CN116334253B - 一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒 - Google Patents
一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、SYBR Green I、检测引物，所述检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。与传统检测试剂盒和检测方法相比，本发明方法具有简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，在检测时间与检测成本方面均明显优于目前检测标准中的方法，适合于批量检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒。
背景技术
鸡支原体病是由支原体引起鸡的传染病病的总称，不仅可以水平传播，也可经种蛋垂直传播，且常继发或混合感染其它病原，给养禽业造成了严重的损失。其中，最常见且危害最大的包括鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）和滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）。鸡毒支原体主要引起鸡慢性呼吸道疾病，鸡群感染后出现啰音、咳嗽、呼吸道粘膜卡他性炎症等症状，种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降，常与大肠杆菌等细菌或病毒混合感染，使疾病复杂化，造成较大的经济损失。滑液囊支原体可引起鸡的传染性滑膜炎，呈慢性感染过程，导致关节病变，出现跛行，影响仔鸡和蛋鸡的生产性能，免疫功能下降，易并发新城疫、传染性支气管炎等传染病。
目前对于鸡毒支原体和滑液囊支原体的检测标准都是基于血清学检测、病原学检测和PCR检测（如NYT553-2002 禽支原体病诊断技术，NYT 553-2015 禽支原体PCR检测方法，OIE《诊断试验与疫苗标准手册——禽支原体》等）。对于血清学和病原学方法而言，涉及的过程非常繁琐且费时，不能达到及时发现病原、控制传播途经，消除污染源的疫病防控要求。而PCR方法灵敏度相对偏低，检测时间也相对偏长，且为提高检出率通常需要增菌后检测。LAMP方法虽灵敏度大幅提高，检测时间也缩短，但极易发生气溶胶污染，且因引物较多易造成引物二聚体，无法通过琼脂糖凝胶电泳辨别假阳性结果。此外，现有技术中同时检测鸡毒支原体和滑液囊支原体的方法基本为多重PCR，至少涉及4条引物，不仅会增加引物二聚体干扰正常扩增反应，还影响检测的灵敏度和特异性。
基于上述原因，本发明提供一种的鸡毒支原体和滑液囊支原体通用核酸检测，可有效解决目前检测标准中的缺陷，仅使用一对引物，就可以达到简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。
发明内容
本发明针对血清学/病原学检测与传统核酸检测技术在鸡毒支原体和滑液囊支原体检测中存在的不足，特别是如何提高检测效率、灵敏度与特异性，提供了一种鸡毒支原体和滑液囊支原体的通用核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
本发明技术方案如下：
本发明提供了一种特异性检测鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述核酸检测试剂盒包括10×反应缓冲液、8000 U/μl Bst DNA聚合酶、10mM dNTPs、检测引物、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、阳性对照和阴性对照；所述检测引物为SEQ ID NO.1的引物和SEQ ID NO.2的引物的组合。
本发明通过使用特别设计的一对检测引物，就可以实现特异性强、灵敏度高的优点。特别需要说明的是，本发明的试剂盒加入石墨化碳纳米管后的扩增条带，有单一的目的特异性条带（如图1所示）。本发明设计是在链交换扩增（使用一对引物进行等温扩增）的基础上改进的（仍使用一对引物，分两步进行扩增）。研究发现，在不加入石墨化碳纳米管的情况下，会出现类似链交换扩增的非特异性扩增现象（如图1所示，出现引物二聚体而特异性条带不清晰等），所以通过加入石墨化碳纳米管等纳米材料可以最大限度的提高反应特异性。石墨化碳纳米管对基因扩增的机制不明，据推测由于表面电荷性质，可与单链DNA形成相对稳定的结构，而双链DNA由于双链间氢健作用力更稳定，所以不会石墨化碳纳米管结合。因此，石墨化碳纳米管可以吸附多余未参加反应的引物单链，以防止引物二聚体的产生，有效提高反应特异性。
本发明的试剂盒中加入甜菜碱可帮助DNA聚合酶顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶从模板DNA中解离。DNA局部区域因含有多个复杂碱基（Py-G-C），会促使DNA聚合酶的停滞，最终导致DNA聚合酶停止有效延伸。而甜菜碱可提高DNA小沟中富含鸟嘌呤和胞嘧啶区域的鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA分子结构，改变DNA灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸。其次，甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性。浓度依赖性降低高GC含量序列的Tm，并使不同引物的Tm相接近，最终降低DNA Tm值。此外，甜菜碱溶液可稳定DNA-蛋白复合物。
进一步的，所述阳性对照支原体CVCC1651基因组DNA，所述阴性对照为无菌生理盐水。
进一步的，所述鸡毒支原体和滑液囊支原体试剂盒检测体系的组分为：每20μL反应液中包括10×反应缓冲液2μL，Bst DNA聚合酶0.8μL，dNTPs 2μL，10×SYBR Green I 2μL，甜菜碱（8mM）1 µL， 聚乙二醇甲醚0.5µL，石墨化碳纳米管溶液（10 ng/µL）2µL，MG/S-F和MG/S-R各3μL，待检样品DNA 3μL，其余为灭菌生理盐水。
进一步的，所述鸡毒支原体和滑液囊支原体检测方法的反应流程为：74℃ 1秒，62℃ 1秒，循环总数45。
进一步的，所述10×反应缓冲液含有200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1% Triton X-100，pH 8.0~8.8。
进一步的，所述鸡毒支原体和滑液囊支原体检测方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
更进一步的，一种使用鸡毒支原体和滑液囊支原体的检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用试剂盒提取基因组DNA，得到检测模板。
S2：将缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green I、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积20μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR 仪进行扩增反应；
S3：当反应结束后，荧光曲线起峰（荧光值大于0.001）判定为阳性；当荧光曲线未起峰（荧光值小于等于0.001）时判定为阴性。或采用3%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明根据精确筛选出的鸡毒支原体和滑液囊支原体特异基因序列设计引物，具有灵敏度高，特异性强的优点。同时，本发明只需通过一次反应，即可同时对鸡毒支原体和滑液囊支原体进行快速检测，相比传统的检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。
附图说明
图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：M为Takara 20 bp DNA Ladder(Dye Plus) ，泳道1为含石墨化碳纳米管体系检测支原体CVCC1651，泳道2为不含石墨化碳纳米管检测支原体CVCC1651，泳道3为阴性对照；
图2为实施例3中抗干扰评价实验的检测结果。图中：1为鸡毒支原体的阳性模板；2为鸡毒支原体、鸡支原体、火鸡支原体、猪肺炎支原体、羊肺炎支原体的阳性混合模板；3为阴性对照；
图3为实施例4中敏感性评价的检测结果。图中：1为4.7×102copies/μl，2为至4.7×101copies/μl，3为4.7×100copies/μl，4为4.7×10-1copies/μl，5为4.7×10-2copies/μl，6为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1鸡毒支原体和滑液囊支原体核酸检测方法的建立
引物的设计：根据GenBank数据库中已知的鸡毒支原体和滑液囊支原体DNA序列、其它血清型支原体DNA序列，以及其它物种DNA序列，通过分析比对后，筛选出在鸡毒支原体和滑液囊支原体中特异性的核苷酸序列，在此基础上设计、优选得到用于特异性检测鸡毒支原体和滑液囊支原体的的引物，如下表所示。
表1 鸡毒/滑液囊支原体核酸检测引物序列MG/S-
模板制备：将鸡毒支原体CVCC1651在PPLO培养基中增菌培养，使用试剂盒提取鸡毒支原体CVCC1651基因组DNA，作为待检模板。
检测试剂的配制：10×反应缓冲液（其组分包括200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1% Triton X-100，pH 8.0~8.8）、dNTPs（包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM）、Bst DNA 聚合酶（8000U/μl）、10μM检测引物、0.5 µL聚乙二醇甲醚、甜菜碱（8mM）、石墨化碳纳米管溶液（10 ng/µL）、10×SYBR Green I。此外，设置石墨化碳纳米管缺省对照组。
检测体系及扩增程序：检测体系为20μL，具体包括：10×反应缓冲液2μL，Bst DNA聚合酶0.8μL，dNTPs 2μL，10×SYBR Green I 2μL，甜菜碱（8mM）1 µL， 聚乙二醇甲醚0.5µL，石墨化碳纳米管溶液（10 ng/µL）2µL，MG/S-F和MG/S-R各3μL，待检样品DNA 3μL，其余为灭菌生理盐水。扩增程序的步骤包括74℃ 1秒，62℃ 1秒，循环总数45。
检测结果的判定：当反应结束后，荧光曲线起峰（荧光值大于0.0001）判定为阳性；当荧光曲线未起峰（荧光值小于等于0.0001）时判定为阴性。或取5μl 扩增产物，加1μl 6×Loading buffer混匀，点样于3%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定，可见约44bp大小的条带，而缺省石墨化碳纳米管对照组几乎未见特异性条带，而出现了引物二聚体（如图1）。
实施例2 特异性评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的特异性评价，将18株参考菌株在PPLO或营养肉汤培养基中增菌培养后，使用试剂盒提取基因组DNA，按照实施例1所述方法进行检测，结果如表2所示，只有鸡毒支原体和滑液囊支原体的检测结果为阳性，其它种属细菌均为阴性。
表2 本发明特异性评价试验结果
| 序号 | 菌株名称 | 菌株代号 | 检测结果 |
| 1 | 鸡毒支原体 | CVCC1651 | + |
| 2 | 鸡毒支原体 | F-36 | + |
| 3 | 鸡毒支原体 | TS-11 | + |
| 4 | 滑液囊支原体 | CVCC385 | + |
| 5 | 滑液囊支原体 | H | + |
| 6 | 滑液囊支原体 | MS1 | + |
| 7 | 鸡支原体 | CVCC349 | - |
| 8 | 火鸡支原体 | CVCC366 | - |
| 9 | 猪肺炎支原体 | CVCC354 | - |
| 10 | 羊肺炎支原体 | CVCC381 | - |
| 11 | 沙门氏菌 | ATCC14028 | - |
| 12 | 奇异变形杆菌 | ATCC12453 | - |
| 13 | 粘质沙雷氏菌 | CMCC41002 | - |
| 14 | 大肠埃希氏菌 | ATCC25922 | - |
| 15 | 金黄色葡萄球菌 | ATCC25923 | - |
| 16 | 铜绿假单胞菌 | ATCC27853 | - |
| 17 | 福氏志贺氏菌 | CMCC51572 | - |
| 18 | 肺炎克雷伯氏菌 | ATCC700603 | - |
实施例3 抗干扰评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。分别将鸡毒支原体CVCC1651、鸡支原体CVCC349、火鸡支原体CVCC366、猪肺炎支原体CVCC354和羊肺炎支原体CVCC381接种PPLO培养基增菌后，再将增菌液稀释后使用试剂盒提取基因组。将提取的基因组分为2份，1号样品仅含鸡毒支原体CVCC1651阳性模板，2号样品为鸡毒支原体、鸡支原体、火鸡支原体、猪肺炎支原体和羊肺炎支原体等量混合的阳性模板，3号样品为阴性对照。按照实施例1所述方法进行检测，结果如图2所示，1号样品和2号样品均显示出明显的荧光曲线，3号样品无荧光曲线出现，表明本发明方法具有较好的抗干扰能力。
实施例4 灵敏度评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。将鸡毒支原体CVCC1651在PPLO培养基中增菌培养，使用试剂盒提取基因组DNA，测定原始浓度后10倍梯度稀释，对不同稀释梯度细菌基因组DNA进行扩增。由图3可知本发明方法检测支原体的最低下限可达4.7拷贝，具有较高的灵敏度和应用价值。
实施例5 稳定性评价实验
用实施例1的方法进行本发明检测方法的重复性评价。以鸡毒支原体CVCC1651基因组DNA为模板，分别进行10次扩增测试。结果见表3，由表可见，荧光信号时间阈值（Tt）相对稳定（变异系数约为5.5%），阴性对照无荧光信号时间阈值，表明该方法具有较好的稳定性。
表3 稳定性测试结果
| 阳性质控 | Tt（min） | 阴性质控 | Tt（min） |
| 1 | 16.37 | 1’ | - |
| 2 | 16.16 | 2’ | - |
| 3 | 18.02 | 3’ | - |
| 4 | 18.28 | 4’ | - |
| 5 | 17.95 | 5’ | - |
| 6 | 18.39 | 6’ | - |
| 7 | 18.81 | 7’ | - |
| 8 | 18.52 | 8’ | - |
| 9 | 17.78 | 9’ | - |
| 10 | 18.56 | 10’ | - |
| CV | 0.055 | CV | - |
实施例6 检测试剂盒的组装
根据实施例1表中的序列合成鸡毒支原体和滑液囊支原体的特异性检测引物，用灭菌生理盐水稀释为10 μM浓度，等体积混合后得到检测引物；使用试剂盒提取鸡毒支原体CVCC1651基因组DNA作为阳性对照；核酸扩增试剂：10×反应缓冲液（其组分包括200mMTris-HCl，100mM (NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1% Triton X-100，pH 8.6~8.8）、dNTPs（包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM）、Bst DNA 聚合酶（8000 U/μl）、甜菜碱（8mM）、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液（10 ng/µL）检测引物、阳性对照以及阴性对照（无菌生理盐水）。
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书（包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等），组装成本发明所述的用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒。
实施例7 临床样品检测
用实施例1的方法进行对支原体阳性种鸡场送检的85份死胚和弱雏进行检测，同时使用禽支原体检测标准（NY/T 553-2015）中的方法进行鸡毒支原体和滑液囊支原体的PCR检测。结果如表4所示，在85份临床病料中，本发明提供的检测方法与NY/T 553-2015标准检测方法均检测出63份阳性样本，且2种检测方法符合率达100%，表明本发明的检测方法具有较好特异性。此外NY/T 553-2015标准检测需要约4个小时时间，采用本发明试剂盒检测仅需约半小时。
表4 临床样本验证测试结果
| 方法 | 总数 | 阳性数 |
| NY/T 553-2015 | 85 | 63 |
| 鸡毒支原体 | 43 | |
| 滑液囊支原体 | 20 | |
| 本发明检测方法 | 85 | 63 |
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1）反应缓冲液；2）检测引物：正向引物MG/S-F和反向引物MG/S-R，所述的MG/S-F和MG/S-R引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；3）Bst DNA聚合酶；4）dNTPs；5）SYBRGreen I；6）甜菜碱；7）聚乙二醇甲醚；8）石墨化碳纳米管。
2.根据权利要求1所述的一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：9）阳性对照：支原体CVCC1651基因组DNA；10）阴性对照：灭菌生理盐水。
3.根据权利要求1所述的一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的反应缓冲液含有Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和Triton X-100。
4.根据权利要求1所述的一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒，其特征在于：正向引物MG/S-F和反向引物MG/S-R的浓度均为10 pmol/μL。
5.根据权利要求1所述的一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒的检测反应体系为：每20μL反应液中包括10×反应缓冲液2μL，Bst DNA聚合酶0.8μL，dNTPs 2μL，10×SYBR Green I 2μL，8mM甜菜碱1 µL， 聚乙二醇甲醚0.5µL，10 ng/µL石墨化碳纳米管溶液2µL，MG/S-F和MG/S-R各3μL，待检样品DNA 3μL，其余为灭菌生理盐水。
6.权利要求1-4任意一项所述的一种用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒在制备检测鸡毒支原体和滑液囊支原体的试剂中的应用。
7.一种使用权利要求1-4任意一项所述的用于鸡毒支原体和滑液囊支原体的核酸检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用试剂盒提取基因组DNA，得到检测模板；
S2：将缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green I、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积20μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR 仪进行扩增反应；
S3：当反应结束后，荧光曲线起峰，即荧光值大于0.001，判定为阳性；当荧光曲线未起峰，即荧光值小于等于0.001，时判定为阴性；或采用3%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
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