合物)加15μL的H2O和5μL的步骤3.2.1获得的待测样品的PCR扩增产物的混合物，或阳性对照的PCR扩增产物，或阴性对照的PCR扩增产物，96℃预变性5min，50℃杂交15min，加入20μL的SAPE显色液，混匀后，50℃静置30min，上机分析。
3.2.3、结果判定标准(Qualitative criteria，QC)
A、若阳性对照和阴性对照中各病原体(病毒或细菌)对应磁球的MFI值的比值≥3，且阳性对照中各病原体对应磁球的MFI值≥300时，则试验成立；
B、计算待测样品中各病原体对应磁球的MFI值与阴性对照中各病毒对应磁球的MFI值的比值QC；
C、A判定为试验成立时，当待测样品中各病原体对应磁球的MFI值≥300，且QC≥3，判为待测样品中对应病原体阳性；否则，判为阴性。
具体地：若对应BVDV的56号偶联磁球MFI值低于300，表明待测样品中无BVDV，若56号偶联磁球MFI值≥300且QC≥3时，表明待测样品中含有BVDV；若对应BRV的37号偶联磁球MFI值低于300，表明待测样品中无BRV，若37号偶联磁球MFI值≥300且QC≥3时，表明待测样品中含有BRV；若对应BCoV的62号偶联磁球MFI值低于300，表明待测样品中无BCoV，若62号偶联磁球MFI值≥300且QC≥3时，表明待测样品中含有BCoV；若对应ETEC的30号偶联磁球MFI值低于300，表明待测样品中无ETEC，若30号偶联磁球MFI值≥300且QC≥3时，表明待测样品中含有ETEC；若对应Salmonella的19号偶联磁球MFI值低于300，表明待测样品中无Salmonella，若19号偶联磁球MFI值≥300且QC≥3时，表明待测样品中含有Salmonella；若对应CpA的75号偶联磁球MFI值低于300，表明待测样品中无CpA，若75号偶联磁球MFI值≥300且QC≥3时，表明待测样品中含有CpA。
实施例4、本发明检测方法的特异性实验
按照实施例3所述方法，用可以对DNA/RNA进行同时提取的AxyGen试剂盒(购自康宁生命科学(吴江)有限公司)对牛流行热病毒((Bovine ephemeral fever virus,BEFV)、牛鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒(Bovine pamillfluenvirus,BPIV)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)A型和B型(PmA和PmB)、曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytic，Mh)等提取基因组RNA/DNA，以含有BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA目的基因片段的质粒为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在本发明实施例1确定的标记引物和偶联探针的引导下进行PCR扩增和液相芯片检测，PCR扩增和液相芯片检测方法参照实施例3，以验证该方法的特异性。
检测结果如下表6所示，对BEFV、IBRV、BRSV、BPIV、Pm(PmA和PmB)和Mh，以及阴性对照的检测MFI值均低于300，而阳性对照均出现相应的阳性结果，检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA。
表6：BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的液相芯片方法特异性检测结果
Figure BDA0003742110030000161
实施例5、本发明检测方法的灵敏度实验
将浓度分别为108copies/μL的BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的阳性质粒核酸混合物，按照10倍梯度依次进行稀释，稀释至浓度为101copies/μL，以不同浓度的核酸混合物样品作为模板，在本发明实施例1确定的标记引物和偶联探针的引导下进行PCR扩增和液相芯片方法检测，PCR扩增和液相芯片检测方法参照实施例3，以验证该方法的灵敏度。
检测结果如下表7所示，108copies/μL到101copies/μL分别代表BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的8个不同浓度梯度。结果显示，针对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的液相芯片检测方法的检测最低限(灵敏度)分别为103copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、102copies/μL。
表7：BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的液相芯片方法灵敏度检测结果
Figure BDA0003742110030000171
实施例6、本发明检测方法的重复性实验
按照实施例5所述，将10倍梯度稀释的共8个梯度的核酸混合物样品，每个样品进行3个重复，在本发明实施例1确定的标记引物和偶联探针的指导下进行PCR扩增和液相芯片方法检测，PCR扩增和液相芯片检测方法参照实施例3，以验证该方法的重复性。
检测结果如下表8所示，从表8中可见每一个浓度梯度的3个重复样品，检测结果均一致，表明本发明对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的液相芯片检测方法的重复性较好。
表8：BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的液相芯片方法重复性检测结果
Figure BDA0003742110030000172
实施例7、检测BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA的液相芯片检测试剂盒
基于上述实施例1、2和3，本发明所提供的液相芯片检测试剂盒包括实施例1确定的用于对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行液相芯片检测的标记引物和偶联探针(或偶联有偶联探针的偶联磁球)。具体为：用于检测BVDV的上游引物(BVDV-F)、下游引物(BVDV-R)和偶联探针(BVDV-P)；用于检测BRV的上游引物(BRV-F1)、下游引物(BRV-R1)和偶联探针(BRV-P1)；用于检测BCoV的上游引物(BCoV-F)、下游引物(BCoV-R)和偶联探针(BCoV-P)；用于检测ETEC的上游引物(ETEC-F1)、下游引物(ETEC-R1)和偶联探针(ETEC-P1)；用于检测Salmonella的上游引物(Sa-F2)、下游引物(Sa-R2)和偶联探针(Sa-P2)；和用于检测CpA的上游引物(CpA-F1)、下游引物(CpA-R1)和偶联探针(CpA-P1)。
该试剂盒还可包括以下3种普通PCR反应体系：(1)对BVDV、BRV和BCoV进行三重PCR扩增的反应体系，其包括：一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 24-26μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT EnzymeMix II 1-2μL(购于TakaRa公司)，上游引物(BVDV-F)和(BCoV-F)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(BVDV-R)和BCoV-R(10μM)：1-2μL，上游引物(BRV-F1)(10μM)：1-2μL，下游引物(BRV-R1)(10μM)：1-3μL；(2)对ETEC和CpA进行双重PCR扩增的反应体系，其包括：一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS1-2μL，PrimeScript RTEnzyme Mix II 1-2μL，上游引物(CpA-F1)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(CpA-R1)(10μM)：1-2μL，上游引物(ETEC-F1)(10μM)：1-2μL，下游引物(ETEC-R1)(10μM)：1-3μL；(3)对Salmonella进行单重PCR扩增的反应体系，其包括：一步法PCR反应液2×One Step RT-PCRBuffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 1-2μL，上游引物(Sa-F2)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(Sa-R2)(10μM)：1-2μL。
该试剂盒还可包括SAPE显色液、1×TMAC缓冲液和1.5×TMAC缓冲液，为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA目的基因片段的质粒，所述阴性对照为不含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA基因组RNA/DNA的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
试剂盒中各试剂的使用可参考实施例3的内容。
实施例8、对疫苗生产原材料中BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA基因组RNA/DNA外源病原体的定性检测
对疫苗生产中牛源原材料(牛源血清)中BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA外源病毒与细菌进行定性检测，检测方法与实施例3相同。
检测结果如下表9所示，从表中可见在22份牛源血清中，3份有BVDV的污染，2份有BRV的污染，1份有BCoV和BRV的混合污染，2份有BVDV、BRV和BCoV的混合污染，2份有ETEC的污染，2份有CpA的污染，1份有Salmonella的污染，1份有ETEC和CpA的混合污染。因此，基于以上对疫苗生产中牛源原材料外源病原体的定性检测，可以明确该疫苗生产中牛源原材料是否存在外源病毒或细菌的污染，进而可以剔除被外源病原体污染的原材料，从而保证牛源原材料等的纯净性和安全性，进而可以保证疫苗接种的安全性。
表9：不同编号样品中BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella、CpA的液相芯片检测结果
Figure BDA0003742110030000191
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行液相芯片检测的引物和偶联探针组合，其包含：
用于检测BVDV的上游引物(BVDV-F)、下游引物(BVDV-R)和偶联探针(BVDV-P)，其中所述上游引物(BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(BVDV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，偶联探针(BVDV-P)的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：3所示；
用于检测BRV的上游引物(BRV-F1)、下游引物(BRV-R1)和偶联探针(BRV-P1)，其中所述上游引物(BRV-F1)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：4所示，下游引物(BRV-R1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，偶联探针(BRV-P1)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：6所示；
用于检测BCoV的上游引物(BCoV-F)、下游引物(BCoV-R)和偶联探针(BCoV-P)，其中所述上游引物(BCoV-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：10所示，下游引物(BCoV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：11所示，偶联探针(BCoV-P)的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：12所示；
用于检测ETEC的上游引物(ETEC-F1)、下游引物(ETEC-R1)和偶联探针(ETEC-P1)，其中所述上游引物(ETEC-F1)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：13所示，下游引物(ETEC-R1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：14所示，偶联探针(ETEC-P1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：15所示；
用于检测Salmonella的上游引物(Sa-F2)、下游引物(Sa-R2)和偶联探针(Sa-P2)，其中所述上游引物(Sa-F2)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：21所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：22所示，偶联探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：20所示；
用于检测CpA的上游引物(CpA-F1)、下游引物(CpA-R1)和偶联探针(CpA-P1)，其中所述上游引物(CpA-F1)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：23所示，下游引物(CpA-R1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：24所示，偶联探针(CpA-P1)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：25所示。
2.根据权利要求1所述的引物和偶联探针组合，其中所述下游引物(BVDV-R)、下游引物(BRV-R1)、下游引物(BCoV-R)、下游引物(ETEC-R1)、下游引物(Sa-R2)和下游引物(CpA-R1)的核苷酸序列的5’端均标记有生物素；所述偶联探针(BVDV-P)、偶联探针(BRV-P1)、偶联探针(BCoV-P)、偶联探针(ETEC-P1)、偶联探针(Sa-P2)和偶联探针(CpA-P1)的核苷酸序列的5’端均标记有胺基。
3.用于对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行液相芯片检测的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的引物和偶联探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其还包含分别与偶联探针(BVDV-P)、偶联探针(BRV-P1)、偶联探针(BCoV-P)、偶联探针(ETEC-P1)、偶联探针(Sa-P2)和偶联探针(CpA-P1)偶联的六种不同的luminex磁球，其中将偶联探针(BVDV-P)与luminex磁球偶联后的磁球称为BVDV偶联磁球，将偶联探针(BRV-P1)与luminex磁球偶联后的磁球称为BRV偶联磁球，将偶联探针(BCoV-P)与luminex磁球偶联后的磁球称为BCoV偶联磁球，将偶联探针(ETEC-P1)与luminex磁球偶联后的磁球称为ETEC偶联磁球，将偶联探针(Sa-P2)与luminex磁球偶联后的磁球称为Sa偶联磁球，将偶联探针(CpA-P1)与luminex磁球偶联后的磁球称为CpA偶联磁球。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其还包含三种PCR反应体系，包括用于扩增BVDV、BRV和BCoV的三重PCR反应体系，用于扩增ETEC和CpA的双重PCR反应体系和用于扩增Salmonella的单重PCR反应体系。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的试剂盒，其还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA目的基因片段的质粒，所述阴性对照为不含BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA核酸的反应体系。
7.一种用权利要求1或2所述的引物和偶联探针组合或权利要求3-6中任一项所述的试剂盒对BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA进行非疾病诊断目的定性检测的方法，其包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组RNA/DNA，以提取的基因组RNA/DNA为模板，在权利要求1-6中任一项提及的引物的引导下进行普通PCR扩增；
2)将步骤1)扩增得到的PCR产物与权利要求4提及的BVDV偶联磁球、BRV偶联磁球、BCoV-P偶联磁球、ETEC偶联磁球、Sa偶联磁球和CpA偶联磁球混合进行液相芯片杂交，并进行上机分析，获得待测样品中各病原体对应偶联磁球的MFI值以及阳性对照品和阴性对照品中各病毒对应偶联磁球的MFI值；
3)基于步骤2)获得的MFI值对待测样品中的BVDV、BRV、BCoV、ETEC、Salmonella和CpA分别进行定性判定。
8.根据权利要求7所述的方法，所述步骤1)中进行三次普通PCR扩增：
(1)对BVDV、BRV和BCoV进行三重PCR扩增，其PCR反应体系包括：一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL，PrimeScript RTEnzyme Mix II 1-2μL，上游引物(BVDV-F)和(BCoV-F)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(BVDV-R)和BCoV-R(10μM)：1-2μL，上游引物(BRV-F1)(10μM)：1-2μL，下游引物(BRV-R1)(10μM)：1-3μL，模板1-3μL，ddH2O补充至50μL；
(2)对ETEC和CpA进行双重PCR扩增，其PCR反应体系包括：一步法PCR反应液2×OneStep RT-PCR Buffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL，PrimeScript RT EnzymeMix II 1-2μL，上游引物(CpA-F1)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(CpA-R1)(10μM)：1-2μL，上游引物(ETEC-F1)(10μM)：1-2μL，下游引物(ETEC-R1)(10μM)：1-3μL，模板1-3μL，ddH2O补充至50μL；
(3)对Salmonella进行单重PCR扩增，其PCR反应体系包括：一步法PCR反应液2×OneStep RT-PCR Buffer III 24-26μL，TaKaRa Ex Taq HS 1-2μL，PrimeScript RT EnzymeMix II 1-2μL，上游引物(Sa-F2)(10μM)：0.5-1μL，下游引物(Sa-R2)(10μM)：1-2μL，模板1-3μL，ddH2O补充至50μL；
步骤1)中所述普通PCR扩增的反应条件为：先52℃15min，95℃2min；然后94℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环；最后终延伸72℃7min。
9.根据权利要求7或8所述的方法，步骤3)的具体定性判定过程为：
A、若阳性对照和阴性对照中各病原体对应磁球的MFI值的比值≥3，且阳性对照中各病原体对应磁球的MFI值≥300时，则试验成立；
B、计算待测样品中各病原体对应磁球的MFI值与阴性对照的MFI值的比值QC；
C、A判定为试验成立时，当待测样品中各病原体对应磁球的MFI值≥300，且QC≥3，判为待测样品中对应病原体阳性；否则，判为阴性。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述步骤1)中的待测样品包括采自牛源用于疫苗生产的原材料血清、疫苗半成品、疫苗成品、牛源睾丸分离的原代细胞或其组合。
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